CN112691121B - 间质干细胞和玻糖醛酸钠混合物的条件培养基及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及间质干细胞和玻糖醛酸钠混合物的条件培养基及其用途。其中，所述条件培养基是将间质干细胞和玻糖醛酸盐混合物接触培养而得的条件培养基；可用于修复细胞氧化压力伤害，并提高细胞存活率。本发明另提供一种增加间质干细胞分泌DKK‑1的方法。

Description

间质干细胞和玻糖醛酸钠混合物的条件培养基及其用途
技术领域
本发明是关于一种间质干细胞和玻糖醛酸钠混合物的条件培养基；特定而言，该条件培养基可用于修复氧化压力伤害。
背景技术
干细胞用于再生医学等领域的发展日益蓬勃，其中又以间质干细胞为研究的主流。间质干细胞可分泌多种生长因子，达成多种治疗功效，例如骨修复、免疫调节、抗发炎、和神经修复等。另一方面，玻尿酸亦常用于治疗关节炎，例如韩国干细胞公司Medipost已将间质干细胞和玻尿酸制成医药组合物，用于治疗关节炎。
再者，已有先前报导揭示间质干细胞具有多个细胞标志，位于细胞表面并可作为辨识干细胞的特征，例如EphA2和CD146。又，EphA2和CD146的表现量和生长激素分泌、免疫调节、细胞质量呈正相关。
氧化压力为细胞内活性氧化物与抗氧化系统之间平衡失调引起的一系列适应性的反应，可能干扰细胞正常的氧化还原状态，并造成多种疾病，例如造成细胞老化。另有报导指出，氧化压力可能造成多种心血管疾病、癌症、或神经退化性疾病。有鉴于此，有必要研发一种修复并回复氧化压力造成的细胞伤害的药物。
发明内容
为解决上述的问题并达成发明的目的，本发明不可预期地发现将间质干细胞和玻糖醛酸钠混合物接触并培养而得的条件培养基具有提高分泌DKK-1的功效，可用于开发修复氧化压力伤害的药物。
本发明的一目的在提供一种条件培养基用于制备治疗氧化压力相关病症的药物的用途；其中，该条件培养基是将间质干细胞和玻糖醛酸钠混合物接触培养而得的条件培养基；其中，该玻糖醛酸钠混合物包括大分子玻糖醛酸钠和小分子玻糖醛酸钠；该大分子玻糖醛酸钠是分子量介于1700-2500kDa的玻糖醛酸钠；该小分子玻糖醛酸钠是分子量介于850-1300kDa的玻糖醛酸钠；以及该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例是介于3:1至1:1；其中，因该经培养间质干细胞分泌DKK-1增加，因此该条件培养基含有较高量的DKK-1。
于一本发明的特定实施例中，其中该间质干细胞是脐带间质干细胞。
于一本发明的特定实施例中，其中该用途是用于制备修复肾脏细胞的抗氧化药物。
于一本发明的特定实施例中，其中该用途是用于制备修复软骨细胞的抗氧化药物。
本发明另一目的在提供一种培养间质干细胞的方法，包括：提供一间质干细胞；使该间质干细胞与浓度介于0.1-0.5％的玻糖醛酸钠混合物接触；将该间质干细胞与该玻糖醛酸钠混合物共同培养约48小时；其中该玻糖醛酸钠混合物包括大分子玻糖醛酸钠和小分子玻糖醛酸钠；该大分子玻糖醛酸钠是分子量介于1700-2500kDa的玻糖醛酸钠；该小分子玻糖醛酸钠是分子量介于850-1300kDa的玻糖醛酸钠；以及该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例是介于3:1至1:1。
于一本发明的特定实施例中，其中该经培养的间质干细胞分泌DKK-1的能力提高。
本发明又一目的在提供一种增加间质干细胞分泌DKK-1的方法，包括：提供一间质干细胞；使该间质干细胞与浓度介于0.1-0.5％的玻糖醛酸钠混合物接触；以及将该间质干细胞与该玻糖醛酸钠混合物共同培养约48小时；其中该玻糖醛酸钠混合物包括大分子玻糖醛酸钠和小分子玻糖醛酸钠；该大分子玻糖醛酸钠是分子量介于1700-2500kDa的玻糖醛酸钠；该小分子玻糖醛酸钠是分子量介于850-1300kDa的玻糖醛酸钠；以及该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例是介于3:1至1:1。
本发明再一目的在提供一种玻糖醛酸钠混合物用于制备增加间质干细胞分泌DKK-1的培养基的用途，其中该玻糖醛酸钠混合物包括大分子玻糖醛酸钠和小分子玻糖醛酸钠；该大分子玻糖醛酸钠是分子量介于1700-2500kDa的玻糖醛酸钠；该小分子玻糖醛酸钠是分子量介于850-1300kDa的玻糖醛酸钠；以及该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例是介于3:1至1:1。
附图说明
为说明本发明，以下列图式呈现较佳具体实施例，惟是以阐述本发明为目的。应被理解的是，本发明并不局限于所示的较佳具体实施例：
图1揭示MixHA对于脐带间质干细胞的存活率的影响的结果。
图2揭示不同剂量的MixHA促进脐带间质干细胞分泌DKK-1的结果。
图3揭示MixHA和UC-MSC共同培养可修复氧化压力诱导肾脏细胞(HEK-293)损伤的结果；图3(A)：MixHA和UC-MSC共同培养所获得的条件培养基可回复肾脏细胞损伤；图3(B)：虽加入MixHA可提高细胞存活率，但若无UC-MSC存在则细胞存活率的升高较不显著；
图3(C)：MixHA、UC-MSC、和HEK-293共同培养可增加DKK-1的浓度。
图4揭示MixHA和UC-MSC的条件培养基修复氧化压力诱导软骨细胞(HC)损伤的结果；图4(A)：MixHA和UC-MSC的条件培养基可回复软骨细胞损伤；图4(B)：虽加入MixHA可提高细胞存活率，但若无UC-MSC共同培养收集的条件培养基存在则细胞存活率的升高较不显著；图4(C)：UC-MSC-CM和软骨细胞共同培养可增加DKK-1的浓度。
图5揭示HA的分子量对于UC-MSC的影响。
具体实施方式
本发明的技术特征，包含特定特征，是揭示于申请专利范围，针对本发明的技术特征，较佳的理解兹配合说明书、依据本发明原理的实施例、和图式将本发明详细说明如下。
本发明说明书及申请专利范围中所述的所有技术性及科学用语，除非另有所定义，皆为本发明所属技术领域具有通常知识者可知晓的定义。其中单数用语「一」、「一个」、「该」、或其近似用语，除非另有说明，皆可指涉多于一个对象。本说明书使用的「或」、「以及」、「和」，除非另有说明，皆指涉「或/和」。此外，用语「包含」、「包括」皆非有所限制的开放式连接词。前述定义仅说明用语定义的指涉而不应解释为对发明目标的限制。除非另有说明，本发明所用的材料皆为市售易于取得。
本文中使用的「约」或「近似」等词意指习知技术者理解的可接受偏差程度，其可在一定程度上根据文中的使用而变化。一般而言，例如，「约」或「近似」可指引用值附近±10％、±5％、或±3％范围的数值。
本发明的一实施方面是提供一种条件培养基用于制备修复氧化压力伤害的医药组合物的用途；其中，该条件培养基是间质干细胞和玻糖醛酸钠混合物的条件培养基。
本发明的另一实施方面是提供一种条件培养基用于制备治疗氧化压力相关病症的药物的用途。其中，该条件培养基是将间质干细胞和玻糖醛酸钠混合物接触培养而得的条件培养基。
根据本发明，该玻糖醛酸钠混合物包括大分子玻糖醛酸钠和小分子玻糖醛酸钠；该大分子玻糖醛酸钠是分子量介于1700-2500kDa的玻糖醛酸钠；该小分子玻糖醛酸钠是分子量介于850-1300kDa的玻糖醛酸钠；以及该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例是介于3:1至1:1。
如本发明实施例，该经培养间质干细胞分泌DKK-1增加，因此该条件培养基含有较高量的DKK-1，具有较佳的修复氧化压力伤害的功效。
根据本发明的另一实施方面，是提供一种用于修复氧化压力伤害的医药组合物，包括：将间质干细胞和玻糖醛酸钠混合物接触培养而得的条件培养基；其中该玻糖醛酸钠混合物包括大分子玻糖醛酸钠和小分子玻糖醛酸钠；该大分子玻糖醛酸钠是分子量介于1700-2500kDa的玻糖醛酸钠；该小分子玻糖醛酸钠是分子量介于850-1300kDa的玻糖醛酸钠；以及该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例是介于3:1至1:1。
因此，本发明亦提供一种培养间质干细胞的方法，包括：
提供一间质干细胞；
使该间质干细胞与浓度介于0.1-0.5％的玻糖醛酸钠混合物接触；
将该间质干细胞与该玻糖醛酸钠混合物共同培养约48小时；
其中该玻糖醛酸钠混合物包括大分子玻糖醛酸钠和小分子玻糖醛酸钠；该大分子玻糖醛酸钠是分子量介于1700-2500kDa的玻糖醛酸钠；该小分子玻糖醛酸钠是分子量介于850-1300kDa的玻糖醛酸钠；以及该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例是介于3:1至1:1。
本发明另提供一种增加间质干细胞分泌DKK-1的方法，包括：
提供一间质干细胞；
使该间质干细胞与浓度介于0.1-0.5％的玻糖醛酸钠混合物接触；以及
将该间质干细胞与该玻糖醛酸钠混合物共同培养约48小时；
其中该玻糖醛酸钠混合物包括大分子玻糖醛酸钠和小分子玻糖醛酸钠；该大分子玻糖醛酸钠是分子量介于1700-2500kDa的玻糖醛酸钠；该小分子玻糖醛酸钠是分子量介于850-1300kDa的玻糖醛酸钠；以及该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例是介于3:1至1:1。
本文中所使用的用语「间质干细胞」是指涉未分化的多功能(multipotent)干细胞，其具有自我更新的能力，并可分化为多种细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、或脂肪细胞等间质细胞。除此之外，间质干细胞亦可以一或多种细胞标记进行辨识，如本说明书所揭示。一般间质干细胞可用于多种医疗用途，包括免疫疾病、退化疾病、组织器官移植、发炎、自体免疫疾病、心肌梗塞等疾病。本案所请发明亦不限于以上医疗用途的使用。
根据本发明的实施例，间质干细胞可自多处器官中取得，例如，脐带血、脐带组织、胎盘、骨髓、或脂肪组织。于本发明的一特定实施例，该间质干细胞取自脐带。于一较佳实施例，该间质干细胞是脐带间质干细胞。
本发明所用于细胞培养的基础培养基并无特别限制，仅需达成使细胞增生的目的即可，可使用本领域通常使用的基础培养基。于一特定实施例中，该基础培养基包括但不限于Ham's F12培养基、DMEM培养基、RPMI-1640培养基、或MCDB培养基。于本发明，该些基础培养基可单独使用或混合至少二种使用。
本文中所使用的用语「条件培养基」是指涉将培养过细胞的培养基，直接用于培养其他细胞或作为其他细胞培养基的添加成分。换言之，条件培养基之中含有许多由细胞分泌的细胞因子。根据本发明的实施例，本发明的「条件培养基」指涉由玻糖醛酸钠混合物和间质干细胞共同培养所形成的条件培养基。
根据本发明，该条件培养基是包括或不包括细胞；换言之，该条件培养基可与间质干细胞一同给予或不与间质干细胞一同给予。
本文中所使用的用语「DKK-1」，是包含基因Dickkopf的家族之一，该家族包括Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3、和Dkk4。DKK-1(Dickkopf-1)是一种参与骨发育及骨形成的重要分泌蛋白，并且为Wnt信号传导的拮抗剂。DKK-1经由其与Wnt共同受体LRP5/6和克里门蛋白(kremenprotein)-1/2的相互作用，阻碍Wnt信号传导。DKK-1多于胎盘中表现，显示DKK-1与胚胎发育之间的关联。此外，由于DKK-1为发炎导致骨质流失的重要因子，因此也作为治疗骨科疾病的目标。
本文中所使用的用语「氧化压力」或「氧化压力伤害」是指涉活性氧或活性氮(ROS)所产生的氧化压力，对于体内细胞的粒线体所造成的伤害，并导致细胞死亡。
因此，氧化压力相关病症与细胞大量死亡并影响生理机能的疾病息息相关。
依据本发明，氧化压力相关病症包括但不限于：老化、退化性关节炎(Osteoarthritis)、慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease)、急性呼吸窘迫症候群((adult respiratory distress syndrome)、新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy)、早产儿支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia)、或中风。
本文中所使用的用语「玻糖醛酸钠」是指一种经常发现于动物结缔组织、上皮组织、或神经组织等细胞外基质(ECM)的玻尿酸的钠盐，属于醣胺聚多醣的一类(Glycosaminoglycan)，是具有长链的双醣聚合物，其单体为Na-葡萄糖醛酸盐-N-乙酰葡萄糖胺。玻糖醛酸钠的分子量大多介于3000-4000kDa，但若用于药物治疗时，通常仅使用分子量约5kDa的小分子。
根据本发明，是使用一种玻糖醛酸钠混合物(Mix HA)，包括大分子玻糖醛酸钠和小分子玻糖醛酸钠。大分子玻糖醛酸钠是定义为分子量大于1700kDa的玻糖醛酸钠。于一较佳实施例，为分子量介于1700-2500kDa的玻糖醛酸钠。小分子玻糖醛酸钠是定义为分子量小于1700kDa的玻糖醛酸钠。于一较佳实施例，为分子量介于850-1700kDa的玻糖醛酸钠。于一更佳实施例，小分子玻糖醛酸钠是分子量介于850-1300kDa的玻糖醛酸钠。
根据本发明的一实施例，该玻糖醛酸钠混合物中该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例是介于3:1至1:1。于一较佳实施例，该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例约为2:1。
本文中所用的用语「患者」、「治疗主体」或近似用语，是哺乳动物，该哺乳动物包含但不限于属于哺乳纲的动物，如人类、非人灵长类如黑猩猩、猿、猴，或畜牧动物如牛、马、绵羊、山羊、猪，或家庭动物如兔、狗、猫，或实验动物如囓齿动物、大鼠、小鼠、天竺鼠、或近似动物。于一特定实施例，该哺乳动物为人类。
本文中所使用的用语「提高」、「提升」或近似用语，是指涉增加或延长药物的意图的效力或持续期间。因此，提升治疗药物的疗效，其中「提升」是指涉其于治疗系统中增加或延长的能力，该能力是药效或持续期间。
本文中所使用的用语「治疗」、「疗法」、或其近似用语是包含以治疗或预防的方式缓和、减轻、或改善至少一项疾病症状或生理状况、预防新增的症状、抑制疾病或生理状况、阻止或减缓疾病发展、造成疾病或生理状况的复原、减缓因疾病造成的生理状况、停止疾病症状或生理状况。
根据本发明，所制得的条件培养基可进一步开发为医药组合物，其包括：治疗有效量的将间质干细胞和玻糖醛酸钠混合物接触培养而得的条件培养基，以及医药上可接受的载剂。
本文中所使用的用语「有效量(effective amount)」或「治疗(therapeutically)有效量」，是指涉化合物或药物的一足够量，可于患者服药后减轻一或多项疾病症状或生理状况；其结果为降低和/或缓和病征、症状、或病因，或为其他生理系统的有意图的改变。举例而言，治疗的「有效量」是包含一本发明提供化合物的可于临床上显著降低疾病症状的剂量。一适当的有效量，其有效值取决于通常药学技术，如药物增量方法(dose escalationmethods)。
本发明所提供的医药组合物可制作成适用于口服投药的形式，包括胶囊、药片、锭剂、药水、药粉、颗粒、驰剂及悬浮剂、舌下锭片、薄片或贴片(如，口颊贴片)。
根据本发明所制得的医药组合物，可以任何适当的给药途径给予，包含但不限于口服、静脉注射、肠胃外给药、黏膜穿透、皮肤穿透、耳、鼻、或局部给药。肠胃外给药的例示包括但不限于肌肉内、皮下、静脉内、髓内注射，以及脊椎腔内、脑室内、腹腔内、淋巴内、和鼻内注射。于一特定实施例，本发明提供的医药组合物是以局部而非系统性给药，举例而言，将医药组合物直接注射入器官。
根据本发明的一实施例，该医药组合物亦可呈可储存的制剂或可持续释放的调配剂形式。于一具体实施例中，长时间作用的调配剂可通过植入而给予，如皮下或肌肉内，或以肌肉内注射。
本发明另一方面提供一种细胞疗法，包括给予患者一医药组合物，其中该医药组合物是以本发明方法制得的条件培养基。其中一特定的具体实施例是MixHA和间质干细胞。
以上述发明说明以及下列实施例说明本发明，但并非用以限制本发明的范围。
实施例
实施例1脐带间质干细胞表面抗原分析
实验方法
将2x 105个脐带间质干细胞(Umbilical cord-derived mesenchymal stemcell，UC-MSC)置于1.5毫升(ml)的微离心管中，并以1000微升(μl)的染色缓冲液清洗细胞一次，其中该染色缓冲液是含有2％FBS的PBS溶液。而后，将细胞悬浮于100μl染色缓冲液，并以抗体染色。
使用染色抗体包括：
CD146抗体和IgG1同型控制组：10μl
EphA2抗体和IgG2a同型控制组：10μl
CD73单株抗体：10μl
CD90单株抗体：10μl
CD105单株抗体：10μl
CD44单株抗体：10μL，以及同型控制组：5μl
加入抗体后，将细胞于4℃放置30分钟，且不照光。而后使用1000μl染色缓冲液再次清洗，再将细胞悬浮于200μl染色缓冲液，最后以流式细胞法分析。获得数据以BDFACSCanto II System以及FlowJo.10软件计算和分析。
结果
本实施例结果揭示于表1。可自表1得知，CD73、CD90、CD105、CD44、和EphA2几乎表现于全部脐带间质干细胞，但CD146的表现率仅有59.3％。
表1
细胞表面抗原 表现比率(％)
CD73 100.0％
CD90 99.1％
CD105 99.2％
CD44 99.9％
CD146 59.3％
EphA2 97.9％
实施例2 MixHA不影响脐带间质干细胞存活率
实验方法
于Alpha-MEM培养基中加入0.025％、0.05％、0.1％、0.2％、和0.5％的玻糖醛酸钠(Sodium hyaluronate)混合物(本文简称MixHA)，该混合物是包括比例为2:1的HA-EP 1.8以及HA-EP 3.0(Bloomage Freda Biopharma)。
将1.2x 106个脐带间质干细胞培养于含有15ml的培养基的T175培养瓶中，并于37℃培养24小时。培养结束后移去培养基，并分别将上述不同浓度的MixHA分别于培养瓶加入10ml以及使用基础培养基做为控制组，再于37℃培养48小时。
经48小时后，使TC20细胞计数器分析细胞数以及存活率并以Microsoft Excel软件分析。实验结果以平均值±标准偏差表示，各实验进行三重复。
结果
本实施例结果揭示于图1。可得知MixHA对于细胞存并不影响，加入0.025-0.5％的MixHA的培养基的细胞存活率与不加入MixHA的培养基的细胞存活率相比并无显著差异。
实施例3 MixHA可促进脐带间质干细胞分泌DKK-1
实验方法
将1.2x 106个脐带间质干细胞培养于含有15ml的培养基的T175培养瓶中，并于37℃培养24小时。培养结束后移去培养基，并分别将实施例2所述不同浓度的MixHA分别于培养瓶加入10ml以及使用基础培养基做为控制组，再于37℃培养48小时。经48小时后，收集MixHA的条件培养基(本文简称UC-MSC-CM)。
于微孔盘中分别加入50μl的试验稀释液RD1-14，再分别于孔洞加入标准组(使用ELISA方法取得蛋白质DKK1的标准曲线)、控制组、或UC-MSC-CM，并于室温放置微孔盘回转式震动器上(500±50rpm)于培养2小时。而后去除培养基并使用400μl的清洗缓冲液清洗4次。于清洗完成后，吸出或倒出全部的清洗缓冲液，并倒置微孔盘置放于干净擦手纸上。再于各孔洞中加入200μl的人类DKK-1接合物(conjugate)，以及放置于震动器上于室温培养2小时。而后重复前述清洗步骤。
再于各孔洞中加入200μl的基质溶液，并于室温培养30分钟(不照光)。培养完成后，于各孔洞中加入停止溶液。于30分钟内，使用SpectraMax M2 ELISA读取机分析各孔洞中OD450/570奈米(nm)的光密度。
数据以SpectraMax M2 ELISA读取机计算并以Microsoft Excel软件分析。实验结果以平均值±标准偏差表示，各实验进行三重复。(*P<0.05：与基础培养基组别比较；#P<0.05：与0.025％MixHA组别比较)
结果
本实施例结果揭示于图2。结果显示经48小时以不同浓度的MixHA培养后，分析不同组别的UC-MSC-CM，可得知含有0.1-0.5％的MixHA的培养基可有效地促进脐带间质干细胞分泌DKK-1。
实施例4 UC-MSC-CM可修复氧化压力诱导肾脏细胞损伤
实验方法
首先，将HEK-293细胞以每孔含有500μl培养液以及4x104个细胞的数量接种于24孔盘中，并培养24小时。而后去除培养液，再加入含有200μM双氧水(H2O2)的500μl培养液，培养4小时之后再把培养液去除。
另于各孔中加入500μl培养液以及分别与UC-MSC和不同浓度的MixHA共同培养，区分为不同实验组，但使用跨孔洞(Trans-well)培养盘分离UC-MSC和HEK-293，因此该些细胞彼此不直接接触，最后将细胞培养于37℃加湿培养箱48小时。
最后使用MTT试剂测量HEK-293细胞的存活率。使用ELISA试验检测DKK-1的浓度的步骤于前述方法相同，于此不再赘述。使用Microsoft Excel软件计算和分析数据。
结果
本实施例结果揭示于图3(A)至3(C)。如图3(A)显示，于200μM H2O2中培养4小时后，HEK-293细胞产生损伤，但加入UC-MSC以及0.1％至0.5％MixHA共同培养48小时之后，可显著地增加细胞存活率。虽加入UC-MSC共同培养即可达成提高存活率的效果，但另加入MixHA后，存活率的升高更加显著，且加入MixHA的组别相较于仅加入UC-MSC的组别具有更佳的存活率，且随剂量增加。(*P<0.05，相较于HEK-293培养于200μM H2O2的组别；#P<0.05，相较于包括0％MixHA的组别)。如图3(B)显示，于200μM H2O2中培养4小时后，HEK-293细胞产生损伤，但加入UC-MSC以及0.2％至0.5％MixHA共同培养48小时之后，可显著地增加细胞存活率。另一方面，虽加入MixHA可提高细胞存活率，但若无UC-MSC存在则细胞存活率的升高较不显著。此外，图3(C)显示，加入0.2％至0.5％MixHA共同培养后，具UC-MSC组别DKK-1的量大幅提升。(*P<0.05、***P<0.001，相较于HEK-293培养于200μM H2O2的组别；#P<0.05、###P<0.001，相较于仅有0.2％MixHA的组别；$$$P<0.001，相较于仅有0.5％MixHA的组别)。
可自本实施例得知，MixHA可促进脐带间质干细胞分泌DKK-1，并修复氧化压力诱导肾脏细胞损伤。此外，若单独给予MixHA，并无法使肾脏细胞修复氧化压力所导致的损伤，需与UC-MSC共同给予，方有显著治疗功效，并显示该治疗功效为MixHA剂量依赖(dose-dependent)。
实施例5
实验方法
首先将人类软骨细胞(Human Chondrocyte(Sciencell))以每孔含有500μl培养液以及4x105个细胞的数量接种于24孔盘中，并培养24小时。而后去除培养液，再加入含有200μM双氧水(H2O2)的500μl培养液，培养4小时之后再把培养液去除。
另于各孔中加入500μl培养液以及分别加入0-0.5％UC-MSC-CM，区分为不同实验组，最后将细胞培养于37℃加湿培养箱48小时。
与实施例4不同，于实施例4，治疗时是给予包含MSC的条件培养基；但于本实施例，治疗时仅给予不包含MSC的条件培养基(以UC-MSC-CM表示)。
最后使用CCK-8试剂测定人类软骨细胞的存活率。
使用ELISA试验检测DKK-1的浓度的步骤于前述方法相同，于此不再赘述。使用Microsoft Excel软件计算和分析数据。
结果
本实施例结果揭示于图4(A)至4(C)。如图4(A)显示，于200μM H2O2中培养4小时后，软骨细胞产生损伤，但加入使用UC-MSC以及0-0.5％MixHA共同培养48小时之后所获得的UC-MSC-CM，可显著地增加软骨细胞存活率。(*P<0.05，相较于软骨细胞培养于200μM H2O2的组别；#P<0.05，相较于包括0％MixHA的组别)。如图4(B)显示，于200μM H2O2中培养4小时后，人类软骨细胞产生损伤，但加入使用UC-MSC以及0.2％至0.5％MixHA共同培养48小时之后所获得的UC-MSC-CM，可显著地增加软骨细胞存活率。虽加入MixHA可提高细胞存活率，但若无UC-MSC-CM存在则细胞存活率的升高较不显著。此外，如图4(C)显示，加入0.2％至0.5％MixHA共同培养后，具UC-MSC-CM组别的DKK-1的量大幅提升。(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，相较于软骨细胞培养于200μM H2O2的组别；#P<0.05、##P<0.01，相较于仅有0.2％MixHA的组别；$P<0.05，相较于仅有0.5％MixHA的组别)。
可自本实施例得知，MixHA可促进脐带间质干细胞分泌DKK-1，并修复氧化压力诱导软骨细胞损伤。此外，若单独给予MixHA，并无法使软骨细胞修复氧化压力所导致的损伤，需与UC-MSC共同给予，方有显著治疗功效。
实施例6HA的分子量对于UC-MSC的影响
实验方法
本实施例是比较不同分子量的HA或其混合物对于UC-MSC的影响。
本实施例使用的包含HA的培养基配置如下：
L-HA(低分子量)：包括0.1％玻糖醛酸钠HA-EP 1.8的α-MEM培养基。
H-HA(高分子量)：包括0.1％玻糖醛酸钠HA-EP 3.0的α-MEM培养基。
MixHA(混合低分子量和高分子量)：包括0.1％玻糖醛酸钠的α-MEM培养基，其中HA-EP 1.8和HA-EP 3.0的比例为2:1。
将UC-MSC接种于T175培养瓶中(1.2x106细胞/瓶，培养基体积：15ml)，并于37℃培养24小时。
除去培养基，并分别加入0.1％的L-HA、H-HA、和MixHA培养基各10ml，再于37℃培养48小时，而后分别收取各实验组别的条件培养基。
使用ELISA试验检测DKK-1的浓度的步骤于前述方法相同，于此不再赘述。
数据以SpectraMax M2 ELISA读取机计算并以Microsoft Excel软件分析。实验结果以平均值±标准偏差表示，各实验进行三重复。(*P<0.05：与基础培养基组别比较；*P<0.05：与控制组(BM)比较)
结果
可自图5得知，含有0.1％HA-EP 1.8或HA-EP 3.0的培养基(L-HA、H-HA)对于UC-MSC分泌DKK-1的量并无显著影响，相对地，含有0.1％HA-EP 1.8和HA-EP 3.0混合物(比例2:1)的培养基(MixHA)对于UC-MSC分泌DKK-1的量有显著影响。故，由图5可得知，并非加入MixHA皆可增加UC-MSC分泌DKK-1的量，而必须混合高分子量和低分子量的HA方可增加DKK-1。
于本说明书实施例揭示的内容，本发明所属领域技术人员可明显得知前述实施例仅为例示而非限制；具本发明所属领域技术人员可通过诸多变换、替换而实施，并不与本发明的技术特征有所差异。依据说明书实施例，本发明可有多种变换仍无碍于实施。本说明书提供的权利要求界定本发明的范围，该范围涵盖前述方法与结构及与其相等的发明。

Claims (5)

1.一种条件培养基用于制备治疗氧化压力相关病症的药物的用途；
其中，该条件培养基是将脐带间质干细胞和玻糖醛酸钠混合物接触培养而得的条件培养基；
其中，该玻糖醛酸钠混合物包括大分子玻糖醛酸钠和小分子玻糖醛酸钠；该大分子玻糖醛酸钠是分子量介于1700-2500kDa的玻糖醛酸钠；该小分子玻糖醛酸钠是分子量介于850-1300kDa的玻糖醛酸钠；以及该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例是介于3:1至1:1；
其中，由于该经培养脐带间质干细胞分泌DKK-1增加，因此该条件培养基含有较高量的DKK-1；
其中，该用途是用于制备修复肾脏细胞或软骨细胞的抗氧化药物。
2.一种培养间质干细胞的方法，包括：
提供一脐带间质干细胞；
使该脐带间质干细胞与浓度介于0.1-0.5％的玻糖醛酸钠混合物接触；
将该脐带间质干细胞与该玻糖醛酸钠混合物共同培养约48小时；
其中该玻糖醛酸钠混合物包括大分子玻糖醛酸钠和小分子玻糖醛酸钠；该大分子玻糖醛酸钠是分子量介于1700-2500kDa的玻糖醛酸钠；该小分子玻糖醛酸钠是分子量介于850-1300kDa的玻糖醛酸钠；以及该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例是介于3:1至1:1。
3.如权利要求2所述的方法，其中该经培养的脐带间质干细胞分泌DKK-1的能力提高。
4.一种增加间质干细胞分泌DKK-1的方法，包括：
提供一脐带间质干细胞；
使该脐带间质干细胞与浓度介于0.1-0.5％的玻糖醛酸钠混合物接触；以及
将该脐带间质干细胞与该玻糖醛酸钠混合物共同培养约48小时；
其中该玻糖醛酸钠混合物包括大分子玻糖醛酸钠和小分子玻糖醛酸钠；该大分子玻糖醛酸钠是分子量介于1700-2500kDa的玻糖醛酸钠；该小分子玻糖醛酸钠是分子量介于850-1300kDa的玻糖醛酸钠；以及该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例是介于3:1至1:1。
5.一种玻糖醛酸钠混合物用于制备增加脐带间质干细胞分泌DKK-1的培养基的用途，其中该玻糖醛酸钠混合物包括大分子玻糖醛酸钠和小分子玻糖醛酸钠；该大分子玻糖醛酸钠是分子量介于1700-2500kDa的玻糖醛酸钠；该小分子玻糖醛酸钠是分子量介于850-1300kDa的玻糖醛酸钠；以及该大分子玻糖醛酸钠和该小分子玻糖醛酸钠的比例是介于3:1至1:1。
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