CN102379973B - 一种茄科酸浆属植物有效部位的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茄科酸浆属植物有效部位的制备方法，包括：1)使用提取溶剂对药材提取，得到提取液；药材为茄科酸浆属植物的果实、根茎、宿萼中的至少一种；2)将提取液浓缩，加水溶解，再分别用极性由小到大的萃取溶剂进行萃取，得到萃取液，经浓缩后上正相柱用洗脱溶剂进行洗脱；收集洗脱液，干燥，得到茄科酸浆属植物有效部位；萃取溶剂至少包括二氯甲烷；所述的洗脱溶剂至少包括由体积比为20～35∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂。该制备方法操作简单，生产成本低，适于工业化生产。本发明方法制备的茄科酸浆属植物有效部位，生理活性强，并且具有质量可控、剂量小、使用方便等优点，可用于制备抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及从中药中提取有效部位的制备和应用领域，特别涉及一种茄科酸浆属植物有效部位的制备方法及应用。
背景技术
茄科(Solanaceae)酸浆属(Physalis)植物全世界约120种，大多数分布在美洲热带及温带地区，少数分布在欧亚大陆及东南亚。我国有7种，其中2种为变种，分别为酸浆(P.alkekengi L.)、挂金灯[P.alkekengi L.var.franchetii(Mast.)Makino](变种)、小酸浆(P.minima L.)、苦蘵(P.angulata L.)、毛苦蘵(P.angulata L.var.illosa Bonati)(变种)、毛酸浆(P.pubescens L.)、灯笼果(P.peruxiana L.)。茄科酸浆属植物其根、全草及果实均可入药，成熟果实可生食，味微酸，香味浓郁，果色鲜亮，是营养元素较为丰富的水果蔬菜，酸浆果红素还可用作食品着色剂。茄科酸浆属植物具有清热解毒、利咽、化痰、利尿作用，用于咽痛音哑，痰热咳嗽，小便不利等症状，同时外治天疱疮、湿疹，是常用的清热解毒药，历代本草多有记载。《神农本草经》中记载有：“酸浆，味酸平，主热烦满，定志益气，利水道，产难，吞其实，立产，一名醋浆，生川泽”。
挂金灯为茄科酸浆属植物，在我国许多地方有分布，挂金灯中含有几十种酸浆苦味素类化合物，其基本结构为13，14-裂环-16，24-环麦角甾烷。迄今为止，对茄科酸浆属中含有酸浆苦味素类化合物有效部位的报道甚少。虽然有文献报道对茄科酸浆属植物进行了一系列常规的提取分离，并且得到一系列酸浆苦味素类化合物，但其并没有能够提供一种性能稳定、药理活性好，且技术操作科学合理的茄科酸浆属植物有效部位的制备方法。
目前在提取溶剂上，文献“锦灯笼的活性成分及质量评价研究”(张初航；锦灯笼的活性成分及质量评价研究[D]；沈阳药科大学学报；2009年第26卷第10期)公开了中药锦灯笼化学成分的分离与鉴定，包括采用乙醇提取，硅胶柱色谱分离纯化，根据理化性质和波谱数据鉴定了3个酸浆苦味素类化合物。其中，提取溶剂采用含乙醇质量百分数为70％的乙醇水溶液，虽然该提取溶剂也能提取出部分的酸浆苦味素类化合物，但其属于小极性成分，不能较完全提取有效部位活性成分，对有效部位的提取效果不佳，存在着技术缺陷。
文献“中药挂金灯中酸浆苦味素类化合物的分离以及抗增殖活性”(Reiko Sunayama，Masanori Kuroyanagi，et al.Physalin and Neophysalins fromPhysalis alkekengi var.francheti and their differentiation inducing activity.Phytochemistry 1993；34：529-533.)公开了中药挂金灯中酸浆苦味素类化合物的分离以及抗增殖活性，包括采用甲醇提取，柱色谱分离纯化，根据波谱数据鉴定了5个酸浆苦味素类化合物，并进行了抗增殖活性测试。其中，提取溶剂采用质量百分数为100％的甲醇，虽然该提取溶剂能够更充分提取出大部分的酸浆苦味素类化合物，但其毒性大，不适合工业化生产，存在着技术缺陷。
在萃取溶剂方面，文献“中药挂金灯中黄酮和甾体类成分的分离以及其抗NO效应”(Qiu L，Zhao F，Jiang ZH，Chen LX，Zhao Q，Liu HX，et al.Steroidsand flavonoids from Physalis alkekengi var.franchetii and their inhibitory effectson nitric oxide production.J Nat Prod 2008；71：642-646.)公开了从中药挂金灯中分离甾体和黄酮以及其抗炎活性，包括采用乙醇提取，乙酸乙酯萃取，柱色谱分离纯化，根据波谱数据鉴定了15个酸浆苦味素类化合物，并进行了抗炎活性测试。其中，萃取时，采用乙酸乙酯作为萃取溶剂，虽然该萃取溶剂也能将酸浆苦味素类化合物从提取液中萃取出来，但其萃取液中包含了一些易溶于乙酸乙酯的极性略大的非酸浆苦味素类化学成分，其萃取的酸浆苦味素类活性成分不够集中，含量不够高，存在着技术缺陷。
在柱层析洗脱体系方面，文献“锦灯笼果实化学成分的研究”(梁慧；锦灯笼果实化学成分的研究；中华中医药学刊；2007年第25卷第8期)公开了锦灯笼果实化学成分采用石油醚-丙酮体系洗脱分离的研究，包括采用含乙醇质量百分数为70％的乙醇水溶液提取以及采用石油醚-丙酮体系进行柱色谱梯度洗脱，根据波谱数据鉴定了2个酸浆苦味素类化合物。其中，柱色谱采用的洗脱体系为石油醚-丙酮体系，虽然采用石油醚-丙酮体系进行柱色谱梯度洗脱也能达到对酸浆苦味素类化合物分离的作用，但该洗脱体系，洗脱范围太大，不能够使有效部位集中于洗脱溶剂中从而不能形成一种稳定的有效部位，存在着技术缺陷。
发明内容
本发明提供了一种茄科酸浆属植物有效部位的制备方法，工艺操作简单，能够提取性能稳定、药理活性好的茄科酸浆属植物有效部位。
一种茄科酸浆属植物有效部位的制备方法，包括以下步骤：
1)提取：使用提取溶剂对药材提取，得到提取液；
所述的药材为茄科酸浆属植物的果实、根茎、宿萼中的至少一种；
2)柱层析：将步骤1)得到的提取液浓缩，加水溶解，再分别用极性由小到大的萃取溶剂进行萃取，得到萃取液，萃取液经浓缩后上正相柱用洗脱溶剂进行洗脱；收集洗脱液，干燥，得到茄科酸浆属植物有效部位；
所述的萃取溶剂至少包括二氯甲烷；
所述的洗脱溶剂至少包括由体积比为20～35∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂。
萃取溶剂可以选用多种，但至少要包括二氯甲烷。二氯甲烷极性小于现有技术中的乙酸乙酯，不但能够将茄科酸浆属植物有效部位的酸浆苦味素类成分完全从提取液中萃取，而且也能够去除一些易溶于乙酸乙酯的极性略大的非酸浆苦味素类化学成分，从而使茄科酸浆属植物有效部位的酸浆苦味素类活性成分更加集中，含量更高。
洗脱溶剂有比较严格的要求，并对体积比也有限定，该洗脱溶剂洗脱能力强，从而能保证得到性能稳定、药理活性好的茄科酸浆属植物有效部位。
为了取得更好的发明效果，以下作为本发明的优选：
步骤1)中，所述的药材为挂金灯植物的宿萼，价格便宜，并且易大量获取。
所述的提取溶剂为水、醇中的一种或两种，这些提取溶剂使用安全、廉价，并具有较好的提取效果。更优选地，所述的提取溶剂为含乙醇质量百分数95％的乙醇水溶液。该提取溶剂的性质非常适合于提取茄科酸浆属植物的果实、根茎、宿萼中的至少一种，能够更加完全地获取茄科酸浆属植物有效部位的活性成分，具有更好的提取效果。
每次加入相对于药材重量的6～10倍重量的提取溶剂，在90℃～100℃加热提取，每次提取的时间为2h～3h，提取2～3次。在这样的提取条件下，不但节省了药材和提取溶剂的使用量，而且能充分将药材中的茄科酸浆属植物有效部位提取，提高了提取率。
步骤2)中，所述的萃取溶剂为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、含乙醇质量百分数95％的乙醇水溶液、水中的两种以上，萃取时按极性大小依次使用单一溶剂进行萃取。溶剂的极性由小到大排列依次为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、含乙醇质量百分数95％的乙醇水溶液、水。进一步优选，所述的萃取溶剂为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇，萃取时按极性大小依次使用单一溶剂等体积进行萃取。根据相似相容原理，分别通过上述萃取溶剂萃取，以使步骤1)中提取液浓缩加水溶解后的溶液按照极性由小到大分离，通过薄层色谱(TLC)检识茄科酸浆属植物有效部位黄色斑点绝大多数集中于二氯甲烷萃取液中，其他溶剂主要是为了进一步提取茄科酸浆属植物有效部位或者除去其他极性物质使得提取到更高纯度的茄科酸浆属植物有效部位，从而使茄科酸浆属植物有效部位的酸浆苦味素类活性成分更加集中，含量更高。因此，进一步优选，可选择将二氯甲烷萃取的萃取液经浓缩后得到的浓缩物上正相柱，其余的可以忽略，从而减少提取成本。
所述的正相柱所用的填料为氧化铝或100～200目的柱层层析硅胶。
所述的洗脱溶剂包括由体积比为100∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为50∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为30∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为25∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为10∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为5∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为2∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂和由体积比为1∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱。采用由二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱，该洗脱体系洗脱能力强，并且通过薄层色谱(TLC)检识茄科酸浆属植物有效部位几乎全部位于由体积比为30∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂及由体积比为25∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂洗脱后的洗脱液中，使得茄科酸浆属植物有效部位的酸浆苦味素类活性成分更加集中，含量更高。
所述的制备方法制备的茄科酸浆属植物有效部位，是来源于酸浆属植物的药物活性成分，主要为酸浆苦味素类化合物，其基本结构为13，14-裂环-16，24-环麦角甾烷，其具体结构可参照现有文献(参考文献：张初航；锦灯笼的活性成分及质量评价研究[D]；沈阳药科大学学报；2009年第26卷第10期。Qiu L，Zhao F，Jiang ZH，Chen LX，Zhao Q，Liu HX，et al.Steroids andflavonoids from Physalis alkekengi var.franchetii and their inhibitory effects onnitric oxide production.J Nat Prod 2008；71：642-6.)。
所述的制备方法制备的茄科酸浆属植物有效部位在制备抗肿瘤药物中的应用。该茄科酸浆属植物有效部位对乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、人胃癌细胞(SGC7901)、人宫颈癌细胞(Hela)具有很好的抑制作用。
以MTT比色法对茄科酸浆属植物有效部位进行抗肿瘤作用的筛选，结果显示，本发明的茄科酸浆属植物有效部位(主要为酸浆苦味素类化合物)在浓度为20ug/mL时处理肿瘤细胞系如乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、人胃癌细胞(SGC7901)、人宫颈癌细胞(Hela)能够明显抑制肿瘤细胞增殖，而对正常人外周血多形核白细胞(PMN)抑制作用较小。上述细胞株可采用市售产品，如可采用美国模式培养物集存库ATCC(Americantype culture collection)的各种细胞株。
本发明茄科酸浆属植物有效部位可与市售或者常用的载体结合，用于制备预防或者/和治疗肿瘤的药物。所述的药物可以为片剂、粉针剂等形式。
所述的茄科酸浆属植物有效部位制成片剂，由以下重量份的原料制成：
茄科酸浆属植物有效部位 50份；
黏合剂 2～10份；
羧甲淀粉钠 6～14份；
淀粉 12～20份；
硬脂酸镁 0.5～1.5份；
所述的黏合剂由含羟丙甲纤维素的质量百分数为1％～10％的羟丙甲纤维素水溶液和含淀粉的质量百分数为4％～10％的淀粉浆按照重量比3∶10混合而成。该片剂对乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、人胃癌细胞(SGC7901)、人宫颈癌细胞(Hela)具有很好的抑制作用，对正常人外周血多形核白细胞(PMN)抑制作用较小。
本发明茄科酸浆属植物有效部位，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将本发明茄科酸浆属植物有效部位配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中，pH通常约为5～8，较佳的pH约为6～8，pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。这类载体介质包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明茄科酸浆属植物有效部位可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物，也可通过常规方法进行制备。药物如针剂溶液片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。药物活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天1μg/kg体重～2000mg/kg体重。此外，本发明茄科酸浆属植物有效部位还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明茄科酸浆属植物有效部位被用作药物时，可将治疗有效剂量的茄科酸浆属植物有效部位施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重～约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提供的茄科酸浆属植物有效部位，来源于酸浆属植物的药物活性成分，主要为酸浆苦味素类化合物，生理活性强，能够大体上代表传统药材的功效，并且具有质量可控、剂量小、使用方便等优点，有别于传统中药的粗、大、黑的落后面貌。
本发明茄科酸浆属植物有效部位的制备方法，首次分离出了茄科酸浆属植物有效部位，主要为酸浆苦味素类化合物，并利用提取溶剂的提取、溶剂的萃取和过柱分离法，得到了纯度较高的酸浆苦味素类化合物。本发明茄科酸浆属植物有效部位的制备方法操作简单，生产成本低，适于工业化生产。
附图说明
图1为实施例1制备的挂金灯有效部位的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的内容作进一步详细的说明，但不应将实施例理解为对本发明的限制。在不脱离本发明上述思想情况下，根据本领域普通技术知识和常规手段作出的各种替换手段或变更，均包含在本发明之内。
实施例1
1)提取：将挂金灯药材的宿萼在60℃干燥5h，得到干燥的挂金灯药材的宿萼，取10Kg干燥的挂金灯药材的宿萼，每次加入相对于药材重量6倍的含乙醇质量百分数95％的乙醇水溶液(即乙醇水溶液60Kg)，在90℃回流提取，每次提取的时间为3h，总共提取3次(乙醇水溶液总计180Kg)，合并提取液。
2)柱层析：将步骤1)得到的提取液减压浓缩至近干，得稠浸膏837g，加入1L的水溶解，然后分别用1L的石油醚、1L的二氯甲烷、1L的乙酸乙酯、1L的正丁醇进行萃取，分别得到石油醚萃取液、二氯甲烷萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，通过薄层色谱(TLC)检识挂金灯有效部位黄色斑点基本上集中于二氯甲烷萃取液中，对二氯甲烷萃取液进行浓缩，得二氯甲烷部位浸膏160g，上填料为150目的柱层层析硅胶的正相柱，然后分别使用多个不同的洗脱溶剂进行洗脱，各个洗脱溶剂都由二氯甲烷和甲醇组成且体积都为6L，各个洗脱溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比分别为100∶1,50∶1,30∶1,25∶1∶10∶1,5∶1,2∶1,1∶1，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱。薄层色谱(TLC)检识挂金灯有效部位黄色斑点集中于二氯甲烷和甲醇的体积比为30∶1的洗脱溶剂的洗脱液及二氯甲烷和甲醇的体积比为25∶1的洗脱溶剂的洗脱液中，收集洗脱液，用旋转蒸发仪在60℃旋蒸25min，即得挂金灯有效部位33.4g。
取实施例1制备的挂金灯有效部位0.15g，用1mL的甲醇溶解，离心，取上清液进行Agilent 1100HPLC分析，液相色谱条件：流速：0.5mL/min，紫外吸收波长：230nm，洗脱体系：乙腈-水，洗脱条件：0～60min，乙腈的质量百分数为10％～100％，其高效液相色谱如图1所示。
实施例2
1)提取：将挂金灯药材的宿萼在60℃干燥5h，得到干燥的挂金灯药材的宿萼，取10Kg干燥的挂金灯药材的宿萼，每次加入相对于药材重量8倍的含乙醇质量百分数95％的乙醇水溶液(即乙醇水溶液80Kg)，在100℃回流提取，每次提取的时间为2h，总共提取2次(乙醇水溶液总计160Kg)，合并提取液。
2)柱层析：将步骤1)得到的提取液减压浓缩至近干，得稠浸膏850g，加入1L的水溶解，然后分别用1L的石油醚、1L的二氯甲烷、1L的乙酸乙酯、1L的正丁醇进行萃取，分别得到石油醚萃取液、二氯甲烷萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，通过薄层色谱(TLC)检识挂金灯有效部位黄色斑点基本上集中于二氯甲烷萃取液中，对二氯甲烷萃取液进行浓缩，得二氯甲烷部位浸膏172g，上氧化铝正相柱，然后分别使用多个不同的洗脱溶剂进行洗脱，各个洗脱溶剂都由二氯甲烷和甲醇组成且体积都为6L，各个洗脱溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比分别为100∶1，50∶1，30∶1，25∶1：10∶1，5∶1，2∶1，1∶1，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱。薄层色谱(TLC)检识挂金灯有效部位黄色斑点集中于二氯甲烷和甲醇的体积比为30∶1的洗脱溶剂的洗脱液及二氯甲烷和甲醇的体积比为25∶1的洗脱溶剂的洗脱液中，收集洗脱液，用旋转蒸发仪在60℃旋蒸25min，即得挂金灯有效部位37g。
实施例3
1)提取：将挂金灯药材的宿萼在60℃干燥5h，得到干燥的挂金灯药材的宿萼，取10Kg干燥的挂金灯药材的宿萼，每次加入相对于药材重量10倍的水(即水100Kg)，在100℃回流提取，每次提取的时间为2h，总共提取2次(水总计200Kg)，合并提取液。
2)柱层析：将步骤1)得到的提取液减压浓缩至近干，得稠浸膏820g，加入1L的水溶解，然后分别用1L的石油醚、1L的二氯甲烷、1L的乙酸乙酯、1L的正丁醇进行萃取，分别得到石油醚萃取液、二氯甲烷萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，通过薄层色谱(TLC)检识挂金灯有效部位黄色斑点基本上集中于二氯甲烷萃取液中，对二氯甲烷萃取液进行浓缩，得二氯甲烷部位浸膏144g，上填料为150目的柱层层析硅胶的正相柱，然后分别使用多个不同的洗脱溶剂进行洗脱，各个洗脱溶剂都由二氯甲烷和甲醇组成且体积都为6L，各个洗脱溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比分别为100∶1，50∶1，30∶1，25∶1：10∶1，5∶1，2∶1，1∶1，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱。薄层色谱(TLC)检识挂金灯有效部位黄色斑点集中于二氯甲烷和甲醇的体积比为30∶1的洗脱溶剂的洗脱液及二氯甲烷和甲醇的体积比为25∶1的洗脱溶剂的洗脱液中，收集洗脱液，用旋转蒸发仪在60℃旋蒸25min，即得挂金灯有效部位29g。
实施例4(茄科酸浆属植物有效部位的体外抗肿瘤实验)
取对数期的细胞每孔1×104接种于96孔板上，每孔加入200μL的DMEM培养基，12h后，弃上清液，然后在3个复孔中加入实施例2制备的挂金灯有效部位(每孔4μg)，为有效部位给药组；在3个复孔中加入阿霉素(每孔4μg，碧云天试剂公司)，为阿霉素给药组；在3个复孔中加入二甲基亚砜(每孔4μg)，为空白组；培养24h后，弃上清液。分别向阿霉素给药组、有效部位给药组和空白组中加入带MTT的溶液50μL培养4h，MTT的溶液由MTT(噻唑蓝，碧云天试剂公司)溶解在磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.3)中形成，MTT浓度为0.5mg/mL，再向各孔分别加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡1h，于酶标仪上570nm处测OD(光密度optical density)值。
分别对乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、人胃癌细胞(SGC7901)、人宫颈癌细胞(Hela)和正常人外周血多形核白细胞(PMN)进行了试验，上述细胞株均购置ATCC，具体结果如表1所示。根据表1的结果显示，加药(挂金灯有效部位)后(20μg/mL)，肿瘤细胞活性明显下降，对正常人外周血多形核白细胞(PMN)抑制作用较小。其中，增殖抑制率％＝(空白组OD值-加药组OD值)/空白组OD值。
表1
实施例5(有效部位药物片剂的制备)
1)称取0.05g的实施例3制备的挂金灯有效部位、0.006g的黏合剂、0.01g的羧甲淀粉钠、0.016份的淀粉和0.001g的硬脂酸镁；其中，黏合剂由含羟丙甲纤维素的质量百分数为8％的羟丙甲纤维素水溶液和含淀粉的质量百分数为8％的淀粉浆(淀粉和水组成)按照重量比3∶10混合而成。羧甲淀粉钠作为崩解剂使用。
2)将称取的挂金灯有效部位0.05g、淀粉0.016g、羧甲淀粉钠0.008g置于混合槽内混合20min，然后加入黏合剂0.006g混合制软材，再过14目筛制粒，干燥后过14目筛整粒，加入称取的硬脂酸镁0.001g和0.002g的羧甲淀粉钠，混合后压制成片，即完成有效部位药物片剂的制备；制备的有效部位药物片剂规格为0.083g(以挂金灯有效部位计)。
将上述的挂金灯有效部位替换为阿霉素(碧云天试剂公司)，重复步骤1)和步骤2)，得到阿霉素药物片剂。
将上述挂金灯有效部位取0g，重复步骤1)和步骤2)，得到辅料片剂。
实施例6(有效部位药物片剂的体外抗肿瘤实验)
取对数期的细胞每孔1×104接种于96孔板上，每孔加入200μL的DMEM培养基，12h后，弃上清，然后在3个复孔中加入实施例5制备的有效部位药物片剂(每孔7μg)，为有效部位药物片剂组；在3个复孔中加入实施例5制备的阿霉素药物片剂(每孔7μg)，为阿霉素药物片剂组；在3个复孔中加入实施例5制备的辅料片剂(每孔7μg)，为辅料片剂组；在3个复孔中加入二甲基亚砜(每孔7μg)，为空白组；培养24h后，弃上清液。分别向有效部位药物片剂组、阿霉素药物片剂组、辅料片剂组和空白组中加入带MTT的溶液50μL培养4h，MTT的溶液由MTT(噻唑蓝，碧云天试剂公司)溶解在磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.3)中形成，MTT浓度为0.5mg/mL，再向各孔分别加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡1h，于酶标仪上570nm处测OD(光密度optical density)值。
分别对乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、人胃癌细胞(SGC7901)、人宫颈癌细胞(Hela)和正常人外周血多形核白细胞(PMN)进行了试验，上述细胞株均购置ATCC，具体结果如表2所示。根据表2的结果显示，加入有效部位药物片剂后，肿瘤细胞活性明显下降，对正常人外周血多形核白细胞(PMN)抑制作用较小。其中，增殖抑制率％＝(空白组OD值-加药组OD值)/空白组OD值。
表2
Claims (3)
1.一种茄科酸浆属植物有效部位的制备方法，包括以下步骤：
1）提取：将挂金灯药材的宿萼在60℃干燥5h，得到干燥的挂金灯药材的宿萼，取10Kg干燥的挂金灯药材的宿萼，每次加入相对于药材重量6倍的含乙醇质量百分数95%的乙醇水溶液，即乙醇水溶液60Kg，在90℃回流提取，每次提取的时间为3h，总共提取3次，乙醇水溶液总计180Kg，合并提取液；
2）柱层析：将步骤1）得到的提取液减压浓缩至近干，得稠浸膏837g，加入1L的水溶解，然后分别用1L的石油醚、1L的二氯甲烷、1L的乙酸乙酯、1L的正丁醇进行萃取，分别得到石油醚萃取液、二氯甲烷萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，通过薄层色谱检识挂金灯有效部位黄色斑点基本上集中于二氯甲烷萃取液中，对二氯甲烷萃取液进行浓缩，得二氯甲烷部位浸膏160g，上填料为150目的柱层层析硅胶的正相柱，然后分别使用多个不同的洗脱溶剂进行洗脱，各个洗脱溶剂都由二氯甲烷和甲醇组成且体积都为6L，各个洗脱溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比分别为100:1,50:1,30:1,25:1:10:1,5:1,2:1,1:1，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱；薄层色谱检识挂金灯有效部位黄色斑点集中于二氯甲烷和甲醇的体积比为30:1的洗脱溶剂的洗脱液及二氯甲烷和甲醇的体积比为25:1的洗脱溶剂的洗脱液中，收集洗脱液，用旋转蒸发仪在60℃旋蒸25min，即得挂金灯有效部位33.4g。
2.一种茄科酸浆属植物有效部位的制备方法，包括以下步骤：
1）提取：将挂金灯药材的宿萼在60℃干燥5h，得到干燥的挂金灯药材的宿萼，取10Kg干燥的挂金灯药材的宿萼，每次加入相对于药材重量8倍的含乙醇质量百分数95%的乙醇水溶液，即乙醇水溶液80Kg，在100℃回流提取，每次提取的时间为2h，总共提取2次，乙醇水溶液总计160Kg，合并提取液；
2）柱层析：将步骤1）得到的提取液减压浓缩至近干，得稠浸膏850g，加入1L的水溶解，然后分别用1L的石油醚、1L的二氯甲烷、1L的乙酸乙酯、1L的正丁醇进行萃取，分别得到石油醚萃取液、二氯甲烷萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，通过薄层色谱检识挂金灯有效部位黄色斑点基本上集中于二氯甲烷萃取液中，对二氯甲烷萃取液进行浓缩，得二氯甲烷部位浸膏172g，上氧化铝正相柱，然后分别使用多个不同的洗脱溶剂进行洗脱，各个洗脱溶剂都由二氯甲烷和甲醇组成且体积都为6L，各个洗脱溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比分别为100:1,50:1,30:1,25:1:10:1,5:1,2:1,1:1，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱；薄层色谱检识挂金灯有效部位黄色斑点集中于二氯甲烷和甲醇的体积比为30:1的洗脱溶剂的洗脱液及二氯甲烷和甲醇的体积比为25:1的洗脱溶剂的洗脱液中，收集洗脱液，用旋转蒸发仪在60℃旋蒸25min，即得挂金灯有效部位37g。
3.一种茄科酸浆属植物有效部位的制备方法，包括以下步骤：
1）提取：将挂金灯药材的宿萼在60℃干燥5h，得到干燥的挂金灯药材的宿萼，取10Kg干燥的挂金灯药材的宿萼，每次加入相对于药材重量10倍的水，即水100Kg，在100℃回流提取，每次提取的时间为2h，总共提取2次，水总计200Kg，合并提取液；
2）柱层析：将步骤1）得到的提取液减压浓缩至近干，得稠浸膏820g，加入1L的水溶解，然后分别用1L的石油醚、1L的二氯甲烷、1L的乙酸乙酯、1L的正丁醇进行萃取，分别得到石油醚萃取液、二氯甲烷萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，通过薄层色谱检识挂金灯有效部位黄色斑点基本上集中于二氯甲烷萃取液中，对二氯甲烷萃取液进行浓缩，得二氯甲烷部位浸膏144g，上填料为150目的柱层层析硅胶的正相柱，然后分别使用多个不同的洗脱溶剂进行洗脱，各个洗脱溶剂都由二氯甲烷和甲醇组成且体积都为6L，各个洗脱溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比分别为100:1,50:1,30:1,25:1:10:1,5:1,2:1,1:1，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱；薄层色谱检识挂金灯有效部位黄色斑点集中于二氯甲烷和甲醇的体积比为30:1的洗脱溶剂的洗脱液及二氯甲烷和甲醇的体积比为25:1的洗脱溶剂的洗脱液中，收集洗脱液，用旋转蒸发仪在60℃旋蒸25min，即得挂金灯有效部位29g。
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| 孔静等.酸浆醇提物对食管癌EC-1.71细胞增殖的抑制作用.<<江苏大学学报(医学版)>>.2011,第21卷(第3期),233-236. |
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| 才谦等.中药锦灯笼化学成分的分离与鉴定.<<沈阳药科大学学报>>.2009,第26卷(第10期),807-810,817. |
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