CN105330709A - 一种同时制备知母中四种药效成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时分离制备知母中主要化学组分新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII的工艺方法，通过组合聚酰胺和大孔吸附树脂，通过分段收集，可以有效的分离制备此四种成分。本工艺对环境友好，树脂和聚酰胺可以重复利用，生产成本低，制备得到的样品纯度在90％以上，并且可以实现规模化生产。

Description

一种同时制备知母中四种药效成分的方法

技术领域

本发明涉及到中药制药技术领域，涉及一种同时制备知母中四种药效成分的方法，具体涉及通过联用两种分离材料实现对知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII制备分离。

背景技术

知母为百合科(Liliacea)植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根茎，具有清热泻火、生津润燥的功效，临床用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘。现代药理研究表明其具有降血糖、抗老年痴呆、抗肿瘤、抗病原微生物、抗血小板聚集、降血糖、解热、抗炎生理活性(徐爱娟等，中药材，2008，31(4)：624-628；YingliWang，et.JEthnopharmacol.2014，153(1)：42-60)，知母中化学成分主要为双苯吡酮类和甾体皂苷类，双苯吡酮类主要成分为新芒果苷(NMF)和芒果苷(MF)，甾体皂苷类主要成分为知母皂苷B-II(TSB-II)、知母皂苷A-III(TSA-III)。芒果苷具有降糖、神经保护、抗氧化、改善记忆、抗肿瘤等药理效应，新芒果苷具有芒果苷相似的药理作用，B-II具有改善认知、抗血栓、抗炎效果，A-III具有抗血小板聚集、抗肿瘤的药理作用，且该四种成分在药材中含量较高，表明其具有潜在的药物开发价值。因此，对此知母中这些成分进行富集纯化具有一定经济价值和社会意义。

采用大孔吸附树脂技术可以实现对知母中总黄酮类成分(段亮亮等，中医研究，2009，22(9)：20-22)和总皂苷类成分(陈志红等，应用化工，2008，37(8)：841-843；胡洋叶等，世界科学技术-中医药现代化，2012，14(1)：1232-1236)富集；若通过大孔吸附树脂技术得到单一化合物知母皂苷B-II、A-III多需要与硅胶柱层析、逆流色谱(Meng-ShunLiu，et.SeparationandPurificationTechnology138(2014)138-143)、制备液相等技术联用才能实现纯化，但受设备限制该工艺很难实现规模化生产，同时成本较高；也有采用大孔吸附树脂对知母皂苷A-III(李志雄等，中成药，2013，35(2)：411-413)、B-II(CN1693310A)分离制备，但现有工艺存在分离制备成分只有一种成分、其他成分没有综合制备利用的问题，或者工艺复杂，生产成本高，很难实现规模化生产。通过单一大孔吸附树脂技术很难实现对知母中四种组分单一成分芒果苷、新芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III的同时分离。

因此建立一种能同时制备知母中芒果苷、新芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III的、对环境友好、分离低成本的方法显得十分必要。

发明内容

本发明目的是建立一种同时规模化分离制备知母中主要化学组分的方法，涉及一种同时制备知母中四种药效成分的方法，洗脱剂中避免使用其他有机溶剂，只使用含水乙醇，在降低生产成本的同时实现对环境友好。

本发明涉及通过联用两种分离材料实现对知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII制备分离；

本发明涉及同时分离制备知母中主要成分的分离方法，涉及聚酰胺-大孔树脂联用对知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII制备分离；

本发明涉及同时制备知母中四种药效成分的方法，先通过聚酰胺洗脱，再通过大孔树脂柱洗脱，同时分离制备知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII的方法。

本发明涉及同时分离制备知母中主要成分的分离方法，其包括：知母用乙醇提取，知母乙醇提取物用聚酰胺吸附，用乙醇洗脱；然后加到大孔树脂柱中，用乙醇洗脱，制备得到知母中四种药效成分。

本发明涉及同时分离制备知母中主要成分的分离方法，其包括：知母用乙醇提取，知母乙醇提取物回收乙醇后，用聚酰胺吸附，水洗除杂，用乙醇洗脱；乙醇洗脱物浓缩后，然后加到大孔树脂柱中，用乙醇洗脱，制备得到知母中四种药效成分。

本工艺的特征工艺是聚酰胺-大孔树脂的连接方式，具体是通过两种分离材料的联用实现分离，即知母乙醇提取液回收醇后的样品水溶后是先通过聚酰胺，不同浓度乙醇洗脱部位回收醇后分别通过大孔吸附树脂分段收集。

聚酰胺-大孔树脂的优选连接方式：先通过聚酰胺树脂，分别用5％-20％乙醇和40％-60％乙醇洗脱，分段后回收乙醇，然后分别采用不同浓度的乙醇进行洗脱大孔树脂柱，大孔树脂柱采用低浓度乙醇为20％-30％乙醇，中浓度乙醇为50％-60％乙醇，高浓度乙醇为70％-80％乙醇洗脱，可以实现对四种组分的规模化制备。

本发明通过实验发现：知母乙醇提取物不能通过“先通过大孔吸附树脂，再通过聚酰胺”而实现新芒果苷、知母皂苷BII、芒果苷和知母皂苷AIII的有效完全分离。

本发明涉及同时分离制备知母中主要成分的分离方法，其包括：

a)将市售的知母药材或饮片直接投料或粉碎成粗粉，以3-10倍体积的30％-80％的乙醇室温超声提取1-3次，每次0.5-1h，或者通过加热方式超声提取或回流提取1-3次，每次1-3h，过滤，合并提取液回收乙醇后加水溶解到适当体积，得提取液。

b)上述提取液通过预处理好的聚酰胺柱，先后采用5％-20％乙醇和40％-60％乙醇溶剂1-5BV(BV为填料的装柱体积，如聚酰胺柱体积为30mL，1-5BV就是洗脱剂要用30-150mL，下同)洗脱。第一部分包括上样流出溶液和5％-20％乙醇洗脱溶液，记作样1；第二部分为40％-60％乙醇洗脱溶液，记作样2。

c)取样1浓缩至无醇味，加水至3-10倍体积至充分溶解，通过大孔吸附树脂柱，分别用水、不同浓度乙醇洗脱。收集低浓度乙醇洗脱部位，记作样3，中浓度洗脱部位，记作样4。

d)取样2浓缩到无醇味，加水适量至充分溶解，通过大孔吸附树脂柱，分别以低浓度、中浓度和高浓度乙醇洗脱，收集低浓度醇洗脱部位，记作样5；高浓度乙醇洗脱部位，记作样6。

e)取样3、样4、样5、样6，浓缩，真空干燥或冷冻干燥，分别得到新芒果苷、知母皂苷BII、芒果苷和知母皂苷AIII。

步骤b)中聚酰胺为30-60目或者60-100目。

步骤c)中大孔吸附树脂为中极性、弱极性或非极性吸附树脂，如D101、HPD100、AB-8、HPD400、HPD600等，低浓度乙醇浓度范围为10％-30％乙醇，中浓度乙醇浓度范围为40％-50％乙醇。

步骤d)中大孔吸附树脂为中极性、弱极性或非极性吸附树脂，如D101、HPD100、AB-8、HPD400、HPD600等，低浓度乙醇浓度范围为20％-30％乙醇，中浓度乙醇浓度范围为50％-60％乙醇，高浓度乙醇浓度范围为70％-80％乙醇。

在上述描述中，上样流速为1-3BV/h，洗脱流速1-2BV/h，洗脱剂体积为柱体积的1-3倍。

聚酰胺-大孔树脂的连接方式：连接方式可以通过一定管线连接以实现流水化。

与现有技术相比，本发明采用乙醇提取，采用聚酰胺和大孔吸附树脂联用技术同时分离制备知母中四种主要成分、芒果苷(MF)、新芒果苷(NMF)、知母皂苷BII(TSB-II)和知母皂苷AIII(TSA-III)，有效避免单一提取带来的资源浪费，提高资源利用效率，且使用的分离材料可以再生处理，洗脱剂为含水乙醇。工艺生产成本低，绿色环保，纯度大于90％，易于规模化生产。知母乙醇提取浓度考察：由表1看出，30％-70％乙醇提取溶剂可以提取绝大部分成分，综合考虑到杂质含量等，以70％乙醇作为提取溶剂。

表1不同乙醇浓度考察结果(n＝2)

大孔吸附树脂型号的静态和动态考察：

分别量取预处理好的18种大孔吸附树脂各1g(干重)，加样品溶液100mL，放入摇床中25℃下回旋震荡12h，滤除溶液，依次分别用水10mL，80％乙醇20mL震荡洗脱2h，测定芒果苷、新芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III的含量，计算比吸附量和解吸率，结果见表2，综合考虑到吸附量、解吸率和树脂价格，选择HPD-100，HPD-400，HPD-600做进一步考察。

表2树脂静态考察

分别取相当于干重8g的HPD-100，HPD-400，HPD-600大孔吸附树脂，装于φ20×300mm层析柱中，取生药浓度1∶10知母提取溶液200mL以2.0BV/h流速通过聚酰胺树脂柱，然后分别以去离子水、10％、20％、30％、40％、50％60％、70％、80％乙醇各80mL以1.0BV/h进行洗脱，80mL分段进行收集，测定新芒果苷、芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III。由表3可以看出，新芒果苷和芒果苷都不能在在三种大孔吸附树脂上实现分离，知母皂苷B-II与芒果苷洗脱曲线也有一定重合，知母皂苷A-III在三种树脂上都能实现分离。在本工艺考察中，芒果苷和知母皂苷B-II在中弱极性树脂HPD400具有相对好的分离效果。

表3三种大孔吸附树脂树脂动态吸附考察

上样质量对四种组分在大孔吸附树脂上分离影响：

取预处理好的相当于8g的HPD400大孔吸附树脂装入φ20×300mm层析柱中，取生药浓度1∶10知母提取溶液60mL，120mL，180mL分别以2.0BV/h通过聚酰胺树脂柱，然后分别以水、10％、20％、30％、40％和50％乙醇1.0BV/h进行洗脱，每80mL分段进行收集，测定新芒果苷、芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III。

由表4可以看出，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III分别被20％-30％乙醇、20％-50％乙醇、40％-60％乙醇和40％-60％乙醇洗脱，随着上样质量的增加，B-II与芒果苷的重合越来越多，为保持合适的分离效率，故上样量以不超过180mL为宜。

表4不同上样体积四种组分在HPD400上的洗脱特征

大孔吸附树脂的型号对四种组分的分离并没有决定性的影响，但因非极性吸附树脂如D101、弱极性吸附树脂如AB-8和中极性吸附树脂具有较大的吸附量，这些型号树脂都可以作为本工艺的分离树脂。四种组分并不能实现在大孔吸附树脂上有效分离。

聚酰胺纯化工艺中聚酰胺规格、厂家和乙醇洗脱浓度考察：分别取预处理好的台州四甲(台州市路桥四甲生化塑料厂)产30-60目(T30-60)、60-100目(T60-100)聚酰胺粉和宝恩(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)产产30-60目(B30-60)、60-100目(B60-100)聚酰胺12g装入φ20×300mm层析柱中，取生药浓度1∶10知母提取溶液40mL以2.0BV/h流速通过聚酰胺树脂柱，然后分别以去离子水、10％，20％，30％，40％，50％乙醇各60mL以1.0BV/h进行洗脱，30mL分段进行收集，测定新芒果苷、芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III。由表5可以看出，台州四甲产60-100目聚酰胺具有较好的分离效果。

表5聚酰胺树脂规格、厂家和乙醇洗脱浓度

聚酰胺纯化工艺中上样质量的考察：

取预处理好的台州四甲产60-100目聚酰胺粉12g装入φ20×300mm层析柱中，取生药浓度1∶10知提取溶液20mL，60mL，100mL，140mL分别以2.0BV/h通过聚酰胺树脂柱，然后分别以水、10％、20％、30％、40％和50％乙醇1.0BV/h进行洗脱，60mL分段进行收集，测定新芒果苷、芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III。由表6可以看出，水和20％乙醇以前洗脱部位可以洗脱得到新芒果苷和知母皂苷B-II，30％-50％部位可以得到芒果苷和知母皂苷A-III，且随着上样量的增加新芒果苷、知母皂苷B-II部位和芒果苷和知母皂苷A-III部位并不会重合，表现出较好的分离效果。但考虑到可能不同样品各成分的差异，为保障分离效果，故上样体积定为不超过100mL，样后先以1BV的20％乙醇进行洗脱后，然后以50％乙醇进行洗脱。

表6不同上样体积四种组分在台州四甲60-100上的洗脱特征

芒果苷、新芒果苷高效液相分析条件：

流动相为0.02％磷酸水和乙腈系统，梯度条件见表7，检测波长为258nm，柱温箱温度30℃，流速1.0mL/min。

表7芒果苷、新芒果苷高效液相流动相条件

知母皂苷BII、知母皂苷AIIIHPLC：

流动相为0.05％甲酸水和乙腈系统，梯度条件见表8，检测器为ELSD检测器，柱温箱温度30℃，流速1.0mL/min，漂移管温度110℃，载气流速2.0L/min，增益值2。

表8知母皂苷BII、AIII高效液相流动相条件

附图说明

图1上样液和制备芒果苷、新芒果苷样品HPLC图

图2上样液和制备知母皂苷BII、知母皂苷AIII样品HPLC图，检测器为ELSD

图3四种组分在三种树脂上的洗脱特征

图4不同上样体积四种组分在HPD400上的洗脱特征

图5四种组分在不同厂家、不同规格聚酰胺柱上洗脱特征

图6不同上样体积四种组分在台州四甲60-100目聚酰胺上的洗脱特征

各图的具体解释

图1的组成ABC(紫外检测器，检测波长258nm，A：上样前样品溶液，B：芒果苷溶液，C：新芒果苷溶液)

图2的组成ABC(检测器：ELSD，A：上样前样品溶液，B：知母皂苷BII溶液，C：知母皂苷AIII溶液)

图3的组成ABC(A：HPD100，B：HPD400，C：HPD600)

图4的组成ABC(A：60mLB：120mLC：180mL)

图5的组成ABCD(A：台州四甲30-60，B：台州四甲60-100，C：宝恩30-60，D：宝恩60-100)

图6的组成ABCD(A：20mL，B：60mL，C：100mL，D：120mL)

具体实施方式

实施例1

取500g知母药材粉碎成60目粉，5000mL的50％乙醇超声提取2次，每次0.5h，抽滤，合并提取液，回收至无醇味，加水至3000ml，以2BV/h流速通过30-60目聚酰胺柱层析柱，续以2倍柱体积的15％乙醇以1BV/h流速洗脱，然后以2倍柱体积的40％乙醇以1BV/h流速洗脱，合并上样后流出液和15％洗脱液，回收乙醇，加水至1000mL，记作样1；回收40％乙醇洗脱部分除去乙醇，加水至2000mL充分溶解，记作样2。样1以2BV/h流速通过HPD-400大孔树脂层析柱，分别用1.5倍柱体积的10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、40％乙醇以1BV/流速洗脱，分别回收20％乙醇洗脱部位、40％乙醇洗脱部位后冻干，分别得到新芒果苷0.55g、知母皂苷BII9.53g；样2以2BV/h流速通过的HPD-400大孔树脂柱层析柱，分别用1.5倍量20％乙醇、30％乙醇、60％乙醇、70％乙醇洗脱，分别回收30％乙醇洗脱部位、70％乙醇洗脱部位后冻干，分别得到芒果苷1.61g、知母皂苷AIII2.13g；

实施例2

取1000g知母药材粉碎成60目粉，10000mL的70％乙醇回流提取2次，每次2h，抽滤，合并提取液，回收至无醇味，加水至4000ml，以2BV/h流速通过的60-100目聚酰胺柱层析柱，续以2倍柱体积的10％乙醇以1BV/h流速洗脱，然后以2倍柱体积的50％乙醇以1BV(/h流速洗脱，合并上样后流出液和20％洗脱液，回收乙醇，加水至2000mL，记作样1；回收40％乙醇洗脱部分除去乙醇，加水至2000mL充分溶解，记作样2。样1以2BV/h流速通过的HPD-100柱层析柱，分别用2倍柱体积的10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、40％乙醇以1BV/流速洗脱，分别回收20％乙醇洗脱部位、40％乙醇洗脱部位后冻干，分别得到新芒果苷1.23g、知母皂苷BII17.56g；样2以2BV/h流速通过HPD-100树脂层析柱，分别用2倍量30％乙醇、60％乙醇、70％乙醇洗脱，分别回收30％乙醇洗脱部位、70％乙醇洗脱部位后冻干，分别得到芒果苷3.60g，知母皂苷AIII3.52g。

实施例3

取1000g知母饮片粉碎成10目粗粉，8000mL的70％乙醇回流提取2次，每次3h，抽滤，合并提取液，回收至无醇味，加水至4000ml，以2BV/h流速通过800mL的30-60目聚酰胺柱层析柱，续以2倍柱体积的20％乙醇以1BV/h流速洗脱，然后以2倍柱体积的50％乙醇以1BV/h流速洗脱，合并上样后流出液和20％洗脱液，回收乙醇，加水至2000mL，记作样1；回收50％乙醇洗脱部分除去乙醇，加水至2000mL充分溶解，记作样2。样1以2BV/h流速通过D-101树脂层析柱，分别用2倍柱体积的10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、40％乙醇以1BV/流速洗脱，分别回收20％乙醇洗脱部位、40％乙醇洗脱部位乙醇后真空干燥，分别得到新芒果苷1.58g、知母皂苷BII21.54g；样2以2BV/h流速通过D-101树脂层析柱，分别用2倍量20％乙醇、30％乙醇、60％乙醇、70％乙醇洗脱，分别回收30％乙醇洗脱部位、70％乙醇洗脱部位乙醇后真空干燥，分别得到芒果苷3.01g、知母皂苷AIII3.25g。

Claims (9)

1.一种同时制备知母中四种药效成分的方法，其特征在于：聚酰胺-大孔树脂柱连用，同时分离制备知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII的方法。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：知母用乙醇提取，知母乙醇提取物用聚酰胺吸附，水洗除杂，用乙醇洗脱；乙醇洗脱物浓缩后，然后加到大孔树脂柱中，用乙醇洗脱，制备得到知母中四种药效成分。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：先通过聚酰胺洗脱，再通过大孔树脂柱洗脱，同时分离制备知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII的方法；聚酰胺采用5％-20％乙醇和40％-60％乙醇溶剂1-5BV洗脱；大孔树脂柱采用低浓度乙醇为20％-30％乙醇，中浓度乙醇为50％-60％乙醇，高浓度乙醇为70％-80％乙醇洗脱。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：包括以下步骤

a)将市售的知母药材或饮片直接投料或粉碎成粗粉，以3-10倍体积的30％-80％的乙醇室温超声提取1-3次，每次0.5-1h，或者通过加热方式超声提取或回流提取1-3次，每次1-3h，过滤，合并提取液回收乙醇后加水溶解到适当体积，得提取液；

b)上述提取液通过预处理好的聚酰胺柱，先后采用5％-20％乙醇和40％-60％乙醇溶剂1-5BV洗脱。第一部分包括上样流出溶液和5％-20％乙醇洗脱溶液，记作样1；第二部分为40％-60％乙醇洗脱溶液，记作样2；

c)取样1浓缩至无醇味，加水至3-10倍体积至充分溶解，通过大孔吸附树脂柱，分别用水、不同浓度乙醇洗脱；收集低浓度乙醇洗脱部位，记作样3，中浓度洗脱部位，记作样4；

d)取样2浓缩到无醇味，加水适量至充分溶解，通过大孔吸附树脂柱，分别以低浓度、中浓度和高浓度乙醇洗脱，收集低浓度醇洗脱部位，记作样5；高浓度乙醇洗脱部位，记作样6；

e)取样3、样4、样5、样6，浓缩，干燥，分别得到新芒果苷、知母皂苷BII、芒果苷和知母皂苷AIII。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：是通过两种分离材料的联用实现分离，即样品是先通过聚酰胺，不同部位洗脱液回收醇后分别通过大孔吸附树脂分段收集。

6.如权利要求1要求所述的方法，其特征在于：b)中聚酰胺为30-60目或者60-100目。

7.如权利要求1要求所述的方法，其特征在于：c)中大孔吸附树脂为中极性、弱极性或非极性吸附树脂，低浓度乙醇为10-30％乙醇，中浓度乙醇为40％-50％乙醇。

8.如权利要求1要求所述的方法，其特征在于：d)中大孔吸附树脂为中极性、弱极性或非极性吸附树脂，低浓度乙醇为20％-30％乙醇，中浓度乙醇为50％-60％乙醇，高浓度乙醇为70％-80％乙醇。

9.如权利要求1要求所述的方法，其特征在于：上样速度为1-3BV/h，洗脱流速1-2BV，洗脱剂体积为柱体积的1-3倍。