CN105925654A - 一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产人参皂苷ck的方法 - Google Patents

一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产人参皂苷ck的方法 Download PDF

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段志广
惠俊峰
米钰
马沛
朱晨辉
李伟娜
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Abstract

本发明涉及一种以二醇组人参皂苷为原料酶催化定向转化生产CK并对其进行分离纯化的新工艺。其具体步骤是将人参皂苷二醇组人参皂苷溶解到去离子水并投入发酵罐中，通N2保护后在线灭菌，然后定量加入复合酶，和催化量的Keggin结构的杂多酸HxYW12O40·nH2O催化剂，其中Y选自P、Si、Fe或Zn，x为3或4，n为0‑30的正整数，在相应的条件下进行定向转化得到大量的CK产物，收集产物进行纯化得到纯度为90%以上的CK。在线灭菌条件通N2保护后，121℃，20min。上述的复合酶为果胶酶、纤维二糖酶以不同比例混合酶。本发明方法产率高，对环境友好，后处理简单，为工业化生产奠定基础。

Description

一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产人参皂苷 CK 的方法
技术领域
本发明涉及一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产人参皂苷CK的方法，属于生物化工领域。
背景技术
人参（Ginseng）作为一种中草药，在亚洲地区已经被使用了数千年，其主要的功能是强身健体，延年益寿。人参皂苷是人参中标志性活性成分之一，目前从人参的根、叶、茎和花中发现的人参皂苷有150多种，其中大部分都具有生物活性，包括抗肿瘤、抗衰老、改善记忆、抗炎及保肝等功效。然而在人参中含有的大量天然皂苷（Rb1、Rg1、Re、R1、Rd）很难被吸收，需要经过肠道微生物进行消化，才能被肠道吸收。研究表明，皂苷被转化成去糖皂苷可以增加其在体内的生理学活性。近些年，科学家通过一系列体内和体外实验证明去糖皂苷compoundK（CK）存在多样的药用价值，例如抗过敏、抗糖尿病、抗癌、抗炎症，抗衰老及保肝等效果。由于其具有很高的安全性和疾病治疗功能，CK被认为是一种潜在的具有多功能的药物。
由于CK具有显著的药物活性及易于体内吸收等优点，而人参中又不存在CK这种稀有皂苷，因此如何利用原始皂苷转化生产CK成为研究重点。目前报道的生产CK的方法主要有酸、碱处理法、高温裂解法、微生物转化法以及酶生物催化法。但酸、碱处理条件比较苛刻，后处理比较繁琐，高温裂解法耗能，对设备等要求高，微生物转化法中大部分微生物属于厌氧菌，培养条件苛刻等缺点的存在，而由于酶生物催化法具有温和、高效、专一性、反应条件简单等特点被认为是目前较理想的生产方式。目前文献报道的能催化转化生成CK的酶主要有β-糖苷酶、柚皮苷酶、纤维素酶、果胶酶等。但都是以单一酶形式进行催化反应，催化的原料一般为从中药材中提取的混合皂苷，催化效率低，不能进行大规模放大生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产人参皂苷CK的方法。
本发明的实现过程如下：
一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产人参皂苷CK的方法，包括如下步骤：将二醇组人参皂苷和缓冲液投入发酵罐中，并通N2保护，经在线灭菌后加入复合酶和催化量的Keggin结构的杂多酸HxYW12O40·nH2O催化剂，其中Y选自P、Si、Fe或Zn，x为3或4，n为0-30的正整数，在25~60℃下催化24~120h，最终经分离纯化得到目标产物。
上述的二醇组人参皂苷浓度为50 ~500g/L；所述的缓冲液为磷酸缓冲液或醋酸缓冲液，pH为3~10。
上述的复合酶为果胶酶、纤维二糖酶以1:9~9:1酶活比例混合，酶浓度为50 ~500g/L。
上述的分离纯化是离心收集沉淀，然后用有机溶剂萃取得到皂苷。
上述的灭菌温度为121℃，时间为20min，且加热前通N2进行保护。
上述的通N2的流速为发酵罐有效容积量的50 ~200%/min，时间1~5min。
一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产人参皂苷CK的方法，具体包括如下步骤：
（1）原料准备：将含量>85%的二醇组人参皂苷溶解于醋酸或磷酸缓冲液，控制溶液pH为3~10，然后投入全自动发酵罐中，通N2，通气流量为50L/min，持续5min，然后停止通气开始加热在线灭菌，灭菌条件为121℃，维持20min；
（2）复合酶的制备：将果胶酶与纤维二糖酶以1:9~9:1的酶活比例混合，溶解于含0.1~50mM的Zn2+离子的醋酸或磷酸缓冲液中，其中酶的总浓度在50~500g/L之间；
（3）待发酵罐内温度降至常温，向发酵罐内投入准备好的复合酶液，和催化量的Keggin结构的杂多酸HxYW12O40·nH2O催化剂，其中Y选自P、Si、Fe或Zn，x为3或4，n为0-30的正整数，培养温度为25~60℃，搅拌速度为100~360rpm/min，在相应的条件下催化反应24~120h；
（4）转化产物的分离纯化：将转化液离心过滤后收集沉淀，将沉淀用磷酸缓冲液清洗，再加入水与有机溶液的混合液进行萃取，萃取2~3次后合并收集有机相，减压浓缩至原体积的1/10~1/20，用制备型的色谱柱进行分离纯化。
上述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、正丁醇。
上述方法得到的目标产物可以利用工业化色谱柱对目标产物进行精制纯化。
利用上述方法制备的人参皂苷CK作为原料药制成硬胶囊、软胶囊、片剂、冲剂、滴丸或注射剂。
本发明的积极效果：本发明综合使用有机酸和杂多酸催化剂，催化效果得到大大提升，利用复合酶的形式对二醇组人参皂苷进行催化水解，大规模定向生产CK；转化率高，收率高，纯化工艺简单，生产成本低。
附图说明
图1为人参皂苷Rb1转化为人参皂苷CK的示意图；
图2为人参皂苷CK标准品液相色谱图；
图3为本发明生产得到的人参皂苷CK液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例1
将有效容积为100L的全自动发酵罐中加入体积为60L、 pH为5，含1Mm Ca2+离子的磷酸缓冲液，再加入3kg的纯度为85%的人参皂苷Rb1（杂质为其它类型的人参皂苷或者多糖），通N2，通气流量为50L/min，持续5min，然后停止通气开始加热在线灭菌，灭菌条件为121℃，维持20min。降温至室温以下后，加入果胶酶：纤维二糖酶为6:4的复合酶2kg，和20g杂多酸H3PW12O40·5H2O。保持发酵罐温度为25℃，搅拌速度为200rpm，催化反应96h。反应结束后将所有液体放出于容器中静置12h，弃上清，加入磷酸缓冲液洗涤数次，再向沉淀中加入水：乙酸乙酯为2:5的溶液进行萃取，反复萃取三次，收集有机相萃取液，减压浓缩至原体积的1/10。用制备柱进行分离纯化，得到1.2kg 稀有人参皂苷CK，纯度为90%。
对比实例：与上述制备方法类似，不同的是仅使用有机酸或杂多酸，稀有人参皂苷CK粗品仅能得到不足1.0kg。
实施例2
将有效容积为300L的全自动发酵罐中加入体积为200L、 pH为7，含4mM Ca2+离子的磷酸缓冲液，再加入30kg的纯度为90%的人参皂苷Rd（杂质为其它类型的人参皂苷或者多糖），通N2，通气流量为150L/min，持续5min，然后停止通气开始加热在线灭菌，灭菌条件为121℃，维持20min。降温至室温以下后，加入果胶酶：纤维二糖酶为8:2的复合酶25kg，和10g杂多酸H4SiW12O40·18H2O。保持发酵罐温度为40℃，搅拌速度为200rpm，催化反应120h。反应结束后将所有液体放出于容器中静置12h，弃上清，加入磷酸缓冲液洗涤数次，再向沉淀中加入水：乙酸乙酯为2:5的溶液进行萃取，反复萃取三次，收集有机相萃取液，减压浓缩至原体积的1/15。用制备柱进行分离纯化，得到18kg 稀有人参皂苷CK，纯度为93%。
实施例3
将有效容积为500L的全自动发酵罐中加入体积为300L、pH为9，含5mM Ca2+离子的磷酸缓冲液，再加入30kg的纯度为95%的人参皂苷Rb2（杂质为其它类型的人参皂苷或者多糖），通N2，通气流量为200L/min，持续5min，然后停止通气开始加热在线灭菌，灭菌条件为121℃，维持20min。降温至室温以下后，加入果胶酶：纤维二糖酶为9:1的复合酶30kg，和40g杂多酸H3FeW12O40·28H2O。保持发酵罐温度为50℃，搅拌速度为200rpm，催化反应120h。反应结束后将所有液体放出于容器中静置12h，弃上清，加入磷酸缓冲液洗涤数次，再向沉淀中加入水：乙酸乙酯为2:5的溶液进行萃取，反复萃取三次，收集有机相萃取液，减压浓缩至原体积的1/15。用制备柱进行分离纯化，得到17kg 稀有人参皂苷CK，纯度为96%。
实施例4
将有效容积为100L的全自动发酵罐中加入体积为65L、 pH为6，含20mM Ca2+离子的磷酸缓冲液，再加入5kg的纯度为95%的人参皂苷Rb3（杂质为其它类型的人参皂苷或者多糖），通N2，通气流量为250L/min，持续5min，然后停止通气开始加热在线灭菌，灭菌条件为121℃，维持20min。降温至室温以下后，加入果胶酶：纤维二糖酶为5:1的复合酶3kg，和20g杂多酸H3ZnW12O40·30H2O。保持发酵罐温度为45℃，搅拌速度为200rpm，催化反应96h。反应结束后将所有液体放出于容器中静置12h，弃上清，加入磷酸缓冲液洗涤数次，再向沉淀中加入水：乙酸乙酯为2:7的溶液进行萃取，反复萃取三次，收集有机相萃取液，减压浓缩至原体积的1/20。用制备柱进行分离纯化，得到2.5kg 稀有人参皂苷CK，纯度为90%。
实施例5
将有效容积为200L的全自动发酵罐中加入体积为100L、 pH为7，含10mM Ca2+离子的磷酸缓冲液，再加入15kg的纯度为90%的人参皂苷Ra1（杂质为其它类型的人参皂苷或者多糖），通N2，通气流量为200L/min，持续5min，然后停止通气开始加热在线灭菌，灭菌条件为121℃，维持20min。降温至室温以下后，加入果胶酶：纤维二糖酶为9:1的复合酶20kg，和50g杂多酸H3PW12O40·5H2O。保持发酵罐温度为50℃，搅拌速度为200rpm，催化反应120h。反应结束后将所有液体放出于容器中静置12h，弃上清，加入磷酸缓冲液洗涤数次，再向沉淀中加入水：乙酸乙酯为2:5的溶液进行萃取，反复萃取三次，收集有机相萃取液，减压浓缩至原体积的1/30。用制备柱进行分离纯化，得到7kg 稀有人参皂苷CK，纯度为95%。

Claims (10)

1. 一种酶催化二醇组人参皂苷大规模生产人参皂苷CK的方法，其特征在于：将二醇组人参皂苷和缓冲液投入发酵罐中，并通N2保护，经在线灭菌后加入复合酶和催化量的Keggin结构的杂多酸HxYW12O40·nH2O催化剂，其中Y选自P、Si、Fe或Zn，x为3或4，n为0-30的正整数，在25~60℃下催化24~120h，最终经分离纯化得到目标产物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的二醇组人参皂苷浓度为50 ~500g/L；所述的缓冲液为磷酸缓冲液或醋酸缓冲液，pH为3~10。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的复合酶为果胶酶、纤维二糖酶以1:9~9:1酶活比例混合，酶浓度为50 ~500g/L。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的分离纯化是离心收集沉淀，然后用有机溶剂萃取得到皂苷。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的灭菌温度为121℃，时间为20min，且加热前通N2进行保护。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的通N2的流速为发酵罐有效容积量的50 ~200%/min，时间1~5min。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）原料准备：将含量>85%的二醇组人参皂苷溶解于醋酸或磷酸缓冲液，控制溶液pH为3~10，然后投入全自动发酵罐中，通N2，通气流量为50L/min，持续5min，然后停止通气开始加热在线灭菌，灭菌条件为121℃，维持20min；
（2）复合酶的制备：将果胶酶与纤维二糖酶以1:9~9:1的酶活比例混合，溶解于含0.1~50mM的Zn2+离子的醋酸或磷酸缓冲液中，其中酶的总浓度在50~500g/L之间；
（3）待发酵罐内温度降至常温，向发酵罐内投入准备好的复合酶液，和催化量的Keggin结构的杂多酸HxYW12O40·nH2O催化剂，其中Y选自P、Si、Fe或Zn，x为3或4，n为0-30的正整数，培养温度为25~60℃，搅拌速度为100~360rpm/min，在相应的条件下催化反应24~120h；
（4）转化产物的分离纯化：将转化液离心过滤后收集沉淀，将沉淀用磷酸缓冲液清洗，再加入水与有机溶液的混合液进行萃取，萃取2~3次后合并收集有机相，减压浓缩至原体积的1/10~1/20，用制备型的色谱柱进行分离纯化。
8. 根据权利要求4或7所述的方法，其特征在于：所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、正丁醇。
9. 根据权利要求1至7所述的方法，其特征在于：利用工业化色谱柱对目标产物进行精制纯化。
10. 利用权利要求1所述方法制备的人参皂苷CK作为原料药制成硬胶囊、软胶囊、片剂、冲剂、滴丸或注射剂。
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