CN113008640A - 基于微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的前处理方法 - Google Patents
基于微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的前处理方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113008640A CN113008640A CN202110219751.2A CN202110219751A CN113008640A CN 113008640 A CN113008640 A CN 113008640A CN 202110219751 A CN202110219751 A CN 202110219751A CN 113008640 A CN113008640 A CN 113008640A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ginsenoside
- methanol
- pretreatment
- detection
- microfluidic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- PWAOOJDMFUQOKB-WCZZMFLVSA-N ginsenoside Re Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2[C@H]3C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]3(C)[C@@H]3[C@@]([C@@]4(CC[C@@H]([C@H]4[C@H](O)C3)[C@](C)(CCC=C(C)C)O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C)(C)C2)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O PWAOOJDMFUQOKB-WCZZMFLVSA-N 0.000 title claims abstract description 47
- AOGZLQUEBLOQCI-UHFFFAOYSA-N ginsenoside-Re Natural products CC1OC(OCC2OC(OC3CC4(C)C(CC(O)C5C(CCC45C)C(C)(CCC=C(C)C)OC6OC(CO)C(O)C(O)C6O)C7(C)CCC(O)C(C)(C)C37)C(O)C(O)C2O)C(O)C(O)C1O AOGZLQUEBLOQCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 47
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 title claims description 30
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 186
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 32
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims abstract description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 46
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 38
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 37
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 claims description 34
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 claims description 33
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 claims description 33
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 claims description 33
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims description 10
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 9
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 47
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 19
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 abstract description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 66
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 24
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 description 17
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 15
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 4
- 229930182494 ginsenoside Natural products 0.000 description 4
- 229940089161 ginsenoside Drugs 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 240000004371 Panax ginseng Species 0.000 description 1
- 235000002789 Panax ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 238000000944 Soxhlet extraction Methods 0.000 description 1
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 description 1
- YURJSTAIMNSZAE-UHFFFAOYSA-N UNPD89172 Natural products C1CC(C2(CC(C3C(C)(C)C(O)CCC3(C)C2CC2O)OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C)(C)C2C1C(C)(CCC=C(C)C)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O YURJSTAIMNSZAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005456 alcohol based solvent Substances 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 239000012296 anti-solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- FIMJSWFMQJGVAM-UHFFFAOYSA-N chloroform;hydrate Chemical compound O.ClC(Cl)Cl FIMJSWFMQJGVAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 1
- 150000002212 flavone derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- YURJSTAIMNSZAE-HHNZYBFYSA-N ginsenoside Rg1 Chemical compound O([C@@](C)(CCC=C(C)C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@]([C@@]3(C[C@@H]([C@H]4C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3C[C@H]2O)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)C)(C)CC1)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YURJSTAIMNSZAE-HHNZYBFYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000011344 liquid material Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004452 microanalysis Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- KVNYFPKFSJIPBJ-UHFFFAOYSA-N ortho-diethylbenzene Natural products CCC1=CC=CC=C1CC KVNYFPKFSJIPBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- -1 saponins compound Chemical class 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 1
- 150000003648 triterpenes Chemical class 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/34—Purifying; Cleaning
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N21/643—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" non-biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
本发明属于微流控免疫芯片快速检测应用领域，具体涉及一种基于微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的前处理分析方法。人参皂苷Re前处理供试品溶液经甲醇溶液超声处理，过滤即得；再结合微流控人参皂苷Re免疫芯片进行荧光快速检测。本发明提供一种比药典更简单样品前处理提取方法，仅需甲醇超声15‑45min，前处理后的样品检测速度快，大大提高了检测效率。有机试剂用量仅需几毫升，对环境污染少，无需昂贵的耗材和精密仪器，检测成本大大减低。
Description
技术领域
本发明涉及中药成分检测技术领域，具体涉及一种基于微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的前处理方法。
背景技术
近些年来，随着中医药现代化和人们对健康意识的不断提升，中药材和中药饮片质量的有效性和安全性受到普遍关注。目前，针对中药材的质量和安全性评价应用最多的仍是基于仪器分析的技术手段，如高效液相色谱、气相色谱、质谱、色谱-质谱联用技术等。仪器分析具有灵敏度高、精密度高、重现性好、易于标准化等优点，但样品前处理繁琐、操作复杂、使用有机试剂耗材多、耗时长、检测成本高、无法满足简单快速低成本的检测要求。
免疫检测技术具有样品量小，操作简单，检测快速，检测成本低廉，高通量及易于现场化等优点。目前在中药领域应用较多有免疫检测有酶联免疫 ELISA法和胶体金检测法，但酶联免疫ELISA法免疫反应操作繁琐，需要多次孵育、耗时、专业性强等，胶体金检测稳定性、准确度差等。酶联免疫和胶体金这两者都不能满足现场快速化检测。微流控免疫芯片是集微流控技术与免疫反应于一体的生物芯片，该芯片具有高效、快速地完成各种微分析检测，并具有试剂用量少、成本低和环保、快速等优点。近几年，微流控免疫芯片在细胞分析、离子和小分子分析、免疫分析、基因分析和蛋白质分析鉴定等领域得到广泛应用，但目前在中药材有效成分快速检测领域应用较少。
人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎。人参性甘、微苦。归脾、肺、心、肾经。具有大补元气、复脉固脱，补脾益肺等功效，临床上用于体虚欲脱，肢冷脉微，脾虚食少、肺虚喘咳，内热消渴等。主要化学成分包括皂苷类、多糖、挥发油、黄酮、有机酸、蛋白质、维生素以及无机元素等，其中皂苷类化合物为主要化学成分。人参皂苷Re是人参皂苷的重要组成部分，属于四环三萜类的衍生物，易溶于水、甲醇、乙醇，可溶于正丁醇、乙酸、乙酸乙酯，不溶于乙醚、苯等亲脂性有机溶剂。目前，人参的含量主要采用2020版《中国药典》方法样品前处理方法，用HPLC检测人参皂苷Rg1、 Re和Rb1但该方法人参前处理供试品溶液制备复杂，需要三氯甲烷索式提取，挥干、加饱和正丁醇溶液过夜净置，然后超声提取，过滤、再挥干，再用甲醇复溶并定容，最后进液相检测。此过程相当复杂，操作过程人为误差较大。并需要大量的三氯甲烷、饱和正丁醇和甲醇等试剂，不仅对环境污染大，而且对操作人员身体健康不利。并需要一个固定的分析实验室及昂贵的高效液相设备，不适合现场即时的大批量样品的快速检测。
在研究微流控免疫芯片检测人参皂苷Re过程中，如采用2020版《中国药典》提供的样品前处理方法不仅制备过程复杂、试剂耗材用量大，且对环境污染大，因此有必要研究一种基于微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re前处理方法。
发明内容
鉴于此，本发明提供一种基于微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的前处理方法，解决现有技术传统前处理方法过程复杂、对环境污染大等问题。
本发明提供的技术方案如下：
一种基于微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的前处理方法，将人参粉末经醇溶液超声处理后，取滤液得处理后样品；所述醇溶液包括甲醇。
进一步地，按质量体积比g/ml计，所述人参粉末与醇的比例为1：(8-30)。
进一步地，所述醇溶液为甲醇，或甲醇的混合醇溶液，混合醇溶液中包含乙醇和/或正丁醇。
进一步地，所述超声条件为250W、50kHz，时间为15-45min。
本发明还提供一种微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的方法，包括以下步骤：
S1.取干人参粉碎，过筛得粉末；
S2.取人参粉末加醇溶液，超声提取；
S3.过滤，取续滤液采用微流控免疫芯片法进行荧光检测；
所述醇溶液包括甲醇。
进一步地，按质量体积比g/ml计，所述人参粉末与醇的比例为1：(8-30)。
进一步地，所述醇溶液为甲醇，或甲醇的混合醇溶液，混合醇溶液中包含乙醇和/或正丁醇。
进一步地，所述超声条件为250W、50kHz，时间为15-45min。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
本发明的人参皂苷Re前处理提取方法操作简单，人参样品和有机试剂使用量少，耗时短，样品前处理简单便捷，同时采用人参皂苷Re微流控免疫芯片进行荧光检测，此检测方法速度快、高效、样品前处理溶液仅需几毫升，试剂耗量大大减少，该方法不仅绿色环保，还大大降低检测成本，适合大工业生产中大批量样品的即时检测。
附图说明
图1为本发明人参皂苷Re微流控检测法定量标准曲线。
图2为本发明荧光检测图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
本发明提出一种基于微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的前处理方法，将人参粉末经醇溶液超声处理后，取滤液得处理后样品。所述醇溶液包括甲醇，优选甲醇，或甲醇与乙醇和/或正丁醇的混合醇溶液。
其中，按质量体积比g/ml计，所述人参粉末与醇的比例为1：(8-30)。
优选地，所述超声条件为250W、50kHz，时间为15-45min。
本发明还提出的一种微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的方法，包括以下步骤：
1.取干人参粉碎，过筛得粉末；
2.取人参粉末加醇溶液，超声提取；
3.过滤，取续滤液采用微流控免疫芯片法进行荧光检测；
所述醇溶液包括甲醇，还可以根据实际情况添加其他的醇类，如甲醇与乙醇，或甲醇和乙醇，或甲醇和正丁醇，或甲醇和乙醇和正丁醇的混合溶液。
本发明中，按质量体积比g/ml计，所述人参粉末与醇的比例优选为1： (8-30)。
所述超声条件为功率250W，频率50kHz，时间优选为15-45min。
本发明中使用醇溶剂除甲醇之外，可添加的醇类包括但不限于乙醇、正丁醇等醇类。
以下实施例中的人参样品粉末来自同一批次。
实施例1
本实施例提供了2020版《中国药典》人参样品前处理方法，具体按照如下操作进行：
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流3小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100ml锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇50ml，密塞，放置过夜，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例2
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇10ml，料液比为1：10，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例3
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加水饱和正丁醇50ml，料液比为1： 50，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例4
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇50ml，料液比为1：50，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例5
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加乙醇50ml，料液比为1：50，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例6
取本品粉末(过四号筛)约2g，精密加甲醇10ml，料液比为1：5，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例7
取本品粉末(过四号筛)约0.25g，精密加甲醇10ml，料液比为1：40，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例8
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇10ml，料液比为1：10，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)60min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例9
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇10ml，料液比为1：10，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)10min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例10
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇10ml，密塞，超声处理(功率 250W，频率50kHz)15min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例11
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇10ml，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)45min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例12
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇和正丁醇溶剂各10ml，配成混合溶液，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例13
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇5ml，正丁醇5ml，混合溶液，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例14
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇5ml，正丁醇5ml，乙醇5ml，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例15
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇10ml，乙醇10ml，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例16
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇10ml，乙醇10ml，正丁醇10ml，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例17
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇8ml，密塞，超声处理(功率 250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例18
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇35ml，密塞，超声处理(功率 250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例19
本实施例在药典人参皂苷前处理方法的基础上，减少了三氯甲烷除杂的，目的在于观察减少除杂过程对微流控检测结果的影响，具体按照如下操作进行：
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加水饱和正丁醇50ml，密塞，放置过夜，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
实施例20
本实施例在实施例19基础上，减少了放置过夜过程，目的在于观察过夜静置过程对微流控检测结果的影响，具体按照如下操作进行：
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加水饱和正丁醇50ml，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。
对比例1
本对比例提供了2020版《中国药典》人参皂苷前处理方法，具体按照如下操作进行：
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流3小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100ml锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇50ml，密塞，放置过夜，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得前处理溶液。采用2020版《中国药典》HPLC法进行人参皂苷Re含量检测。
对比例2
本对比例使用实施例2的前处理方法进行前处理：
取本品粉末(过四号筛)约1g，精密加甲醇10ml，料液比为1：10，密塞，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，取续滤液，即得。同对比例1采用HPLC法进行人参皂苷Re含量检测。
实验例人参皂苷Re微流控免疫芯片与2020版《中国药典》人参高效液相法对比分析研究
1.人参皂苷Re微流控免疫芯片法检测
实验材料：人参皂苷Re微流控免疫芯片(厦门三优股份有限公司)，微流泵(保定申辰股份有限公司)，荧光集成检测设备(定制集成设备)；人参皂苷Re抗体(中康生物科技有限公司)；二抗(thermofisher)；PBST；移液抢 (大龙兴创实验仪器北京股份有限公司)；甲醇(国药集团化学试剂有限公司)；人参样品；人参皂苷Re对照品(中国食品药品检定研究院)；人参样品(来源于吉林产地)；
人参前处理溶液制备：按照实施例1-20方法对人参样品进行人参皂苷溶液前处理，称样量分别约为1.00g。
实验过程：
(一)微流控快速检测定量标准曲线的建立
a.溶液配制：
(1)2ug/mL Re-Ab一抗溶液配制：吸取2uL Re-Ab(4.11mg/mL)加入至 4mL 1×PBST溶液中，充分混合摇匀，即得使用溶液。
(2)2400ng/mL Re标准品溶液配制：吸取24.4uL Re标品(0.199mg/mL，HPLC标准品)加入至1.2mL 1×PBST溶液中，充分混合摇匀，即得使用溶液。以PBST作为稀释溶剂，以此稀释浓度为2400ng/mL、1200ng/mL、600ng/mL、 300ng/mL、150ng/mL、75ng/mL、37.5ng/mL的人参皂苷Re标准品溶液。
(3)Anit-mouse-Alexa 555IgG二抗溶液配制：吸取4uL Alexa 555原液(棕色瓶子)加入4mL 1×PBST溶液中，混匀即得。
b.含人参皂苷Re标准品一抗溶液配制：
将2ug/ml一抗稀释溶液分别与不同浓度的人参皂苷Re标准品按照1:1混合，并震荡混合均匀，分别标记待用。最后溶液含标准品浓度依次为2400ng/mL、 1200ng/mL、600ng/mL、300ng/mL、150ng/mL、75ng/mL、37.5ng/mL、18.75ng/mL 的一抗标准品溶液。
c.快检操作过程如下：
(1)打开控制器电源、SPM控制器、四通道舵机控温器。
(2)用注射器将1×PBST灌注到快检芯片内，使流道充满液体，并将加液孔槽中的多余液体用纸吸干弃去。
(3)将检测芯片放置于控制阀门下(注意控制阀是否归零，若无，请用软件内“舵机归零”按钮，将其归位)。
(4)将对应的加热模块放置于芯片正上方。
(5)将注射器安装于注射泵上，并将软管连接于检测芯片上，连接前需让软管内充满PBST。
(6)在对应的芯片孔槽池内，依次加入PBST溶液400uL、含人参皂苷Re 标品的一抗溶液400uL和二抗稀释溶液400uL。b.含人参皂苷Re标准品一抗溶液配制：
(7)打开快检系统控制软件——“SPM_SPC注射泵控制器V0.23”，选择对应的串口：注射泵串口选择COM20，控制板串口选择COM16。
(8)点击软件“快检注射泵控制”，进入操作界面，设置参数：
a.“通道数量”改为“2”；b.“步骤一”参数改为“
抽取量： 30μL，抽取时间20s”；c.点击“流速计算”；d.点击“设置”；e.点击“运行”。
(9)微流控芯片自然晾。
(10)在集成荧光检测器上进行荧光拍照及数据处理。
(11)建立人参皂苷Re标准曲线，实验数据如表1所示，人参皂苷Re微流控检测法定量标准曲线如图1所示，荧光检测图谱示意图如图2所示。
表1：Re标准曲线各浓度荧光值
(二)不同实施例前处理溶液微流控芯片法检测
(1)不同实施例前处理溶液样本稀释：分别取50μL不同实施例中药前处理溶液加入10mL PBST溶液中，混匀备用；
(2)含前处理溶液一抗溶液制备：将2μg/ml一抗稀释溶液分别与不同实施例的人参皂苷Re前处理稀释液按照1:1混合，并震荡混合均匀，分别标记待用；
(3)芯片快检法快速荧光检测，荧光检测结果如表2所示；
表2：实施例1-20前处理溶液采用微流控芯片快速荧光检测法与对比例1-2 标准药典方法检测所得人参皂苷Re含量表
2.结果分析：
对比例1为人参样品采用2020版《中国药典》前处理方法HPLC检测人参皂苷Re含量，以对比例1的人参皂苷Re含量为标准值，以回收率为考察指标，回收率计算公式为：回收率％＝芯片法测得Re含量/对比例1标准值含量，回收率范围在80％-120％比较合适。
对比例2前处方法与实施例2一致，但检测方法采用HPLC法检测。对比例2回收率结果为53.13％，比实施例2低，说明甲醇超声提取的溶液不适合HPLC 法检测。HPLC方法对供应品溶质纯度要求高，直接甲醇超声无除杂过程，供应品检测杂质多，检测时峰相互重合，相互影响，故Re含量偏低。微流控免疫检测法利用竞争免疫原理检测，检测灵敏度高并通量高，可直接甲醇超声提取，无需除杂过程。
实施例1为2020版《中国药典》人参样品的人参皂苷Re前处理方法，采用微流控芯片法进行检测，与采用2020版《中国药典》人参样品的人参皂苷Re 检测方法对比例1标准值Re含量比，回收率为98.43％，即实施例1芯片法检测结果与药典法检测结果保持一致，说明芯片法检测人参皂苷Re结果可靠，即该快检方法准确性可靠，故选择微流控芯片法快速检测人参皂苷Re含量。
实施例1、实施例2、实施例19和实施例20主要考察前处理操作过程，实施例1、2、19和20回收率分别为98.43％、103.13％、118.75％和93.75％，即这些前处理提取方法都可以考虑。但实施例1为2020版《中国药典》人参样品的人参皂苷Re前处理方法，操作过程繁琐。实施例19简化实施例1中的三氯甲烷水浴除杂过程，实施例20简化实施例1中除杂和静置过夜的过程。实施例2 前处理方法直接采用甲醇超声提取，无需繁杂的三氯甲烷溶剂水浴除杂，也无需水饱和正丁醇提取。实施例2前处理方法最简便，便于后期快速、移动、现场的检测。与实施例1、实施例19和实施例20相比，故选用最简便的实施例2 前处理方法。
实施例3、实施例4和实施例5主要考察不同溶剂总类(甲醇、乙醇、正丁醇)对其人参Re含量提取的影响。实施例3、实施例4和实施例5液料比同为 1：50，回收率分别为51.56％、60.94％、51.56％，从回收率值上看，实施例4 甲醇溶剂提取，提取效果更高。故选用甲醇为提取溶剂。
实施例2，6，7，16，17，18主要考察料液比对其人参Re含量提取的影响。料液比分别为1：10、1：5、1：40、1：30、1：8和1：35。回收率值分别为 103.13％、156.25％、70.31％、81.25％、118.75％、78.13％。从回收率可以看出，实施例2料液比1：10和实施例16料液比1：30实施例17料液比1：8前处理方法可行。实施例6料液比1：5回收率偏高，故不考虑。实施例7料液比1： 40和实施例18料液比1：35回收率低于80％，故不考虑。故料液比选择范围为 1：8-1：30。
实施例2、实施例8、实施例9、实施例10和实施例11分别考察了提取时间30min、60min、10min、15min、45min，提取时间在60min回收率偏高125.00％偏高、在10min时回收率值65.63％偏低、，故适宜的提取时间为15-45min。
实施例12、13、14、15、16分别考虑不同组合的甲醇、乙醇和正丁醇的混合提取溶剂，回收率均大于80％，故甲醇和乙醇和/或正丁醇均可以考虑。均可以作为专利保护的范围。
故优选地前处理方法为精密称取适量人参粉末，加料液比为1:8-1:30的甲醇溶剂，超声提取15-45min。过滤，取续滤液适量。并且，本发明实施例2前处理方法为人参皂苷Re微流控免疫芯片快检法的最优选。
本发明提供的前处理过程简单，易操作，使用试剂品种少，用量仅需几毫升，对环境和操作人员影响小。原因在于传统药典法HPLC采用色谱法检测，对供试品溶质纯度要求高，直接甲醇超声无除杂过程，检测杂质多，故Re含量偏低。微流控免疫检测法利用竞争免疫原理检测，检测灵敏度高并通量高，可直接甲醇超声提取，无需除杂过程。本发明结合微流控免疫芯片荧光法检测，利用免疫芯片高通量、快速、准确的特点，使人参皂苷Re检测费用大大降低、检测效率大大提高，试剂使用量少，污染小，快速，适合大批量样品快速现场即时检测。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和修改，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的方案和这里示出的实验示例。
Claims (8)
1.一种基于微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的前处理方法，其特征在于，将人参粉末经醇溶液超声处理后，取滤液得处理后样品；所述醇溶液包括甲醇。
2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，按质量体积比g/ml计，所述人参粉末与醇的比例为1：(8-30)。
3.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述醇溶液为甲醇，或甲醇的混合醇溶液，混合醇溶液中包含乙醇和/或正丁醇。
4.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述超声条件为250W、50kHz，时间为15-45min。
5.一种微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.取干人参粉碎，过筛得粉末；
S2.取人参粉末加醇溶液，超声提取；
S3.过滤，取续滤液采用微流控免疫芯片法进行荧光检测；
所述醇溶液包括甲醇。
6.根据权利要求5所述的快速检测人参皂苷Re的方法，其特征在于，按质量体积比g/ml计，所述人参粉末与醇的比例为1：(8-30)。
7.根据权利要求5所述的快速检测人参皂苷Re的方法，其特征在于，所述醇溶液为甲醇，或甲醇与乙醇和/或正丁醇的混合醇溶液。
8.根据权利要求5所述的快速检测人参皂苷Re的方法，其特征在于，所述超声条件为250W、50kHz，时间为15-45min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110219751.2A CN113008640A (zh) | 2021-02-26 | 2021-02-26 | 基于微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的前处理方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110219751.2A CN113008640A (zh) | 2021-02-26 | 2021-02-26 | 基于微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的前处理方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113008640A true CN113008640A (zh) | 2021-06-22 |
Family
ID=76386543
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110219751.2A Pending CN113008640A (zh) | 2021-02-26 | 2021-02-26 | 基于微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的前处理方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113008640A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090086807A (ko) * | 2008-02-11 | 2009-08-14 | 주식회사 비티씨 | 가공 인삼 또는 가공 인삼 추출물의 제조방법 |
| CN105255984A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-01-20 | 延边大学 | 一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法 |
| CN107064383A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-08-18 | 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 | 一种ase‑hplc法测定人参中多种人参皂苷的方法 |
| CN107064343A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-08-18 | 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 | 一种ase‑hplc法测定红参中人参皂苷的方法 |
| CN108107127A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-06-01 | 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 | 一种测定人参中人参皂苷Re含量的方法 |
| CN108152405A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-06-12 | 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 | 一种测定人参中多种人参皂苷的方法 |
| CN111323513A (zh) * | 2020-03-26 | 2020-06-23 | 吉林省长源药业有限公司 | 一种含猪脑提取物制剂中人参皂苷Re含量的检测方法 |
-
2021
- 2021-02-26 CN CN202110219751.2A patent/CN113008640A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090086807A (ko) * | 2008-02-11 | 2009-08-14 | 주식회사 비티씨 | 가공 인삼 또는 가공 인삼 추출물의 제조방법 |
| CN105255984A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-01-20 | 延边大学 | 一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法 |
| CN107064383A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-08-18 | 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 | 一种ase‑hplc法测定人参中多种人参皂苷的方法 |
| CN107064343A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-08-18 | 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 | 一种ase‑hplc法测定红参中人参皂苷的方法 |
| CN108107127A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-06-01 | 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 | 一种测定人参中人参皂苷Re含量的方法 |
| CN108152405A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-06-12 | 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 | 一种测定人参中多种人参皂苷的方法 |
| CN111323513A (zh) * | 2020-03-26 | 2020-06-23 | 吉林省长源药业有限公司 | 一种含猪脑提取物制剂中人参皂苷Re含量的检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 欧阳柳凤: "基于半抗原抗体技术研究人参皂苷在脑组织内的分布", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
| 王秋颖: "人参皂苷的提取与化学转化研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）医药卫生科技辑》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107607649B (zh) | 一种黑骨藤的检测方法 | |
| CN104458993B (zh) | 壮药材滇桂艾纳香hplc指纹图谱的建立方法 | |
| CN105806978B (zh) | 一种用spe‑hplc测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法 | |
| CN106124639A (zh) | 杜仲药材的多成分含量测定方法 | |
| CN106370738B (zh) | 一种美洲大蠊药材的指纹图谱质量测定方法 | |
| CN109142588A (zh) | 一种莲芝消炎胶囊hplc特征图谱及其构建方法和应用 | |
| CN106324167B (zh) | 一种uplc测定黄芪提取物中黄酮类成分的方法 | |
| CN110243986B (zh) | 一种活血消瘿片hplc指纹图谱及其制备方法 | |
| CN113008640A (zh) | 基于微流控免疫芯片快速检测人参皂苷Re的前处理方法 | |
| CN107748211B (zh) | 一种使用深共融溶剂提取测定玛咖中5种玛咖酰胺的方法 | |
| CN103076403B (zh) | 一种治疗下尿路感染胶囊的检测方法 | |
| CN112858550B (zh) | 一种不同厂家和/或相同厂家不同批次银杏叶药物相似度的分析方法 | |
| CN110687224B (zh) | 雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的测定方法 | |
| CN111735900B (zh) | 五灵胶囊中有效成分的检测方法 | |
| CN109374815B (zh) | 一种治疗咳喘胸满药物组合的质量检测方法 | |
| CN113209155A (zh) | 一种排钱草总生物碱提取物及其应用 | |
| CN108037200B (zh) | 一种滋肾宁神丸的质量检测方法 | |
| CN106053685B (zh) | 一种测定乐舒洗液中黄柏碱含量的spe‑hplc法 | |
| CN110187032A (zh) | 一种杜仲药材中松脂醇二葡萄糖苷含量的测定方法 | |
| CN115212255B (zh) | 一种从芍药籽粕中提取鉴定总黄酮的方法 | |
| CN108982684A (zh) | 一种检测和鉴别石格菜的方法 | |
| CN107607665A (zh) | 一种苗药山豆根及其中药制剂质量控制方法 | |
| CN114236034B (zh) | 一种飞龙掌血药材的检测方法 | |
| CN111423481B (zh) | 一种宽叶独行菜的标志物及其制备方法和应用 | |
| CN111323518B (zh) | 一种乌锦颗粒的uplc-pda联合qams的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210622 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |