CN102584805B

CN102584805B - 天然植物中一个活性成分的制备方法

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Publication number: CN102584805B
Application number: CN201110412171.1A
Authority: CN
Inventors: 袁珂; 王广华; 牛英鹏; 杨中汉; 刘辉鑫
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2011-12-07
Filing date: 2011-12-07
Publication date: 2015-04-01
Anticipated expiration: 2031-12-07
Also published as: CN102584805A

Abstract

本发明提供了一种从天然植物红花芒毛苣苔中分离纯化活性新成分的制备方法。本发明的特点是采用传统提取及色谱分离技术从红花芒毛苣苔中分离纯化新新化合物，包括冷浸提取、闪蒸浓缩、柱色谱分离等，从红花芒毛苣苔中分离得到1个新化合物：5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷。该化合物的提取率为1.1％，纯度达96％以上。本发明具有制备工艺较简单、经济、安全，得率高。无污染等特点。经初步活性研究表明，所制备的该化合物具有一定的抑菌和抗氧化作用，具有很好的开发应用前景。

Description

天然植物中一个活性成分的制备方法

技术领域

本发明属于新化合物及其制备方法技术领域，具体为从红花芒毛苣苔中分离纯化的新化合物的制备方法。

背景技术

天然药物是指自然界中存在的有药理活性的天然产物。随着社会的发展，人们越来越关注化学药品给人类自身健康及生活环境带来的负面影响；回归自然、保护环境已成为一种处理人类和环境关系的潮流思想。对天然药物的研究和开发顺势大力发展，天然药物成为极为重要的药物开发资源。我国拥有丰富的中药材资源，中医药发展前景仍然非常广阔，应大力发展中医药产业。当前，由于从化学合成物中筛选新药的难度越来越大、时间越来越长、投入越来越高，并且化学药物对人体的毒副作用，易产生抗药性和药源性疾病等弱点越来越明显，因此，许多国家转向了天然药物的研究、开发和利用，使其成为继化学药物、生物制剂、基因工程类药品之后最具发展前景的特色产业，中药产业也将成为世界医药产业的重要发展方向之一。世界许多国家在新药开发方面都寄托于天然药物。中国具有世界上最丰富的天然药物资源，据全国中药材资源调查表明，目前我国现有的中药资源种类为12807种，有着广阔的发展前景。随着近年天然药物有效成分提取、分离、纯化及结构研究技术的不断发展和应用，使得天然药物获得更为快速的增长。天然药物作为来自植物的“绿色药品”已受到越来越多消费者的青睐，随着全球崇尚自然热潮的兴起，天然药物必将成为21世纪最受欢迎的药物之一。

红花芒毛苣苔为苦苣苔科芒毛苣苔属植物Aeschynanthus moningeriae(Merr.)，生于山谷林中或溪边石上，海拔800-1200米，为野生海南植物。据文献报道，苦苣苔科植物在全世界有120～140个属，在我国有54个属，其中药用植物有100多种。该科植物中所含的化学成分主要为黄酮类、苯乙醇类、醌类和萜类等，具有显著的抑菌、抗氧化、、抗病毒、抗炎、祛痰止咳等作用。经文献检索，尚未见有对红花芒毛苣苔化学成分进行研究的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种从红花芒毛苣苔中分离制备的新化合物的技术方案，其制备工艺简单，加工制备的成本低、纯度好、收得率高。制得的单体化合物具有较强的抑菌活性和抗氧化活性。

所述的从红花芒毛苣苔中分离纯化的新成分，其特征在于包括以下步骤：

1)原料的处理：取干燥的红花芒毛苣苔，粉碎成粗粉，备用；

2)冷浸提取：将干燥的红花芒毛苣苔用折合红花芒毛苣苔药材干重8倍量的50％～80％含水乙醇进行冷浸提取3次，每次提取12～20小时，合并提取液。

3)闪蒸浓缩：将提取液在水浴温度60～70℃下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩，得到折合每毫升浓缩液含0.5～1.0克原药材的浓缩液；

4)萃取粗分：得到的浓缩液分散到适量的水中，分别用乙酸乙酯、正丁醇萃取。萃取溶剂的用量为浓缩液与萃取溶剂的体积比为1∶1-3，萃取3～5次。分别得到乙酸乙酯、正丁醇萃取部位。将各萃取部位在水浴温度60～70℃下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩，得到各部位的浓缩液；

5)大孔树脂纯化：得到的正丁醇浓缩液通过Diaion HP-20大孔吸附树脂分离富集，先用H₂O洗脱，再依次用10％～70％含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70％丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液。将各含水乙醇部位的洗脱液在60～70℃以下真空闪蒸浓缩、干燥得粉末；

6)柱色谱分离纯化：将上述50％含水乙醇洗脱部位的浓缩干粉溶于少量的水中，通过Sephadex LH-20和MCI-gelCHP-20柱色谱，用水、10％含水乙醇、20％含水乙醇、40％含水乙醇、60％含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70％丙酮洗脱，TLC检识，相同流分合并，从中分离得到为白色粉末的新成分；

所述的从红花芒毛苣苔中分离纯化的新成分，其特征在于所述的新成分为5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷，其结构式为：

上述步骤2)、步骤5)和步骤6)中的含水乙醇换用含水甲醇，也可以得到基本类似的效果。

上述步骤中用H₂O洗脱是为了除去水溶性杂质，最后都用70％丙酮洗脱除掉全部杂质，再生大孔吸附树脂。本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，液体的百分含量为体积比，固体的百分含量为重量比。

所述的一个活性新成分的制备方法，其特征在于步骤2)中：冷浸所用含水乙醇的浓度为55％～70％，优选65％～70％；每次提取时间为15～20小时，优选16～18小时；

所述的一个活性新成分的制备方法，其特征在于步骤4)中：萃取溶剂的用量为浓缩液与萃取溶剂的体积比为1∶1-2；

所述的一个活性新成分的制备方法，其特征在于步骤5)中：先用H₂O洗脱，再依次用10％含水乙醇、20％含水乙醇、40％含水乙醇、60％含水乙醇、70％含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70％丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20％含水乙醇、40％含水乙醇、60％含水乙醇部位的洗脱液；

所述的一个活性新成分的制备方法，其特征在于步骤5)中：先用H₂O洗脱，再依次用10％含水乙醇、25％含水乙醇、45％含水乙醇、65％含水乙醇、70％含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70％丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并25％含水乙醇、50％含水乙醇、65％含水乙醇部位的洗脱液；

所述的一个活性新成分的制备方法，其特征在于步骤5)中：先用H₂O洗脱，再依次用15％含水乙醇、30％含水乙醇、40％含水乙醇、55％含水甲乙醇、70％含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70％丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并15％含水乙醇、30％含水乙醇、45％含水乙醇、55％含水乙醇部位的洗脱液；

所述的一个活性新成分在防氧化、抑菌方面的应用。

本发明具有如下有益效果：该方法制备工艺简单，加工制备的成本低、纯度好、收得率高；制备工艺中不用有毒溶剂、无环境污染，具有经济安全、绿色环保的特点；得到的单体化合物收率较高，化合物5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷的提取率为1.1％，纯度达到96％以上；制备的单体化合物具有明显的抗氧化及抑菌活性，具有很好的开发应用前景，为今后的研究开发奠定了基础。

附图说明

图1为5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷的HR-ESI-MS

图2为5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷的¹H NMR(400MHz)图谱

图3为5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷的¹³C NMR(100MHz)图谱

图4为5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷的DEPT图谱

图5为5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷的¹H-¹H COSY图谱

图6为5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷的HSQC图谱

图7为5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷的HMBC图谱

图1～图7中横坐标代表化学位移。

具体实施方式

现对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明所述的新成分的制备方法包括以下步骤：

2)冷浸提取：将干燥的红花芒毛苣苔用折合红花芒毛苣苔药材干重8倍量的70％含水乙醇进行冷浸提取3次，每次提取16小时，合并提取液。

3)闪蒸浓缩：将提取液在水浴温度60℃下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩，得到折合每毫升浓缩液含1.0克原药材的浓缩液；

4)萃取粗分：得到的浓缩液分散到适量的水中，分别用乙酸乙酯、正丁醇萃取。萃取溶剂的用量为浓缩液与萃取溶剂的体积比为1∶1，萃取4次。分别得到乙酸乙酯、正丁醇萃取部位。将各萃取部位在水浴温度60℃下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩，得到各部位的浓缩液；

5)大孔树脂纯化：得到的正丁醇浓缩液通过Diaion HP-20大孔吸附树脂分离富集，先用H₂O洗脱，再依次用10％含水乙醇、20％含水乙醇、40％含水乙醇、60％含水乙醇、70％含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70％丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20％含水乙醇、40％含水乙醇、60％含水乙醇部位的洗脱液；将各含水乙醇部位的洗脱液在65℃以下真空闪蒸浓缩、干燥得粉末；

6)柱色谱分离纯化：将上述50％含水乙醇洗脱部位的浓缩干粉溶于少量的水中，通过Sephadex LH-20和MCI-gelCHP-20柱色谱，用水、10％含水乙醇、20％含水乙醇、40％含水乙醇、60％含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70％丙酮洗脱，TLC检识，相同流分合并，从中分离得到为白色粉末的新成分。

上述步骤2)中，冷浸提取所用含水乙醇的浓度为55％，65％，75％；每次提取12小时，14小时，18小时，20小时。步骤3)中，水浴温度65℃，70℃；得到折合每毫升0.5克，0.6克，0.8克原药材的浓缩液。步骤4)中，浓缩液与萃取溶剂的体积比为1∶2，为1∶3；萃取3次，5次；水浴温度65℃，70℃。步骤5)中，先用H₂O洗脱，再依次用15％含水乙醇、25％含水乙醇、45％含水乙醇、65％含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70％丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并25％含水乙醇、45％含水乙醇、65％含水乙醇部位的洗脱液。步骤同实施例1，也可以取得本发明所述的有益效果。

所述的“用折合红花芒毛苣苔药材干重8倍量的50％～80％含水乙醇”意思是指：若红花芒毛苣苔药材干重为1kg则50％～80％含水乙醇的用量为8升。

所述的真空薄膜浓缩装置为自行设计组装，所有部件均可从市场上直接购得，具体的组装结构也已经公开过。所述的Diaion HP-20大孔吸附树脂由日本三菱公司生产，可直接购得。所述的MCI gel CHP-20柱色谱填料由日本三菱公司生产，可直接购得。所述的Sephadex LH-20(葡聚糖凝胶)柱色谱填料为Parmacia Bioteck产品，可直接购得。

本发明进行TLC检识的条件：薄层板为0.6％CMC-Na-硅胶GF₂₅₄板，展开剂为乙酸乙酯-甲醇系统及氯仿-甲醇系统，显色剂a：紫外灯(254nm)下观察荧光；显色剂b：2％FeCl₃-2％K₃Fe(CN)₆喷洒，105℃烘烤至显色。

结构鉴定：主要利用光谱技术，包括核磁共振谱(¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC)和质谱分析(HR-ESI-MS)鉴定化合物的结构。

该化合物为白色粉末，遇三氯化铁-铁氰化钾试剂显蓝色。HR-ESI-MS[M+Na]⁺m/z 363.0690(计算值363.0692)，确定化合物分子式为340，结合 ¹³C-NMR及DEPT谱确定化合物的分子式为C₁₅H₁₆O₉。通过光谱技术，确定该化合物为5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷。其¹H NMR(400MHz)、¹³CNMR(100MHz)数据见表1。

表1化合物I的一维及二维氢谱和碳谱波谱数据(400Hz，in CD₃OD)

上述符号说明如下：HR-EMS为高分辨电喷雾电离质谱；ESI-MS为电喷雾电离质谱；¹H-NMR为核磁共振氢谱；¹³C-NMR为核磁共振碳谱；DEPT为无畸变极化转移增强法；¹H-¹H COSY为二维氢氢相关谱，HSQC为二维碳氢直接相关谱；HMBC为二维碳氢远程相关谱；δ为化学位移，单位为ppm；J为偶合常数，单位为Hz；TMS为内标物；CD₃OD为氘代甲醇。

为进一步说明本发明在医药领域中的作用，下面通过部分体外抑菌及抗氧化活性试验来说明。

1、抑菌活性试验结果：

抑菌活性的测定采用琼脂扩散滤纸片法，根据抑菌圈直径判断抑菌能力。滤纸片直径6.0mm，灭菌干燥后备用。每个样品做3次重复实验，数据采用SPSS1010进行分析，组间比较采用t检验。

供试样品溶液的配制：分别称取一定量的化合物5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷，平行称取3份，加蒸馏水定容至量瓶中，然后依次稀释为不同浓度的水溶液，并以消毒蒸馏水做空白对照。

菌种活化与灭菌处理：将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌冷藏菌种分别接入2支营养琼脂斜面培养基活化，30℃培养24h。培养基、其他实验所用器材和试剂均在120℃下湿热高压灭菌2h。

抑菌实验及抑菌圈的测定：抑菌圈测量是利用抑菌物质在涂布特定试验菌的琼脂培养基内成球形立体状扩散，抑制试验菌的繁殖，在抑菌物质的周围形成的透明圈。将无菌小滤纸片高温蒸汽灭菌干燥后备用。用无菌移液管吸取各种菌悬液加入无菌培养皿中，夹取浸透样品溶液的滤纸片，将其放在培养基表面。将放好滤纸片的含菌培养皿分别在恒温箱中培养，到时取出，测量并记录形成的抑菌环的直径。每组实验重复3次，实验结果取平均值。

最小抑菌浓度(MIC)测定结果：MIC的测定采用二倍稀释法。将不同浓度的样品溶液分别移入各个平皿内，倒入的培养基中充分混匀，冷却凝固后，每皿中加入菌悬液，用无菌涂布器涂布均匀进行培养。取出，观察结果，以不长菌的溶液浓度做为最低抑菌浓度MIC，结果供试样品对金黄色葡萄球菌的抑菌试验结果MIC为54.45μg·mL^-1，抑菌环直径26.42mm；对大肠杆菌的抑菌试验结果MIC为68.89μg·mL^-1，抑菌环直径15.57mm。

该试验结果表明，供试样品的水溶液对供试菌种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均具有较强的抑制作用，且随浓度的增加抑菌效果增强。该试验结果表明化合物5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷具有一定的抑菌活性。

2、抗氧化活性试验结果：

本试验采用DPPH分光光度法用以评价本发明制备的单体化合物5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷的抗氧化能力。

DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的以氮为中心自由基，当它与自由基清除剂作用时，由于清除剂与DPPH孤对电子配对而使其在517nm处的吸光度减小，使溶液的典型紫色变浅。吸光度越小，自由基清除剂清除自由基的能力越强，因而可用分光光度法进行定量分析。

IC₅₀值是用于评价抗氧化能力的参数，它是指抗氧化剂清除50％的DPPH自由基时所需的浓度。其值越小，表示达到50％清除率时，所用的自由基清除剂的浓度剂量越小，其自由基清除效果也就越好，对应的参试样品抗氧化活性越强。

(1)实验条件：Tecan Infinite M200酶标仪(瑞士)；UV-2102PCS紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；101-3电热鼓风恒温干燥箱(杭州蓝天化验仪器厂)；KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；R201B旋转蒸发仪(上海申胜生物科技有限公司)。1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH)购自sigma公司，酶标板：96微孔板，其他试剂均为分析纯。

(2)测定方法与结果：用移液枪在96孔酶标板中分别加入不同浓度的供试品溶液200μL和DPPH试液100μL。样品加入后震荡30s，26℃保温30min后，在用Infinite M 200酶标仪在517nm波长下测定其吸光值(Ap)，同时测定不加DPPH的样品空白(用100μL70％乙醇代替DPPH)吸光值(Ac)和加DPPH但不加样品(用200μL70％乙醇醇代替样品)的吸光值(Amax)。以各供试样品的浓度(μg/mL)为横坐标，以测得的自由基清除率(Y)为纵坐标绘制准曲线，得到回归方程，根据回归方程计算IC₅₀。

计算结果Trolox对DPPH清除率的IC₅₀值为20.06μg/mg，供试样品对DPPH清除率的IC₅₀值为58.46μg/mg。表明供试样品达到半数清除率时的用量是 Trolox用量的2.9倍。实验结果表明，供试样品对DPPH自由基具有一定的清除率，且清除率随供试样品溶液浓度的增大而提高。表明5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷具有一定的的抗氧化活性。

经初步体外活性试验表明，化合物5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷具有一定的抗氧化及抗菌活性，因此具有很好的开发应用价值。

Claims

1.天然植物中一个活性成分的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2)冷浸提取：将干燥的红花芒毛苣苔用折合红花芒毛苣苔药材干重8倍量的50％～80％含水乙醇进行冷浸提取3次，每次提取12～20小时，合并提取液；

4)萃取粗分：得到的浓缩液分散到适量的水中，分别用乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取溶剂的用量为浓缩液与萃取溶剂的体积比为1∶1-3，萃取3～5次，分别得到乙酸乙酯、正丁醇萃取部位，将各萃取部位在水浴温度60～70℃下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩，得到各部位的浓缩液；

5)大孔树脂纯化：得到的正丁醇浓缩液通过Diaion HP-20大孔吸附树脂分离富集，先用H₂O洗脱，10％含水乙醇、25％含水乙醇、50％含水乙醇、65％含水乙醇、70％含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70％丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并25％含水乙醇、50％含水乙醇、65％含水乙醇部位的洗脱液，将各含水乙醇部位的洗脱液在60～70℃以下真空闪蒸浓缩、干燥得粉末；

6)柱色谱分离纯化：将上述50％含水乙醇洗脱部位的浓缩干粉溶于少量的水中，通过Sephadex LH-20和MCI-gelCHP-20柱色谱，用水、10％含水乙醇、20％含水乙醇、40％含水乙醇、60％含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70％丙酮洗脱，TLC检识，相同流分合并，从中分离得到为白色粉末的化合物，所述化合物为5，7-二羟基-8-C-β-D-葡萄糖色酮碳苷，其结构式为：

2.如权利要求1所述的天然植物中一个活性成分的制备方法，其特征在于步骤2)中：冷浸所用含水乙醇的浓度为55％～70％，每次提取时间为15～20小时。

3.如权利要求1所述的天然植物中一个活性成分的制备方法，其特征在于步骤4)中：萃取溶剂的用量为浓缩液与萃取溶剂的体积比为1∶1-2。

4.如权利要求1所述的天然植物中一个活性成分的制备方法，所述活性成分在防氧化、抑菌方面的应用。