JP2006204200A - 間葉系幹細胞の骨化及び/又は軟骨化促進剤と骨化及び/又は軟骨化促進方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 レクチンを有効成分として含む、間葉系幹細胞の骨化及び/又は軟骨化促進用薬剤。
【選択図】 なし
Description
スポーツや事故により膝十字靭帯、膝関節外側側副靭帯や踵骨腱(アキレス腱)を損傷した場合は、人工靭帯を用いることが多い。
したがって、本発明の目的は、低コストで骨や軟骨や靭帯の形成を効果的に促進し得る方法や薬剤を提供することである。
即ち、本発明によれば、レクチンを有効成分として含む、間葉系幹細胞の骨化及び/又は軟骨化促進用薬剤が提供される。この薬剤は、間葉系幹細胞の培地に添加されることが好ましい。レクチンがインゲンマメレクチンE4(PHA-E)またはタチナタ豆レクチン(ConA)であることが好ましい。
「軟骨化した間葉系幹細胞」とは、間葉系幹細胞から分化して軟骨基質を産生するようになった細胞を意味する。
レクチンの培地への添加濃度は、レクチンの種類、培地組成、培養時間、使用されるMSCの状態等によっても異なってくるが、一般に0.1μg/ml以上であることが好ましく、1μg/ml以上であることが更に好ましい。また、100μg/ml以下であることが好ましく、50μg/ml以下であることが更に好ましい。
骨疾患としては、骨折、骨欠損、骨量低下疾患等が挙げられる。骨折としては、例えば、複雑骨折、偽関節、単純骨折等が挙げられる。骨欠損の原因としては、例えば、外科処置(腫瘍摘出、嚢胞摘出等)、嚢胞、歯周疾患、先天性骨形成異常(唇顎口蓋裂等)等が挙げられる。外傷や骨折によっても骨欠損を生じ得る。また、顎堤の高度吸収等は、加齢によっても生じる。骨量低下疾患としては、例えば、骨粗鬆症(原発性骨粗鬆症、二次性骨粗鬆症)、先天性骨疾患(骨形成不全症等)、顎堤の高度吸収症(顎堤異常)、人工関節置換術での骨補填等が挙げられる。骨量低下疾患においては骨折も生じ易い。軟骨疾患としては、軟骨欠損(例えば外傷、外科的処置等による)、慢性関節リウマチ、変形性関節症、先天性軟骨疾患(軟骨無形成症等)、軟骨損傷(半月板損傷等)等が挙げられる。靱帯損傷としては、膝十字靭帯、膝関節外側側副靭帯や踵骨腱(アキレス腱)等が挙げられる。
(1)使用細胞
Cambrex社より購入したヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞(製品コードPT-2501、ロット番号3F0551)(以下「IMSC 1(Human Iliac mesenchymal stem cell No. 1)」と記す)と、広島大学倫理委員会の許可を得て41歳男性患者の正常腸骨より採取したヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞(Human Iliac mesenchymal stem cell、以下「IMSC 2」(Human Iliac mesenchymal stem cell No. 2)と記す)とを実験に使用した。
IMSC 1とIMSC 2を、それぞれ、(I)レクチン非添加群(Cont)、(II)ConA 1回処理群(ConA 1 time)、(III)PHA-E 1回処理群(PHA-E 1 time)、(IV)ConA継続添加群(ConA all)、(V)PHA-E継続添加群(PHA-E all)に分け、48穴TC培養プレート(カタログ番号35-3078、Falcon)に1ウエルあたり10000個/800μlにて播種し、10%FBS含有DMEM(濃縮Antibiotic-Antimycotic液を最終濃度として1%で含む)で、90%コンフルエントまで培養した。
レクチン処理開始日(これを0日目とする)から7日目ごとに、各群の細胞についてアリザリンレッド染色とカルシウム蓄積量測定を行った。
図1に、IMSC 1の(I)〜(V)群の細胞をアリザリンレッド染色した各ウエルの写真を示す。図1から明らかなように、ConAまたはPHA-Eを添加した群、特にConA 継続添加群およびPHA-E 継続添加群、では14日目に明確な石灰化沈着が認められたのに対して、非添加群では14日目には非常に低度の石灰化沈着しか認められなかった。
(1)使用細胞
上述の実施例1(1)記載の継代数8のIMSC 1を用いた。
IMSC 1を、実施例1(1)で使用した10%FBS含有DMEM(濃縮Antibiotic-Antimycotic液を最終濃度として1%で含む)を用いて、48穴TC培養プレートへ1ウエルあたり10000個/800μlで播種し、90%コンフルエントまで培養した後、培地を200μlのレクチン含有骨誘導培地(最終濃度 0、2、4、6、8、もしくは10μg/mlのConAまたは最終濃度 0、2、5、10、20、もしくは50μg/mlのPHA-Eを含有)と交換し、37℃、5% CO2気相下で12日間培養した。レクチン含有骨誘導培地の交換は3日ごとに行った。その後、実施例1(2)記載の方法で、カルシウム蓄積量を測定した。
図5に、各濃度のConA 添加培地で培養されたIMSC 1のカルシウム蓄積量の測定結果を示す。図から明らかなように、ConA 濃度 8μg/ml(p<0.01)まで有意に濃度依存性にカルシウム蓄積量が増加した(t検定)。
(1)使用細胞
上述の実施例1(1)記載の継代数8のIMSC 1を用いた。
IMSC 1を、実施例1(1)で使用した10%FBS含有DMEM(濃縮Antibiotic-Antimycotic液を最終濃度として1%で含む)を用いて48穴TC培養プレートへ1ウエルあたり10000個/800μlで播種し、90%コンフルエントまで培養した後、最終濃度8μg/mlのConA、または最終濃度10μg/mlのPHA-E、または最終濃度 0、50、100、もしくは300ng/mlのBMP-2(Sigma)を含む骨誘導培地に交換し、37℃、5% CO2気相下にて12日間培養した。培地の交換は3日ごとに行った。その後、実施例1(2)記載の方法で、カルシウム蓄積量を測定した。
(3)結果
図7に、各濃度のBMP-2 培地で培養されたIMSC 1のカルシウム蓄積量の測定結果を示す。BMP-2 濃度50ng/ml以上では、BMP-2 濃度0と比較して有意(p<0.05, ANOVA検定)にカルシウム蓄積量は高くなっているが、それ以上BMP-2 濃度が上昇してもカルシウム蓄積量の増加は認められずプラトーに達していた。
Claims (18)
- レクチンを有効成分として含む、間葉系幹細胞の骨化及び/又は軟骨化促進用薬剤。
- 間葉系幹細胞の培地に添加される、請求項1記載の薬剤。
- レクチンがインゲンマメレクチンE4(PHA-E)またはタチナタ豆レクチン(ConA)である、請求項1または2記載の薬剤。
- 間葉系幹細胞をレクチンを含む培地で培養する工程を含む、間葉系幹細胞の骨化及び/又は軟骨化促進方法。
- レクチンがPHA-EまたはConAである、請求項4記載の方法。
- レクチンを含む培地で培養された間葉系幹細胞。
- 骨化又は軟骨化した請求項6記載の間葉系幹細胞。
- レクチンがPHA-EまたはConAである、請求項6または7記載の間葉系幹細胞。
- (i)レクチンを含む培地で培養された間葉系幹細胞;または
(ii)レクチンと間葉系幹細胞;
を人工骨または人工軟骨と共に培養する工程を含む、人工培養骨または人工培養軟骨の製造方法。 - レクチンがPHA-EまたはConAである、請求項9記載の方法。
- (i)レクチンを含む培地で培養された間葉系幹細胞;または
(ii)レクチンと間葉系幹細胞;
を含む培地で培養された、人工培養骨または人工培養軟骨。 - (i)レクチン;
(ii)レクチンを含む培地で培養された間葉系幹細胞;または
(iii)レクチンと間葉系幹細胞;
を有効成分として含む、骨形成及び/又は軟骨形成を促進する薬剤。 - 骨疾患または軟骨疾患の予防及び/又は治療のために使用される、請求項12記載の薬剤。
- レクチンがPHA-EまたはConAである、請求項12または13記載の薬剤。
- 骨形成及び/又は軟骨形成を促進する方法であって、そうした処置を必要とするヒトなどの温血動物に対して、
(i)レクチン;
(ii)レクチンを含む培地で培養された間葉系幹細胞;または
(iii)レクチンと間葉系幹細胞;
の有効量を投与することを含む方法。 - 骨疾患、軟骨疾患または靱帯損傷の予防及び/又は治療方法であって、そうした処置を必要とするヒトなどの温血動物に対して、
(i)レクチン;
(ii)レクチンを含む培地で培養された間葉系幹細胞;または
(iii)レクチンと間葉系幹細胞;
の有効量を投与することを含む方法。 - 骨及び/又は軟骨の修復方法であって、そうした処置を必要とするヒトなどの温血動物に対して、
(i)レクチンを含む培地で培養された間葉系幹細胞;または
(ii)レクチンと間葉系幹細胞;
を含む培地で培養された人工培養骨または人工培養軟骨を移植することを含む方法。 - 骨疾患または軟骨疾患の治療方法であって、そうした処置を必要とするヒトなどの温血動物に対して、
(i)レクチンを含む培地で培養された間葉系幹細胞;または
(ii)レクチンと間葉系幹細胞;
を含む培地で培養された人工培養骨または人工培養軟骨を移植することを含む方法。
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