KR20070028386A

KR20070028386A - 티모사포닌 ｂｉｉ의 제조방법

Info

Publication number: KR20070028386A
Application number: KR1020067024925A
Authority: KR
Inventors: 바이핑 마; 하오 천; 청치 시옹; 리핑 캉; 지에 장
Original assignee: 인스티튜트 오브 레디에이션 메디슨, 아카데미 오브 밀리터리 메디컬 사이언시즈, 피엘에이
Priority date: 2004-04-29
Filing date: 2005-04-21
Publication date: 2007-03-12
Also published as: HK1100865A1; RU2006142102A; EP1752464A1; CA2564889C; EP1752464A4; PL381702A1; RU2395518C2; CN1693310A; PL211896B1; CN100427500C; JP5208499B2; WO2005105824A1; CA2564889A1; US20090012277A1; JP2007534706A; US8765925B2; EP1752464B1

Abstract

중국 전통 의약인 지모(Rhizoma Anemarrhena) 또는 지모 Anemarrhena asphodeloides Bge.(나리과 Liliaceae)의 신선한 근경(rhizoma) 또는 섬유성 뿌리를 이용하는 티모사포닌 BII의 제조방법은 용매 추출, 레진 흡착, 폴리아미드 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피 등에서 선택된 하나 이상의 방법에 의해 티모사포닌 BII를 분리하고, 감압 건조, 동결 건조, 분무 건조 등과 같은 통상적인 건조 방법을 함께 수행하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 수득되는 티모사포닌 BII는 90%를 넘는 순도를 가지며, 그 방법은 산업적 생산을 위해 간단하고 실용적이며 적절하다.

Description

티모사포닌 ＢＩＩ의 제조방법{A process for preparation of timosaponin BII}

본 발명은 티모사포닌 BII의 제조방법에 관한 것이다.

중국 전통 의약인 지모(Rhizoma Anemarrhena)는 중국 동북부의 산시성의 네이멍구 자치구의 허베이 및 몇몇 다른 지역에 널리 분포하는 지모 Anemarrhena asphodelodes Bge.(나리과 Liliaceae)의 근경(rhizoma)이다. 해열 및 소염 작용, 그리고 체액의 생성을 촉진하며 폐를 자양(nourishing)하는 작용으로 인해, 지모는 전통적인 중의학에서 자주 사용되었다. Anemarrhena asphodeloides Bge.의 주요 성분은 플라본, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 및 지방산 등과 함께 스테로이드 사포닌이다. 약리학적 연구 결과, 지모는 항균 효과, 항바이러스 효과, 단백질 분해 효과, 항당뇨병 효과, 진정 효과, 혈소판 응집 저해 효과, 항암 효과, 및 방사능 방어 효과 등을 갖는 것으로 나타났다.

티모사포닌 BII는 프로티모사포닌 AIII라고도 하며, Anemarrhena asphodeloides Bge. 근경의 주요 성분이다. 그것은 (25S)-26-O-β-D-글루코피라노실-22-히드록시-5β-퓨로스탄-3β, 26-디올-3-O-β-D-글루코피라노실-(1→2)-β-D-갈락토피라노사이드의 구조를 갖는다. 그것은 하기 화학식의 구조를 갖는다:

티모사포닌 BII는 1963년에 Toshio KAWAZAKI에 의해 최초로 분리되었으나, 그는 그 구조를 밝혀내지는 않았다. 1991년에, Seiji NAGUMO는 최초로 티모사포닌 BII의 구조를 규명하였다(Seiji NANGUMO et al, YAKUGAKU ZASSHI, 1991; 111(1): 306-310). 그 후, Noboru Nakashima(NOBORU NAKASHIMA et al, Journal of Natural Products, 1993; 56(3): 345-350), Bai-ping Ma(Bai-ping Ma et al, Acta. Pharm. Sin. 1996; 31(4): 271-277), Masayasu Kimula(Masayasu KIMURA et al, Biol. Pharm. BUll, 1996; 19(7): 926-931) 및 Jian-ying Zhang(Jian-ying ZHANG et al, Clinica Chimica Acta, 1999; 289: 79-88)은 티모사포닌 BII의 분리 및 활성을 보고하였다. 연구자들은 티모사포닌 BII가 항당뇨 효과, 혈소판 응집 억제 효과, 자유 라디칼 제거 효과 및 항치매 효과를 갖는다고 보고하였다. 거의 모든 선행 기술 문헌에서, 티모사포닌 BII는 n-부탄올 추출, 보통의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 거대다공성(macroporous) 레진 컬럼 크로마토그래피, 및 HPLC에 의해 제조되 었다. 그러나, 그것은 n-부탄올 추출에서 유화되기 쉽고, 샘플의 양이 실라카겔 컬럼 크로마토그래피에 한정되고, 실리카겔을 재활용하기 어려우며, 클로로포름-메탄올-물의 용리액(eluent)을 회수하기 어렵다. 그러므로, 이전에 보고된 방법들은 대개 공정의 난이, 낮은 수율, 낮은 순도를 가지며 산업적인 규모의 생산에 적합하지 않다. 거대다공성 레진 및 역상 액체크로마토그래피를 이용하는 경우에도, 메탄올-물의 용리액은 티모사포닌 BII의 C-22 히드록실 메톡시화를 유발하여 소정의 비율의 티모사포닌 BI를 형성할 것이다(Seiji NAGUMO et al, YAKUGAKU ZASSHI, 1991; 111(1): 306-310). 따라서, 이러한 방법들은 샘플의 일부를 버리게 될 것이고, 티모사포닌 BII 및 티모사포닌 BI의 혼합물을 생성시키만 할 것이며, 순수한 티모사포닌 BII를 획득하기 어렵다.

이러한 이유 때문에, 티모사포닌 BII의 제조방법을 개선시키는 것이 필요하다.

발명의 간단한 설명

본 발명의 목적은 티모사포닌 BII의 개선된 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법은 추출 및 정제에서 n-부탄올 및 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하지 않으며, 용리에서 메탄올을 사용하지 않음으로써, 티모사포닌 BII를 고순도 및 고수율로 획득하는 것을 가능하게 한다.

따라서, 본 발명은

(a) 원료로서 중국 전통적인 의약인 지모 또는 Anemarrhena asphodeloides Bge.의 신선한 뿌리 또는 신선한 근경의 추출용 조각을 제공하고, 물, 아세톤, 에탄올, 프로판올, 및 그중 2 개 이상의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 용매로 추출하는 단계;

b) a)로부터 얻어진 추출물을, 레진 흡착, 폴리아미드 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 방법에 의해 분리하고, 물, 아세톤, 아세토니트릴, 에탄올, 프로판올, 및 그중 2 개 이상의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 용리액에 의해 용리하는 단계; 및

c) b)의 용리액를 합하고, 건조하고, 티모사포닌 BII를 획득하는 단계를 포함하는 티모사포닌 BII를 제조하는 개선된 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 단계 (a)에서, 사용되는 용매는 물, 아세톤, 에탄올, 및 프로판올 중 어느 하나 또는 그중 2 개 이상이 임의의 비율로 구성된 혼합물일 수 있다. 추출은 함침 추출 또는 실온에서 초음파 추출기 중에서의 초음파 추출, 또는 가열 조건 하에서 함침 추출 또는 환류 추출일 수 있으며, 추출은 1 회 또는 그 이상 수행할 수 있다. 단계 (a)에서, 바람직한 추출방법은 다음과 같다:

물을 이용한 다림(decoction); 또는 10 내지 90% 에탄올 수용액을 이용한 환류, 디콜레이션(decoaltion), 또는 초음파 추출; 또는 10 내지 80% 아세톤 수용액을 이용한 환류, 디콜레이션, 또는 초음파 추출.

본 발명에 따르면, 레진 흡착에 관한 단계 b)에서, 사용되는 레진은 D-101 타입 흡착 레진, AB-8 타입 흡착 레진, XAD-2 타입 흡착 레진, HP20 타입 흡착 레진, SP825 타입 흡착 레진, SP700 타입 흡착 레진, CHP-20P 타입 흡착 레진, 또는 SP70 타입 흡착 레진, 또는 다른 타입의 폴리스티렌(PS) 거대다공성 흡착 레진일 수 있다. 사용되는 용리액은 물, 아세톤, 에탄올, 및 프로판올중 하나 또는 그 이상일 수 있다. 용리 방법은 등용매 용리 또는 기울기 용리일 수 있다.

특정 구현예에서, 원심분리 상등액 또는 추출 여액을 거대 다공성 레진에 흡착시키고, 불순물은 물 또는 저농도의 아세톤 수용액이나 저가 알콜(예: 에탄올 또는 프로판올) 수용액으로 용리함으로써 제거할 수 있으며, 여기에서 농도는 5 내지 30%일 수 있고, 부피는 컬럼 부피의 2 내지 7배(2 내지 7 BV)일 수 있다. 그런 다음, 컬럼을 고농도의 아세톤 수용액 또는 저가 알콜(예: 에탄올 또는 프로판올) 수용액으로 용리하며, 여기에서 여기에서 농도는 20 내지 70%일 수 있고, 부피는 컬럼 부피의 2 내지 7배(2 내지 7 BV)일 수 있다. 검출 결과에 따라, 용출액(eluate)의 전부 또는 일부를 모으고, 용매를 회수하며, 잔사를 농축하여 원료 티모사포닌 BII을 얻는다.

본 발명에 따르면, 단계 b)에서 이용될 수 있는 또 다른 방법으로서, 폴리아미드 크로마토그래피는 컬럼 크로마토그래피 또는 고정상 흡착 여과 방법일 수 있으며, 용리액은 물, 아세톤, 아세토니트릴, 에탄올, 및 프로판올 중 하나 또는 그이상일 수 있다. 용리 방법은 등용매 용리 또는 기울기 용리일 수 있다.

특정 구현예에서, 티모사포닌 BII의 수용액을 폴리아미드 컬럼에 로딩하고 물 또는 저농도의 아세톤 수용액이나 저급 알콜(예: 에탄올 또는 프로판올) 수용액으로 용리하며, 여기에서 농도는 0 내지 15% 일 수 있고, 부피는 컬럼 부피의 2 내지 5 배(2 내지 5 BV)일 수 있다. 검출 결과에 따라, 용출액의 전부 또는 일부를 모으고, 용매를 회수하며, 잔사를 농축하여 티모사포닌 BII를 얻는다. 또 다른 방법으로서, 폴리아미드를 티모사포닌 BII를 포함하는 수용액에 부가하고 충분히 교반하고 정치하고 Buchenr 깔대기에 의해 여과한 다음, 물 또는 저농도의 아세톤 수용액이나 저가 알콜 수용액으로 용리한다. 검출 결과에 따라, 용출액 전체 또는 일부를 합하고, 용매를 회수하고, 잔사를 농축하여 티모사포닌 BII를 얻는다. 폴리아미드는 고농도의 아세톤 수용액, 에탄올 수용액, 또는 프로판올 수용액으로, 또는 산이나 알칼리로 재생시킬 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 단계 b)에서 사용될 수 있는 또 다른 방법으로서, 역상 컬럼 크로마토그래피는 정상압 또는 가압 역상 컬럼 크로마토그래피일 수 있다. 컬럼 충진물은 실리카 겔 역상 18(실리카 겔 RP-18) 또는 실리카 겔 역상 8(실리카겔 RP-8)일 수 있다. 용리액은 아세토니트릴-물, 아세톤-물, 에탄올-물, 및 프로판올-물 중 하나 이상일 수 있다. 용리 방법은 등용매 용리 또는 기울기 용리일 수 있다.

특정 구현예에서, 티모사포닌 BII를 함유하는 샘플을 용리액에 녹이고, 그 용액을 역상 컬럼에서 크로마토그래피를 수행하고, 아세토니트릴-물, 아세톤-물, 에탄올-물, 및 프로판올-물 중 하나 또는 그 이상으로 용리할 수 있으며, 여기에서 유기용매의 농도는 15 내지 60%일 수 있고, 용출액을 분획별로 수집한다. 검출 결과에 따라, 용출액의 일부를 합하고, 용매를 회수하며, 잔사를 농축하여 티모사포닌 BII를 얻는다.

본 발명에 따른 방법의 단계 b)에서 사용될 수 있는 또 다른 방법으로서, Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피는 정상압 또는 가압 컬럼 크로마토그래피일 수 있다. 용리액은 아세토니트릴-물, 아세톤-물, 에탄올-물, 및 프로판올-물 중 하나 이상일 수 있으며, 용리 방법은 등용매 용리 또는 기울기 용리일 수 있다.

특정 구현예에서, 티모사포닌 BII를 함유하는 샘플을 용리액에 녹이고, Sephadex LH-20에서 크로마토그래피를 수행하고, 아세토니트릴-물, 아세톤-물, C2 내지 C5 알콜(예: 에탄올 및 프로판올)-물(여기에서, 유기용매의 농도는 5~60%일 수 있다) 중 하나 또는 그 이상으로 용리하며, 용출액을 분획별로 수집한다. 검출 결과에 따라, 용출액의 일부를 합하고, 용매를 회수하며, 잔사를 농축하여 티모사포닌 BII를 얻는다.

본 발명에 따르면, 단계 c)에서, 당해 기술분야에 공지된 건조 방법, 예를 들어 감압 건조, 동결 건조, 또는 분무 건조가 이용될 수 있다.

본 발명은 선행기술의 까다로운 문제, 특히 n-부탄올, 메탄올, 및 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피의 사용으로 인해 티모사포닌 BII가 낮은 순도 및 낮은 수율로 얻어지는 문제를 해결하였다. 본 발명의 방법에 따르면, 제조된 티모사포닌 BII의 순도는 90%보다 높으며; 이 방법은 산업화 하기에 간단하고, 실용적이며, 용이하다.

하기 실시예는 본 발명을 보다 상세하게 설명할 것이나, 어떤 식으로든 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1

티모사포닌 BII 의 제조

중국 전통 의약인 지모의 추출용 조각(8 kg)을 분쇄하고, 거기에 50% 에탄올 48 L를 가하였다. 그 약재을 1 시간 이상 함침한 다음, 여과하기 전에 1 시간동안 환류 추출하였다. 잔사를 유사한 방법으로 2 회 더 환류 추출 하였다. 에탄올 추출물을 합하고, 에탄올을 회수하고, 잔사를 40 L가 될 때까지 감압 농축하였다. 전처리된 거대 다공성 흡착 레진 SP825(Mitsubishi Co., Japan)을 컬럼(18 L)에 로딩하고, 물로 평형시켰다. 상기 농축된 추출물을 여과하고, 여액을 컬럼 상에서 크로마토그래피를 수행하고, 물로 세척하여 불순물을 제거하였다. 그런 다음, 컬럼을 컬럼 부피 3 배(3BV)의 35% 에탄올, 3BV의 50% 에탄올, 및 3BV의 95% 에탄올로 순서대로 용리하였다. 검출한 결과, 티모사포닌 BII가 주로 50%의 에탄올 분획에서 수집되는 것으로 나타났다. 이 분획을 소량의 부피가 될 때까지 농축하여 에탄올을 제거한 다음, 추가적인 이용을 위해 에탄올을 최종 농도가 35%가 될 때까지 부가하였다. 재생된 거대다공성 레진 SP825 컬럼(18 L)를 35% 에탄올로 평형시켰다. 상기 샘플을 컬럼 상에서 크로파토그래피 하고, 6BV의 45% 에탄올로 용리하였다. 용출액을 분획당 2,000 mL가 되도록 분획별로 수집하고, 각각의 분획의 순도를 HPLC로 검출하였다. 분획 18 내지 30을 합하고, 농축하여 부피가 작아질 때까지 농축하였다. 획득된 용액을 전치리된 폴리아미드 컬럼(6L, 30-60 메쉬, Linjiang Reagent Chemical Plant) 상에서 크로마토그래피 하고, 5BV의 물로 용리 하였다. 처음의 유색 물질을 함유하는 분획은 버리고, 용출액을 분획당 600 mL가 되도록 수집한 다음, HPLC로 검출하였다. 분획 6 내지 23을 합하고, 농축하고, 분무건조하여 티모사포닌 BII(56.5 g)을 얻었다. 생성물의 수율은 원료 의약물질의 0.71% 였으며, HPLC에 의해 검출된 순도는 90.8% 였다.

실시예 2

티모사폰닌 BII 의 제조

중국 전통 의약인 지모의 추출용 조각(5 kg)을 분쇄하고, 거기에 30% 아세톤 30 L를 가하였다. 그 약재을 2 시간 이상 함침한 다음, 여과하기 전에 0.5 시간동안 초음파 오실레이터(oscillator)로 추출하였다. 잔사를 유사한 방법으로 2 회 더 초음파 추출하였다. 아세톤 추출물을 합하고, 아세톤을 회수하고, 잔사를 30 L가 될 때까지 감압 농축하였다. 전처리된 거대 다공성 레진 AB-8(Tianjin Nankai Chemical Plant)을 컬럼(18 L)에 로딩하고, 물로 평형시켰다. 상기 농축된 추출물을 여과하고, 여액을 컬럼 상에서 크로마토그래피를 수행하고, 물로 용리하여 불순물을 제거하였다. 그런 다음, 컬럼을 컬럼 부피 3 배(3BV)의 20% 에탄올, 3BV의 50% 에탄올, 및 3BV의 95% 에탄올로 순차적으로 용리하였다. 검출한 결과, 티모사포닌 BII가 주로 50%의 에탄올 분획에서 수집되는 것으로 나타났다. 이 분획을 소량의 부피가 될 때까지 농축하여 에탄올을 제거한 다음, 진공건조하여 티모사포닌 BII의 조 샘플(286 g)을 수득하였다. 조 샘플 80 g을 25% 아세톤 1,000 mL에 녹이고, 25% 아세톤으로 미리 평형시킨 SILICA GEL RP-18 컬럼(6.5 L) 상에 로딩하였다. 그 컬럼을 28% 아세톤(20,000 mL) 및 30% 아세톤(20,000 mL)의 순서로 용리한 다음, 80% 아세톤(13,000 mL)으로 재생시켰다. 28% 아세톤 및 30% 아세톤의 용출액을 분획당 600 mL가 되도록 분회별로 수집하고, 각각의 분획의 순도를 HPLC로 검출하였다. 분획 6 내지 21을 합하고, 소량의 부피가 될 때까지 농축하여 아세톤을 제거한 다음, 동결건조하여 티모사포닌 BII(12.9 g)을 수득하였다. 생성물의 수율은 원료 의약물질의 0.92% 였으며, HPLC에 의해 검출된 순도는 94.3% 였다.

실시예 3

티모사폰닌 BII 의 제조

중국 전통 의약인 지모의 추출용 조각(5 kg)을 분쇄하고, 거기에 30% 아세톤 30 L를 가하였다. 그 약재을 2 시간 이상 함침한 다음, 여과하기 전에 0.5 시간동안 초음파 오실레이터(oscillator)로 추출하였다. 잔사를 유사한 방법으로 2 회 더 초음파 추출하였다. 아세톤 추출물을 합하고, 아세톤을 회수하고, 잔사를 30 L가 될 때까지 감압 농축하였다. 전처리된 거대 다공성 레진 AB-8(Tianjin Nankai Chemical Plant)을 컬럼(18 L)에 로딩하고, 물로 평형시켰다. 상기 용리된 추출물을 여과하고, 여액을 컬럼 상에서 크로마토그래피를 수행하고, 물로 세척하여 불순물을 제거하였다. 그런 다음, 컬럼을 컬럼 부피 3 배(3BV)의 20% 에탄올, 3BV의 50% 에탄올, 및 3BV의 95% 에탄올로 순차적으로 용리하였다. 검출한 결과, 티모사포닌 BII가 주로 50%의 에탄올 분획에서 수집되는 것으로 나타났다. 이 분획을 소량의 부피가 될 때까지 농축하여 에탄올을 제거한 다음, 진공건조하여 티모사포닌 BII의 조 샘플(290 g)을 수득하였다. 조 샘플 80 g을 25% 아세톤 용액 1,000 mL에 녹이고, 32% 메탄올로 미리 평형시킨 SILICA GEL RP-18 컬럼 상에서 크로마토그래 피 하였다. 그 컬럼을 32% 메탄올(20,000 mL) 및 34% 메탄올(20,000 mL)의 순서로 용리한 다음, 90% 메탄올(15,000 mL)으로 재생시켰다. 32% 메탄올 및 34% 메탄올의 용출액을 분획당 600 mL가 되도록 분회별로 수집하고, 각각의 분획의 순도를 HPLC로 검출하였다. 분획 8 내지 19를 합하고, 소량의 부피가 될 때까지 농축하여 메탄올을 제거한 다음, 동결건조하여 티모사포닌 BII(9.79 g)을 수득하였다. HPLC에 의해 검출한 결과 순도는 73.1% 였다. 샘플을 30% 아세톤에 용해하고, 95℃에서 5 시간동안 환류한 다음, 소량의 부피가 될 때까지 농축하여 아세톤을 제거한 다음, 동결건조하여 티모사포닌 BII(9.7 g)을 수득하였다. 생성물의 수율은 원료 의약물질의 0.70% 였으며, HPLC에 의해 검출된 순도는 93.9% 였다.

실시예 4

티모사폰닌 BII의 제조

Anemarrhena asphodeloides Bunge의 신선한 근경(4 kg)을 슬라이스하고, 여과하기 전에 1 시간동안 물 10 L로 달였다. 그 잔사에 물 8 L를 부가하고, 여과하기 전에 1 시간동안 달였다. 여액을 합하고 10 L가 될 때까지 감압농축하였으며, 거기에 최종 농도가 25%가 되도록 에탄올을 가해 추가의 사용을 위한 추출물을 생성시켰다. 미리 처리된 거대 다공성 레진 D101(Tianjin Agrochemical Plant)을 컬럼(6 L)에 로딩하고, 25% 에탄올로 평형시켰다. 상기 추출 용액을 여과하고, 여액을 컬럼 상에서 크로마토그래피 하였다. 그런 다음, 컬럼을 3BV의 20% 에탄올, 3BV의 35% 에탄올, 및 3BV의 90% 에탄올로 순서대로 용리하였다. 검출한 결과, 티모사포닌 BII가 주로 35%의 에탄올 분획에서 수집되는 것으로 나타났다. 이 분획 을 소량의 부피가 될 때까지 농축하여 에탄올을 제거하였다. 농축된 용출액을 전처리된 폴리아미드 컬럼(6 L, 30-60 메쉬, Linjiang Reagent Chemical Plant) 상에서 크로마토그래피하고, 5BV의 물로 용리하였다. 처음의 유색 물질을 함유하는 분획을 버리고, 용출액을 각 분획이 600 mL가 되도록 분획별로 수집하고, HPLC로 검출하였다. 분획 8 내지 24를 합하고, 농축하고, 분무건조하여 티모사포닌 BII의 조 샘플(51 g)을 수득하였다. 약 40 g의 조 샘플을 35% 에탄올 200 mL에 용해하고, 35% 에탄올로 미리 평형시킨 Sephadex LH-20 컬럼(8.5 L) 상에서 크로마토그래피 하였다. 그 컬럼을 35% 에탄올(50,000 mL)로 용리한 다음, 95% 에탄올(20,000 mL)로 재생시켰다. 35% 에탄올의 용출액을 각 분획이 800 mL를 함유하도록 분획별로 수집하고, 각 분획의 순도를 HPLC로 검출하였다. 분획 16 내지 35를 합하고, 소량의 부피가 될 때까지 농축하여 에탄올을 제거한 다음, 동결건조하여 티모사포닌 BII(11.2 g)을 수득하였다. 생성물의 수율은 신선한 근경의 0.36% 였으며(건조 약재의 1.07%의 수율에 해당), HPLC에 의해 검출된 순도는 92.3% 였다.

실시예 5

티모사포닌 BII 의 제조

Anemarrhena asphodeloides Bunge의 섬유성 뿌리(2 kg)을 자르고, 여과하기 전에 16 L의 물로 1 시간 동안 달였다. 그 잔사에 물 12 L를 부가하고, 여과하기 전에 1 시간동안 달였다. 여액을 합하고 12 L가 될 때까지 감압농축 하였으며, 추가의 사용을 위해 거기에 최종 농도가 15%가 되도록 아세톤을 가했다. 미리 처리된 거대 다공성 레진 SP700(MItsubishi Co., Japan)을 컬럼(6 L)에 로딩하고, 15% 에탄올로 평형시켰다. 상기 추출물을 여과하고, 여액을 컬럼 상에서 크로마토그래피 하였다. 그런 다음, 컬럼을 3BV의 25% 아세톤, 3BV의 35% 아세톤, 및 3BV의 80% 아세톤의 순서대로 용리하였다. 검출한 결과, 티모사포닌 BII가 주로 35%의 아세톤 분획에서 수집되는 것으로 나타났다. 이 분획을 농축하여 아세톤을 제거하고, 분무 건조하여 티모사포닌 BII의 조 샘플(45.0 g)을 수득하였다. 조 샘플 약 40 g을 10% 아세톤 200 mL에 용해하고, 10% 아세톤으로 미리 평형시킨 Sephadex LH-20 컬럼(8.5 L) 상에서 크로마토그래피 하였다. 컬럼을 10% 아세톤(40,000 mL)으로 용리한 다음, 80% 아세톤(20,000 mL)으로 재생시켰다. 10% 아세톤의 용출액을 분획 당 800 mL가 되도록 분획별로 수집하고, 각 분획의 순도를 HPLC로 검출하였다. 분획 20 내지 36을 합하고 소량이 부피가 될 때까지 농축하여 아세톤을 제거한 다음, 동결건조하여 티모사포닌 BII(9.2 g)을 생성시켰다. 생성물의 수율은 뿌리 원료의 0.52% 였으며, HPLC에 의해 검출된 순도는 91.7% 였다.

실시예 6

티모사포닌 BII 의 제조

Anemarrhena asphodeloides Bunge의 신선한 근경(4 kg)을 슬라이스 하고, 여기에 50% 에탄올 8 L를 부가하였다. 약재를 2 시간 동안 함침한 다음, 여과하기 전에 0.5 시간 동안 초음파 오실레이터로 추출하였다. 잔사를 유사하게 2 회 더 초음파 추출하였다. 에탄올 추출물을 합하고, 10 L가 될 때까지 감압농축하여 에탄올을 제거하였다. 미리 처리된 거대다공성 레진 AB-8(Tianjin Nankai Chemical Plant)을 컬럼(6 L)에 로딩하고, 물로 평형시켰다. 상기 농축된 추출물을 여과하 고, 여액을 컬럼 상에서 크로마토그래피 하고, 물로 용리하여 불순물을 제거하였다. 그런 다음, 컬럼을 3BV의 20% 에탄올, 3BV의 50% 에탄올, 및 3BV의 95% 에탄올의 순서로 용리하였다. 검출한 결과, 티모사포닌 BII는 주로 50% 에탄올의 분획에서 수집되었다. 이 분획을 소량의 부피가 될 때까지 농축하여 농축하여 에탄올을 제거한 다음, 진공건조하여 티모사포닌 BII의 조 샘플(59.3 g)을 수득하였다. 조 샘플 50 g을 25% 아세톤 200 mL에 용해하고, 25% 아세톤으로 미리 평형시킨 실리카 겔 RP-18 컬럼(6.5 L) 상에서 크로마토그래피 하였다. 컬럼을 28% 아세톤(20,000 mL) 및 30% 아세톤(20,000 mL)의 순서로 용리한 다음, 80% 아세톤(15,000 mL)으로 재생시켰다. 28% 아세톤 및 30% 아세톤의 용출액을 분획 당 600 mL가 되도록 분획별로 수집하고, 각 분획의 순도를 HPLC로 검출하였다. 분획 6 내지 25를 합하고, 소량의 부피가 될 때까지 농축하여 아세톤을 제거한 다음, 동결 건조하여 티모사포닌 BII(15.6 g)를 수득하였다. 그 샘플 14.1 g을 25% 아세톤 용액 70 mL에 용해하고, 25% 아세톤으로 미리 평형시킨 실리카 겔 RP-18 컬럼(6.5 L) 상에서 크로마토그래피 하였다. 그 컬럼을 28% 아세톤(40,000 mL)으로 용리한 다음, 80% 아세톤(1,200 mL)로 재생시켰다. 용출액을 분획 당 600 mL가 되도로 분획별로 수집하고, 각 분획의 순도를 HPLC로 검출하였다. 분획 8 내지 19를 합하고, 소량의 부피가 될 때까지 농축하여 아세톤을 제거한 다음, 티모사포닌 BII(4.5 g)를 수득하였다. 생성물의 수율은 신선한 근경의 0.15% 였으며(건조 의약 원료를 기초로 할 때 0.44%의 수율에 해당), HPLC에 의해 검출된 순도는 98.6% 였다.

생성물은 백색의 무정형 분말이고, mp > 243℃(dec)이고, Liebermann- Burchard 반응 및 Molish 반응 모두에 대해 양성이며, Ehrilich 시약에 대해 양성이었다.

획득된 티모사포닌 BII의 구조는 IR, MS, 및 NMR에 의해 다음과 같이 규명되었다:

하기 표 1에 ¹³C-NMR 데이터를 나타내었다. 화합물은 (25S)-26-O-β-D-글루코피라노실-22-히드록시-5β-퓨로스탄-3β,26-디올-3-O-β-D-글루코피라노실-(1→2)-β-D-갈락토피라노사이드였다.

비교예 I

티모사포닌 BII 의 제조

중국의 전통적인 의약인 지모(1 kg)의 추출용 조각을 분쇄하고, 거기에 60% 에탄올 6 L를 가했다. 약물을 1 시간이상 함침한 다음, 여과하기 전에 1 시간동안 가열하여 환류 추출하였다. 잔사를 유사하게 2 회 더 환류 추출하였다. 에탄올 추출물을 합하고, 4 L가 될 때까지 감압농축하여 에탄올을 제거하였다. 물로 포화된 n-부탄올 4 L를 상기 농축된 용액에 가했다. 획득된 용액을 진탕하여 균질하게 혼합하고 잠시 방치한 후에 층을 형성시켰다. 그런 다음, n-부탄올 층을 수집하고, 수층을 물로 포화된 n-부탄올을 부가함으로써 유사하게 4 회 더 추출하였다. 5 회의 n-부탄올 추출물을 합하고, 농축 건조함으로써 사포닌(33.1 g)을 획득하였다. 사포닌을 메탄올 중에 녹이고, 실리카 겔(60 g)과 혼합한 다음, 가열하여 용매를 증발시킴으로써 건조하였다. 혼합 샘플을 건조 방법에 의해 충진된 실리카 겔 컬럼(3 L) 상에서 크로마토그래피 하고, 클로로포름-메탄올-물의 기울기 혼합물로 용리하였다. 티모사포닌 BII를 함유하는 클로로포름-메탄올-물(60:40:10, 더 낮은 상) 용출물 수집하고 농축 건조하여 조 생성물(2.3 g)을 획득하였다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼(500 mL) 상에서 더 크로마토그래피 하고, 클로로포름-메탄올-물로 용리하였다. 클로로포름-메탄올-물(65:35:10, 더 낮은 상)의 용출물을 분획 당 50 mL를 갖도록 분획 별로 수집하였다. 분획 15 내지 23을 농축하여 건조함으로써 생성물(0.67 g)을 획득하였다. 생성물을 32% 메탄올 중에 용해하고, 실리카 겔 RP-18 컬럼(600 mL) 상에서 크로마토그래피 하였다. 컬럼을 32% 메탄올(1,800 mL) 및 34% 메탄올(1,800 mL)의 순서로 용리한 다음, 90% 메탄올(1,200 mL)로 재생하였다. 32% 메탄올 및 34% 메탄올의 용출물을 분획당 50 mL가 되도록 분획별로 수집하고, 각 분획의 순도를 HPLC로 검출하였다. 분획 13 내지 21을 합하고 소량의 부피가 될 때까지 농축하여 메탄올을 제거한 다음, 동결건조하여 티모사포닌 BII(0.34 g)를 획득하였다. HPLC에 의해 검출된 순도는 75.5% 였다. 생성물을 30% 아세톤 중에 용해하고, 95℃의 워터 배쓰에서 5 시간동안 환류하고, 농축하여 아세톤을 제거한 다음, 동결건조하여 티모사포닌 BII(0.33 g)을 획득하였다. 생성물의 수율은 원료 의약 물질의 0.033% 였으며, 그 순도는 93.4% 였다.

Claims

(a) 원료로서 중국 전통적인 의약인 지모 또는 Anemarrhena asphodeloides Bge.의 신선한 뿌리 또는 신선한 근경의 추출용 조각을 제공하고, 물, 아세톤, 에탄올, 프로판올, 및 그중 2 개 이상의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 용매로 추출하는 단계;

b) a)로부터 얻어진 추출물을, 레진 흡착, 폴리아미드 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 방법에 의해 분리하고, 물, 아세톤, 아세토니트릴, 에탄올, 프로판올, 및 그중 2 개 이상의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 용리액에 의해 용리하는 단계; 및

c) b)의 용출액을 합하고, 건조하고, 티모사포닌 BII를 획득하는 단계를 포함하는 티모사포닌 BII를 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, a)에서의 추출은 실온에서 또는 가열하면서 추출, 또는 초음파 처리와 함께 수행하고, 그 추출은 1 회 이상 수행할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, a)에서의 용매 추출은

10 내지 95%의 에탄올 수용액으로 환류, 디아콜레이션(diacolation), 또는 초음파 추출; 및

10 내지 80%의 아세톤 수용액으로 환류, 디아콜레이션, 또는 초음파 추출로 구성된 그룹에서 선택된 방법에 의해 추출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, b)에서의 레진 흡착에서, 사용되는 레진은 폴리스티렌 타입 거대다공성 레진이고, 사용되는 용리액는 물, 아세톤, 에탄올, 및 프로판올로 구성된 그룹에서 선택되며, 용리는 등용매 용리 또는 기울기 용리일 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, b)에서의 레진은 D-101 타입 흡착 레진, AB-8 타입 흡착 레진, XAD-2 타입 흡착 레진, HP20 타입 흡착 레진, SP825 타입 흡착 레진, SP700 타입 흡착 레진, CHP-20P 타입 흡착 레진, 또는 SP70 타입 흡착 레진인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 레진 흡착 방법은

원심분리 상등액 또는 용매 추출물의 여액을 거대다공성 레진 상에서 흡착하는 단계,

컬럼 부피의 2 내지 7 배의 양의 물, 또는 5 내지 20%의 아세톤, 에탄올, 또는 프로판올의 수용액으로 용리한 다음, 컬럼 부피의 2 내지 7 배의 20 내지 70%의 아세톤, 에탄올, 또는 프로판올의 수용액으로 용리함으로써 불순물을 제거하는 단 계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, b)에서의 폴리아미드 크로파토그래피는 컬럼 크로마토그래피 또는 고정상 흡착 여과 방법이며, 용리액은 물, 아세톤, 아세토니트릴, 에탄올, 및 프로판올로 구성된 그룹에서 선택된 용매이며, 용리는 등용매 용리 또는 기울기 용리일 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, b)에서 폴리아미드 크로마토그래피는 티모사포닌 BII의 수용액을 폴리아미드 컬럼 상에 로딩하는 단계, 및

그런 다음 그것을 컬럼 부피의 2 내지 7배의 양의 물 또는 0 내지 15%의 아세톤, 에탄올, 또는 프로판올 수용액으로 용리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 역상 컬럼 크로마토그래피는 정상압 또는 가압 역상 컬럼 크로마토그래피이며, 컬럼 충진물은 실라카겔 RP-18 (ODS) 또는 RP-8이고, 용리액는 아세토니트릴-물, 아세톤-물, 에탄올-물, 및 프로판올-물로 구성된 그룹에서 선택되며, 용리는 등용매 용리 또는 기울기 용리일 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피는 정상압 또는 가압 컬럼 크로마토그래피이며, 용리액는 아세토니트릴-물, 아세톤-물, 에탄올-물, 및 프로판올-물로 구성된 그룹에서 선택되며, 용리는 등용매 용리 또는 기울기 용리일 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.