KR101793104B1

KR101793104B1 - 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101793104B1
Application number: KR1020140164080A
Authority: KR
Inventors: 장선일; 유강열; 최영지; 김미희; 정도연
Original assignee: 재단법인 전주농생명소재연구원; 재단법인 발효미생물산업진흥원
Priority date: 2014-11-24
Filing date: 2014-11-24
Publication date: 2017-11-03
Also published as: KR20160062235A

Abstract

본 발명은 꾸지뽕잎 및 뽕잎의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물; 및 꾸지뽕잎 및 뽕잎의 혼합 추출물의 유효량을 대상의 피부에 처리하여 멜라닌 색소의 침착을 개선하는 방법;에 관한 것으로, 본 발명의 꾸지뽕잎 및 뽕잎의 혼합 추출물은 피부 미백 효과가 탁월할 뿐만 아니라, 천연물 유래의 유효성분이므로 안전하고, 꾸지뽕나무 및 뽕나무의 잎 부위를 이용하므로 비교적 공급이 용이하여 화장품 산업에 널리 활용될 수 있다.

Description

꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물{Cosmetic composition for whitening skin comprising mixed extract of Cudrania tricuspidata leaf and Morus alba leaf as effective component}

본 발명은 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 열수 추출물의 유효량을 대상의 피부에 처리하여 멜라닌 색소의 침착을 개선하는 방법에 관한 것이다.

사람의 피부색은 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈의 양에 따라 결정되는데, 이 중 멜라닌에 의한 영향이 가장 크며, 피부의 두께와 반사도 및 혈류량 등에 의해서도 영향을 받는다. 피부색을 결정하는 가장 중요한 요소인 멜라닌 색소는 인체에 정상적으로 존재하는 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)이 표피의 기저 층에 존재하는 멜라닌 세포의 내부에 함유되어 있는 효소인 티로시나제(tyrosinase)에 의해 도파(dopa)로 전환되고, 계속되는 일련의 복잡한 산화과정을 통해 최종적으로 흑갈색의 중합체인 멜라닌이 생성되는 것이다.

티로시나제는 미생물, 식물 및 동물 등 거의 모든 생물종에 분포되어 있으며, 활성 부위에 한 쌍의 구리 이온을 함유하고 있는 금속함유 단백질로, 티로시나제의 기능은 피부와 관련된 질병과 밀접한 관련성이 있어, 지금까지의 미백제에 관한 연구들은 주로 티로시나제의 활성 저해제를 개발하는데 치중되어 왔다. 동물에서는 멜라닌 합성의 이상에 따라 백반증과 색소침착과 같은 비정상적인 멜라닌 착색을 일으키며, 이는 더 심할 경우 피부암을 일으키기도 한다.

현재 알려져 있는 미백을 위한 방법들은 자외선 차단, 신호 억제, 유전자 발현 억제, 효소작용 억제, 색소 환원 및 각질층 제거 등이 있다. 미백 기능을 나타내는 대표적 단일 물질로는 알부틴, 코지산, 아스코르브산 및 히드로퀴논 등이 사용되고 있으며, 현재 자연 친화적인 미백제 개발을 위한 천연 물질의 탐색이 활발히 진행되고 있다.

꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata ( CaLL .) Bureau)는 뽕나무과 (Moraceae)에 속하는 낙엽교목으로 가지에 가시가 많으며 어린 가지에는 털이 있고, 잎은 어긋나고 때때로 3 갈래로 갈라지며, 여러 개의 열매가 뭉쳐서 커다란 하나의 열매처럼 맺히고 붉은색으로 익은 특징이 있다. 최근 꾸지뽕나무 줄기 또는 열매를 대상으로 활발히 연구되고 있는데, 이들의 에탄올 추출물은 글루티놀(glutinol), 타락세론(taraxerone), 퀘세틴(quercetin), 캠퍼롤(kaempferol), 이소람네틴(isorhamnetin), 오로볼(orobol), 탁시폴린(taxifolin), 나린제닌(naringenin) 등이 함유되어 있으며, 티로시나제의 억제, 항산화 효과 및 항염증 효과 등이 보고되어 있다. 그러나 꾸지뽕잎을 대상으로 활성물질의 추적과 생리활성에 대한 보고는 미흡한 실정이다.

한편, 뽕나무(Morus alba L.)는 뽕나무과(Moraceae)에 속하는 낙엽 활엽교목으로 열매와 잎이 산업용으로 활발히 활용되고 있는데, 뽕잎(Mulberry leaves)은 한약명으로 상엽(Mori Folium)이라 하는데, 뽕잎에는 플라본(flavones), 트리테르펜(trierpenes), 스테로이드(steroids), 무기질 성분 및 식이섬유가 풍부하여 당뇨뿐만 아니라 혈관질환을 예방하거나 치료하는데 활용되어 왔다. 뽕잎에는 레스베라트롤(resveratrol)과 같은 스틸베노이드(stillbenoid)계 성분과 모루신(morusin), 멀베린(mulberrin), 퀘세틴(quercetin), 캠퍼롤(kaempferol) 및 아스트라갈린(astragalin) 과 같은 플라보노이드(flavonid) 계열의 성분이 풍부하게 함유되어 있어 항당뇨, 항산화 및 항염증, 항고지혈증 및 항균작용이 있는 것으로 알려져 있다. 최근에는 뽕잎을 대상으로 캠퍼롤(kaempferol) 및 아스트라갈린(astragalin)과 같은 플라보노이드(flavonoid) 계열의 물질을 분리하여 2,2'-아조비스중염산염(2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride)이 유도하는 산화적 스트레스로부터 적혈구의 손상을 보호할 수 있는 효과가 보고된 바 있으나, 현재까지 꾸지뽕잎과 뽕잎 추출물을 조합한 미백 활성에 대해서는 보고된 바 없다.

한편, 한국공개특허 제2014-0128110호에는 '꾸지뽕 추출물을 함유하는 피부외용제'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0567200호에는 '뽕잎 분말을 포함하는 황토팩 조성물 및 그 제조방법'이 개시되어 있으며, [한국식품저장유통학회지, 2011년, 제18권 p236]에는 '꾸지뽕 열매 발효 추출물의 항산화 특성과 엘라스테이스(Elastase) 및 티로시나제(Tyrosinase) 저해활성'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 꾸지뽕잎 및 뽕잎으로부터 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 유효성분인 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물이 꾸지뽕잎 추출물 및 뽕잎 추출물 단독에 비해 티로시나제의 억제 활성과 멜라닌 생성 억제 효과가 현저하다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 열수 추출물의 유효량을 인간을 제외한 포유류의 피부에 처리하여 멜라닌 색소의 침착을 개선하는 방법을 제공한다.

본 발명의 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물은 피부 미백 효과가 탁월할 뿐만 아니라, 식물 유래의 추출물이므로 안전하고, 꾸지뽕잎 및 뽕잎은 비교적 공급이 용이하여 화장품 산업에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 꾸지뽕잎; 뽕잎; 및 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물;의 티로시나제 활성 억제에 대한 효소반응 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물이 세포독성에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 3은 본 발명의 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물이 세포 내의 티로시나제 활성 억제에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 4는 본 발명의 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물이 멜라닌 자극 호르몬인 α-MSH(α-melanin stimulating hormone)로 활성화된 마우스 흑색종 B16 세포에서 멜라닌 합성에 미치는 영향을 평가한 결과이다.

본 발명은 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물은 꾸지뽕잎 및 뽕잎의 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 에틸 아세테이트 또는 이들의 혼합 용매의 추출물일 수 있고, 바람직하게는 물 추출물이며, 더욱 바람직하게는 꾸지뽕잎 및 뽕잎 열수 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 꾸지뽕잎 및 뽕잎 열수 추출물은 채취한 꾸지뽕잎 및 뽕잎을 물로 세척한 후 4~6분간 증기로 찐 후 실온에서 건조하고, 35~45℃의 건조기에서 10~14시간 동안 건조한 후, 건조한 꾸지뽕잎 및 뽕잎 각각 80~120g에 대하여 800~1,500㎖의 비율로 물을 첨가하여 1~3시간 끓여 추출한 다음, 여과하고 동결건조기로 건조하여 제조할 수 있고, 바람직하게는 채취한 꾸지뽕잎 및 뽕잎을 물로 세척한 후 5분간 증기로 찐 후 실온에서 건조하고, 40℃의 건조기에서 12시간 동안 건조한 후, 건조한 꾸지뽕잎 및 뽕잎을 각각 200g을 증류수 2,500㎖에 넣고 3시간 끓여 추출한 다음, 여과하고 동결건조기로 건조하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 피부 외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 화합물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부 미백 활성 성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 피부 미백 활성 성분으로는 코지산 및 이의 유도체, 알부틴, 아스코르브산 및 이의 유도체, 히드로퀴논 및 이의 유도체, 레조르시놀, 사이클로알카논, 메틸렌디옥시페닐 알칸올, 2,7-디니트로인다졸 또는 덩굴귤 추출물, 쌀 추출물, 감초 추출물과 같은 식물 추출물 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기와 같이 피부 미백용 화장료 조성물을 화장품으로 제형화할 경우, 활성 성분에 대한 담체로 작용하는 피부에 적용가능한 공지의 부형제를 포함할 수 있다. 화장품으로 제형화 시에는 국제화장품 성분 사전(International cosmetic ingredient dictionary) 제67판(1995)에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있을 것이다. 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.

본 발명의 일 구현예에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 10중량% 함유될 수 있고, 바람직하게는 0.005 내지 1중량% 함유되어 있을 수 있으나, 바람직한 미백 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물의 유효량을 인간을 제외한 포유류의 피부에 처리하여 멜라닌 색소의 침착을 개선하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 멜라닌 색소의 침착을 개선하는 방법에 있어서, 상기 대상은 인간을 제외한 포유류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, '유효량'이라 함은 피부의 과다 색소 침착을 억제, 저해 또는 완화시킬 수 있는 추출물의 양을 의미한다. 본 발명의 피부 미백용 조성물에 포함되는 상기 추출물의 유효량은 피부 미백용 조성물이 제품화되는 형태, 상기 화합물이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 상기 피부 미백용 조성물이 피부의 과다 색소 침착에 따른 피부과적 치료를 위한 의약품으로 제품화되는 경우에는 일상적으로 피부에 적용하게 되는 화장품으로 제품화되는 경우에 비해 높은 농도로 상기 꾸지뽕잎 및 뽕잎 열수 추출물을 포함할 수 있을 것이다. 화장품으로 제품화되는 경우에 있어서도 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제, 세정제 등과 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 상기 추출물을 포함할 수 있을 것이다. 반면 유효성분이 장기간 동안 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림, 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 추출물을 포함해도 무방할 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 열수 추출

본 발명의 실시예에서 사용한 꾸지뽕잎은 전라북도 순창군 농장과 부안군 농장에서 2014년 6월 20일에 채취하였고, 뽕잎은 전북 완주군 소양면 만덕산에서 2014년 5월 30일 채취하였다. 채취한 후, 꾸지뽕잎 표본(#CT14-06-20-CT)과 뽕잎 표본(#MA14-06-20)은 전주대학교 대체의학대학 보건관리 연구실에 보관하고 있다.

상기 채취한 꾸지뽕잎 및 뽕잎을 각각 물로 세척 후, 5분간 증기로 찐 후 실온에서 건조하고, 40℃의 건조기에서 12시간 동안 건조한 후, 분말로 제조하였다.

상기 제조한 200g의 꾸지뽕잎 및 200g의 뽕잎의 분말을 혼합하여 증류수 2,500㎖에 넣고 3시간 끓여 추출한 다음, 여과하고 동결건조기로 건조하여 약 18g을 회수한 후 -20℃에서 보관하였다.

본 발명의 혼합 추출물의 시너지 효과를 입증하기 위한 비교 시료로, 단독의 꾸지뽕잎 추출물과 뽕잎 추출물을 제조하였다. 꾸지뽕잎 추출물은 상기와 동일한 방법으로 400g의 꾸지뽕잎 단독의 분말을 2,500㎖의 증류수에 넣고 3시간 끓여 추출한 다음, 여과하고 동결건조기로 건조하여 약 18g을 회수한 후 -20℃에서 보관하였으며, 마찬가지로 뽕잎 추출물의 경우도 동일한 방법으로 추출물을 획득하고 여과한 다음 동결건조 후 -20℃에서 보관하였다.

이하, 실시예 2 내지 5에서는 본 실시예 1에서 제조한 각각의 추출물을 이용하여 활성분석을 실시하였으며. 실시한 결과의 모든 실험값은 평균±표준오차로 표시하였고, 통계분석은 분산분석(ANOVA)과 스튜던트 T-검정(Student's t-test)을 수행하였다. 유의 수준은 <0.05일 때 유의성이 있는 것으로, 던칸의 다중 범위 검정(Duncan's multiple range test)에 의한 사후분석을 수행하였다.

실시예 2. 미백 활성 검정을 위한 티로시나제( tyrosinase )의 활성 측정

본 실시예 2에서는 꾸지뽕잎 및 뽕잎의 중량에 대하여 1:1 비율로 혼합한 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물을 이용하여, 멜라닌 생성과 관련된 티로시나제 활성 억제에 미치는 영향을 꾸지뽕잎 또는 뽕잎을 단독처리한 것과 비교하고자 하였다.

티로시나제 활성 측정을 위한 버섯 티로시나제(Sigma, USA)는 2,500U/㎖가 되도록 50mM 인산 나트륨 버퍼(pH 6.8)에 녹여 -20℃에서 동결 보관 후, 효소원으로 사용하였다. 시료 10㎕와 효소 10㎕를 160㎕의 완충용액에 첨가하여 25℃에서 5분간 방치하였다. 기질로 L-3,4-디히드록시페닐알라닌(L-3,4-dihydroxyphenylalanine) 20㎕를 첨가하여 10분간 반응시킨 후, 475nm에서 흡광도를 측정하여 하기 식(1)로 계산하였다.

식(1)

티로시나제 활성능(%)=(시료 첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100

본 실시예 2에서는 양성대조군으로 알부틴을 사용하였으며, 본 발명의 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물은 꾸지뽕잎 또는 뽕잎을 단독으로 처리한 경우보다 실시한 모든 농도에서 우수한 티로시나제 활성 억제 효과를 확인할 수 있었다. 본 실시예 2에서는 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 및 800㎍/㎖의 농도로 각각의 시료를 처리하였다.

본원 발명의 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물은 상기 실시예 1에 개시한 바와 같이 꾸지뽕잎과 뽕잎을 중량비로 1:1로 혼합한 상태에서 추출한 것이므로, 혼합 추출물 내의 꾸지뽕잎 및 뽕잎의 농도는 각각 단독 처리한 꾸지뽕 또는 뽕잎 추출물의 농도에 대하여 각각은 50%일 것으로 해석하였다.

본원 발명의 혼합 조성물이 동일한 조건의 모든 농도에서 티로시나제 활성 억제율이 비교 시료인 꾸지뽕잎 추출물 또는 뽕잎 추출물의 단독처리한 경우 뿐만 아니라, 양성대조군인 알부틴보다 효과적으로 티로시나제를 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 800㎍/㎖의 농도에서는 티로시나제의 억제효과가 약 70%로, 그 효과가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다(표 1 및 도 1).

꾸지뽕잎과 뽕잎 1:1(w/w) 혼합 추출물의 티로시나제의 활성 억제효과

	티로시나제 억제율(%)
농도(㎍/㎖)	꾸지뽕잎	뽕잎	꾸지뽕잎+뽕잎 (1:1 혼합비율)	알부틴
12.5	-	7.5^a	10.2^b	-
25	5.1	8.8^a	15.8^b	5.4
50	8.7	10.5^a	19.2^b	15.4^a
100	10.1	18.2^a	35.3^b	19.9^a
200	14.5	20.5^a	50.2^b	24.7^a
400	19.7	24.9^a	65.3^b	30.2^a
800	25.8	30.6^a	70.4^b	35.8^a

^a: 꾸지뽕잎과 비교한 유의성 검증(p<0.05) ^b: 알부틴과 비교한 유의성 검증(p<0.05)

실시예 3. 흑색종 세포의 세포생존율 측정

본 실시예 3에서는 멜라닌 자극 호르몬인 α-MSH(α-melanin stimulating hormone)로 활성화된 마우스 유래 흑색종 세포 B16에서 꾸지뽕잎 및 뽕잎 1:1(w/w) 혼합 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

본 실시예 3에 사용된 마우스 유래 흑색종 세포주(melanoma, B16)는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하였다. B16 세포는 10% FBS (fetal bovine serum, 소태아혈청)와 1%의 항생제(antibiotics)가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 사용하여 습도가 충분하고, 37℃의 온도가 유지되는 CO₂ 배양기(5% CO₂와 95% 대기)에서 배양하였다. 배양된 세포는 웰(well)당 2×10⁴로 계수하여 24 웰(well) 배양 플레이트에 접종하고 24시간 후에 꾸지뽕잎과 뽕잎 혼합 추출물(50~400㎍/㎖) 또는 알부틴(400㎍/㎖)로 처리하고 α-MSH(1μM, α-melanin stimulating hormone)로 자극하여 48시간 배양하였다. B16세포의 생존율은 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 에세이에 의해 측정하였다. 요약하면 MTT 용액(5mg/㎖)을 주입하고 4 시간 동안 37℃에서 방치한 후, 상층액을 제거하고 포르마잔(formazan) 산물을 DMSO (Dimethyl sulfoxide)로 용해하여 96 웰 플레이트로 옮겨 효소면역측정장치(ELISA reader (Molecular Divices, USA))를 이용하여 540nm에서의 흡광도를 측정하였다.

결과는 도 2에 개시한 바와 같이 본 발명의 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물 농도를 50, 100, 200 및 400㎍/㎖으로 처리했을 때, 세포 생존율에 아무런 영향을 주지 않는 것을 확인함으로써, 세포 독성이 거의 없다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 흑색종 세포의 티로시나제 활성 측정

본 실시예 4에서는 상기 실시예 3에 개시한 바와 같이, 꾸지뽕잎과 뽕잎 혼합 추출물이 세포에 독성이 없음을 확인한 후, 멜라닌 자극 호르몬인 α-MSH(α-melanin stimulating hormone)로 활성화된 마우스 유래 흑색종 B16 세포에서 꾸지뽕잎 및 뽕잎 1:1 혼합 추출물의 세포질 내 티로시나제 활성을 확인하였다.

B16 세포의 티로시나제 활성은 Tomita 방법(Pigment Cell Res . 5: 357 1992)에 따라 L-DOPA 산화율을 측정하여 계산하였다.

B16 세포는 웰당 1×10⁵로 계수하여 24 웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후에 추출물을 농도별로 처리하고, α-MSH(1μM)로 자극하여 48시간 배양한 후 냉각(4℃) 인산 완충용액으로 2회 세척하고, 0.25% 트립신을 처리하여 세포를 수확하였다. 상기 세척된 세포는 인산 완충용액을 사용하여 1,200rpm으로 2회 원심세척하고, 150㎕의 용해(lysis) 완충용액(0.1M 인산완충용액(pH 6.8), 1% Triton X-100 및 0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride)을 주입하고 4℃에서 30분간 방치한 후 12,000rpm으로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 단백질 정량은 브래드포드법(Bradford method)로 정량하였고, 각각의 세포용해 액은 웰 당 100㎕씩 96 웰 플레이트에 주입한 후, 상기 인산완충액(pH 6.8)에 100㎕의 0.1% L-DOPA 용액을 다시 주입하여 혼합하고, 37℃에서 60분간 방치한 후, 효소면역 측정장치(ELISA reader)를 이용하여 405nm에서의 흡광도를 측정하였다.

결과는 도 3에 개시한 바와 같이 α-MSH가 처리되지 않은 정상군에 비해서 α-MSH가 처리된 대조군은 티로시나제의 활성이 현저히 증가하는 반면, α-MSH 처리된 대조군에 꾸지뽕잎 및 뽕잎 1:1 혼합 추출물을 처리한 실험군의 경우, 농도에 의존하여 티로시나제 활성이 억제되는 효과가 있다는 것을 확인하였다. 상세하게는 본 발명의 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물 농도를 50, 100, 200 및 400㎍/㎖으로 처리하였으며, 티로시나제 활성이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

특히 꾸지뽕잎과 뽕잎 혼합 추출물 100~400㎍/㎖의 농도로 처리한 경우 세포질 티로시나제 활성율(%)이 70~60%로 확인되었고, 양성대조군인 400㎍/㎖의 알부틴의 처리군에서는 티로시나제 활성율(%)이 80% 정도로 나타나 꾸지뽕잎 및 뽕잎 1:1 혼합 추출물이 알부틴보다 티로시나제 활성억제에 대하여 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 5. 흑색종 세포의 배양 및 웨스턴 블랏을 통한 멜라닌 합성률 측정

본 실시예 5에서는 멜라닌 자극 호르몬인 α-MSH(α-melanin stimulating hormone)로 활성화된 마우스 유래 흑색종 B16 세포에서 본 발명의 꾸지뽕잎 및 뽕잎 추출물이 멜라닌 합성 억제에 미치는 영향을 알아보았다.

마우스 유래 흑색종 세포(melanoma, B16, American Type Culture Collection)는 10% 열처리 된 우태아 혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 MEM 배지를 사용하여 배양하였다. 세포는 2×10⁵/㎖ 밀도로 24 웰 배양 플라스크에 접종하여 약 70% 성장이 도달되었을 때 추출물(100~200㎍/㎖)과 멜라닌 자극 호르몬으로 100nM α-MSH(α-melanin stimulating hormone)를 각각 처리하여 3일 동안 배양하였다. 배양을 마친 세포를 인산 완충식염수로 2번 세척 후, 세포를 모아 차가운 용해 완충용액(lysis buffer, 20mM sodium phosphate(pH 6.8), Triton X-100, 1mM PMSF 및 1mM EDTA)를 이용하여 세포를 용해시키고, 15,000×g에 15분 동안 원심분리를 하여 얻은 멜라닌 펠렛을 20% DMSO가 포함된 1N NaOH로 95℃에서 1시간 동안 녹였다. 녹인 시료를 분광광도계를 사용하여 490nm에서의 흡광도를 측정하였다. 합성 멜라닌(synthetic melanin)을 표준물질로 사용하여 0~50㎍/㎖의 농도 범위에서 얻은 표준 검량선으로부터 브래드포드법(Bradford assay)을 이용하여 멜라닌 단백질 함량을 정량하고, 50㎍을 취해 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리한 다음, 트랜스퍼 용액(20% 메탄올, 25mM Tris, 192mM 글리신, pH 8.3)을 이용해 니트로셀룰로오스 막에 분리된 단백질을 이동시켰다. 비특이적 반응을 제거하기 위해서 5%의 탈지유가 함유된 TTBS(triton-tris buffered saline)로 4℃에서 2시간 이상 충분히 흔들면서 방치하였다. 그 후 TBS(tris buffered saline)로 3회 세척하고, 항-티로시나제(1:1,000)를 첨가하여 3시간 동안 실온에서 반응시킨 후 충분히 세척하고, 호스래디쉬퍼옥시다제가 부착된 염소 항-토끼 IgG(goat anti-rabbit IgG, 1:2,000)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 막은 TBS로 충분히 세척하고 통상적인 ECL(enhanced chemiluminescence) 방법으로 발색시켰다.

결과는 도 4에 개시한 바와 같이, α-MSH가 처리되지 않은 정상군에 비해서 α-MSH 처리된 대조군은 멜라닌 합성률(%)이 현저히 증가하는 반면, α-MSH 처리된 대조군에 꾸지뽕잎 및 뽕잎 1:1 혼합 추출물을 처리한 실험군의 경우, 농도에 의존하여 멜라닌 합성이 억제되는 효과를 보였다. 특히, 꾸지뽕잎 및 뽕잎 추출물의 농도 100㎍/㎖에서 멜라닌 합성 억제율(%)이 약 25% 정도로, 400㎍/㎖의 알부틴에서의 억제율과 거의 비슷하게 나타나 본 발명의 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물이 양성대조군에 비해 우수한 효과가 있음을 확인하였다. 특히, 꾸지뽕잎 및 뽕잎 혼합 추출물의 농도가 200㎍/㎖ 내지 400㎍/㎖에서는 35~40%의 멜라닌 합성 억제율(%)을 보여 멜라닌 합성 억제 효과가 우수함을 확인하였다.

Claims

꾸지뽕잎 및 뽕잎의 혼합 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 꾸지뽕잎 및 뽕잎의 혼합 열수 추출물은 꾸지뽕잎 및 뽕잎을 물로 세척하여 4~6분간 증기로 찌고, 물기가 없어질 때까지 실온에서 건조한 후, 35~45℃의 건조기에서 10~14시간 동안 더 건조하고, 상기 건조한 꾸지뽕잎 및 뽕잎 80~120g에 대하여 800~1,500㎖의 비율로 물을 첨가하여 1~3시간 동안 끓여 추출한 다음, 여과하고 동결건조기로 건조하여 제조한 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 피부 미백용 화장료 조성물의 유효량을 인간을 제외한 포유류의 피부에 처리하여 멜라닌 색소의 침착을 개선하는 방법.