CN104086558A - 一种木莲总倍半萜内酯提取物的提取方法 - Google Patents

一种木莲总倍半萜内酯提取物的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明属植物提取技术领域，涉及一种木莲总倍半萜内酯提取物的提取方法，是将木莲属植物材料的干样粉碎后加入含水的低级醇进行超声波提取；过滤，滤液经减压回收溶剂后以酯类溶剂萃取得到粗提物；粗提物再经柱层析分离、纯化，收集所需成分后即得到木莲总倍半萜内酯提取物。本发明工艺简单，采用超声波提取技术可避免由于长期浸泡所导致的小白菊内酯分解、破坏，节省提取时间，具有产率高、成本低、易于工业生产等特点，所得提取物中小白菊内酯含量高，有效成分明确，具有抗肿瘤的作用，可用于生产抗肿瘤作用的各种药物制剂。

Description

一种木莲总倍半萜内酯提取物的提取方法
技术领域
本发明属植物提取技术领域，涉及一种总倍半萜内酯的提取方法，具体是一种木莲总倍半萜内酯提取物的提取方法。
背景技术
小白菊内酯(英文名：parthenolide、分子式C15H2OO3、相对分子质量248.32、熔点115-116)℃最早是从艾菊中纯化出的一种倍半萜稀内酯化合物(sesquiterpene lactone)，同时也是艾菊提取物中价值最高的主要成分之一，有研究报道小白菊内酯具有抗肿瘤作用。药理研究表明，小白菊内酯是转录因子NF-κB的有效抑制剂，通过阻断IκB-α和IκB-β的降解，抑制NF-κB的正常活化，特异抑制IκB激酶复合物中的β-IκB亚基。小白菊内酯还可以抑制DNA与转录因子NF-κB和STAT的结合，其抗肿瘤效应与激活氨基末端激酶(JNK)、减少有丝分裂原激活蛋白(mitogen-activated protein,MAP)激酶活性、增强活性氧(reactiveoxygen species，ROS)有关。
木莲(Manglietia fordiana)，木兰科木莲属常绿乔木，植株高达20米，在我国主要产于长江流域至两广、云贵等省区，生于海拔300-1200米的溪边、密林中。木莲的树干(茎干)通直圆满材质坚硬，为水箱、高级家具、乐器等小巧工艺用材，一直被用来制作家具，果及树皮入药，治便闭和干咳。目前，小白菊内酯除从艾菊中提取外，还有报道小白菊内酯还可由玉兰、含笑中提取，至今也没有文献记载从木兰科木莲属植物中专门针对富含小白菊内酯总倍半萜内酯提取的研究。
现有针对药用植物有效成分提取的技术大多采用浸泡的方式，浸泡提取的方法往往需要大量的时间、使用大量的溶剂，且溶出的有效成分较低。
超声波提取分离主要是依据物质中有效成分和有效成分群体的存在状态、极性、溶解性等进行分离的一种技术，合理利用超声波振动的方法进行提取的新工艺，使溶剂快速地进入固体物质中，将其物质所含的有机成分尽可能完全地溶于溶剂之中，得到多成分混合提取液。用超声波技术来强化提取分离过程，可有效提高提取分离率，缩短提取时间、节约成本、甚至还可以提高产品的质量和产量。
发明内容
本发明的目的是提供一种木莲总倍半萜内酯提取物的提取方法，采用超声波提取技术可避免由于长期浸泡所导致的小白菊内酯分解、破坏，节省提取时间，所得提取物中小白菊内酯含量高。
本发明所采用的技术方案：
一种木莲总倍半萜内酯提取物的提取方法，其步骤如下：
1、将木莲属植物材料于干燥通风处晒1～2周，将干样粉碎成粗粉；按照每克粗粉用5～10mL提取溶剂的比例关系将含水量为5～20％的低级醇加入到粗粉中，于室温下进行超声波提取。
所述木莲属植物材料是指海南木莲、川滇木莲、滇桂木莲、中缅木莲中的任一种的叶或/和茎干、根、皮。
所述低级醇是甲醇、乙醇、丙醇其中的一种或任两种。
所述超声波提取的次数为2～5次，每次提取时间为20～40分钟。
2、超声波提取后过滤，滤液经减压回收溶剂至原体积的1/5～1/7得到浓缩液；按体积比为浓缩液：萃取剂＝1:2～4的比例在浓缩液中加入萃取剂，萃取至颜色变淡，减压蒸馏萃取剂、干燥得到粗提物。所述萃取剂乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、二氯甲烷中的任一种。
3、将粗提物上硅胶柱色谱，以混合有机溶剂梯度洗脱，跟踪检测，收集含小白菊内酯的流份，减压蒸馏，得到浸膏即为木莲总倍半萜内酯提取物。所述混合有机溶剂是下列混合液中的一种(v/v)：石油醚：乙酸乙酯＝20:1～1:20、己烷：乙酸乙酯＝20:1～1:20、石油醚：丙酮20:1～1:20、己烷：丙酮＝20:1～1:20、氯仿：乙酸乙酯＝40:1～1:1、氯仿：丙酮＝40:1～1:1、氯仿：乙酸乙酯＝40:1～1:1、氯仿：甲醇＝20:1～1:1。
进一步的作为本发明的优选，将木莲总倍半萜内酯提取物经C8或C18反相硅胶柱纯化，以少量的甲醇溶解，以甲醇水溶液洗脱至颜色变淡，HPLC跟踪检测收集小白菊内酯含量大于80％的馏分，减压蒸馏至干，即得到小白菊内酯含量大于80％的木莲总倍半萜内酯提取物。所述甲醇水溶液是指每10体积份数的水溶液中，甲醇的体积份数在4份以上，水的体积份数在6份以下。
本发明工艺简单，采用超声波提取技术可避免由于长期浸泡所导致的小白菊内酯分解、破坏，节省提取时间，所得提取物中小白菊内酯含量高，具有产率高、成本低、易于工业生产等特点。
附图说明
图1是小白菊内酯标准品的HPLC图谱。
图2是小白菊内酯标准品的MS图谱。
图3是实施例一的提取物的HPLC图谱。
图4是实施例一的提取物的MS图谱。
图5是实施例二的提取物的HPLC图谱。
图6是实施例二的提取物的MS图谱。
图7是实施例三的提取物的HPLC图谱。
图8是实施例三的提取物的MS图谱。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一、以海南木莲叶为原料提取木莲总倍半萜内酯
将采集的新鲜海南木莲叶样品经清洗后于干燥通风处晒14天得到干叶，粉碎；称量10.0g粉碎后的干叶于250mL小烧杯中加入100mL85％乙醇常温超声波提取30min后倾出上清液；用相同的方法再提取样品两次，第三次超声提取结束后过滤样品，并将三次超声提取液合并。用30mL85％乙醇溶液分三次洗涤滤渣，将洗涤液与提取液合并将滤液用减压蒸馏的方法浓缩至50mL；浓缩液用乙酸乙酯萃取三次，每次使用120mL乙酸乙酯，合并三次乙酸乙酯层萃取液，减压蒸馏得到浸膏即为粗提物。重复上述操作10次，将浸膏合并，得到粗提物4.953g。将粗提物上硅胶柱色谱，以石油醚与丙酮(20:7，v/v)的混合有机溶剂梯度洗脱，跟踪检测，收集含小白菊内酯的流份，减压蒸馏，得到浸膏0.4873g(海南木莲总倍半萜内酯提取物)。
检验：
取小白菊内酯标准品进行HPLC-MS分析，设置条件为A：0.1％磷酸，B：乙腈，A:B＝40:60，检测波长为210nm，柱温25℃，进样量为10μL。检测出其HPLC图谱如图1所示，检测MS图谱(7.8min分离出物质)如图2所示。
取0.0354g浸膏(海南木莲总倍半萜内酯提取物)用5mL乙酸乙酯溶解，在相同的条件进行HPLC-MS分析，其HPLC图谱如图3所示，MS图谱(7.6-8.9min分离出物质)如图4所示。
由图谱比较可以看出，浸膏的HPLC图谱及MS图谱与同条件下的小白菊内酯标准品的图谱一致，说明海南木莲叶提取物中确存在小白菊内酯。经HPLC检测上述浸膏乙酸乙酯溶液中小白菊内酯含量为60.19717mg/L。
实施例二、以海南木莲皮为原料提取富含小白菊内酯的总倍半萜内酯类化合物
将采集的新鲜海南木莲皮样品经清洗后于干燥通风处晒10天得到干品，粉碎；称量10.0g粉碎后的干品于250mL小烧杯中加入80mL90％甲醇常温超声波提取40min后倾出上清液；用相同的方法再提取样品三次，第四次超声提取结束后过滤样品，并将四次超声提取液合并。用30mL90％甲醇溶液分三次洗涤滤渣，将洗涤液与提取液合并将滤液用减压蒸馏的方法浓缩至60mL；浓缩液用乙酸甲酯萃取三次，每次使用180mL乙酸甲酯，合并三次乙酸甲酯层萃取液，减压蒸馏得到浸膏。重复上述操作10次，将浸膏合并，得到粗提物5.692g。将粗提物上硅胶柱色谱，以氯仿与乙酸乙酯(4:1，v/v)的混合有机溶剂梯度洗脱，跟踪检测，收集含小白菊内酯的流份，减压蒸馏，得到浸膏5.2174g(海南木莲总倍半萜内酯提取物)。将木莲总倍半萜内酯提取物经C8反相硅胶柱纯化：先以少量的甲醇溶解，以80％甲醇水溶液洗脱至颜色变淡，HPLC跟踪检测收集小白菊内酯含量大于80％的馏分，减压蒸馏至干，即得到小白菊内酯含量大于80％的木莲总倍半萜内酯提取物0.2993g。
检测：
取0.0489g提取物以乙酸乙酯为溶液配制成5ml溶液，用与实施例一相同的条件进行HPLC-MS分析含量为172.2795mg/L。其HPLC图谱如图5所示，MS图谱(7.7-8.7min分离出物质)如图6所示。
实施例三、以海南木莲茎干为原料提取木莲总倍半萜内酯并对有效成分纯化
用1000g干燥后的海南木莲茎干用实施例1中方法进行超声波提取得到浸膏(粗提物)59.7849g，将该浸膏用乙醇溶解并用30～60目的硅胶拌样，过200～300目、80×100cm干硅胶柱，用10:1的石油醚与乙酸乙酯溶液洗脱至颜色变浅，再用3:1的石油醚与乙酸乙酯溶液洗脱合并洗脱液，HPLC跟踪检测，收集含小白菊内酯的馏分减压蒸馏至干，用尽量少的甲醇溶解，经80×100cm的C18反相硅胶柱，用4：6的甲醇水溶液洗脱至颜色变淡，再用7：3的甲醇水溶液洗脱系统洗脱，HPLC跟踪检测收集小白菊内酯含量大于80％的馏分，减压蒸馏回收溶剂，得到富含小白菊内酯的总倍半萜内酯提取物3.2g。
检测：
上述总倍半萜内酯提取物经HPLC检测其小白菊内酯含量为89.84％。用与实施例一相同的条件进行HPLC-MS分析。其HPLC图谱如图7所示，MS图谱(7.6-8.9min分离出物质)如图8所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种木莲总倍半萜内酯提取物的提取方法，其特征在于，其步骤如下：
1)、将木莲属植物材料于干燥通风处晒1～2周，将干样粉碎成粗粉；按照每克粗粉用5～10mL提取溶剂的比例关系将含水量为5～20％的低级醇加入到粗粉中，于室温下进行超声波提取；
2)、超声波提取后过滤，滤液经减压回收溶剂至原体积的1/5～1/7得到浓缩液；按体积比为浓缩液：萃取剂＝1:2～4的比例在浓缩液中加入萃取剂，萃取至颜色变淡，减压蒸馏萃取剂、干燥得到粗提物；所述萃取剂乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、二氯甲烷中的任一种；
3)、将粗提物上硅胶柱色谱，以混合有机溶剂梯度洗脱，跟踪检测，收集含小白菊内酯的流份，减压蒸馏，得到浸膏即为木莲总倍半萜内酯提取物；所述混合有机溶剂是下列混合液中的一种：石油醚：乙酸乙酯＝20:1～1:20、己烷：乙酸乙酯＝20:1～1:20、石油醚：丙酮20:1～1:20、己烷：丙酮＝20:1～1:20、氯仿：乙酸乙酯＝40:1～1:1、氯仿：丙酮＝40:1～1:1、氯仿：乙酸乙酯＝40:1～1:1、氯仿：甲醇＝20:1～1:1。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述木莲属植物材料是指海南木莲、川滇木莲、滇桂木莲、中缅木莲中的任一种的叶或/和茎干、根、皮。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述低级醇是甲醇、乙醇、丙醇其中的一种或任两种。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述超声波提取的次数为2～5次，每次提取时间为20～40分钟。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：将木莲总倍半萜内酯提取物经C8或C18反相硅胶柱纯化，以少量的甲醇溶解，以甲醇水溶液洗脱至颜色变淡，HPLC跟踪检测收集小白菊内酯含量大于80％的馏分，减压蒸馏至干，即得到小白菊内酯含量大于80％的木莲总倍半萜内酯提取物；所述甲醇水溶液是指每10体积份数的水溶液中，甲醇的体积份数在4份以上，水的体积份数在6份以下。
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