KR20040100789A - 아밀라아제에 대한 저해활성이 있는 율무 추출물과리파아제에 대한 저해활성이 있는 호박추출물의 분리 및이를 이용한 비만 및 당뇨에 효과적인 식이 조성물 - Google Patents

아밀라아제에 대한 저해활성이 있는 율무 추출물과리파아제에 대한 저해활성이 있는 호박추출물의 분리 및이를 이용한 비만 및 당뇨에 효과적인 식이 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 율무와 호박으로부터 탄수화물과 지방의 소화흡수에 중요한 역할을 하는 췌장 아밀라아제와 리파아제에 대한 저해활성이 있는 물질을 추출하고 이의 분리, 정제 및 이를 이용한 비만 및 혈당 조절용 조성물의 생산방법에 관한 것이다. 구체적으로 돼지 췌장 유래의 아밀라아제와 리파아제에 대한 저해활성이 있는 천연물을 검색하여 율무와 호박의 추출물에서 저해활성이 있음을 확인하고 활성물질을 추출하는 단계와 추출액으로부터 저해활성의 저하를 최소화하며 활성물질을 분리하는 단계 및 상기 방법에 의해 생산된 저해활성물질을 이용하여 생체내 탄수화물 분해효소인 아밀라아제와 지방 분해 효소인 리파아제의 활성을 저해함으로써 비만의 개선과 당뇨환자의 혈당증가를 억제하는 비만 및 혈당조절용 조성물에 관한것이다. 본 발명은 탄수화물과 지방의 분해를 직접적으로 억제하므로 음식물 섭취의 제한 없이 당뇨병의 예방 및 치료와 비만의 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

아밀라아제에 대한 저해활성이 있는 율무 추출물과 리파아제에 대한 저해활성이 있는 호박추출물의 분리 및 이를 이용한 비만 및 당뇨에 효과적인 식이 조성물{PURIFICATION OF JOB'S TEARS EXTRACT AND PUMPKIN EXTRACT AGAINST AMYLASE AND LIPASE AND COMPOSITIONS CONTAINING JOB'S TEARS EXTRACT AND PUMPKIN EXTRACT FOR REGULATION OF OBESITY AND DIABETIC}
본 발명은 췌장 아밀라아제에 대한 저해활성이 있는 율무추출물과 리파아제에 대한 저해활성이 있는 호박추출물의 생산 및 분리 방법과 이를 이용한 비만 및 당뇨 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 아밀라아제에 대한 저해활성이 있는 율무 추출물의 열수를 이용한 생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 율무추출물에서 저해 활성물질을 분리하는 방법과 리파아제에 대한 저해활성이 있는 호박추출물의 열수를 이용한 생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 호박추출물에서 저해 활성물질을 분리하는 방법을 이용하여 장내 탄수화물과 지방 분해효소인 아밀라아제와 리파아제의 활성을 저해함으로써 비만인의 체중 조절용 조성물과 당뇨환자의 혈당증가를 억제하는 조성물에 관한 것이다.
종래의 비만 개선에는 원푸드 다이어트나 단식 등의 무리한 방법을 사용함으로써 신진대사 이상과 요요현상 등의 부작용이 발생하기도 하며 식품으로 안전성이 입증되지 않은 천연물을 무절제하게 남용하여 간, 위, 신장 등에 무리가 가게 함으로써 심각한 건강상의 위험을 일으키기도 하였다
따라서 전체 영양소의 섭취를 제한하는 기존에 사용되는 식이요법이나 식이섬유를 이용한 장 청소효과를 주된 기작으로 하는 다이어트 제품은 적합하지 못하므로, 다른 필수적인 무기이온 및 단백질 등의 흡수저해 없이 탄수화물과 지방의 흡수만을 저해할 수 있는 차별화된 방법의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 장내 소화 효소인 아밀라아제와 리파아제의 활성을 억제하는 율무와 호박의 추출물이 탄수화물과 지방의 소화 흡수를 직접적으로 억제하여 비만 및 당뇨 질환의 개선 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 탄수화물과 지방의 최종 체내 흡수를 억제함으로써 비만의 예방및 치료에 이용할 수 있는 기능성 원료로서 비만 및 당뇨인의 삶의 질을 크게 향상시킬 수 있다.
본 발명의 목적은 탄수화물 분해효소에 대한 저해능이 있는 율무의 추출물과 지방 분해효소에 대한 저해능이 있는 호박의 추출물을 열수와 유기용매를 이용하여 구하고 그 추출액으로부터 저해활성물질을 순수 분리하는 방법과 이를 이용한 조성물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 추출물을 포함하는 비만 개선용 또는 혈당 조절용 조성물을 제공하는 것이다.
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상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아밀라아제를 저해하는 율무의 성분을 추출하고 분리하는 방법을 제공한다.
또한, 리파아제를 저해하는 호박의 성분을 추출하고 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 유효성분을 함유하는 비만 및 혈당 조절용 약학 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 유효성분을 함유하는 식품 및 음료 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 아밀라아제를 저해하는 물질을 율무로부터 추출하고 추출물로부터 활성물질을 분리하는 방법을 제공한다.
상기 분리방법은
1) 아밀라아제를 표적 효소로 사용하여 이를 저해하는 율무의 연수 추출물을 생산하는 단계 ;
2) 상기 율무의 열수 추출물을 감압농축, 원심분리, 한외여과 방법을 이용하여 농축한 후에 음이온 교환수지가 충진 된 컬럼을 통과시켜 분리하는 단계 ; 및
3) 상기 저해물질을 함유하는 음이온 교환수지 통과 시료를 젤 거르기 컬럼을 통과시켜 분리하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 리파아제를 저해하는 물질을 호박으로부터 추출하고 추출물로부터 활성물질을 분리하는 방법을 제공한다.
상기 분리방법은
1) 리파아제를 표적 효소로 사용하여 이를 저해하는 호박의 열수 추출물을 생산하는 단계;
2) 상기 호박의 열수추출물을 농축하고 에틸아세테이트를 이용하여 추출하는 단계 ;
3) 상기 저해물질을 함유하는 에틸아세테이트 시료를 실피카겔 칼럼 크로마토그라피와 알피-18 칼럼 크로마토그라피를 이용하여 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 표적 단백질로 사용된 아밀라아제와 리파아제는 돼지뿐만 아니라 랫트, 마우스, 기니아피그, 토끼 또는 사람 및 사람 유래 세포주로부터 분리될 수 있으며, 이들 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물에 발현된 것일 수 있다.
율무추출물의 저해활성은 디 니트로살리실릭 산(3,5-dinitrosalicylic acid)을 이용하는 방법으로 저해정도를 확인하였다.
호박추출물의 저해활성은 트리올레인에서 방출되는 올레인산의 방출율로 측정하였다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 유효성분을 함유하는 탄수화물과 지방 흡수 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물을 이용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이, 엘릭서, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 및 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 포장 분말 등의 형태일 수 있다.
적당한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 알긴산염, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥내 또는 근육내를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 정제된 율무 추출물의 통상적인 1일 투여량은 5 내지 30 mg/kg 체중, 바람직하게는 10 내지 20 mg/kg 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
그러나 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 선택된 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 증상의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
아울러, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 유효성분을 함유하는 식품 및 음료 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 및 음료 조성물은 체내에서 탄수화물과 지방의 분해를 억제하므로 혈당량 조절, 비만 억제 등을 통하여 건강을 유지 및 향상시킬 수 있다.
본 발명은 당뇨병 등의 예방 및 치료 효과를 나타낼 목적으로, 또는 비만 개 선을 위한 다이어트 원료로서 과도한 탄수화물과 지방의 흡수에 기인한 질환에 대하여 효과가 있는, 예를 들어 식품 또는 음료에 첨가제 또는 식품 보조제로서 혼입될 수 있다. 상기 식품 또는 음료로는, 육류; 야채 쥬스 (예를 들어, 당근 쥬스 및 토마토 쥬스) 및 과일 쥬스 (예를 들어, 오렌지 쥬스, 포도 쥬스, 파인애플 쥬스, 사과 쥬스 및 바나나 쥬스); 초롤렛; 스넥류; 과자류; 피자; 빵, 케익, 크래커, 쿠키, 비스킷, 누들 등과 같이 곡물 분말로 만들어진 식품류; 껌류; 우유, 치즈, 요구르트 및 아이스크림과 같은 유제품; 스프; 육즙; 페이스트, 케찹 및 쏘스; 차; 알콜성 음료류; 탄산 음료류; 비타민 복합체, 및 다양한 건강 식품류 등이 있다. 이 경우, 식품 또는 음료 중 율무와 호박 추출물의 함량은 0.5 내지 5 중량%, 바람직하게는 1 내지 2 중량%의 범위일 수 있으나 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
＜실시예 1＞율무로부터 열수를 이용한 저해활성 물질의 추출
율무 100g을 밀봉한 상태의 용기에서 95℃의 열수 1 liter를 이용하여 2시간 가열하여 추출하였다. 열수 추출 후 추출액의 상층액 100ml를 취하여 저해 시료로 이용하였다.
저해시료의 저해활성 확인은 3,5-디니트로살리실릭 산(3,5-dinitrosalicylic acid, 이하 DNS)을 이용하는 방법을 사용하였다(이하 DNS법). DNS 발색 시약의 제조는 1g의 DNS 시약을 20ml의 2M 수산화나트륨 용액에 녹이고 30g의 소디움 포타시움 타트레이트 테트라하이드레이트를(sodium potassium tartrate tetrahydrate) 천천히 가하여 녹인 후 증류수를 이용하여 최종 볼륨이 100ml이 되도록 맞춘다. 효소의 기질로서 수용성전분을 50mM 생리식염이 포함된 pH 6.9의 0.02M 인산염 완충액에 1%의 농도가 되도록 용해하여 사용하였다. 검량선 작성을 위해서는 글루코오스 용액을 이용하여 작성하였다. 효소 저해제의 활성을 정량하기 위하여 양성 대조군으로 기질 1%, 50 mM (인산염완충액), 효소 (0.2 unit), 증류수를 포함하며 반응용량은 2 ㎖로 37℃에서 20분간 반응시켰다. 효소 저해제의 검사는 기질 1%, 50 mM(인산염완충액), 효소 (0.2 unit), 천연물 추출액, 증류수를 포함하며 반응용량은 2 ㎖로 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응이 종료된 후에는 100℃에서 반응을 종료하였다. 발색 반응을 위하여 상기에 제조된 DNS 시약 1ml를 가한 후에 100℃ 5분간 반응 후 식힌 후에 10ml의 증류수를 가하고 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정은 96 웰 마이크로플레이트에서 ELISA 판독기로 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
저해제의 분리는 율무 1kg을 10 리터의 증류수를 가하여 95℃의 온도에서 2시간 정도 열수 추출하였다. 열수 추출액에서 저해 물질의 활성을 확인 후에 율무의 열수 추출물은 50℃에서 감압농축 하였으며 원심분리하여 고형분을 제거하였다. 원심분리 후에 분자량 10만의 컷오프 크기를 갖는 한외여과막을 이용하여 분자량 10만 이하의 저당류를 제거하였다. 한외여과 후에는 이온교환 컬럼 크로마토그라피를 수행하였다. 이온교환 수지는 아머샴바이오사이언스사(Amersham-Biosciences)의 세파로스 큐 (Shepharose Q FF) 수지를 사용하였으며 300ml의 이온교환 수지를 50X3.5cm의 유리컬럼에 충진 시킨 다음 한외여과를 통과한 활성 농축액을 통과 시켰다. 이온교환 수지를 이용하여 단백질 성분들과 색소성분을 제거하였다. 이온교환 수지를 통과한 활성분획은 아머샴바이오사이언스사(Amersham-Biosciences)의 세파덱스 지-200(G-200) 젤 거르기 컬럼 크로마토그라피를 이용하여 저해 활성물질을 분리 하였다(도 1).
＜실시예 2＞ 율무 추출물의 효소활성 억제 확인
상기 실시예 1로부터 분리·정제된 유효성분이 실제로 아밀라아제의 활성을 억제할 수 있는지의 여부를 확인하기 위해서 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 각각 아밀라아제의 효소활성을 측정하면서 효소반응 시에 유효성분을 1mg/㎖의 농도로 첨가하여 효소의 활성저해 정도를 측정하였다. 아밀라아제에 대한 율무추출물의 활성저해를 비교하기 위해 효소를 첨가하지 않은 대조군과 저해제 미첨가군, 율무 추출물 첨가군을 이용하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 유효성분에 의해 아밀라아제가 약 40%정도의 효소활성이 저해됨을 확인하였다.
＜실시예 3＞ 호박으로부터 열수를 이용한 저해활성 물질의 추출
호박 1kg을 밀봉한 상태의 용기에서 95℃의 열수 10 liter를 이용하여 2시간가열하여 추출하였다. 열수 추출 후 추출액의 상층액 100ml를 취하여 저해 시료로
이용하였다.
저해시료의 저해활성 확인은 트리올레인(triolein)에서 유리되는 올레인산(oleic acid)의 방출율로 측정하였다. 트리올레인(80 mg), 렉틴 (lectin 10 mg), 타우로콜린산(taurocholic acid 5 mg)를 0.1 M NaCl이 첨가된 0.1 M 트리스 완충액 (N-tris(hydroxymethyl)metyl-2-aminoethanesulfaonic acid(TES, pH 7.0)) 9mL에 넣고 5분간 초음파 분쇄하여 준비한 기질 0.15 mL에 0.1 mL 췌장 리파아제(lipase 200 units/mL)와 호박 열수 추출물을 첨가하여 최종 부피가 0.4 mL 되게 하여 37℃에서 30분간 반응하였다.
반응액에 3 mL의 클로로포름:헵탄 (chloroform : heptane, 1:1, 2% MeOH함유)용액을 가하여 10분간 교반 하면서 추출하고, 혼합액을 2000×g에서 20분간 원심분리하여 상층액은 버리고 하층의 유기용매층에 1 mL 구리용액을 첨가한 후 10분간 교반하고 다시 2000×g에서 20분간 원심분리 하였다.
추출된 유리 지방산의 구리염이 함유되어 있는 용매층 0.5 mL에 0.1% 바쏘쿠프린(bathocuprine)과 0.05% 아니솔(3-(2)-tert-butyl-4-hydroxy-anisol(BHA))을 녹인 클로로포름 용액을 0.5 mL 첨가 후, 이 혼합액을 720nm에서 흡광도( EL-800, Bio-TEC instruments, INC. Korea)를 구하였다.
저해제의 분리는 호박 열수 추출물과 에틸아세테이트를 4 : 1의 비율로 혼합한 후 2시간 교반하여 추출하였다. 에틸아세테이트 추출액은 감압농축기(N-1000, EYELA, Japan)를 이용하여 50℃에서 감압 농축하였으며 농축 후 소량의 에틸아세테이트에 녹여서 회수하였다. 회수된 활성농축액은 크로마토그라피법을 이용하여 분리 정제하였다.
실리카겔(silica gel 60, Merck) 500 mL를 60×4 cm의 유리 칼럼에 충진 후 에틸아세테이트로 평형 시킨 다음 소량의 에틸아세테이트에 녹인 활성 시료를 가한 후 에틸아세테이트와 메탄올을 이용하여 용출하였다. 각 분획은 농축한 후에 메탄올에 녹인 다음 췌장 리파아제 활성을 측정하였다. 리파아제 활성 저해가 나온 분획은 농축하여 알피-18(Linchioprep RP-18, Merck) 칼럼 크로마토그라피의 시료로 이용하였다.
알피-18 칼럼 크로마토그라피는 소량의 활성 시료를 가한 후 증류수와 메탄올을 이용하여 용출 하였으며 활성 분획을 확인하였다(도 3).
＜실시예 4＞ 호박 추출물의 효소활성 억제 확인
상기 실시예 3으로부터 분리·정제된 유효성분이 실제로 리파아제의 활성을 억제할 수 있는지의 여부를 확인하기 위해서 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 각각 리파아제의 효소활성을 측정하면서 효소반응 시에 유효성분을 1mg/㎖의 농도로 첨가하여 효소의 활성저해 정도를 측정하였다. 리파아제에 대한 호박추출물의 활성저해를 비교하기 위해 효소를 첨가하지 않은 대조군과 저해제 미첨가군, 호박추출 물 첨가군을 이용하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 유효성분에 의해리파아제가 약 25%정도의 효소활성이 저해됨을 확인하였다
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 아밀라아제에 대한 글루코엑스는 열수를 이용하여 안전하게 대량으로 생산이 가능하여 매우 경제적일 뿐만 아니라 다른 필수적인 무기이온 및 단백질 등의 흡수 저해 없이 탄수화물의 흡수만을 효과적으로 저해함으로써 혈당조절을 통한 당뇨 질환 및 비만의 개선 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (7)

  1. 율무와 호박의 열수추출물로부터 유효성분을 분리하는 단계를 포함하는 아밀라아제와 리파아제에 대한 저해 활성이 있는 저해제를 생산하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서 아밀라아제와 리파아제 단백질이 돼지 소장, 랫트, 마우스, 기니아픽, 토끼 또는 사람 및 사람 유래 세포주로부터 분리한 것 또는 재조합 미생물에 의해서 발현되거나 화학적으로 합성된 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 율무와 호박으로부터 직접 유기용매를 이용하여 저해활성 물질을 추출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 유효성분을 함유하는, 탄수화물과 지방 흡수 억제용 약학 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 비만 또는 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 유효성분을 함유하는 식품 및 음료 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 당뇨와 비만 방지 또는 개선에 사용되는 것을 특징으로 하는 식품 및 음료 조성물.
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