CN102942637B - 一种提高野生仙人掌多糖提取率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高野生仙人掌多糖提取率的方法，该方法是以新鲜的生长3±1个月的野生仙人掌嫩茎为材料，经预处理获得仙人掌干粉，采用热水浸提法提取仙人掌多糖，经醇沉、去蛋白、透析、冷冻干燥，获得仙人掌多糖干粉；该法操作简单，多糖得率及纯度较高，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高野生仙人掌多糖提取率的方法，属于天然产物提取技术领域。
背景技术
仙人掌（Opuntia dillenii Haw.）为仙人掌科仙人掌属肉质多年生植物，又名观音刺、神仙掌、火焰等。我国的野生仙人掌主要分布在广西、广东、江西、福建等省，资源丰富。大量药理学研究表明，仙人掌多糖具有降血糖血脂、降血清胆固醇、抗氧化、调节免疫、抗癌和护肝等功效。相关的文献及专利有：曾富华等（2009）在专利“野生仙人掌多糖提取物的制备及高效降血清胆固醇的作用”中，提出野生仙人掌多糖能显著降低高脂血症大鼠的总胆固醇含量，明显改善脂代谢紊乱，且无明显的不良反应；杨宁等（2007）在专利“仙人掌多糖及其提取纯化方法与运用”中通过水提、超滤膜过滤、Sevag法去蛋白等方法制得的仙人掌多糖，对糖尿病并发症中的氧化应激有抑制作用；Zhao Long-yan等（2011）以给药链脲菌素的方法建立小鼠糖尿病模型，通过DEAE 琼脂糖快流速离子交换层析得到的仙人掌多糖组分喂食糖尿病小鼠，其中组分ODP-Ia具有显著的降血糖作用，保护肝组织免受过氧化伤害；Zhao Long-yan等（2012）报道了仙人掌多糖主要组分对高脂血症大鼠的降血脂作用并解释了其主要机制。因此，仙人掌多糖具有潜在的药用价值，开发前景广阔。
目前，有大量关于仙人掌多糖的提取分离方法的文献报道，但皆存在产品得率及纯度较低的缺点。如Cai等（2008）通过响应面分析法得到仙人掌多糖的最佳热水浸提条件，温度86.1 ℃，时间3.61 h，料液比1 : 3.72，提取2次，仙人掌粗多糖的得率仅为0.698%；黄德娟等（2008）等通过热水浸提法提取仙人掌多糖，采用单因素试验和L9（33）正交试验设计考察提取温度、时间、料液比等因素对仙人掌多糖提取率的影响，结果表明在提取温度 80 ℃，提取时间 1 h，固液比为 1 : 60的条件下，多糖得率5.71%，粗多糖中多糖含量为31.4%；梁艳等（2006）以水为溶剂，采用微波辅助法提取仙人掌多糖。优化的工艺条件：料液比1 : 10（w/v），提取2次，每次提取3 min，微波炉功率700 W，得率以样品计算为6.8%，含量以粗多糖样品计算为8.5%，赵龙岩等（2011）以双酶法提取仙人掌多糖，确定最佳提取条件：果胶酶浓度0.7%，纤维素酶度浓度0.3%，40 ℃提取1.5 h，多糖产率较高，为20.08%，纯度为83.02%，但双酶法成本太高。关于仙人掌多糖的提取分离研究主要是通过提取手段及提取过程温度、液料比、时间等影响因素的优化来提高其得率，尚未见通过选择不同茎龄仙人掌提高仙人掌多糖得率的报道。本方法是在曾富华等（2009）专利“野生仙人掌多糖提取物的制备及高效降血清胆固醇的作用”的基础上，通过选择不同茎龄的仙人掌，进一步大幅度提高仙人掌多糖的得率。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种提高野生仙人掌多糖提取率的方法。其关键是选择茎龄在3 ± 1个月的野生仙人掌嫩茎为原料，采用热水浸提法提取仙人掌多糖。该法操作简单，能最大限度地提高仙人掌多糖得率。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的，具体包括以下步骤：
（1）原料处理：野生仙人掌茎片除刺、洗净、切碎、匀浆，用酒精浸泡除醇溶性物质，干燥，粉碎后过40目筛得到仙人掌干粉；
（2）浸提：将上述仙人掌干粉与去离子水混合，在95 ℃的温度下浸提，3 000 rpm离心15 min，收集上清液；
（3）浓缩：将上述上清液在55 ℃下浓缩；
（4）纯化：向上述浓缩液加入三氯乙酸，搅拌，常温静置2 h，8 000 rpm离心15 min除去蛋白，上清液调pH至中性；然后往上清液加入乙醇进行沉淀，静置过夜后，5 000 rpm离心15 min，收集沉淀物；沉淀物加去离子水复溶，用透析袋透析，记录透析袋内多糖溶液体积并测定糖含量；此溶液减压浓缩后加入乙醇进行沉淀，静置过夜后，5 000 rpm离心15 min，收集沉淀，沉淀经无水乙醇洗涤，冻干得仙人掌多糖干粉；
所述的原料是新鲜的生长3 ± 1个月的野生仙人掌嫩茎；
所述的酒精为80%食用酒精，浸泡次数为5次；
所述的仙人掌与去离子水按重量体积比1 : 60的比例混合；
所述的浸提时间为3 h，浸提2次，收集上清液分离后，对滤渣重复提取1次，合并两次上清液；
所述的上清液浓缩至原体积的1/3 - 1/2；
所述的三氯乙酸质量浓度为10%，加入量为浓缩液体积的1倍；
所述的乙醇浓度为95%，加入量为上清液或浓缩液体积的3倍；
所述的去离子水与沉淀物减压浓缩前的体积比为1:1；
所述的透析袋截留分子量为3 500 Da，透析温度4 ℃，透析时间3 d。
本发明根据仙人掌茎片中可溶性多糖在其生长旺盛时期快速积累，随后逐渐减少，纤维素含量增加，并影响胞内可溶性多糖的释放而选用茎龄3 ± 1个月的野生仙人掌嫩茎为原料，采用热水浸提法提取仙人掌多糖，经醇沉、去蛋白、透析、冷冻干燥，获得仙人掌多糖干粉，该法操作简单，多糖得率是比茎龄在6个月以上的野生仙人掌老茎的2倍以上，且纯度较高，适合工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
（1）原料处理：新鲜的茎龄2个月的野生仙人掌茎片，除刺、洗净、切碎、匀浆，80%食用酒精浸泡5次除醇溶性物质，干燥，粉碎过40目筛得到仙人掌干粉；
（2）浸提：仙人掌干粉与去离子水按重量与体积比1 : 60混合，在95 ℃的温度下浸提3 h，3 000 rpm离心15 min，收集上清液，滤渣按上述方法重复浸提1次，合并两次上清液；
（3）浓缩：将上清液在55 ℃下减压浓缩至原体积的1/3 ；
（4）纯化：向浓缩液加入质量浓度为10%三氯乙酸，加入量为浓缩液体积的1倍，搅拌，室温静置2 h，8 000 rpm离心15 min除去蛋白，上清液调pH至中性；然后往上清液加入3倍体积95%乙醇，静置过夜，5 000 rpm离心15 min，收集沉淀物；沉淀物加与减压浓缩前等体积的去离子水复溶，用截留分子量为3 500 Da的透析袋4 ℃透析3 d，记录透析袋内多糖溶液体积并测定糖含量；减压浓缩后加入3倍体积95%乙醇，静置过夜，5 000 rpm离心15 min，收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤，冻干得仙人掌多糖干粉，得率为30.51%，纯度为87.13%。
实验例2
（1） 原料处理：新鲜的茎龄3个月的野生仙人掌茎片，除刺、洗净、切碎、匀浆，80%食用酒精浸泡5次除醇溶性物质，干燥，粉碎过40目筛得到仙人掌干粉；
（2） 浸提：仙人掌干粉与去离子水按重量与体积比1 : 60混合，在95 ℃的温度下浸提3 h，3 000 rpm离心15 min，收集上清液，滤渣按上述方法重复浸提1次，合并两次上清液；
（3） 浓缩：将上清液在55 ℃下减压浓缩至原体积的1/2；
（4）纯化：向浓缩液加入质量浓度为10%三氯乙酸，加入量为浓缩液体积的1倍，搅拌，常温静置2 h，8 000 rpm离心15 min除去蛋白，上清液调pH至中性；然后往上清液加入3倍体积95%乙醇进行沉淀，静置过夜后，5 000 rpm离心15 min，收集沉淀物；沉淀物加与减压浓缩前等体积的去离子水复溶，用截留分子量为3 500 Da的透析袋4 ℃透析3 d，记录透析袋内多糖溶液体积并测定糖含量；减压浓缩后加入3倍体积95%乙醇进行沉淀，静置过夜后，5 000 rpm离心15 min，收集沉淀，沉淀经无水乙醇洗涤，冻干得仙人掌多糖干粉，得率为30.07%，纯度为85.54%。
实施例3
（1）原料处理：新鲜的生长4个月的野生仙人掌茎片，除刺、洗净、切碎、匀浆，80%食用酒精浸泡5次除醇溶性物质，干燥，粉碎过40目筛得到仙人掌干粉；
（2） 浸提：仙人掌干粉与去离子水按重量与体积比1 : 60混合，在95 ℃的温度下浸提3 h，3 000 rpm离心15 min，收集上清液，对滤渣重复提取1次，合并两次上清液；
（3）浓缩：将上清液在55 ℃下减压浓缩至原体积的1/3；
（4） 纯化：向浓缩液加入质量浓度为10%三氯乙酸，加入量为浓缩液体积的1倍，搅拌，常温静置2 h，8 000 rpm离心15 min除去蛋白，上清液调pH至中性；然后往上清液加入3倍体积95%乙醇进行沉淀，静置过夜后，5 000 rpm离心15 min，收集沉淀物；沉淀物加与减压浓缩前等体积的去离子水复溶，用截留分子量为3 500 Da的透析袋4 ℃透析3 d，记录透析袋内多糖溶液体积并测定糖含量；减压浓缩后加入3倍体积95%乙醇进行沉淀，静置过夜后，5 000 rpm离心15 min，收集沉淀，沉淀经无水乙醇洗涤，冻干得仙人掌多糖干粉，得率为30.25%，纯度为87.13%。
实施例4
取材：新鲜的生长6个月以上的野生仙人掌茎片；
原料处理：野生仙人掌茎片除刺、洗净、切碎、匀浆，80%食用酒精浸泡5次除醇溶性物质，干燥，粉碎过40目筛得到仙人掌干粉；
浸提：仙人掌干粉与去离子水按料液比1 : 60（重量与体积比）混合，在95 ℃的温度下浸提3 h， 3000 rpm离心15 min，收集上清液，对滤渣重复提取1次，合并两次上清液；
浓缩：将上清液在55 ℃下减压浓缩至原体积的1/3 - 1/2；
纯化：向浓缩液加入质量浓度为10%三氯乙酸，加入量为浓缩液体积的1倍，搅拌，常温静置2 h，8 000 rpm离心15 min除去蛋白，上清液调pH至中性；然后往上清液加入3倍体积95%乙醇进行沉淀，静置过夜后，5 000 rpm离心15 min，收集沉淀物；沉淀物加与减压浓缩前等体积的去离子水复溶，用截留分子量为3 500 Da的透析袋4 ℃透析3 d，记录透析袋内多糖溶液体积并测定糖含量；减压浓缩后加入3倍体积95%乙醇进行沉淀，静置过夜后，5 000 rpm离心15 min，收集沉淀，沉淀经无水乙醇洗涤，冻干得仙人掌多糖干粉，得率为13.87%，纯度为83.27%。
Claims (1)
1.一种提高野生仙人掌多糖提取率的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）原料处理：野生仙人掌茎片除刺、洗净、切碎、匀浆，用酒精浸泡除醇溶性物质，干燥，粉碎后过40目筛得到仙人掌干粉；
（2）浸提：将上述仙人掌干粉与去离子水混合，在95 ℃的温度下浸提，3000 rpm离心15 min，收集上清液；
（3）浓缩：将上述上清液在55 ℃下浓缩；
（4）纯化：向上述浓缩液加入三氯乙酸，搅拌，常温静置2 h，8000 rpm离心15 min除去蛋白，上清液调pH至中性；然后往上清液加入乙醇进行沉淀，静置过夜后，5000 rpm离心15 min，收集沉淀物；沉淀物加去离子水复溶，用透析袋透析，记录透析袋内多糖溶液体积并测定糖含量；此溶液减压浓缩后加入乙醇进行沉淀，静置过夜后，5000 rpm离心15 min，收集沉淀，沉淀经无水乙醇洗涤，冻干得仙人掌多糖干粉；
所述步骤（1）所述原料是新鲜的生长3 ± 1个月的野生仙人掌嫩茎；
所述步骤（1）所述酒精为80%食用酒精，浸泡次数为5次；
所述步骤（2）所述的仙人掌与去离子水按重量体积比1 : 60的比例混合；
所述步骤（2）所述的浸提时间为3 h，浸提2次，收集上清液分离后，对滤渣重复提取1次，合并两次上清液；
所述步骤（3）所述上清液浓缩至原体积的1/3 - 1/2；
所述步骤（4）所述三氯乙酸的质量浓度为10%，加入量为浓缩液体积的1倍；
所述步骤（4）所述的乙醇浓度为95%，加入量为上清液或浓缩液体积的3倍；
所述步骤（4）所述去离子水与沉淀物减压浓缩前的体积比为1:1；
所述步骤（4）所述透析袋的截留分子量为3500 Da，透析温度4 ℃，透析时间3 d。
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