CN103502437A - 高端粒酶活性的骨髓间充质干细胞、其制造方法和基于其的药物和治疗方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有高端粒酶活性的分离的人骨髓间充质干细胞(tBMMSC)。还公开了分离的人CD34⁺骨髓间充质干细胞。此外还公开了以端粒酶诱导剂处理的骨髓间充质干细胞。

Description

高端粒酶活性的骨髓间充质干细胞、其制造方法和基于其的药物和治疗方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年7月20日提交的美国临时申请第61/366,095号的权益，其全部内容以引用的方式全部并入本文中。

关于联邦赞助的研发的声明

本发明是根据美国国立牙科和颅面研究院(National Institute of Dental andCraniofacial Research)/国立卫生研究院(National Institute for Health)所授予的合同R01DE 17449号利用政府的资助得以完成。政府在本发明中享有一定权利。

技术领域

本发明大体上涉及骨髓间充质干细胞，更具体而言，涉及具有高端粒酶活性的新型BMMSC的亚群、含有BMMSC的药物组合物、使用BMMSC的免疫调节方法和通过施用BMMSC来治疗全身性红斑狼疮的方法。

背景技术

骨髓间充质细胞（BMMSC）是能够自我更新并分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的有影响的新生干细胞(Bianco等，2001；Friedenstein等，1974；Owen等，1988；Pittenger等，1999；Prockop等，1997)。

由于BMMSC的异质性，因而没有供BMMSC分离之用的单一的、独特的标记物，而是采用细胞分子阵列来描绘BMMSC。广泛接受的是BMMSC表达SH2(CD105)、SH3/SH4(CD73)、整联蛋白β₁(CD29)、CD44、Thy-1(CD90)、CD71、血管细胞粘附分子-1(CD 106)、活化的白细胞粘附分子(CD 166)、STRO-1、GD2、黑色素瘤细胞粘附分子(CD 146)、八聚物-4(Oct4)和阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA4)(Conget等，1999；Galmiche等，1993；Gronthos等，2003；Haynesworth等，1992；Martinez等，2007；Pittenger等，1999；Sacchetti等，2007；Shi等，2003；Simmons等，1991；Sordi等，2005)。通常认为BMMSC对于具有极低水平的端粒酶活性的CD14和CD34等造血细胞标记物是阴性的(Conget等，1999；Covas等，2008；Galmiche等，1993；Haynesworth等，1992；Martinez等，2007；Pittenger等，1995；Sacchetti等，2008；Shi等，2002、2003；Sordi等，2005)。近来的研究暗示，小鼠的BMMSC可能表达造血表面分子CD45(Chen等，2007)和CD34(Copland等，2008)

BMMSC被视为成骨细胞的祖细胞，具有在体内再生骨和骨髓成分的能力。这些发现引起了使用BMMSC进行矿化组织工程的广泛研究。临床证据看起来支持BMMSC植入术能够提高基于细胞的骨骼组织再生这一观点(Kwan等，2008；Panetta等，2009)。近来，积累的证据表明BMMSC产生了多种细胞因子，并显示出深厚的免疫调节性(Nauta等，2007；Uccelli等，2007、2008)，这可能是通过抑制诸如自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等多种主要免疫细胞的增殖和功能实现的(Aggarwal和Pittenger,2005；Nauta等，2007；Uccelli等，2007、2008)。这些独特的性质使得BMMSC在用于治疗免疫失调的临床应用方面引起极大的关注(Nauta和Fibbe,2007；Bernardo等，2009)。

BMMSC被认为来自骨髓间质隔室，最初显现为粘附的、单一的集落群（成纤维细胞集落形成单位[CFU-F])，随后在培养皿上增殖(Friedenstein等，1980)。粘附的BMMSC能够增殖并进行成骨细胞分化，从而提供了CFU-F作为成骨细胞谱系的前体的第一证据(Friedenstein等，1980)。在过去的40多年中，粘附的CFU-F检测已经用作鉴别和筛选BMMSC的有效手段。时至今日，CFU-F检测一直被视为BMMSC分离和扩增的金标准之一(Clarke等，1989；Friedenstein等，1970)。

发明内容

骨髓间充质干细胞(BMMSC)是能够分化为多种细胞类型并提供对于多种疾病的备选疗法的新生前体细胞的异质群体。我们认为，标准的附着CFU-F检测收集到大部分的BMMSC，而BMMSC的独特亚群仍然保留在培养液中。

本发明的一个方面涉及具有增强的治疗潜力的BMMSC新型亚群。

本发明的另一个方面涉及收集并分离本发明的新型BMMSC的方法。

本发明的另一方面涉及用于诱导常规的BMMSC转化为更具治疗效力的BMMSC的方法。

本发明的另一个方面包括具有高端粒酶活性的分离的人骨髓间充质干细胞。高端粒酶活性被最广泛地定义为具有比常规的BMMSC更高的端粒酶活性的BMMSC群体，不过，优选的是，分离的人BMMSC亚群具有的端粒酶活性比常规的BMMSC高至少2倍。在优选的实施方式中，本发明的分离的人骨髓间充质干细胞中的至少约6%、更优选至少20%的细胞为CD34⁺。

本发明的分离的人骨髓间充质干细胞包括：(1)源自塑料培养物中的未粘附细胞的分离的BMMSC（以下称为“tBMMSC”）；(2)分离的CD34⁺BMMSC，优选CD34⁺/CD73⁺BMMSC；和(3)已经用端粒酶诱导剂处理过的人CD 34^-BMMSC（例如TAT-BMMSC）。

本发明的另一个方面涉及包含本发明的分离的人骨髓间充质干细胞的药物组合物。另外，所述药物组合物还可包含载体。

本发明的另一个方面涉及由新生前体细胞的异质群体分选和隔离tBMMSC。tBMMSC能够粘附于细胞外的细胞基质(ECM)涂覆的培养皿并显示出区别于造血细胞的间充质干细胞特性，正如CD73或CD105与CD34的共表达所证明的，由此在ECM上形成单一的集落群，而且不能分化为造血细胞谱系。

本发明的另一个方面是通过用端粒酶处理BMMSC而将常规的CD34-BMMSC转化为tBMMSC的方法，所述端粒酶包含阿司匹林及具有相似化学结构的相关化合物。

本发明的另一个方面涉及调节免疫系统的方法。本发明的方法涉及对需要的患者施用有效量的本发明的分离的人骨髓间充质干细胞。

本发明的另一个方面涉及经由（不受理论的限制）高水平的一氧化氮(NO)的产生来治疗全身性红斑狼疮(SLE)的方法。所述治疗方法包括对需要的患者施用有效量的本发明的分离的人骨髓间充质干细胞。通过端粒酶活性并结合Wnt/β-catenin（β-连环蛋白）信号传导可以对本发明的分离的人骨髓间充质干细胞中的这种高NO产生进行正调控。此外，我们发现，端粒酶活化剂诱导的tBMMSC也显示出显著提高的免疫调节功能，这表明诱导免疫激活的BMMSC来改善用于免疫失调的基于细胞的疗法的可行性。

参照此处所描述的附图、说明、实例和其他公开内容来描述本方面的这些和其他方面。

附图说明

图1显示出tBMMSC能够附着在ECM涂覆的培养皿上。(A)假定模型表明，骨髓所有有核细胞(ANC)以15×10⁶接种在10cm的培养皿中，并在5% CO₂的条件下于37℃的常规培养基中温育2天，随后使用羟基磷灰石磷酸三钙(HA)作为载体将来自培养液的未附着的细胞皮下移植到免疫低下的小鼠中8周。通过H&E染色在该未附着的细胞移植物中检测到通过成骨细胞而新生成的骨骼(B)（空心箭头）和相关的结缔组织(C)。原始放大倍数：X 200。标尺=100μm。(B)分离tBMMSC的假定模型。原始ANC以15×10⁶接种在10cm的培养皿中，2天之内BMMSC通常粘附于塑料皿上，不过，原始ANC中的一小部分BMMSC未附着到培养皿，而仍然保留在细胞悬浮液中。收集包含假定的未附着的BMMSC的细胞悬浮液，并将其转移到涂覆有BMMSC所产生的ECM的培养皿中，以形成单一的集落群(CFU-F)。这些附着ECM的BMMSC(tBMMSC)在常规的塑料培养皿上进行再次培养以用于其他的试验。(C)由1.5×10⁶全部骨髓ANC产生的附着到塑料的CFU-F的数目比来自BMMSC-ECM粘附的tBMMSC的数目高超过7倍。(D)流式细胞检测分析表明，相比于常规的BMMSC(CD73:70.8%,Sca-1:52.16%,Oct4:14.08%)，tBMMSC表达高水平的间充质干细胞标记物CD73(81.8%)、Sca-1(87.74%)、Oct4(40.7%)和SSEA4(24.56%)。然而，看起来tBMMSC和BMMSC表达了类似水平的SSEA-4。(E)通过BrdU掺入法对SSEA4⁺tBMMSC和常规BMMSC的增殖率进行24小时评估。阳性细胞的数目表示为相对于各群体的总数的百分比。与对照组相比，tBMMSC中的阳性细胞的百分比明显增大。(F)与常规的BMMSC相比，tBMMSC显示出群体倍增的显著增加。

图2显示了tBMMSC表达CD34并具有高端粒酶活性。(A)流式细胞检测分析表明，常规的BMMSC不能表达CD34，而对于CD45抗体染色呈阳性（21.35%）。然而，tBMMSC既能表达CD34(23.37%)又能表达CD45(31.22%)。(B)流式细胞检测分析还表明，CD34⁺tBMMSC对于抗CD73(13.8%)和Oct4(13.41%)抗体染色呈阳性。没有染色组用作阴性对照。(C、D)蛋白质印迹分析表明，tBMMSC表达CD34及间充质表面分子CD73和CD105。相反，常规的BMMSC仅表达CD73和CD105(C)。tBMMSC在经历1-5表达CD34(D)。β-肌动蛋白用作样品加载对照。BMC：全骨髓ANC。(E、F)免疫细胞染色证实tBMMSC对于CD34/CD73(三角形，E)和CD34/CD105(三角形，F)为双阳性。常规的BMMSC对于CD34抗体染色为阴性，仅对于抗CD73(E)和CD105(F)抗体染色为阳性。标尺=100μm。(G)tBMMSC具有比BMMSC明显更高水平的端粒酶活性。HEK293T细胞(293T)用作阳性对照，热灭活HEK293T细胞(H.I.)用作阴性对照，通过Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA试剂盒进行测定。(H)蛋白质印迹证明tBMMSC表达端粒酶逆转录酶(TERT)，BMMSC对于抗TERT抗体染色为阴性。(I)在全骨髓ANC中有3.77%的细胞对于抗CD34和CD73抗体染色为双阳性，通过使用流式细胞分选机能够将这些CD34⁺/CD73⁺细胞从全骨髓中分选出来。(J)CD34⁺/CD73⁺细胞以类似于tBMMSC的频率在BMMSC-ECM培养物上形成CFU-F。(K)CD34⁺/CD73⁺BMMSC显示出比常规的BMMSC更高的端粒酶活性。HEK293T细胞用作阳性对照，热灭活HEK293T细胞(H.I.)用作阴性对照，通过Telo TAGGGTelomerase PCR ELISA试剂盒进行测定。(L)与常规的BMMSC相比，CD34⁺/CD73⁺BMMSC也显示出显著的NO生成。这些结果表示五个独立的试验。比例标尺=50μm。***P<0.001。图中的棒条表示平均值±SD。

图3显示了阿司匹林处理提高了BMMSC中的CD34的表达。(A)流式细胞检测分析表明，与常规的BMMSC(BMMSC)中的阴性CD34表达相比，经阿司匹林处理的BMMSC(TAT-BMMSC)显示出CD34的阳性表达。CD45在TAT-BMMSC中的表达水平低于其在BMMSC和tBMMSC中的表达水平。(B)与BMMSC相比，TAT-BMMSC表达了明显高水平的Scal1、Oct4和CD34，但处于比tBMMSC低得多的水平。不过，与tBMMSC和常规的BMMSC相比，TAT-BMMSC表达低得多的CD45水平。(C)蛋白质印迹分析表明，tBMMSC和经阿司匹林处理的BMMSC表达CD34，但是BMMSC不能表达CD34。这些结果表示五个独立的试验。**P<0.01；***P<0.005。图中的棒条表示平均值±SD。

图4显示了tBMMSC的造血分化。(A)BMMSC、tBMMSC和经阿司匹林处理的BMMSC在具有或不具有促红细胞生成素(EPO；3U/mL)的造血分化培养基下的35mm的低附着培养皿(2×l0⁴/培养皿)上培养7天。全骨髓细胞和谱系阴性骨髓细胞（谱系细胞）用作阳性对照。结果表示五个独立的试验。(B)小鼠或者接受常规BMMSC(BMMSC，n=5)，或者接受不含细胞的PBS(对照，n=8)，存活未超过14天。全骨髓细胞输注组（全BM细胞，n=3）为阳性对照组，照射后存活超过110天。BMMSC能够延长以致死剂量照射的小鼠的寿命(tBMMSC，n=10)。Kaplan-meier生存曲线。

图5显示了tBMMSC表现出上调的免疫调节性。(A)在tBMMSC和常规BMMSC培养物（在24孔板上各自为0.2×10⁶/孔）的上清液中的NO水平在INF-γ(25ng/ml)/IL-lβ(5ng/ml)处理的tBMMSC组中明显高于常规的BMMSC组。(B-J）通过使用transwell系统使上室中的抗CD-3和抗CD-28（各自为1μg/ml）抗体激活的脾(SP)细胞与或不与下室中的tBMMSC或常规BMMSC（1×10⁵/室）进行共培养。共培养后3天，使用细胞计数试剂盒-8来测定活化的SP细胞的细胞活力(B-D)。与未与BMMSC(BMMSC-)一起培养的细胞以及与常规的BMMSC一起培养的细胞相比，tBMMSC共培养物显示出活化的SP细胞的细胞活力的显著降低(B)。通过tBMMSC而非常规的BMMSC减少脾细胞活力的效果在一般NOS抑制剂L-NMMA(1mM)处理组(C)和iNOS特定抑制剂1400W(0.2mM)处理组(D)组消除。共培养后3天，对上室中的活化SP细胞进行染色以检测凋亡细胞，正如在材料和方法中所述的(E-J)。与阴性对照组(BMMSC-)相比，tBMMSC和常规的BMMSC均能够诱导显著量的Annexin V(+)早期凋亡细胞(E)和Annexin V(+)7AAD(+)晚期凋亡及死亡细胞(H)。看起来tBMMSC在诱导早期(E)和晚期(H)凋亡细胞方面具有比常规的BMMSC显著的效果。L-NMMA和1400W均能够消除tBMMSC和BMMSC诱导的Annexin V(+)(F,I)和Annexin V(+)7AAD(+)细胞(G、J)。并且看起来1400W处理对于tBMMSC诱导的活化的SP细胞的早期凋亡具有更为显著的抑制(G)。(K-M)在TGFβ1(2ng/ml)和IL-2(2ng/ml)的存在下，在存在或不存在NOS抑制剂的情况下活化的CD4⁺CD25^-T细胞（1×10⁶/孔）和tBMMSC或常规的BMMSC（各自为0.1×10⁶/孔）共培养3天。对漂浮细胞的CD4⁺CD8^-CD25⁺FoxP3⁺调节T细胞(Treg)进行染色。tBMMSC在上调Foxp3⁺调节T细胞(Treg)方面显示出显著的效果(K)。不过，L-NMMA和1400W处理消除了tBMMSC诱导的Treg的上调（L、M）。这些结果代表了至少三个独立的试验。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。图中的棒条表示平均值±SD。

图6表明，tBMMSC显示出对SLE样MRL/lpr小鼠的优异的治疗效果。(A)假定模型显示，将来自C3H/HeJ小鼠的tBMMSC或常规的BMMSC输注到10周龄的MRL/lpr小鼠中（0.1×10⁶细胞/10g小鼠体重）。(B)tBMMSC和BMMSC处理使SLE诱导的肾小球中的基底膜失调和肾小球膜细胞的过度生长恢复(G)(H&E染色)。(C)BMMSC输注后2周评估尿蛋白水平。与MRL/lpr组相比，tBMMSC和BMMSC均能够降低尿蛋白水平。不过，相比于常规的BMMSC，tBMMSC更为显著地降低了尿蛋白的水平。(D、E)ELISA量化表明，与对照组(C3H)中的不可检测(N.D.)的水平相比，抗dsDNA IgG和IgM抗体的水平在MRL/lpr小鼠的外周血中明显增大。tBMMSC和BMMSC处理能够降低抗dsDNA IgG和IgM的水平，不过在降低dsDNAIgG水平方面tBMMSC显示了优于BMMSC的处理效果(D)。(F)tBMMSC和BMMSC处理能够显著减少MRL/lpr小鼠的抗核抗体(ANA)，这比对照组（n=6）明显增大。不过，tBMMSC显示了比BMMSC处理更好的降低ANA水平的效果。(G)tBMMSC和BMMSC处理能够增大白蛋白水平（与MRL/lpr小鼠的水平的相比），这比对照组（n=6）明显减少。与经BMMSC处理的组相比，tBMMSC处理显示在升高血清中的白蛋白水平方面更为有效。(H)流式细胞检测分析表明，MRL/lpr外周血的CD4⁺T淋巴细胞中的CD25⁺Foxp3⁺Treg的数目与对照组相比减少。BMMSC和tBMMSC处理提高了Treg的数目。看起来，与BMMSC相比，tBMMSC诱导了更为显著的Treg水平的升高。(I)流式细胞术揭示，与对照组相比，MRL/lpr小鼠在脾脏中具有显著升高的CD4⁺IL17⁺IFNg^-T淋巴细胞（Th17细胞）的水平。Th17细胞在BMMSC和tBMMSC处理组中明显降低。tBMMSC处理诱导了比BMMSC更为显著的Th17细胞的减少。这些结果代表了六个独立的试验。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。图中的棒条表示平均值±SD。

图7显示通过端粒酶和Wnt/β-catenin信号传递来控制借助于BMMSC的一氧化氮产生。(A、B)tBMMSC与端粒酶抑制剂III（1μM）一起培养一周。端粒酶的活性(A)和NO的产生(B)在端粒酶抑制剂处理组中明显降低。293T细胞和热灭活样品分别用作阳性对照和阴性对照。(C-E)常规的BMMSC与阿司匹林或端粒酶抑制剂III（TeloI，1μM）一起培养一周。阿司匹林可增大BMMSC中的端粒酶的活性(C)、端粒酶逆转录酶(TERT)的表达(D)和NO的产生(E)。相反，端粒酶抑制剂III降低了端粒酶的活性(C)和NO的产生(E)。(F)在阿司匹林处理组中，将Wnt抑制剂DKK1(DKK,10ng/ml)添加至BMMSC培养物中三天（DKK-TAT），与阿司匹林(TAT)组相比，其引起了NO水平的显著降低。(G)蛋白质印迹分析表明，DKK1可以降低活化β-catenin的水平。阿司匹林(TAT)处理能够部分阻断DKK-1诱导的活化β-catenin表达的下调。(H)DKK1处理能够消除阿司匹林(TAT)诱导的BMMSC中的端粒酶的活性(DKK-TAT)。(I)当BMMSC与Chiron（β-catenin信号传递的活化剂）以1μM和10μM一起培养1周时，BMMSC中的NO产生以剂量相关的方式明显增加，正如由TotalNO/Nitrite/Nitrate试剂盒所测定的。(J)蛋白质印迹分析证实，Chiron处理诱导了BMMSC中的活性β-catenin的上调的表达。(K)Chiron处理能够诱导高端粒酶活性，而在Chiron诱导之前使用端粒酶抑制剂III(Telo i-Chiron)则阻滞该活性。293T细胞和热灭活样品分别用作阳性对照和阴性对照。(L)Chiron诱导的高NO产生能够被端粒酶抑制剂III处理阻断。这些结果表示五个独立的试验。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。图中的棒条表示平均值±SD。

图8显示，经阿司匹林处理的BMMSC显示出对SLE样MRL/lpr小鼠的改进的治疗效果。(A)BMMSC输注后2周评估尿蛋白水平。与MRL/lpr组相比，BMMSC和阿司匹林(TAT)处理的BMMSC(TAT-BMMSC)均能够降低尿蛋白的水平。不过，当全身性输注0.1×10⁶或0.01×10⁶细胞时，相比于常规的BMMSC，tBMMSC更为显著地降低了尿蛋白的水平。看起来，与MRL/lpr小鼠相比，0.01×10⁶BMMSC未能降低尿蛋白水平。(B、C)ELISA量化表明，与对照组(C3H)相比，抗dsDNA IgG和IgM抗体的水平在MRL/lpr小鼠的外周血中明显增大。TAT-BMMSC和BMMSC处理能够降低抗dsDNA IgG和IgM的水平，不过在降低dsDNA IgG和IgM水平方面TAT-BMMSC显示了优于BMMSC的处理效果。0.01×10⁶细胞输注组的TAT-BMMSC能够显著降低抗dsDNA IgG和IgM的水平。(D)TAT-BMMSC和BMMSC处理能够显著减少MRL/lpr小鼠的抗核抗体(ANA)，其与对照组（C3H）相比明显增多。不过，0.01×10⁶细胞输注组的TAT-BMMSC在降低ANA水平方面显示出比BMMSC处理更好的效果。(E)ELISA分析显示，与MRL/lpr小鼠中的高水平相比，TAT-BMMSC和BMMSC处理能够降低血清IL17水平。然而，与BMMSC处理组相比，0.01×10⁶细胞输注组的TAT-BMMSC显示出在降低血清中的IL17水平方面更为有效。(F)流式细胞术揭示，与对照组(C3H)相比，MRL/lpr小鼠在脾脏中具有显著增大的CD4⁺IL17⁺IFNg^-T淋巴细胞（Th17细胞）水平。Th17细胞在TAT-BMMSC和BMMSC处理组中明显降低。与BMMSC组相比，TAT-BMMSC处理诱导了更为显著的Th17细胞的减少。(G)流式细胞分析表明，MRL/lpr外周血的CD4⁺T淋巴细胞中的CD25⁺Foxp3⁺Treg的数目与对照组(C3H)相比减少。TAT-BMMSC和BMMSC处理提高了Treg的数目。看起来，当全身性输注0.01×10⁶细胞时，TAT-BMMSC诱导了比BMMSC更为显著的Treg水平的升高。这些结果表示六个独立的试验。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。图中的棒条表示平均值±SD。

图9显示人骨髓包含tBMMSC。(A)人tBMMSC(htBMMSC)表现出比BMMSC(hBMMSC)显著更高水平的端粒酶活性，这通过Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA试剂盒测定。293T细胞和热灭活(H.I.)分别用作阳性对照和阴性对照。(B)htBMMSC产生了比hBMMSC更高水平的NO，这通过Total NO/Nitrite/Nitrate试剂盒检测。(C)相比于hBMMSC，htBMMSC中的犬尿氨酸的产生明显增多(p<0.005)。(D)当hBMMSC或htBMMSC与活化T细胞共培养时，共培养体系中的犬尿氨酸的水平急剧增大，相比于hBMMSC组，在htBMMSC组中的增大更为显著。(E)当与hBMMSC或htBMMSC共培养时，活化的T细胞中的Annexin V和7AAD双阳性凋亡细胞数目增多。然而，与hBMMSC组相比，htBMMSC组中的凋亡细胞率显著增大。这些结果表示三个独立的试验。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.005。图中的棒条表示平均值±SD。

图10显示了BMMSC培养物中的CFU-F的数目。原始ANC以1×10⁶接种在6cm的普通塑料培养皿(Plastic)或涂覆有通过BMMSC产生的ECM的培养皿(ECM)中14天。CFU-F的数目在涂覆ECM的培养皿中培养的BMMSC中显著增多。这些结果表示五个独立的试验。***P<0.001。图中的棒条表示平均值±SD。

图11显示了tBMMSC的多能分化。(a)茜素红S和碱性磷酸酶（ALP）染色显示，tBMMSC在体外的成骨细胞分化方面类似于常规的BMMSC。(b)使用羟基磷灰石磷酸三钙(HA)作为载体将tBMMSC或常规的BMMSC（4×10⁶细胞/移植物）移植到免疫低下的小鼠中8周。由H&E染色证明，在tBMMSC和BMMSC移植物中检测到骨骼的形成。HA：羟基磷灰石磷酸三钙，B：骨骼，M：骨髓，C：结缔组织；原始放大倍数：X 200。标尺=50μm。(c)tBMMSC能够形成油红O阳性细胞并表达PPARγ2和LPL mRNA，正如分别通过油红O染色和RT-PCR分析在常规的BMMSC中所观察到的。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）用作内部对照。这些结果表示五个独立的试验。比例标尺=100μm。1：阴性对照，2：BMMSC，3：tBMMSC。(d)软骨细胞分化通过用于酸性硫酸盐化的粘液物质的Alcian blue染色、用于胶原的Pollak三色染色和用于II型胶原的免疫组织化学染色来评估。tBMMSC能够分化为软骨细胞，正如在常规的BMMSC中所观察到的。标尺=50μm。这些结果表示三个独立的试验。图中的棒条表示平均值±SD。

图12显示，对tBMMSC、BMMSC和tBMMSC(2×l0⁵/孔)中的NO水平培养3天，然后用L-NMMA(1mM)或1400W(0.2mM)处理3天。(a)收集到的培养物上清液用来测定NO的水平。结果代表五个独立的试验。(b)蛋白质印迹分析显示，iNOS的表达被LNMMA和1400W抑制。*P<0.05；***P<0.001。图中的棒条表示平均值±SD。

图13显示经tBMMSC处理的MRL/lpr小鼠的破骨细胞的活性。(a)TRAP染色表明，与对照组(C3H)相比，MRL/lpr小鼠的端股骨骨骺中的TRAP阳性细胞的数目增加。tBMMSC和BMMSC输注显著减少了TRAP阳性细胞的数目。看起来，tBMMSC组显示出比BMMSC组更为显著地减少了TRAP阳性细胞的数目。(b、c)ELISA揭示，与对照组相比，MRL/lpr小鼠血清中的可溶性RANKL(sRANKL)(b)和I型胶原的C末端端肽(c)的水平增大。tBMMSC和BMMSC输注能够显著降低sRANKL(B)和CTX(C)的水平，但tBMMSC组在降低sRANKL(b)和CTX(c)方面更为有效。结果代表五个独立的试验。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。图中的棒条表示平均值±SD。

图14显示通过端粒酶来调控BMMSC的免疫调节性。使用Trans-well系统（Corning）将用抗CD3(5μg/mL)和CD28(2μg/mL)抗体激活的SP细胞（1×10⁶/室）与或不与BMMSC(0.2×l0⁶/室)一起共培养3天。在进行共培养前，用TAT类似物（TAT，3μM）对BMMSC处理3天。使用细胞计数试剂盒-8(Dojindo Molecular Technoloies,Gaithersburg,MD)测定SP细胞的细胞活力。凋亡细胞用Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒I(BD Bioscience)染色，并用FACSCalibur(BD Bioscience)分析。与常规的BMMSC相比，经TAT类似物处理的BMMSC（TAT-BMMSC）能够显著降低活化的SP细胞的活力（a）并提高活化的SP细胞的早期(b)和晚期(c)的细胞凋亡。结果代表五个独立的试验。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。图中的棒条表示平均值±SD。

具体实施方式

缩写

BMMSC：人骨髓间充质干细胞；

CFU-F：成纤维细胞集落形成单位；

ECM：细胞外细胞基质；

Oct4：八聚物-4；

SSEA4：阶段特异性胚胎抗原-4；

SLE：全身性红斑狼疮；

Treg：CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺调节T细胞；

ANC：所有有核细胞

定义

除非另有指明，本文中使用的所有术语具有这些术语对于本发明的领域的技术人员所具有的含义。实施者可具体关注目前的教科书以获取技术的定义和术语。不过，应当理解的是，本发明并不限于所描述的特定的方法、方案和试剂，因为这些方法、方案和试剂可发生变化。

本文中将通过使用“+”或“-”符号提及的各种细胞和细胞群体指的是某种细胞或细胞群体是表达还是缺乏特定的标记物，如CD分子。与单一细胞结合使用时，使用“+”或“-”符号表明该细胞是表达还是缺乏特定的标记物。例如，“CD34⁺”、“CD31^-”细胞是表达CD34但不表达CD31的细胞。与细胞群体结合使用时，使用“+”或“-”符号表明某个细胞群体或其一部分是表达还是缺乏特定的标记物。

正如本文中使用的，所谓的“常规的BMMSC”是在常规的塑料培养物上表现为粘附的、单一的集落群（成纤维细胞集落形成单位[CFU-F]）、随后在培养皿上增殖的BMMSC(Friedenstein等，1980)。

“处理”既指治疗性处理，又指预防性的措施，其中，目的是防止或减缓（减轻）目标病理状况或失调。需要处理的对象包括已经患有失调的那些以及倾向于患上失调的那些或要预防失调的那些。

tBMMC的“治疗有效量”是足以实现具体描述的目的的量。“有效量”可凭借经验并按照与所述目的有关的常规方式来确定。

本文中所用的“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，这些物质在所采用的剂量和浓度下对于与其接触的细胞或哺乳动物是无毒的。生理学上可接受的载体可以是无菌的水性pH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的实例包括：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他的有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其他的碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂。

本发明的一个方面涉及具有高端粒酶活性的分离的人骨髓间充质干细胞的独特亚群。高端粒酶活性被最广泛地定义为具有比常规的BMMSC更高的端粒酶活性的BMMSC的群体，不过，优选的是，分离的人BMMSC的亚群具有比常规的BMMSC高至少2倍的端粒酶活性。本发明的具有高端粒酶活性的分离的人BMMSC通常的特征在于相对于常规的BMMSC具有增大的CD34的表达。优选的是，本发明的分离的人骨髓间充质干细胞中的至少约6%、更优选至少20%的细胞为CD34⁺。在其最广泛的意义上，术语“分离的”在与所关注的细胞的群体结合使用时意思是指该细胞群体至少部分地从与其一同天然存在于起源组织（例如，骨髓）中的其他细胞类型或其他细胞材料中分离。在另一个实施方式中，分离的干细胞也基本上不含可溶的、天然存在的分子。

本发明的分离的人骨髓间充质干细胞包括：(1)源自塑料培养物中的未附着细胞的分离的人BMMSC（以下称为“tBMMSC”）；(2)分离的CD34⁺BMMSC，优选CD34⁺/CD73⁺BMMSC；和(3)已经用端粒酶诱导剂处理过的人CD 34^-BMMSC（例如TAT-BMMSC）。

与本发明有关的可用的人骨髓一般可从人骨内获得。优选的是，所述骨髓是新生儿骨髓。通常使用骨髓的所有有核细胞。最优选的是，将来自股骨和胫骨的源自骨髓的所有有核细胞(ANC)如本文中所述使用。

本文中描述并鉴定的特定细胞类型可通过采用本领域的技术人员已知的技术从收集到的细胞中分离，所述技术例如包括但不限于密度梯度离心法、磁体细胞分离、流式细胞术、亲和细胞分离或差速粘附技术。在优选的实施方式中，本发明的干细胞可通过例如如下所述的流式细胞术（例如，FACS分析）来纯化。本文中描述的高端粒酶BMMSC将根据用于BMMSC的已知方法进行离体扩增以富集细胞数量，从而用于组织再生或全身性治疗。

分离的tBMMSC

tBMMSC通常由新生前体细胞的异质群体分离。分离的tBMMSC通常描述为人BMMSC，其不能在塑料培养物中形成集落群（CFU-F），但能够粘附于间充质干细胞产生的ECM并显示出相对于常规人BMMSC增大的端粒酶的表达。tBMMSC显示了区别于造血细胞的间充质干细胞特性，正如CD73或CD105与CD34的共表达所证明的。tBMMSC不能分化为造血细胞谱系。

本发明的另一方面针对分离tBMMSC的方法，所述方法包括：在塑料底物上培养源自骨髓的所有有核细胞的样品；移除未粘附于塑料底物的细胞；在BMMSC-ECM涂覆的培养基上培养移除的细胞；和收集所述BMMSC-ECM培养基上的形成集落的附着细胞。

更具体而言，tBMMSC可如下制造并分离：将原始ANC接种在塑料底物（如，塑料培养皿）上。原始ANC中的tBMMSC不能附着于培养皿，而是仍保留在细胞悬浮液中。收集包含假定的未附着的BMMSC的细胞悬浮液，并将其转移到涂覆有由BMMSC所产生的细胞外基质（ECM）的培养皿中，以形成单一的集落群(CFU-F)。这些ECM附着的BMMSC(tBMMSC)根据已知方法在常规的塑料培养物上进行再次培养。典型的流式细胞分析表明，相比于常规的BMMSC(CD73:如约70%,Sca-1:约50%,Oct4:约14%)，tBMMSC表达高水平的间充质干细胞标记物CD73(例如，约80%)、Sca-1(例如，约90%)和Oct4(例如，约40%)。然而，看起来tBMMSC和BMMSC表达了类似水平的SSEA-4。

tBMMSC表达CD34并相对于常规的BMMSC拥有高端粒酶活性。如本文中所述，常规的BMMSC不能表达CD34，但是对于CD45为阳性（约20%）。然而，tBMMSC能够同时表达CD34(约25%)和CD45(约30%)。蛋白质印迹分析显示，tBMMSC表达CD34和间充质表面分子CD73和CD105。相反，常规的BMMSC仅表达CD73和CD105。tBMMSC也具有比常规BMMSC明显更高水平的端粒酶活性。

为确保tBMMSC的纯度，优选的是分离并基本上纯化tBMMSC，tBMMSC表达已知在常规BMMSC中表达的并选自由STRO-1、CD29、CD73、CD90、CD105、CD146、八聚物-4(Oct4)和阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA4)组成的组中的标记物。在优选的实施方式中，SSEA4⁺tBMMSC可通过诸如免疫FACS等本领域普通技术人员公知的技术分离并纯化。tBMMSC干细胞的样品在至少80%、或至少90%、或至少95%、且在某些情况中至少99%不包含除了所关注的细胞之外的细胞时，则该tBMMSC干细胞的样品为“基本上纯净”。因此，例如，SSEA4⁺tBMMSC干细胞样品在至少80%、或至少90%、或至少95%、且在某些情况中至少99%不包含除SSEA4⁺tBMMSC之外的细胞时，该样品为“基本上纯净”。纯度可通过任何适宜的方法测定，例如，荧光活化细胞分类法(FACS)或其他可区分细胞类型的检测。

分离的CD34⁺人BMMSC

CD34⁺BMMSC与常规的BMMSC的不同之处在于前者具有升高的端粒酶活性和高水平的早期的间充质干细胞标记物Oct4，以及增大的免疫调节功能。其可能有助于上调免疫调节功能的机理与tBMMSC中的高NO产生(Ren等，2008)以及NO驱使的高Treg水平(Niedbala等，2007)有关，这似乎是通过端粒酶活性并结合Wnt/β-catenin信号传递进行调控的。不受理论的限制，据信原因是tBMMSC在处理SLE小鼠时具有优异的治疗效果。

分离的CD34⁺BMMSC不能在塑料培养物中形成CFU-F，但能够粘附于间充质干细胞产生的ECM，而且能够分化为C3H/HeJ小鼠和C57BL/6J小鼠的成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。CD34⁺BMMSC共表达间充质干细胞标记物CD73和CD105。此外，CD34⁺BMMSC与HSC的区别在于以下事实：CD34⁺BMMSC不能在体外分化为造血细胞谱系，并且不能救治以致死剂量照射的小鼠。

优选的是，分离的人BMMSC对于CD34和已知在常规BMMSC中表达的至少一种其他标记物呈双阳性，所述至少一种其他标记物选自由STRO-1、CD29、CD73、CD90、CD105、CD146、八聚物-4(Oct4)和阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA4)组成的组。优选的是，BMMSC同时为CD34⁺和CD73⁺。优选的是，分离的CD34⁺BMMSC基本上纯净。CD34⁺BMMSC的样品在至少80%、或至少90%、或至少95%、且在某些情况中至少99%不包含除所关注细胞之外的细胞时，该样品为“基本上纯净”。因此，例如，CD34⁺BMMSC的样品（群体）在至少80%、或至少90%、或至少95%、且在某些情况中至少99%不包含除CD34⁺BMMSC之外的细胞时，该样品为“基本上纯净”。纯度可通过任何适宜的方法测定，例如，荧光活化细胞分类法(FACS)或其他可区分细胞类型的检测。

如本文中所述，全骨髓ANC中大约4%的人BMMSC细胞对于CD34和CD73为双阳性。这些CD34⁺/CD73⁺细胞可使用如流式细胞分选机等常规技术从骨髓中分选并分离。使用流式细胞术从全骨髓中分离CD34⁺/CD73⁺BMMSC提供了分离并收集tBMMSC以供临床治疗用途的实用方法。CD34⁺/CD73⁺细胞能够从tBMMSC中和从已经用如本文中所述的端粒酶诱导剂处理过的常规BMMSC中分选并分离。优选的是，CD34⁺/CD73⁺BMMSC为“基本上纯净”。CD34⁺/CD73⁺BMMSC的群体在至少80%、或至少90%、或至少95%、且在某些情况中至少99%不包含除CD34⁺/CD73⁺BMMSC之外的细胞时，该群体为“基本上纯净”。

CD34⁺/CD73⁺细胞以类似于tBMMSC的频率在BMMSC-ECM培养物上形成CFU-F。CD34⁺/CD73⁺BMMSC也显示出比常规的BMMSC更高的端粒酶活性。与常规的BMMSC相比，CD34⁺/CD73⁺BMMSC还显示出NO产生的显著增大。

以端粒酶诱导剂处理的CD34^-BMMSC

本发明的另一个方面涉及增大CD34^-人骨髓间充质干细胞中的端粒酶活性的方法，所述方法包括：使人骨髓间充质干细胞与有效量的端粒酶诱导剂接触。CD34^-BMMSC例如可以为常规的BMMSC。如本文中所定义的，如果BMMSC的族群少于约1%为CD34⁺，则该族群为CD34^-。

CD34^-BMMSC的端粒酶活性可通过在培养基中加入有效量的端粒酶诱导剂而提高。一种优选的端粒酶诱导剂是阿司匹林，不过也可以用阿司匹林的结构和功能类似物来替代。培养条件可以由本领域的技术人员通过如本文中所述测定端粒酶活性水平而适当地确定。使用阿司匹林时，优选以约2μg/ml～约50μg/ml添加到培养基中约1周。在这些条件下的培养实现了BMMSC中的端粒酶活性的水平的显著提高。

在一个特定的实施方式中，常规的人BMMSC用端粒酶诱导剂处理以变为具有高端粒酶活性并具有改善的免疫调节功能的BMMSC。具体而言，在将阿司匹林以2.5μg/ml或50μg/ml添加到培养基中1周时，实现了BMMSC中的端粒酶活性水平的显著提高。得到的BMMSC在本文中称为TAT-BMMSC。与常规的BMMSC中的阴性CD34表达相比，TAT-BMMSC显示CD34的阳性表达。TAT-BMMSC中的CD45的表达水平低于在BMMSC和tBMMSC中的水平。与BMMSC相比，TAT-BMMSC表达了明显高水平的Scal1、Oct4和CD34，但处于比tBMMSC低得多的水平。不过，与tBMMSC和常规的BMMSC相比，TAT-BMMSC表达低得多的CD45水平。蛋白质印迹分析表明，tBMMSC和经阿司匹林处理的BMMSC表达CD34，但是BMMSC不能表达CD34。

高端粒酶活性的BMMSC的治疗应用

本发明的另一个方面涉及使用本发明的BMMSC来治疗一种或多种失调。

本发明的另一个方面涉及免疫调节方法，所述方法包括对需要该免疫调节的患者施用治疗有效量的本发明的分离的人骨髓间充质干细胞。

本发明的另一个方面涉及增大体内的NO浓度的方法，所述方法包括对有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的分离的人骨髓间充质干细胞。NO是一种气态的生物媒介，在影响巨噬细胞和T细胞功能方面发挥重要作用(Sato等，2007；Bogdan等，2001)。iNOS由BMMSC中的IFNγ、INFα、IL-1α或IL-1β诱导，并且iNOS^-/-小鼠显示出降低的抑制T细胞功能的能力(Ren等，2008)。据报道，活跃的内皮NOS与雌激素受体一起共同调节内皮中的人端粒酶逆转录酶(hTERT)表达(Grasselli等，2008)。我们在本文中描述了高端粒酶活性通过升高约10μM的NO产生和约5%的Treg的上调来改进BMMSC的免疫调节活性的功能性作用。端粒酶提高的NO产生也与Wnt/β-catenin信号传递有关，其中Wnt抑制剂DKK1能够阻断BMMSC中的端粒酶活化剂诱导的端粒酶活性及相关的NO产生。此外，Wnt活化剂Chiron能够促进BMMSC中的端粒酶的活性及NO产生。用端粒酶抑制剂进行预处理可部分消除Wnt活化剂诱导的端粒酶的活性。这些数据表明，端粒酶与Wnt/β-catenin信号传递相结合能够促进NO的产生。因此，除了参与Wnt/β-catenin信号传递途径的功能性作用(Park等，2009)之外，端粒酶也与Wnt/β-catenin信号传递协作来调节NO的产生。端粒酶和Wnt/β-catenin活化剂均能够诱导常规BMMSC中的高NO产生，从而产生改善的活化的SP细胞活力的减少。但是，仅有端粒酶活化剂处理能够增强活化的SP细胞的细胞凋亡。其他的免疫调节因子也有可能有助于提高tBMMSC的免疫调节。

本发明的另一个方面涉及全身性红斑狼疮的治疗，所述治疗包括对需要该治疗的患者施用治疗有效量的本发明的分离的人骨髓间充质干细胞。

正如本文中使用的，本发明的BMMSC的术语“有效量”与方法结合使用时是足以完成具体描述的目的的量。通常，涉及治疗疾病或失调的“有效量”可以凭借经验参照本文中所公开的数据和标准并按照与所述目的有关的常规方式来确定。有效量优选以单次剂量的方式提供给患者；然而，所述有效量也可以作为一段时间内的许多次剂量递送给患者。正如本文中描述的，在常规BMMSC的情况中，0.1×10⁶细胞/10g体重的剂量足以处理SLE小鼠。通过使用高端粒酶活性的BMMSC，所述剂量可减小至0.01×10⁶细胞/10g体重，仍具有治疗效果。本领域的技术人员可通过使用将小鼠剂量关联到人剂量的已知模型并使用用于优化剂量的已知技术而将其应用于治疗人类。

本发明还包括药物组合物，其包含有效量的在载体介质中含有具有高端粒酶活性的分离的骨髓间充质干细胞的药物组成。本发明的药物组合物用于根据本文中描述的任一种方法来施用具有高端粒酶活性的分离的骨髓间充质干细胞以供治疗。

在本文中所描述的方法中，本发明的BMMSC应当与患者相容，并且以治疗有效量的BMMSC给药。所述治疗有效量可以为可被患者安全接受的最大细胞数至用于实现预期效果所必需的最小细胞数。本领域的技术人员能够根据已知的技术来确定并优化有效量，从而实现预期的治疗目的。

治疗有效量的BMMSC可悬浮在药学上可接受的载体中。这样的载体可包括但不限于适宜的培养基加上1%的血清白蛋白、盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水及其组合。制剂应当适合给药方式。

在优选的实施方式中，根据本领域的技术人员已知的用于药物制剂的过程将BMMSC制剂或组合物配制为用于对人类进行全身给药。通常，用于全身给药的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。各组分可以分别提供，也可以按单位剂型混合在一起，例如，作为气密性密封容器（如安瓿）中冷藏的浓缩物，标示出活性剂的量。

在阅读本说明书后，将细胞施用给对象的各种手段对于本领域的技术人员将是显而易见的。这样的方法可包括将细胞全身施用或注射到对象的目标部位。可以将细胞插入到通过注射或植入到受试对象体内而便于引入的递送装置中。该递送装置可包括用于将细胞和液体注射到接受对象体内的管子，例如导管。在优选的实施方式中，所述管子还具有针头，例如，注射器，本发明的细胞可通过该设施而引入到对象的所需位置。所述细胞可制备为以各种不同的形式递送。例如，所述细胞可以悬浮在溶液或凝胶中。细胞也可以与在其中本发明的细胞仍具活力的药学上可接受的载体或稀释剂混合。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。这类载体和稀释剂的使用在本领域中是众所周知的。所述溶液优选为无菌的流体，并且往往是等渗的。优选的是，所述溶液在制造和保存条件下是稳定的，并通过使用例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等而免受细菌和真菌等微生物的污染作用的影响。

施用分离的人BMMSC的方式包括但不限于全身静脉内或动脉内注射和直接注射到组织的预期活性部位。制剂可通过任何方便的途径给药，例如，通过输注或弹丸注射，而且可以与其他的生物活性剂一起给药。给药优选是全身性的。在某些条件下，有利的是使用靠近或最接近预期活性部位的给药部位。当组合物通过输注给药时，其可通过包含无菌药用级的水或盐水的输液瓶来分配。当所述组合物通过注射给药时，可以提供用于注射的无菌水或盐水的安瓿，以使可以在给药前将各组分混合。

本发明的BMMSC的施用可以结合一种或多种其他的治疗剂一同进行，包括同时（并行）施用和以任何顺序连续施用。

实施例

提供以下实施例是为了说明和进一步阐述本发明的某些实施方式和方面，而不应当理解为限制本发明的范围。尽管这样的实施例是那些可以使用的方式的代表，不过也可以选择使用本领域的技术人员已知的其他过程。事实上，本领域的技术人员基于本文中的教导可以容易地设计并创造出其他的实施方式，而无需过多的试验。

试验方法

动物。雌性C3H/HeJ、C57BL/6J和CSMRL-Fas^lpr小鼠购自Jackson Lab。雌性免疫低下小鼠(Beige nude/nude XIDIII)购自Harlan。所有的动物试验均在机构批准的用于动物研究的规章(USC#10874和10941)下进行。

抗体。抗Oct4、SSEA4、活化β-catenin和β-catenin购自Millipore。抗Sca-1-PE、CD34-PE、CD34-FITC、CD45-PE、CD73-PE、CD4-PerCP、CD8-FITC、CD25-APC、CD3ε和CD28抗体购自BD Bioscience。抗CD105-PE、Foxp3-PE、IL17-PE和IFNγ-APC抗体购自eBioscience。非结合的抗CD34、CD73和CD 105以及抗TERT购自Santa CruzBiosciences。抗β-actin（肌动蛋白）抗体购自Sigma。

小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)的分离。将来自股骨和胫骨的源自骨髓的所有有核细胞(ANC)的单一悬浮液于37℃在5% CO₂条件下以15×10⁶接种在100mm的培养皿(Corning)中。48小时后移除未粘附的细胞，并将附着的细胞在补充有20%胎牛血清(FBS,Equitech-bio)、2mM L-谷氨酰胺、55μM2-巯基乙醇、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen)的阿尔法最低必需培养基(α-MEM,Invitrogen)中保留16天。使形成集落的附着细胞经过一次以供其他的试验使用。

细胞外基质(ECM)涂覆的培养皿的准备。如Chen等(2007)所述准备ECM涂覆的培养皿。简而言之，使100%细胞覆盖的BMMSC与100nM L-抗坏血酸磷酸盐(WakoPure Chemical)在培养基中培养。2周后，培养物用PBS洗涤，并于室温用0.005%的Triton X-100(Sigma)温育5分钟～10分钟以除去细胞。ECM于37℃用DNase I(100单位/ml；Sigma)处理1小时。ECM用PBS洗涤三次，然后于4℃保存在2ml的包含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素B(Invitrogen)的PBS中。

tBMMSC的分离。源自骨髓的ANC以15×10⁶接种在100mm的培养皿中，并培养48小时。收集培养物上清液并进行离心分离以获得假定的未附着的BMMSC。将细胞按照指定数目再接种于ECM涂覆的培养皿上。48小时后，培养物中的漂浮细胞用PBS移除，将ECM上的附着细胞再保留14天。使形成集落的附着细胞经过一次，然后在常规的塑料培养皿上进行再次培养以用于其他的试验。对于一些干细胞的表征分析，我们使用FACS^Calibur流式细胞仪(BD Bioscience)收集SSEA4阳性tBMMSC，并在培养基中进行扩增。

成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)检测。将来自骨髓的ANC中的一百万个细胞接种在T25细胞培养瓶(Nunc)上。16天后，培养物用PBS洗涤，并用2%多聚甲醛(PFA)中的1%甲苯胺蓝溶液染色。在显微镜下将具有超过50个细胞的细胞群作为集落计数。每个试验组在五个独立的样品中计数集落数。

细胞增殖检测。通过溴脱氧尿苷(BrdU)掺入法进行BMMSC和tBMMSC的增殖。将各细胞群体(1×10⁴细胞/孔)接种在2孔腔式载玻片(Nunc)上并培养3天。培养物用BrdU溶液(1:100)(Invitrogen)温育20小时，然后用BrdU染色试剂盒(Invitrogen)染色。每个对象在10幅图像中计数BrdU阳性细胞数和总细胞数。对于每个实验组在5个独立样品中重复BrdU检测。

群体倍增检测。在第一次经历时将BMMSC和pBMMSC的0.5×10⁶细胞接种在60mm的培养皿上。达到细胞覆盖后，细胞以相同的细胞密度进行。根据以下等式求算每次经历的群体倍增：log₂(收获的细胞数/接种的细胞数)。有限的群体倍增由在细胞停止分裂之前由各次经历产生的总数的累加所限定。

间充质干细胞表面分子的流式细胞分析。BMMSC或pBMMSC（0.2×10⁶）于4℃与1μg的PE结合抗体或同型匹配的对照IgG(Southern Biotech)温育45分钟。样品用FACS^Calibur流式细胞仪(BD Bioscience)分析。对于双色分析，细胞用PE结合和FITC结合抗体或同型匹配的对照IgG（各自为1μg）处理。用FACS^Calibur(BD Bioscience)分析细胞。

免疫荧光显微术。在8孔腔式载玻片(Nunc)上再次培养的细胞（2×10³/孔）以4%PFA固定。样品于4℃与特定的或同型匹配的小鼠抗体(1:200)温育整夜，然后用若丹明结合的第二抗体(1:300,Jackson ImmunoResearch;Southern Biotechnology)处理。最后，通过包含4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的Vectashield安装介质(VectorLaboratories)来安装样品。

CD34⁺CD73⁺双阳性细胞的分离。在黑暗条件下将源自骨髓的ANC在冰上用抗CD34-FITC和抗CD73-PE抗体染色30分钟。用PBS洗涤后，将细胞再次悬浮在补充有2%FBS和抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的OPTI-MEM(Invitrogen)中，然后用MOFLO XDP细胞分选仪(BECKMAN Coulter)进行分选。分选出的双阳性细胞以1×10⁶/培养皿的密度接种在ECM涂覆的60mm培养皿上，并进行培养以用于其他的试验。

体内骨形成试验。4.0×10⁶个细胞与羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)陶瓷粉末(40mg,Zimmer Inc.)混合，然后皮下移植到8周龄的免疫低下的小鼠中。8周后，收取植入物，在4%PFA中固定，并用5% EDTA(pH7.4)脱钙，随后包埋在石蜡中。石蜡部分用苏木精和曙红(H&E)染色，然后通过N1H Image-J进行分析。计算来自五个区域的新形成的矿化组织的面积并将其表示为相对于全部组织面积的百分比。

体外成骨细胞分化试验。BMMSC和tBMMSC在包含2mMβ-甘油磷酸酯(Sigma)、100μM L-抗坏血酸-2-磷酸盐和10nM地塞米松(Sigma)的成骨细胞培养条件下培养。诱导之后，培养物用茜素红或碱性磷酸酶染色。

体外脂肪细胞分化试验。对于脂肪细胞的诱导，在培养基中加入500nM异丁基 甲基黄嘌呤、60μM消炎痛、500nM氢化可的松、10μg/ml胰岛素(Sigma)、100nM L-抗坏血酸磷酸盐。10天之后，培养的细胞用油红O染色，使用N1H Image-J对阳性细胞进行量化。10天诱导后还将全部RNA与培养物分离以用于其他的试验。

逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)分析。根据标准过程进行全部RNA的提取和RT-PCR。

蛋白质印迹分析。使用20mg的蛋白质，并根据标准过程进行SDS-PAGE和蛋白质印迹法。相同薄膜上的β-肌动蛋白用作加载对照。

抑制剂处理。tBMMSC和BMMSC用1mM L-NMMA(Cayman Chemical)或0.2mM 1400W(Cayman Chemical)处理以分别抑制全部NOS或iNOS。阿司匹林50μg/ml(TAT)和端粒酶抑制剂III(1μM；EMD Chemicals)用来分别激活和抑制培养的BMMSC中的端粒酶的活性。CHIRON 99021(1或10μM；Chiron Corporation)和Dickkopf1(DKK1,10ng/ml,R&D Systems)用作活化剂和抑制剂来调节BMMSC中的β-catenin的水平。

端粒酶活性的测定。使用TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA试剂盒(Roche)来测定端粒酶的活性。

一氧化氮产生的测定。BMMSC(0.2×10⁶/孔)在24孔板上与或不与细胞因子(IFNγ,25ng/ml；IL-1β,5ng/ml,R&D Systems)和化学品(L-NMMA,1ml；1400W,0.2mM；阿司匹林，50μg/ml；端粒酶抑制剂III，1μM；CHIRON99021,1或10μM；DKK1,10ng/ml)一起按指定的浓度和天数培养。同样的化学品浓度也用在诸如DKK和阿司匹林或端粒酶抑制剂和CHIRON 99021的组合处理中。收集各培养物的上清液，并使用Total Nitric Oxide and Nitrate/Nitrite Parameter Assay kit(R&D Systems)根据制造商的说明书测定一氧化氮浓度。

细胞凋亡和细胞存活检测。Transwell系统(Corning)用于共培养试验。将0.2×10⁶的tBMMSC或BMMSC接种在各下室中。在上室中，加载将板上结合的抗CD3ε抗体(5μg/ml)和可溶性抗CD28抗体(2μg/ml)预刺激3天的活化的脾细胞(1×10⁶/室)。两室中均充满包含Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM,Lonza)与10%热灭活的FBS、50μM的2-巯基乙醇、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠(Sigma)、1%非必需氨基酸(Cambrex)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的完全培养基。为测定脾细胞的活力，使用细胞计数试剂盒-8(Dojindo Molecular Technoloies)。对于脾细胞的细胞凋亡分析，使用Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒I(BDBioscience)，并用FACS^Calibur(BD Bioscience)分析。

体外的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Tregs诱导。通过CD4⁺CD25⁺调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)收集的CD4⁺CD25^-T淋巴细胞（1×10⁶/孔）用板上结合的抗CD3ε抗体(5μg/ml)和可溶性抗CD28抗体(2μg/ml)预刺激3天。这些活化的T淋巴细胞与重组人TFGβl(2μg/ml)(R&D Systems)和重组小鼠IL2(2μg/ml)(R&D Systems)一起加载于0.2×10⁶的BMMSC或tBMMSC上。3天后，收集悬浮液中的细胞，并在黑暗条件下在冰上用抗CD4-PerCP、抗CD8a-FITC、抗CD25-APC抗体(各自为1μg)染色45分钟。之后使用用于细胞固定和透化的Foxp3染色缓冲液试剂盒(eBioscience)用抗Foxp3-PE抗体（1μg）对细胞染色。

同种异体小鼠tBMMSC移植到MRL/lpr小鼠中。在全身麻醉下，将源自C3H/HeJ的BMMSC或tBMMSC（0.1×10⁶细胞/10g体重）经由尾静脉输注到10周龄的MRL/lpr小鼠中(n=6)。在对照组中，MRL/lpr小鼠中接受PBS(n=5)。所有的小鼠均在12周龄时杀死以用于进一步的分析。使用Bio-Rad Protein Assay(Bio-Rad)测定尿中的蛋白质浓度。通过Coulter LH-750(BECKMAN Coulter)测定外周血中的白细胞的数量。

自身抗体、白蛋白、sRANKL和CTX的测定。收集小鼠的外周血的血清样品。使用市售的试剂盒(抗dsDNA抗体、ANA和白蛋白，alpha diagnostic；sRANKL,R&DSystems;CTX,Nordic Bioscience Diagnostics A/S)，根据制造商的说明书通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法来分析自身抗体、白蛋白、sRANKL和CTX。结果在各组中求取平均值。计算平均值之间的组内差。

TRAP染色。脱蜡切片用50%乙醇和50%丙酮的混合物再固定10分钟。TRAP染色溶液是新制的(1.6%萘酚AS-BI磷酸盐在N,N-二甲基甲酰胺和0.14%坚牢红-紫色LB重氮盐中，0.097%酒石酸和0.04%MgCl₂在0.2M乙酸钠缓冲液中，pH5.0)并按照1:10混合。所述切片在护罩下在所述溶液中于37℃温育10分钟，然后用甲苯胺蓝复染。所有用于TRAP染色的试剂均购自Sigma。

组织化学。以H&E染色测定骨切片上的骨小梁的面积。为量化骨中破骨细胞的活性，通过附着于骨表面的TRAP阳性细胞来确定成熟的破骨细胞的数目。使用NIHImage-J由每个样品的五个代表性图像来测定各自的细胞数和面积，随后求算平均值。数据是各试验组中的平均值。结果表示为各个标示的百分比。

救治以致死剂量照射的小鼠。在各组中，将50ml PBS中的1×10⁶细胞或单独作为对照的PBS注射到以致死剂量（8.5Gy/小鼠）照射后1天的接受小鼠的尾静脉中。记录每只小鼠的存活日期并进行分析。

统计。使用Student t试验来分析统计学差异。p值小于0.05则被视为具有显著性。

实施例1

BMMSC的亚群不能粘附于塑料培养皿，但附着于ECM涂覆的培养皿。

为确定BMMSC的亚群是否保留在培养液中，我们在常规的塑料培养条件下接种15×10⁶个骨髓的所有有核细胞(ANC)2天，随后使用羟基磷灰石磷酸三钙(HA/TCP)作为载体将所有未附着的细胞皮下移植到免疫低下的小鼠中。移植后8周，通过H&E染色来鉴定植入物中新形成的骨（图1A），表明BMMSC培养液可包含具有在体内分化成为骨形成细胞的能力的细胞。新增的证据表明，与塑料培养物相比，由BMMSC产生的细胞外基质(ECM)（BMMSC-ECM）能够粘附更多数量的CFU-F(图10；Chen等，2007)。因此，我们收集了初始CFU-F培养后2天的培养基，并将该培养基加载到BMMSC-ECM涂覆的培养皿上（图1B）。悬浮液中的BMMSC的亚群（称为tBMMSC）能够粘附于BMMSC-ECM并形成CFU-F（图1B），而且与由常规的BMMSC产生的CFU-F的数目相比具有更低的发生率（图1C）。发现tBMMSC表达间充质干细胞相关的标记物(CD73、干细胞抗原1[Sca-1]、八聚物4[Oct4]和阶段特异性抗原4[SSEA4])，正如由流式细胞分析所证明的（图1D）。与常规的BMMSC相比时，tBMMSC表达明显更高水平的Sca-1(87.74%对BMMSC中的52.16%)和Oct4(40.7%对BMMSC中的14.08%)，二者均为间充质干细胞的早期祖细胞表面分子。为了表征tBMMSC的干细胞特性，我们收集了SSEA4阳性的tBMMSC并通过溴脱氧尿苷(BrdU)标记来评估其增殖率。我们发现，与常规的BMMSC相比，tBMMSC具有显著升高的BrdU吸收率（图1E）。另外，我们使用了连续的细胞培养法，表明SSEA4+tBMMSC获得了显著增多的群体倍增的数目（图1F）。这些数据意味着tBMMSC在附着、增殖和自我更新方面明显不同于常规的BMMSC。

为检验多能分化潜能，我们揭示了，tBMMSC在表达碱性磷酸酶(ALP)、在成骨诱导培养物下矿化结节聚合以及使用HA/TCP作为载体移植到免疫低下小鼠中时的骨再生方面均与BMMSC类似（图11A、11B）。另外，我们展示了，tBMMSC在以下方面与常规的BMMSC相似：在成脂诱导条件下形成油红O阳性细胞、表达成脂基因过氧化物酶体增生物激活的受体γ2（PPARγ2）和脂蛋白脂肪酶(LPL)、以及在诱导软骨形成的条件下分化为软骨细胞并表达蛋白多糖、三色阳性胶原和II型胶原（图11C、11D）。这些数据证实，tBMMSC是未粘附的BMMSC的新型亚群。

实施例2

tBMMSC表达端粒酶和CD34，但不同于造血干细胞。

为表征tBMMSC，使用流式细胞分析来检验tBMMSC是否表达造血细胞标记物。我们发现，17.4%的tBMMSC而非常规的BMMSC表达CD34、HSC和内皮细胞标记物（图2A）。BMMSC(21.25%)和tBMMSC(31.22%)在经历2表达CD45，即另一种造血细胞标记物（图2A）。BMMSC和tBMMSC均对CD l1b抗体染色呈阴性（数据未示出），排除了tBMMSC源自单核细胞/巨噬细胞谱系细胞。重要的是，CD34⁺tBMMSC共表达BMMSC相关标记物（CD73或Oct4），正如由流式细胞分析证明的（图2B）。蛋白质印迹分析证实，tBMMSC表达CD34、CD73和CD105（图2C），常规的BMMSC表达CD73和CD105，而不表达CD34（图2C）。tBMMSC显示出从经历1至5的CD34的连续表达，然而，表达水平看起来在经历3之后降低（图2D）。为进一步验证tBMMSC中的CD34的表达，我们使用了双免疫细胞染色，表明tBMMSC共表达CD34与间充质标记物CD73和CD105(图2E、2F)，常规的BMMSC则对于抗CD34抗体染色为阴性(图2E、2F)。更有趣的是，我们通过PCR-ELISA检测和蛋白质印迹分析发现，tBMMSC具有比常规的BMMSC显著更高水平的端粒酶活性（图2G、2H），这意味着tBMMSC可能是BMMSC的原始亚群。

接下来，我们使用流式细胞术从骨髓ANC中分选CD34和CD73双阳性细胞，并回收了3.77%的双阳性细胞（图2I）。这些CD34和CD73双阳性细胞显示出间充质干细胞的特性，包括形成单一集落群（图2J），和分化为成骨细胞和脂肪细胞（数据未示出），表明由骨髓直接分离tBMMSC样细胞的可行的方法。与常规的BMMSC相比，CD34⁺/CD73⁺BMMSC在具有更高水平的端粒酶活性和高NO产生方面与tBMMSC类似（图2K、2L）。

为排除tBMMSC中的潜在的HSC污染，我们使用阿司匹林(TAT)来升高常规的CD34^-BMMSC中的端粒酶的水平（图7C）。在阿司匹林处理后，BMMSC显示出比BMMSC更高水平的Sca-1和Ooct-4表达，但处于比tBMMSC更低的水平（图3A、3B）。重要的是，经阿司匹林(TAT)处理的CD34^-BMMSC获得了CD34的阳性表达（图3A）。蛋白质印迹分析证实，阿司匹林(TAT)处理的BMMSC表达CD34，不过比tBMMSC的水平低（图3C）。这些数据表明，CD34在BMMSC中的表达并非由于HSC的污染所致。

通常认为，CD34表达与HSC和内皮群体有关。HSC能够分化为造血细胞系，并救治以致死剂量照射的对象。因此，我们使用造血分化介质来处理tBMMSC、经阿司匹林(TAT)处理的BMMSC和常规的BMMSC，并发现所有这些细胞均不能分化为造血细胞系，正如在作为能够形成集落群的阳性对照的骨髓细胞和谱系细胞中所观察到的（图4A）。接下来，我们进行全身性输注tBMMSC来救治以致死剂量照射的小鼠，发现tBMMSC而非常规的BMMSC能够延长以致死剂量照射的小鼠的寿命（图4B）。不过，tBMMSC不能救治以致死剂量照射的小鼠，正如骨髓组中所示（图4B）。这些实验证据进一步表明，CD34在tBMMSC中的表达并非由于HSC的污染所致。

实施例3

tBMMSC通过高一氧化氮(NO)产生具有优异的免疫调节功能。

近来，免疫调节性被确定为BMMSC的重要的干细胞特性，导致利用全身性输注BMMSC来治疗各种免疫疾病(Nauta等，2007；Uccelli等，2007、2008)。此处我们发现，在用干扰素γ(IFNγ)和白介素1β（IL-1β）处理时，tBMMSC显示出比常规BMMSC显著增大的NO产生能力（图5A）。已知NO在BMMSC介导的免疫抑制中起到关键的作用(Ren等，2008)，因此，我们评估了高NO产生在tBMMSC相关的免疫调节性中的功能性作用。脾(SP)细胞通过抗CD3和抗CD28抗体的刺激活化3天，然后在普通的一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂、NG-单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)或可诱导的NOS(iNOS)抑制剂1400W的存在下使用Transwell培养系统与tBMMSC或常规的BMMSC共培养。验证了L-NMMA和1400W对于抑制BMMSC中的NO产生的功效(图12)。尽管tBMMSC和常规的BMMSC均能够抑制活化的SP细胞的细胞活力，不过tBMMSC显示出比常规的BMMSC更为显著的对SP细胞活力的抑制（图5B）。有趣的是，L-NMMA和1400W均能够显著阻止tBMMSC而非常规的BMMSC诱导的活化的SP细胞的细胞活力（图5C、5D）。此外，流式细胞分析表明，tBMMSC和常规的BMMSC均在Transwell培养系统中诱导了活化的SP细胞的细胞凋亡，包括早期凋亡细胞(图5E)和晚期凋亡及死亡细胞(图5H)。然而，与常规的BMMSC相比，tBMMSC在诱导活化的SP细胞凋亡方面显示出升高的能力（图5E、5H）。在将L-NMMA和1400W添加到培养物中时，早期和晚期凋亡的SP细胞的数目在tBMMSC组和常规BMMSC组中均显著减少（图5F、5G、5I、5J）。用1400W处理产生了在tBMMSC组中比常规的BMMSC组显著更强的对早期凋亡的SP细胞的抑制（图5G）。这些数据表明，NO的产生对于BMMSC介导的免疫调节是必需的。

接下来，我们在IL-2和转化生长因子β1(TGF-β1)的存在下共培养了初始T细胞和tBMMSC或常规的BMMSC。我们发现，与常规的BMMSC相比，tBMMSC显示出对于CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞(Treg)水平的显著上调（图5K）。L-NMMA和1400W均能够抑制BMMSC和tBMMSC诱导的Treg的上调，正如流式细胞分析所示的（图5L、5M）。tBMMSC组中对Tregs的调节效果比BMMSC组中的更为显著（图5L、5M）。这些数据进一步验证了NO在tBMMSC诱导的免疫调节效果中的作用。

实施例4

tBMMSC移植改善了MRL/lpr小鼠的多器官功能。

为了检验tBMMSC的体内免疫调节性，我们将同种异体tBMMSC和BMMSC输注给10周龄的MRL/lpr小鼠，然后在12周龄时分析处理反应（图6A）。我们发现，tBMMSC和BMMSC均能够改善SLE诱导的肾小球基底膜失调（图6B）并降低尿蛋白的水平（图6C）。看起来在降低总尿蛋白水平方面tBMMSC比BMMSC更为优异（图6C）。正如所预期的，MRL/lpr小鼠显示了自身抗体水平的显著增加，包括外周血中的抗双链DNA（dsDNA）IgG和IgM抗体（图6D、6E）和抗核抗体（ANA；图6F）。尽管tBMMSC和BMMSC输注显示出外周血中的dsDNA IgG、IgM抗体和ANA水平的明显降低（图6D～F），不过tBMMSC在降低dsDNA IgG抗体和ANA水平方面显示出比BMMSC组更为优异的治疗效果（图6D、6F）。另外，通过tBMMSC和BMMSC输注恢复了MRL/lpr小鼠的降低的血清白蛋白水平（图6G），但tBMMSC处理得到了比BMMSC处理更为显著的恢复（图6G）。

接下来，我们使用了流式细胞分析，揭示出与BMMSC相比，tBMMSC在恢复外周血中的降低的CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Treg水平和增多的CD4⁺IL17⁺IFNγ^-T淋巴细胞数量方面更为有效（图6H、6I）。此外，我们展示了，tBMMSC在减少MRL/lpr小鼠的端股骨骨骺中的增多的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性破骨细胞的数量（图13A）、升高的可溶性矮小相关的NF-κB配体(sRANKL)（破骨细胞形成的关键因素）的血清水平（图13B）和骨吸收标记物I型胶原的C-末端端肽（CTX，图13C）方面均优于BMMSC。这些数据表明，与BMMSC相比，tBMMSC显示出对于SLE失调的优异的治疗效果。

实施例5

BMMSC中的NO产生通过端粒酶活性并结合Wnt/β-catenin信号传递来调节

由于在tBMMSC中观察到升高的NO产生端粒酶活性，因此重要的是阐明端粒酶的活性是否能够控制tBMMSC中的NO的产生。我们发现，端粒酶抑制剂III能够有效地抑制tBMMSC中的端粒酶的活性并减少NO的产生（图7A、7B）。在常规的BMMSC中也观察到端粒酶抑制剂的相似效果（图7C、7E）。相反，阿司匹林(TAT)处理导致了BMMSC中的明显升高的端粒酶的活性、端粒酶逆转录酶(TERT)的表达和NO的产生（图7C～E）。这些数据意味着端粒酶的活性可能与tBMMSC中的NO的产生有关。

近来，据报道端粒酶通过用作β-catenin转录复合物中的辅助因子而直接调节Wnt/β-catenin信号传递(Park等，2009)。因此，我们评估了BMMSC中的端粒酶活性相关的NO产生是否能够被Wnt抑制剂Dickkopf1(DKK1)下调。有趣的是，我们发现，在进行阿司匹林(TAT)处理之前将DKK1添加到培养物中时其能够显著地阻断BMMSC中的阿司匹林诱导的NO产生（图7F）。蛋白质印迹分析证实了DKK1在降低活化的β-catenin水平方面的功效（图7G）。另外，我们发现，阿司匹林(TAT)能够部分阻断DKK1诱导的活化β-catenin的下调（图7G）。为了检验DKK1抑制阿司匹林(TAT)诱导的NO产生的机理，我们展示了，DKK1能够阻断阿司匹林(TAT)诱导的端粒酶的活性（图7H）。这些数据表明，端粒酶驱动的NO产生是与Wnt/β-catenin信号传递相结合的。

接下来，我们确定了Wnt/β-catenin信号传递是否影响BMMSC中的NO产生。我们使用Chiron 99021(Chiron)处理BMMSC7天，并显示出活化β-catenin以剂量相关方式增大（图7I），证明了Chiron作为Wnt/β-catenin活化剂的功效。随后我们展示了，Chiron处理以剂量相关方式上调了BMMSC中的NO产生（图7J），以及提高了BMMSC中的端粒酶的活性（图7K）。此外，我们展示了，以端粒酶抑制剂III进行3天预处理可以阻断Chiron诱导的端粒酶活性和NO产生（图7K、7L）。这些发现表明，在BMMSC中端粒酶和Wnt/β-catenin协同增强了端粒酶活性并诱导了NO的产生。

实施例6

阿司匹林处理产生了免疫调节性活化BMMSC

为了确定端粒酶否影响常规的BMMSC的免疫调节性，我们展示了，阿司匹林(TAT)能够促进BMMSC诱导的活化的SP细胞活力的下降，并增大活化的SP细胞的早期和晚期的细胞凋亡（图14A～14C）。这些数据表明了诱导常规BMMSC中的端粒酶活性以改进其免疫调节功能的潜能，正如在tBMMSC中所看到的。

为确认阿司匹林(TAT)处理的BMMSC（TAT-BMMSC）的治疗效果，我们将0.1×10⁶或0.01×10⁶TAT-BMMSC输注给10周龄的MRL/lpr小鼠，然后在小鼠12周龄时分析处理反应。我们发现，与MRL/lpr小鼠相比，阿司匹林处理的TAT-BMMSC和BMMSC均能够降低尿蛋白水平（图8A）。与BMMSC相比，TAT-BMMSC在0.1×10⁶组和0.01×10⁶组中均更为有效地降低总尿蛋白水平。看起来输注0.01×10⁶TAT-BMMSC不能显著降低尿蛋白水平（图8A）。尽管TAT-BMMSC和BMMSC输注显示出外周血中的dsDNA IgG、IgM抗体和ANA水平的明显降低（图8B～D），不过与BMMSC组相比，TAT-BMMSC在0.1×10⁶组和0.01×10⁶组中均显示出降低dsDNA IgG和IgM抗体以及ANA水平的优异治疗效果（图8B-D）。另外，ELISA和流式细胞分析揭示，与BMMSC相比，TAT-BMMSC显示更为有效地降低了0.01×10⁶组中血清IL17水平（图8E)和0.1×10⁶组及0.01×10⁶组中的CD4⁺IL17⁺IFNγ^-T淋巴细胞的数目（图8F），并升高了0.01×10⁶组中的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg的水平（图8G）。这些数据表明，免疫疗法中的BMMSC的数目能够经体外端粒酶活化剂处理而显著减少。

实施例7

人骨髓包含tBMMSC，阿司匹林处理能够诱导常规的人BMMSC变为具有改进的免疫调节功能的tBMMSC。当阿司匹林以2.5μg/ml或50μg/ml添加到培养基中1周时，BMMSC中的端粒酶活性的水平显著增大。

在本文中已经公开了各种不同的方面和实施方式的情况下，其他的方面和实施方式对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。本文中所公开的各种不同的方面和实施方式的目的在于描述而非意图限制，真实范围和实质将由以下权利要求所指明。本领域的技术人员将意识到，或者能够使用仅仅常规的试验就确定本文中所描述的方法和组合物的特定的实施方式的许多等同物。这些等同物应由以下权利要求所涵盖。

本文中所列举的所有参考文献（包括但不限于专利、专利申请和非专利文献）在此以引用的方式而将其全文并入本文中。

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Claims (12)

1.具有高端粒酶活性的分离的人骨髓间充质干细胞(tBMMSC)。

2.如权利要求1所述的分离的人骨髓间充质干细胞，其中，所述细胞是SSEA4⁺。

3.分离的人CD34⁺骨髓间充质干细胞。

4.如权利要求3所述的分离的人CD34⁺骨髓间充质干细胞，其中，所述干细胞是CD73⁺。

5.如权利要求3所述的分离的人CD34⁺骨髓间充质干细胞，其中，所述干细胞是CD105⁺。

6.如权利要求3所述的分离的人CD34⁺骨髓间充质干细胞，其中，所述干细胞不能在塑料培养物中形成CFU-F，但粘附于间充质干细胞产生的细胞外基质。

7.如权利要求3所述的分离的人CD34⁺骨髓间充质干细胞，其中，所述干细胞能够分化成为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。

8.分离的经阿司匹林处理的骨髓间充质干细胞。

9.一种用于增大CD34^-人骨髓间充质干细胞中的端粒酶活性的方法，所述方法包括：使人骨髓间充质干细胞与有效量的端粒酶诱导剂接触。

10.如权利要求7所述的方法，其中，所述端粒酶诱导剂是阿司匹林。

11.一种用于分离高端粒酶骨髓间充质干细胞的方法，所述方法包括：

在塑料底物上培养源自骨髓的所有有核细胞的样品；

移除未粘附于所述底物的细胞；

在BMMSC-ECM涂覆的培养基上培养所述培养基中的任何细胞；

收集所述BMMSC-ECM培养基上的形成集落的附着细胞。

12.一种用于治疗全身性红斑狼疮的方法，所述方法包括对患者施用治疗有效量的分离的高端粒酶人骨髓间充质干细胞。

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