CN115010782B - 熊果酸n-糖苷衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了熊果酸N‑糖苷衍生物及其制备方法和应用，属于化学产品技术领域，其包括结构式I或结构式II，相比于熊果酸，本发明制备的熊果酸N‑糖苷衍生物的抗肿瘤活性显著提高，具有开发成制备肺癌、肝癌或宫颈癌等相关抗肿瘤药物的前景。
Description
技术领域
本发明属于化学产品技术领域，涉及化学产品的衍生物制备技术，具体为熊果酸N-糖苷衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤一直以来都是严重危害人类健康的重大疾病。目前，肿瘤的治疗手段有化疗治疗、激素治疗、免疫治疗和分子靶向治疗。而大多数临床上抗肿瘤药物存在着选择性差，毒副作用大及易产生耐药性问题。因此，抗肿瘤药物的研究一直以来都是药物研发的热点之一。
现代临床上使用的药物中，天然来源及以天然产物为先导化合物经过结构修饰和改造产生的药物超过三分之一。因此，对具有抗肿瘤活性的天然产物进行结构修饰、研究用于抗肿瘤药物的开发具有十分重要的经济和社会效益。
熊果酸为熊果烷型五环三萜类代表性化合物，广泛分布于多种药用植物、水果和蔬菜中。现代药理研究表明熊果酸具有多种药理作用，如抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗过敏等作用。近年来，熊果酸的抗肿瘤活性一直都有相关报道，但是由于熊果酸的抗肿瘤活性弱，其医药用途受到了一定制约。
发明内容
针对上述熊果酸的抗肿瘤活性弱，医药用途被制约的问题，本发明提出了熊果酸N-糖苷衍生物及其制备方法和应用。
本发明提出了一种熊果酸的衍生物，熊果酸N-糖苷衍生物，其相对于熊果酸具有更好的抗肿瘤活性，能够更好地应用于抗肿瘤药物的制备；其具体技术方案如下：
熊果酸N-糖苷衍生物，所述熊果酸N-糖苷衍生物的化学结构式包括如下结构式I或结构式II，
所述结构式I和结构式II中的R均为还原糖。
进一步限定，所述还原糖包括D-岩藻糖、2-脱氧-D-半乳糖、2-脱氧-D-核糖、3-O-甲基-D-葡萄糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、L-来苏糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、L-岩藻糖、2-脱氧-D-葡萄糖、L-核糖或L-阿拉伯糖。
进一步限定，所述结构式I的目标化合物是UA-1、UA-2、UA-3、UA-4或UA-5；所述UA-1的结构式、UA-2的结构式、UA-3的结构式、UA-4的结构式以及UA-5的结构式如下：
进一步限定，所述结构式II的目标化合物是UA-6、UA-7、UA-8、UA-9或UA-10，所述UA-6的结构式、UA-7的结构式、UA-8的结构式、UA-9的结构式以及UA-10的结构式如下：
基于上述的熊果酸N-糖苷衍生物所形成的制备方法，所述结构式I所形成的目标化合物的制备方法包括以下步骤：
1)将熊果酸和4-二甲氨基吡啶溶解于无水四氢呋喃中，在N2保护下，加入氯乙酰氯，回流反应12h-24h，回收溶剂，加入硅胶拌样，经硅胶柱层析得到中间产物2；
2)将中间产物2溶于无水乙醇中，加入碘化钠，在N2保护下室温搅拌，加入甲胺四氢呋喃溶液回流反应3h-24h，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物3；
3)将中间产物3溶于甲醇溶液中，加入还原糖和乙酸进行还原反应，经硅胶柱洗脱得到结构式I的目标化合。
进一步限定，所述步骤3)中还原反应的条件为：反应温度为30℃-50℃，反应时间为24-48小时。
基于上述的熊果酸N-糖苷衍生物所形成的制备方法，所述结构式II所形成的目标化合物的制备方法包括以下步骤：
a)取熊果酸溶于无水二氯甲烷中，搅拌，依次加入N,O-二甲基羟胺盐酸盐和N-甲基吗啉，再缓慢加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，冰浴反应，反应完成后加入盐酸猝灭，加入二氯甲烷萃取，合并有机层，洗涤，浓缩，将浓缩产物溶于无水四氢呋喃中，搅拌，加入四氢铝锂反应，反应结束后加入饱和氯化铵溶液猝灭，萃取，回收溶剂，层析、分离、纯化后溶于甲醇中，分别加入甲氧基盐酸盐和吡啶，回流反应3h-12h，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物4；
b)将中间产物4溶于乙酸中，加入氰基硼氢化钠，室温反应8-12小时，反应结束后，有机相浓缩，层析、分离、纯化得到中间产物5；
c)将中间产物5溶于甲醇中加入还原糖和乙酸，进行糖基化反应，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到结构式II的目标化合物。
进一步限定，所述步骤a)中萃取过程采用的萃取剂为乙酸乙酯。
上述的熊果酸N-糖苷衍生物在用于制备抗肿瘤药物方面的应用。
上述的熊果酸N-糖苷衍生物在用于制备抗肺癌药物、抗肝癌药物以及抗宫颈癌药物方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明所制备的熊果酸N-糖苷衍生物，其是利用天然的熊果酸经过一系列反应生成的，能够很好地代替熊果酸应用于抗肿瘤药物的制备中，且解决了熊果酸抗肿瘤活性弱，相比于熊果酸，本发明制备的熊果酸N-糖苷衍生物的抗肿瘤活性显著提高，其抑制效率与熊果酸相比，高出一个数量级，具有开发成制备肺癌、肝癌或宫颈癌等相关抗肿瘤药物的前景。
附图说明
图1为熊果酸N-糖苷衍生物UA-1的1H-NMR(500MHz，C5D5N)谱；
图2为熊果酸N-糖苷衍生物UA-2的1H-NMR(500MHz，C5D5N)谱；
图3为熊果酸N-糖苷衍生物UA-3的1H-NMR(500MHz，C5D5N)谱；
图4为熊果酸N-糖苷衍生物UA-4的1H-NMR(500MHz，C5D5N)谱；
图5为熊果酸N-糖苷衍生物UA-5的1H-NMR(500MHz，C5D5N)谱；
图6为熊果酸N-糖苷衍生物UA-6的1H-NMR(500MHz，C5D5N)谱；
图7为熊果酸N-糖苷衍生物UA-7的1H-NMR(500MHz，C5D5N)谱；
图8为熊果酸N-糖苷衍生物UA-8的1H-NMR(500MHz，C5D5N)谱；
图9为熊果酸N-糖苷衍生物UA-9的1H-NMR(500MHz，C5D5N)谱；
图10为熊果酸N-糖苷衍生物UA-10的1H-NMR(500MHz，C5D5N)谱；
图11为目标化合物UA-6与熊果酸对HepG2细胞克隆形成能力的影响图；
图12为目标化合物UA-6的浓度对HepG2细胞凋亡数量的柱状图；
图13为目标化合物UA-6的浓度对HepG2细胞凋亡影响的染色显示图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明的技术方案进行进一步地解释说明，但本发明并不限于以下说明的实施方式。
本发明熊果酸N-糖苷衍生物的化学结构式包括如下结构式I或结构式II，
结构式I和结构式II中的R均为还原糖。
优选的，其还原糖为D-岩藻糖、2-脱氧-D-半乳糖、2-脱氧-D-核糖、3-O-甲基-D-葡萄糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、L-来苏糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、L-岩藻糖、2-脱氧-D-葡萄糖、L-核糖或L-阿拉伯糖中的一种。
优选的，结构式I的目标化合物是UA-1、UA-2、UA-3、UA-4或UA-5；其中，UA-1的结构式、UA-2的结构式、UA-3的结构式、UA-4的结构式以及UA-5的结构式如下：
优选的，结构式II的目标化合物是UA-6、UA-7、UA-8、UA-9或UA-10，UA-6的结构式、UA-7的结构式、UA-8的结构式、UA-9的结构式以及UA-10的结构式如下：
基于上述的熊果酸N-糖苷衍生物所形成的制备方法，其中，结构式I所形成的目标化合物的制备方法包括以下步骤：
1)将2g-3g的熊果酸和50㎎-60㎎的4-二甲氨基吡啶溶解于50ml无水四氢呋喃中，在N2保护下，逐滴加入0.96mL，12.1mmol的氯乙酰氯，回流反应12h-24h，回收溶剂，加入硅胶拌样，经硅胶柱层析得到中间产物2；
2)将2g的中间产物2溶于160ml的无水乙醇中，加入0.9g的碘化钠，在N2保护下室温搅拌2h，加入甲胺四氢呋喃溶液回流反应3h-24h，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物3；
3)将54.2mg的中间产物3溶于5ml甲醇溶液中，加入还原糖和乙酸在30℃-50℃的条件下搅拌进行还原反应24h-48h，经硅胶柱洗脱得到结构式I的目标化合。
步骤3)中还原反应的条件为：反应温度为30℃-50℃，反应时间为24-48小时。
具体的，结构式I的目标化合物的制备过程为：
结构式I的目标化合物的制备方法，其具体的实施例包括以下：
实施例1
1)将2.1g的熊果酸和54㎎的4-二甲氨基吡啶溶解于50ml无水四氢呋喃中，在N2保护下，逐滴加入0.96mL，12.1mmol的氯乙酰氯，回流反应16h，回水溶剂(无水四氢呋喃)，加入硅胶拌样，经硅胶柱层析得到中间产物2；
2)将2g的中间产物2溶于160ml的无水乙醇中，加入0.9g的碘化钠，在N2保护下室温搅拌2h，加入甲胺四氢呋喃溶液回流反应12h，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物3；
3)将54.2mg的中间产物3溶于5ml甲醇溶液中，加入D-葡萄糖和乙酸在40℃的条件下搅拌进行还原反应36h，经硅胶柱洗脱得到结构式I的目标化合物UA-1。
实施例2
1)将2g的熊果酸和50㎎的4-二甲氨基吡啶溶解于50ml无水四氢呋喃中，在N2保护下，逐滴加入0.96mL，12.1mmol的氯乙酰氯，回流反应12h，回水溶剂(无水四氢呋喃)，加入硅胶拌样，经硅胶柱层析得到中间产物2；
2)将2g的中间产物2溶于160ml的无水乙醇中，加入0.9g的碘化钠，在N2保护下室温搅拌2h，加入甲胺四氢呋喃溶液回流反应3h，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物3；
3)将54.2mg的中间产物3溶于5ml甲醇溶液中，加入D-半乳糖和乙酸在30℃的条件下搅拌进行还原反应24h，经硅胶柱洗脱得到结构式I的目标化合物UA-2。
实施例3
1)将2.4g的熊果酸和52㎎的4-二甲氨基吡啶溶解于50ml无水四氢呋喃中，在N2保护下，逐滴加入0.96mL，12.1mmol的氯乙酰氯，回流反应24h，回水溶剂(无水四氢呋喃)，加入硅胶拌样，经硅胶柱层析得到中间产物2；
2)将2g的中间产物2溶于160ml的无水乙醇中，加入0.9g的碘化钠，在N2保护下室温搅拌2h，加入甲胺四氢呋喃溶液回流反应24h，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物3；
3)将54.2mg的中间产物3溶于5ml甲醇溶液中，加入2-脱氧-D-葡萄糖和乙酸在50℃的条件下搅拌进行还原反应48h，经硅胶柱洗脱得到结构式I的目标化合物UA-3。
实施例4
1)将2.8g的熊果酸和58㎎的4-二甲氨基吡啶溶解于50ml无水四氢呋喃中，在N2保护下，逐滴加入0.96mL，12.1mmol的氯乙酰氯，回流反应18h，回水溶剂(无水四氢呋喃)，加入硅胶拌样，经硅胶柱层析得到中间产物2；
2)将2g的中间产物2溶于160ml的无水乙醇中，加入0.9g的碘化钠，在N2保护下室温搅拌2h，加入甲胺四氢呋喃溶液回流反应10h，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物3；
3)将54.2mg的中间产物3溶于5ml甲醇溶液中，加入2-脱氧-D-半乳糖和乙酸在35℃的条件下搅拌进行还原反应32h，经硅胶柱洗脱得到结构式I的目标化合物UA-4。
实施例5
1)将3.0g的熊果酸和60㎎的4-二甲氨基吡啶溶解于50ml无水四氢呋喃中，在N2保护下，逐滴加入0.96mL，12.1mmol的氯乙酰氯，回流反应20h，回水溶剂(无水四氢呋喃)，加入硅胶拌样，经硅胶柱层析得到中间产物2；
2)将2g的中间产物2溶于160ml的无水乙醇中，加入0.9g的碘化钠，在N2保护下室温搅拌2h，加入甲胺四氢呋喃溶液回流反应20h，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物3；
3)将54.2mg的中间产物3溶于5ml甲醇溶液中，加入2-脱氧-D-半乳糖和乙酸在45℃的条件下搅拌进行还原反应42h，经硅胶柱洗脱得到结构式I的目标化合物UA-5。
基于上述的熊果酸N-糖苷衍生物所形成的制备方法，结构式II的目标化合物的制备方法包括以下步骤：
a)取4g-5g的熊果酸溶于150ml的无水二氯甲烷中，搅拌，依次加入1.0g-1.5g的N,O-二甲基羟胺盐酸盐和1.5mL-2.0ml、12mmol的N-甲基吗啉，再缓慢加入2.5g-3.0g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，冰浴反应1h-3h，反应完成后加入80mL质量浓度为5％的盐酸猝灭，加入二氯甲烷萃取，合并有机层，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶剂，将浓缩产物溶于100ml无水四氢呋喃中，搅拌30min，加入0.7g的四氢铝锂反应，继续反应4h，反应结束后加入饱和氯化铵溶液猝灭，萃取，回收溶剂(无水四氢呋喃)，层析、分离、纯化后溶于50ml甲醇中，分别加入4g甲氧基盐酸盐和10ml吡啶，回流反应3h-12h，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物4；
b)将1.0g-1.5g的中间产物4溶于100mL乙酸中，加入1.6g氰基硼氢化钠，室温反应8-12小时，反应结束后，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化得到中间产物5；
c)将45㎎-50㎎的中间产物5溶于5ml甲醇中加入30㎎-36㎎的还原糖和60μL的乙酸，进行糖基化反应，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到结构式II的目标化合物。
步骤a)中萃取过程的采用的萃取剂为200mL～500mL的乙酸乙酯。
结构式II所形成的目标化合物的制备方法，其具体的实施例包括以下：
实施例6
a)取4.58g的熊果酸溶于150ml的无水二氯甲烷中，搅拌，依次加入1.2g的N,O-二甲基羟胺盐酸盐和1.6ml、12mmol的N-甲基吗啉，再缓慢加入2.9g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，冰浴反应2h，反应完成后加入80mL质量浓度为5％的盐酸猝灭，加入二氯甲烷萃取，合并有机层，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶剂，将浓缩产物溶于100ml无水四氢呋喃中，搅拌30min，加入0.7g的四氢铝锂反应，继续反应4h，反应结束后加入饱和氯化铵溶液猝灭，萃取，回收溶剂(无水四氢呋喃)，层析、分离、纯化后溶于50ml甲醇中，分别加入4g甲氧基盐酸盐和10ml吡啶，回流反应8h，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物4；
b)将1.2g的中间产物4溶于100mL的乙酸中，加入1.6g的氰基硼氢化钠，室温反应10小时，反应结束后，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化得到中间产物5；
c)将47.2mg的中间产物5溶于5mL的甲醇中，加入30mg的D-葡萄糖和60μL的乙酸，进行还原反应，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到结构式II的目标化合物UA-6。
实施例7
a)取4g的熊果酸溶于150ml的无水二氯甲烷中，搅拌，依次加入1.0g的N,O-二甲基羟胺盐酸盐和1.5ml、12mmol的N-甲基吗啉，再缓慢加入2.5g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，冰浴反应1h，反应完成后加入80mL质量浓度为5％的盐酸猝灭，加入二氯甲烷萃取，合并有机层，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶剂，将浓缩产物溶于100ml无水四氢呋喃中，搅拌30min，加入0.7g的四氢铝锂反应，继续反应4h，反应结束后加入饱和氯化铵溶液猝灭，萃取，回收溶剂(无水四氢呋喃)，层析、分离、纯化后溶于50ml甲醇中，分别加入4g甲氧基盐酸盐和10ml吡啶，回流反应8h，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物4；
b)将1.0g的中间产物4溶于100mL的乙酸中，加入1.6g的氰基硼氢化钠，室温反应8小时，反应结束后，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化得到中间产物5；
c)将45mg的中间产物5溶于5mL的甲醇中，加入32mg的D-半乳糖和60μL的乙酸，进行还原反应，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到结构式II的目标化合物UA-7。
实施例8
a)取4.3g的熊果酸溶于150ml的无水二氯甲烷中，搅拌，依次加入1.3g的N,O-二甲基羟胺盐酸盐和1.8ml、12mmol的N-甲基吗啉，再缓慢加入2.8g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，冰浴反应2.5h，反应完成后加入80mL质量浓度为5％的盐酸猝灭，加入二氯甲烷萃取，合并有机层，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶剂，将浓缩产物溶于100ml无水四氢呋喃中，搅拌30min，加入0.7g的四氢铝锂反应，继续反应4h，反应结束后加入饱和氯化铵溶液猝灭，萃取，回收溶剂(无水四氢呋喃)，层析、分离、纯化后溶于50ml甲醇中，分别加入4g甲氧基盐酸盐和10ml吡啶，回流反应8h，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物4；
b)将1.3g的中间产物4溶于100mL的乙酸中，加入1.6g的氰基硼氢化钠，室温反应12小时，反应结束后，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化得到中间产物5；
c)将48mg的中间产物5溶于5mL的甲醇中，加入34mg的2-脱氧-D-葡萄糖和60μL的乙酸，进行还原反应，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到结构式II的目标化合物UA-8。
实施例9
a)取4.8g的熊果酸溶于150ml的无水二氯甲烷中，搅拌，依次加入1.4g的N,O-二甲基羟胺盐酸盐和1.9ml、12mmol的N-甲基吗啉，再缓慢加入2.9g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，冰浴反应3h，反应完成后加入80mL质量浓度为5％的盐酸猝灭，加入二氯甲烷萃取，合并有机层，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶剂，将浓缩产物溶于100ml无水四氢呋喃中，搅拌30min，加入0.7g的四氢铝锂反应，继续反应4h，反应结束后加入饱和氯化铵溶液猝灭，萃取，回收溶剂(无水四氢呋喃)，层析、分离、纯化后溶于50ml甲醇中，分别加入4g甲氧基盐酸盐和10ml吡啶，回流反应12h，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物4；
b)将1.4g的中间产物4溶于100mL的乙酸中，加入1.6g的氰基硼氢化钠，室温反应10小时，反应结束后，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化得到中间产物5；
c)将49mg的中间产物5溶于5mL的甲醇中，加入36mg的2-脱氧-D-半乳糖糖和60μL的乙酸，进行还原反应，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到结构式II的目标化合物UA-9。
实施例10
a)取5g的熊果酸溶于150ml的无水二氯甲烷中，搅拌，依次加入1.5g的N,O-二甲基羟胺盐酸盐和2.0ml、12mmol的N-甲基吗啉，再缓慢加入3.0g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，冰浴反应3h，反应完成后加入80mL质量浓度为5％的盐酸猝灭，加入二氯甲烷萃取，合并有机层，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶剂，将浓缩产物溶于100ml无水四氢呋喃中，搅拌30min，加入0.7g的四氢铝锂反应，继续反应4h，反应结束后加入饱和氯化铵溶液猝灭，萃取，回收溶剂(无水四氢呋喃)，层析、分离、纯化后溶于50ml甲醇中，分别加入4g甲氧基盐酸盐和10ml吡啶，回流反应12h，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物4；
b)将1.5g的中间产物4溶于100mL的乙酸中，加入1.6g的氰基硼氢化钠，室温反应12小时，反应结束后，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化得到中间产物5；
c)将49mg的中间产物5溶于5mL的甲醇中，加入36mg的D-阿拉伯糖和60μL的乙酸，进行还原反应，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到结构式II的目标化合物UA-10。
参见图1，将实施例1制备的结构式I的目标化合物UA-1进行核磁共振测试，其测试结果为：(0.11g，78％yield).1HNMR(500MHz，C5D5N)δ5.49(s，1H)，4.81(d，J＝10.4Hz，1H，βH1′)，4.80–4.76(m，1H)，4..55(d，J＝10.0Hz，1H)，4.44–4.35(m，1H)，4.32–3.99(m，5H)，3.87(s，3H)，3.86–3.79(m，1H)，2.65(d，J＝11.3Hz，1H)，1.29(d，J＝9.6Hz，3H)，1.04(s，6H)，0.99(s，3H)，0.93(s，3H)，0.85(d，J＝5.3Hz，6H)。表明结构式I的目标化合物UA-1被合成。
参见图2，将实施例2制备的结构式I的目标化合物UA-2进行核磁共振测试，其测试结果为：(51％yield)。1HNMR(500MHz，C5D5N)δ5.49(s，1H)，4.87–4.82(m，1H)，4.79(d，J＝8.7Hz，1H，βH1′)，4.58(dd，J＝18.3，9.4Hz，1H)，4.47(d，J＝3.3Hz，1H)，4.39–4.08(m，6H)，3.99(s，3H)，2.65(d，J＝11.2Hz，1H)，1.25(s，3H)，1.04(s，3H)，0.99(d，J＝6.0Hz，2H)，0.85(s，3H)，0.83(s，3H)，0.80(s，3H)。表明结构式I的目标化合物UA-2被合成。
参见图3，将实施例3制备的结构式I的目标化合物UA-3进行核磁共振测试，其测试结果为：(48％yield)。1HNMR(500MHz，C5D5N)δ5.49(s，1H)，4.82(d，J＝8.9Hz，1H，βH1′)，4.58(d，J＝11.3Hz，1H)，4.43–4.18(m，6H)，4.05(s，3H)，3.97(s，1H)，2.66(d，J＝11.2Hz，1H)，1.25(s，3H)，1.03(d，J＝6.3Hz，6H)，0.99(s，3H)，0.90(s，3H)，0.84(s，3H)，0.82(s，3H)。表明结构式I的目标化合物UA-3被合成。
参见图4，将实施例4制备的结构式I的目标化合物UA-4进行红外光谱测试，其测试结果为：(48％yield)。1HNMR(500MHz，C5D5N)δ5.49(s，1H)，4.78(ddd，J＝18.2，10.1，5.1Hz，2H)，4.45(d，J＝5.9Hz，1H)，4.33–3.91(m，5H)，3.89–3.81(m，4H)，2.65(d，J＝11.2Hz，1H)，1.25(s，3H)，1.04(s，6H)，0.98(d，J＝6.1Hz，3H)，0.90(s，3H)，0.84(d，J＝2.0Hz，3H)。表明结构式I的目标化合物UA-4被合成。
参见图5，将实施例5制备的结构式I的目标化合物UA-5进行核磁共振测试，其测试结果为：(49％yield)。1HNMR(500MHz，C5D5N)δ5.49(s，1H)，5.33(d，J＝5.4Hz，0.33H，αH1′)，4.82–4.77(m，1H)，4.72–4.62(m，1.67H)，4.39–4.14(m，5H)，3.94(m，3H)，3.78(d，J＝12.1Hz，0.67H)，3.59(d，J＝5.4Hz，0.33H)，2.65(d，J＝11.2Hz，1H)，1.25(s，3H)，1.03(d，J＝5.2Hz，6H)，0.99(d，J＝6.2Hz，3H)，0.93(d，J＝5.2Hz，3H)，0.86(s，3H)，0.83(d，J＝3.6Hz，3H)。表明结构式I的目标化合物UA-5被合成。
参见图6，将实施例6制备的结构式II的目标化合物UA-6进行核磁共振测试，其测试结果为：(52％yield)。1HNMR(500MHz，C5D5N)δ5.23(t，J＝3.3Hz，1H)，4.66(d，J＝8.2Hz，1H，βH1′)，4.53(dd，J＝11.8，2.7Hz，1H)，4.42(dd，J＝11.7，4.8Hz，1H)，4.34–4.22(m，3H)，3.98–3.91(m，1H)，3.62(s，3H)，3.54(d，J＝14.7Hz，1H)，3.47(dd，J＝10.8，5.2Hz，1H)，3.04(d，J＝15.3Hz，1H)，1.27(s，3H)，1.21(s，3H)，1.16(s，3H)，1.08(s，3H)，0.98(d，J＝6.3Hz，3H)，0.93(t，J＝2.9Hz，6H)，0.88(s，1H)。表明结构式II的目标化合物UA-6被合成。
参见图7，将实施例7制备的结构式II的目标化合物UA-7进行核磁共振测试，其测试结果为：(42％yield)。1HNMR(500MHz，C5D5N)δ5.22(d，J＝5.8Hz，0.5H，αH1′)，5.11(s，1H)，4.69(d，J＝2.9Hz，0.5H，βH1′)，4.53–4.47(m，1H)，4.44–4.32(m，3H)，4.09(t，J＝6.2Hz，1H)，3.67(dd，J＝13.6，4.5Hz，1H)，3.62(s，3H)，3.51–3.45(m，1H)，2.98(dd，J＝15.2，9.1Hz，2H)，1.26(s，3H)，1.21(s，3H)，1.20(s，3H)，1.06(s，3H)，0.95(d，J＝3.4Hz，3H)，0.93–0.89(m，6H)，0.87(s，1H)。表明结构式II的目标化合物UA-7被合成。
参见图8，将实施例8制备的结构式II的目标化合物UA-8进行核磁共振测试，其测试结果为：(49％yield)。1HNMR(600MHz，C5D5N)δ5.18(s，1H)，4.72(d，J＝10.7Hz，1H，βH1′)，4.55–4.49(m，1H)，4.42(dd，J＝11.5，4.6Hz，1H)，4.30(dd，J＝15.1，7.9Hz，1H)，4.11(t，J＝8.9Hz，1H)，3.85(dd，J＝10.3，5.8Hz，1H)，3.67(s，3H)，3.51–3.46(m，1H)，3.43(d，J＝15.2Hz，1H)，2.83(d，J＝15.2Hz，1H)，1.27(s，3H)，1.22(s，3H)，1.13(s，3H)，1.08(s，3H)，1.00(d，J＝6.2Hz，3H)，0.95(d，J＝6.1Hz，3H)，0.92(s，3H)，0.88(s，1H)。表明结构式II的目标化合物UA-8被合成。
参见图9，将实施例9制备的结构式II的目标化合物UA-9进行核磁共振测试，其测试结果为：(53％yield)。1HNMR(500MHz，C5D5N)δ5.21(dd，J＝5.6，2.3Hz，1H)，5.10(d，J＝5.3Hz，0.8H，αH1′)，4.94–4.90(m，1H)，4.71(dd，J＝5.3，3.4Hz，1H)，4.65(dd，J＝8.5，3.7Hz，1H)，4.55–4.19(m，3H)，3.55–3.45(m，1H)，3.39(d，J＝4.2Hz，3H)，2.68–2.60(m，2H)，2.33–2.26(m，1H)，1.27(s，3H)，1.21(s，3H)，1.16(s，3H)，1.08(s，3H)，0.98(d，J＝6.3Hz，3H)，0.93(t，J＝2.9Hz，6H)，0.88(s，1H)。表明结构式II的目标化合物UA-9被合成。
参见图10，将实施例10制备的结构式II的目标化合物UA-10进行核磁共振测试，其测试结果为：(43％yield)。1HNMR(600MHz，C5D5N)δ5.22(s，1H)，5.14(d，J＝5.0Hz，0.5H，αH1′)，4.99–4.94(m，0.5H)，4.68–4.59(m，1H)，4.44–4.22(m，3H)，4.19–4.15(m，1H)，3.62(s，3H)，3.53–3.41(m，2H)，3.18(d，J＝15.4Hz，1H)，1.27(s，3H)，1.22(s，3H)，1.19(s，3H)，1.06(s，3H)，0.96(d，J＝3.6Hz，3H)，0.94(s，3H)，0.93(d，J＝5.2Hz，3H)，0.88(s，1H)。表明结构式II的目标化合物UA-10被合成。
上述的熊果酸N-糖苷衍生物在用于制备抗肿瘤药物方面的应用。
上述的熊果酸N-糖苷衍生物在用于制备抗肺癌药物、抗肝癌药物以及抗宫颈癌药物方面的应用。
熊果酸N-糖苷衍生物抗肿瘤活性测试：
取等量的结构式I的目标化合物UA-1、结构式I的目标化合物UA-2、结构式I的目标化合物UA-3、结构式I的目标化合物UA-4、结构式I的目标化合物UA-5、结构式II的目标化合物UA-6、结构式II的目标化合物UA-7、结构式II的目标化合物UA-8、结构式II的目标化合物UA-9、结构式II的目标化合物UA-10以及熊果酸分别溶于DMSO中，配置母液，用新鲜的细胞培养液DMEM稀释至相等浓度，肿瘤细胞株以DEME培养基培养悬浮，肿瘤细胞株分别为肺癌细胞(A549)、肝癌细胞(HepG2)和宫颈癌细胞(HeLa)，以1×105个细胞/mL的密度接种于96孔培养板上，在37℃，5％CO2条件下孵育24h。吸走培养基，然后给药。37℃，5％CO2培养48h。然后每孔加入10μLMTT溶液，继续培养4h，洗掉培养基。每孔加入100μLDMSO，振摇10分钟。在490nm下检测吸光值，并按照以下公式计算抑制率：细胞抑制率＝(1-给药细胞组平均吸光值/对照组细胞吸光值)*100％，最后计算IC50值，其中，IC50值为半抑制浓度。试验结果如下：
表1实施例1-实施例10的熊果酸N-糖苷衍生物对三种肿瘤细胞的IC50值
如表1所示，本发明中熊果酸N-糖苷衍生物对A549、HepG2以及HeLa均有很好的抑制作用，其中UA-2和UA-4分别对A549和HeLa的抑制作用非常明显，可将HeLa的IC50值抑制至3.8±1.1μM，抑制效率与熊果酸相比，高出一个数量级；UA-6对这三种肿瘤细胞都有显著的抑制作用，且它们都显著优于熊果酸。
为进一步研究熊果酸N-糖苷衍生物的抗肿瘤作用，以HepG2细胞为例，进行相关机制研究。
(1)取等量的结构式II的目标化合物UA-6和熊果酸分别溶于DMSO中，配置母液，用新鲜的细胞培养液DMEM稀释至相等浓度。将肿瘤细胞株HepG2以每孔1000个细胞数接种于六孔板中，每孔有2mLDMEM培养液，在37℃，5％CO2条件下孵育24h。然后细胞分别用DMSO、不同浓度UA-6和熊果酸处理，每周更换两次培养基，孵育两周。然后用PBS洗去培养液。在4％多聚甲醛中固定，加入适量0.5％结晶紫染色液，拍照。目标化合物UA-6是否诱导HepG2细胞中的细胞死亡，用浓度为2μM、4μM和8μM的UA-6处理细胞，对比目标化合物UA-6和熊果酸对HepG2细胞克隆形成能力的影响，参见图11，与熊果酸相比，细胞克隆形成能力分析显示，HepG2肿瘤细胞的增殖生长被UA-6显著抑制，比熊果酸抑制效果更为明显。
(2)将处于对数生长期的HepG2细胞接种到6孔板中，将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h。加入不同浓度梯度的UA-6培养基(0，2μM，4μM和8μM)，同时设立阴性对照，继续培养24h。而后弃去培养基，并往每个孔中加入胰酶，并不断用培养液吹打细胞，使细胞适度消化并收集细胞。用PBS洗涤，然后2000rpm离心5分钟，再收集细胞，用PBS配制细胞浓度为5×105个。随后用5μL的PI及5μL的Annexin-VFITC进行染色，室温避光孵育5分钟后，流式细胞仪检测(Ex＝488nm；Em＝530nm)。如图12和图13所示，为了深入研究UA-6是否能诱导HepG2细胞凋亡从而抑制生长，用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)对DMSO(control)或UA-6培养的HepG2细胞进行了染色。结果显示经UA-6的处理诱导HepG2细胞的早期和晚期凋亡均呈剂量依赖性(2μM、4μM和8μM)增加(分别为13.92％，28.44％和36.07％)。表明UA-6能够诱导HepG2细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用。
综上所述，本发明制备的熊果酸N-糖苷衍生物对肿瘤细胞具有很好的抑制效果。
Claims (7)
1.熊果酸N-糖苷衍生物，其特征在于，所述熊果酸N-糖苷衍生物的化学结构式包括如下结构式I或结构式II，
所述结构式I的目标化合物是UA-1、UA-2、UA-3、UA-4或UA-5；所述UA-1的结构式、UA-2的结构式、UA-3的结构式、UA-4的结构式以及UA-5的结构式如下：
所述结构式II的目标化合物是UA-6、UA-7、UA-8或UA-10，所述UA-6的结构式、UA-7的结构式、UA-8的结构式以及UA-10的结构式如下：
2.基于权利要求1所述的熊果酸N-糖苷衍生物所形成的制备方法，其特征在于，所述结构式I所形成的目标化合物的制备方法包括以下步骤：
1)将熊果酸和4-二甲氨基吡啶溶解于无水四氢呋喃中，在N2保护下，加入氯乙酰氯，回流反应12h-24h，回收溶剂，加入硅胶拌样，经硅胶柱层析得到中间产物2；
2)将中间产物2溶于无水乙醇中，加入碘化钠，在N2保护下室温搅拌，加入甲胺四氢呋喃溶液回流反应3h-24h，有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物3；
3)将中间产物3溶于甲醇溶液中，加入还原糖和乙酸进行还原反应，经硅胶柱洗脱得到结构式I的目标化合；
所述中间产物2的结构式为：
所述中间产物3的结构式为：
3.如权利要求2所述的熊果酸N-糖苷衍生物所形成的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中还原反应的条件为：反应温度为30℃-50℃，反应时间为24-48小时。
4.基于权利要求1所述的熊果酸N-糖苷衍生物所形成的制备方法，其特征在于，所述结构式II所形成的目标化合物的制备方法包括以下步骤：
a)取熊果酸溶于无水二氯甲烷中，搅拌，依次加入N,O-二甲基羟胺盐酸盐和N-甲基吗啉，再缓慢加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，冰浴反应，反应完成后加入盐酸猝灭，加入二氯甲烷萃取，合并有机层，洗涤，浓缩，将浓缩产物溶于无水四氢呋喃中，搅拌，加入四氢铝锂反应，反应结束后加入饱和氯化铵溶液猝灭，萃取，回收溶剂，层析、分离、纯化后溶于甲醇中，分别加入甲氧基盐酸盐和吡啶，回流反应3h-12h，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到中间产物4；
b)将中间产物4溶于乙酸中，加入氰基硼氢化钠，室温反应8-12小时，反应结束后，有机相浓缩，层析、分离、纯化得到中间产物5；
c)将中间产物5溶于甲醇中加入还原糖和乙酸，进行糖基化反应，反应完成后有机相浓缩，硅胶柱层析、分离、纯化，得到结构式II的目标化合物；
所述中间产物4的结构式为：
所述中间产物5的结构式为：
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中萃取过程采用的萃取剂为乙酸乙酯。
6.权利要求1所述的熊果酸N-糖苷衍生物在用于制备抗肿瘤药物方面的应用。
7.权利要求6所述的熊果酸N-糖苷衍生物在用于制备抗肺癌药物、抗肝癌药物以及抗宫颈癌药物方面的应用。
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