CN106480156A - 一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产稀有人参皂苷的方法 - Google Patents

一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产稀有人参皂苷的方法 Download PDF

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范代娣
惠俊峰
段志广
米钰
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马晓轩
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    • C12P33/00—Preparation of steroids
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Abstract

本发明公开了一种以二醇组人参皂苷为原料在离子液体中进行酶催化定向转化生产稀有人参皂苷并对其进行分离纯化的新工艺。其具体步骤是将人参皂苷二醇组人参皂苷溶解到离子液体中并投入反应釜中，然后定量加入复合酶制剂，在相应的条件下进行定向转化可得到大量的稀有人参皂苷，收集产物进行纯化得到若干种纯度95%以上的稀有人参皂苷。该工艺稀有人参皂苷产率高，对环境友好，下游纯化工艺相对简单，利于规模生产。

Description

一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产稀有人参皂苷的方法
技术领域
本发明涉及一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产稀有人参皂苷的方法，属于生物化工领域。
背景技术
人参皂苷是五加科人参属植物（人参、西洋参、三七等）的主要药效成分，具有增强免疫、抗肿瘤、抗疲劳、抗缺氧、抗衰老、降血糖等多种药理作用。目前从人参中分离的人参皂苷超过150种，它们大体上可分为两类：常见人参皂苷和稀有人参皂苷，其中常见人参皂苷是指在人参属植物中含量较高、分离纯化相对容易的人参皂苷，主要有原人参二醇型人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd和原人参三醇型人参皂苷Re、Rg1、Rg2等。稀有人参皂苷多为常见人参皂苷脱去部分糖基或侧链结构改变的次级人参皂苷，这些皂苷在人参属植物中含量极低或不存在，主要有人参皂苷Rh1、Rh2、Rh3、Rg3、Rg5、Rg6、Rk1、Rk3、Rh4、F4、CK等。近年来的多项研究表明，稀有人参皂苷在抗肿瘤、增强免疫力、抗疲劳以及清除自由基等生物活性方面较常见人参皂苷具有更高的药理活性。如人参皂苷CK是公认的一种具有良好的生物学活性的潜在的多功能药物，它具有抗过敏、降血糖、抗肿瘤、抗炎，抗衰老及保肝等效果。人参皂苷Rg3具有一定的抗肿瘤效果，这种抗肿瘤效果不仅仅是促进肿瘤细胞的凋亡，还表现出对肿瘤组织新生血管的抑制作用，现在临床上已经有一类新药“人参皂苷”作为肝癌和肺癌的辅助用药进行应用。人参皂苷Rh2也具有良好的抗肿瘤效果和增强免疫力等生物学活性。
随着稀有人参皂苷新的生物活性不断被发现，如何快速、高效的获得稀有人参皂苷成为目前人参皂苷研究的热点之一。目前生产稀有人参皂苷方法主要有化学法（酸、碱水解）、高温裂解法、微生物转化法以及酶催化法等。化学法条件比较苛刻，反应过程不易控制，副产物较多，目标产物收率很低，后处理比较繁琐；高温裂解法耗能，对设备等要求高，反应过程中对母环的破坏较为严重；微生物转化法和酶催化法反应条件温和，专一性较强，属于技术含量较高的两种方法。目前文献报道的能催化转化生成稀有人参皂苷的酶主要有纤维素酶、柚苷酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶等，催化的原料一般为从中药材中提取的混合皂苷，但催化效率不高，很难进行大规模生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产稀有人参皂苷的方法，该方法通过合理选择离子液体介质，使用几种工业化酶的混合配比，酶转化条件控制工艺。
本发明的实现过程如下：
一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产稀有人参皂苷的方法，其将二醇组人参皂苷加至离子液体中，再加入酶制剂进行催化转化，产物经洗涤、萃取、再分离纯化得到稀有人参皂苷；
所述的酶制剂选自纤维素酶、柚苷酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶中任意两种或两种以上组合。
所述稀有人参皂苷为人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh2、人参皂苷CK或原人参二醇。
所述的二醇组人参皂苷含有人参皂苷Ra1、人参皂苷Ra2、人参皂苷Ra3、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc或人参皂苷Rd。
所述的二醇组人参皂苷浓度范围是50g/L~500g/L，含量≥85%。
所述的离子液体选自1-乙基-3-甲基-咪唑醋酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑二乙基磷酸盐、１-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、１-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。
所述反应器的有效容积为50L~500L；催化转化温度为25℃~50℃；反应时间为24h~120h。
产物经离心洗涤后，用有机溶剂萃取获得皂苷，有机溶剂选自乙酸乙酯、正丁醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯、三氯甲烷。所述的再分离纯化工艺为采用工业化制备色谱柱进行梯度洗脱分离。
本发明利用酶制剂在离子液体介质中对二醇组人参皂苷（人参皂苷Ra1、人参皂苷Ra2、人参皂苷Ra3、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd等）进行催化水解，大规模生产稀有人参皂苷。发明人利用离子液体作为反应介质进行稀有人参皂苷的酶促转化，发现其转化效率得到大幅度提高。
具体实施方式
本发明方法主要包括以下四步：（1）原料准备：将二醇组人参皂苷（人参皂苷Ra1、人参皂苷Ra2、人参皂苷Ra3、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd等，含量≥85%）溶解于离子液体中，然后投入可控温反应釜（夹套水浴加热）中，通N2，通气流量为反应釜有效容积量的（50%~200%）/min，持续1min~5min。
（2）酶制剂的制备：取纤维素酶、柚苷酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶中两种或两种以上，以一定的比例组成酶制剂，待反应釜内温度降至常温后投入反应釜中，其中酶的总浓度在50g/L~200g/L之间。
（3）转化反应温度为25℃~50℃，搅拌速度为100rpm~360rpm，在相应的条件下催化反应24h~120h。
（4）转化产物的分离纯化：由于产物稀有人参皂苷不易溶于水，溶于乙酸乙酯、正丁醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯、三氯甲烷等有机溶剂，并且产物转化率较高。可以先将转化液离心过滤后收集沉淀，将沉淀用磷酸缓冲液清洗数次，再加入水与有机溶液不同比例的混合液进行萃取，萃取2~3次后合并收集有机相，减压浓缩至原体积的1/10~1/20，用制备型的色谱柱进行分离纯化。可以得到纯度95%以上的人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh2、人参皂苷CK和原人参二醇四种稀有人参皂苷。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，需要指出的是，以下所有实施例并不以任何方式限定本发明的权利要求和核心内容。
实施例1
将有效容积为50L的反应釜中加入体积为30L离子液体1-乙基-3-甲基-咪唑醋酸盐，再加入1.5kg含量为86.1%的二醇组人参皂苷（杂质主要为多糖），通N2，通气流量为25L/min，持续5min。降温至室温以下后，加入纤维素酶/果胶酶为1:1的酶制剂3kg。保持反应釜温度为25℃，搅拌速度为100rpm，催化反应120h。反应结束后将所有液体放出于容器中静置12h，弃上清，加入磷酸缓冲液洗涤数次，再向沉淀中加入水：乙酸乙酯为2:5的溶液进行萃取，反复萃取2次，收集有机相萃取液，减压浓缩至原体积的1/20。用制备柱进行分离纯化。分离得到四种稀有人参皂苷：人参皂苷Rg3，纯度95.2%；人参皂苷Rh2，纯度95.7%；人参皂苷CK，纯度96.3%；原人参二醇，纯度95.7%，总皂苷转化率为70%。
对比实例：与实施例1类似，不同的是离子液体1-乙基-3-甲基-咪唑醋酸盐用等体积水代替，总皂苷转化率仅为42%。
实施例2
将有效容积为100L的反应釜中加入体积为60L离子液体1-乙基-3-甲基咪唑二乙基磷酸盐，再加入30kg含量为85.3%的二醇组人参皂苷（杂质主要为多糖），通N2，通气流量为200L/min，持续1min。降温至室温以下后，加入纤维素酶/糖化酶为1:1的酶制剂12kg。保持反应釜温度为30℃，搅拌速度为360rpm，催化反应72h。反应结束后将所有液体放出于容器中静置12h，弃上清，加入磷酸缓冲液洗涤数次，再向沉淀中加入水：丁酸乙酯为2:5的溶液进行萃取，反复萃取3次，收集有机相萃取液，减压浓缩至原体积的1/12。用制备柱进行分离纯化。分离得到四种稀有人参皂苷：人参皂苷Rg3，纯度95.5%；人参皂苷Rh2，纯度96.1%；人参皂苷CK，纯度95.9%；原人参二醇，纯度96.0%，总皂苷转化率为70%。
对比实例：与实施例2类似，不同的是离子液体1-乙基-3-甲基咪唑二乙基磷酸盐用等体积水代替，总皂苷转化率仅为45%。
实施例3
将有效容积为200L的反应釜中加入体积为120L离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，再加入24kg含量为88.1%的二醇组人参皂苷（杂质主要为多糖），通N2，通气流量为160L/min，持续4min。降温至室温以下后，加入柚苷酶/果胶酶酶为1:1的酶制剂36kg。保持反应釜温度为37℃，搅拌速度为180rpm，催化反应48h。反应结束后将所有液体放出于容器中静置12h，弃上清，加入磷酸缓冲液洗涤数次，再向沉淀中加入水：乳酸乙酯为2:5的溶液进行萃取，反复萃取2次，收集有机相萃取液，减压浓缩至原体积的1/15。用制备柱进行分离纯化。分离得到四种稀有人参皂苷：人参皂苷Rg3，纯度95.7%；人参皂苷Rh2，纯度95.4%；人参皂苷CK，纯度96.2%；原人参二醇，纯度95.3%，总皂苷转化率为75%。
对比实例：与实施例3类似，不同的是离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐用等体积水代替，总皂苷转化率仅为46%。
实施例4
将有效容积为300L的反应釜中加入体积为180L离子液体１１-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，再加入54kg含量为89.0%的二醇组人参皂苷（杂质主要为多糖），通N2，通气流量为300L/min，持续3min。降温至室温以下后，加入纤维素酶/淀粉酶为1:1的酶制剂54kg。保持反应釜温度为42℃，搅拌速度为200rpm，催化反应24h。反应结束后将所有液体放出于容器中静置12h，弃上清，加入磷酸缓冲液洗涤数次，再向沉淀中加入水：正丁醇为2:5的溶液进行萃取，反复萃取3次，收集有机相萃取液，减压浓缩至原体积的1/18。用制备柱进行分离纯化。分离得到四种稀有人参皂苷：人参皂苷Rg3，纯度95.1%；人参皂苷Rh2，纯度96.4%；人参皂苷CK，纯度96.1%；原人参二醇，纯度95.4%，总皂苷转化率为75%。
实施例5
将有效容积为500L的反应釜中加入体积为300L离子液体１-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，再加入120kg含量为89.6%的二醇组人参皂苷（杂质主要为多糖），通N2，通气流量为750L/min，持续2min。降温至室温以下后，加入果胶酶/纤维素酶为1:2的酶制剂60kg。保持反应釜温度为50℃，搅拌速度为300rpm，催化反应60h。反应结束后将所有液体放出于容器中静置12h，弃上清，加入磷酸缓冲液洗涤数次，再向沉淀中加入水：三氯甲烷为2:5的溶液进行萃取，反复萃取3次，收集有机相萃取液，减压浓缩至原体积的1/10。用制备柱进行分离纯化。分离得到四种稀有人参皂苷：人参皂苷Rg3，纯度95.6%；人参皂苷Rh2，纯度95.1%；人参皂苷CK，纯度95.5%；原人参二醇，纯度96.0%，总皂苷转化率为75%。

Claims (9)

1.一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产稀有人参皂苷的方法，其特征在于：将二醇组人参皂苷加至离子液体中，再加入酶制剂进行催化转化，产物经洗涤、萃取、再分离纯化得到稀有人参皂苷；
所述的酶制剂选自纤维素酶、柚苷酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶中任意两种或两种以上组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述稀有人参皂苷为人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh2、人参皂苷CK或原人参二醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的二醇组人参皂苷含有人参皂苷Ra1、人参皂苷Ra2、人参皂苷Ra3、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc或人参皂苷Rd。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的二醇组人参皂苷浓度范围是50g/L~500g/L，含量≥85%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的离子液体选自1-乙基-3-甲基-咪唑醋酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑二乙基磷酸盐、１-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、１-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：反应所用反应器的有效容积为50L~500L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的催化转化温度为25℃~50℃；反应时间为24h~120h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：产物经离心洗涤后，用有机溶剂萃取获得皂苷，有机溶剂选自乙酸乙酯、正丁醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯、三氯甲烷。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的再分离纯化工艺为采用工业化制备色谱柱进行梯度洗脱分离。
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