CN114504653A - 干细胞条件培养基在制备抗癌组成物中的应用、抗癌组成物及应用 - Google Patents

干细胞条件培养基在制备抗癌组成物中的应用、抗癌组成物及应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及干细胞条件培养基在制备抗癌组成物中的应用、抗癌组成物及应用。干细胞条件培养基可与细胞激素联用制成抗癌组成物，用以抑制癌细胞的生长，其中干细胞条件培养基为瓦顿式凝胶间叶干细胞条件培养基，细胞激素为自由骨塑型蛋白‑4、Dickkopf相关蛋白、干扰素β以及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体中的一种或多种。本申请通过干细胞条件培养基的转用及与细胞激素的联用，实现了对癌细胞生长的抑制，且本发明使用的细胞激素，并不会影响正常细胞的生长，具有极高的安全性。

Description

干细胞条件培养基在制备抗癌组成物中的应用、抗癌组成物 及应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及干细胞条件培养基在制备抗癌组成物中的应用、抗癌组成物及应用。
背景技术
癌症是一种细胞不正常增生、进而影响生物体正常生理机能的一种疾病，以往治疗癌症的方法，主要包括以手术切除癌细胞组织、或以放射线治疗、药物治疗等方式，抑制癌细胞的生长以及诱发癌细胞死亡。
上述方法虽均能起到抗癌效果，但普遍具有较强的副作用，清除或抑制癌细胞的同时还会同时影响到人体正常细胞的生长、甚至导致正常细胞的死亡，继而影响到患者的正常生理机能，使得癌症患者更为虚弱。
当前虽然也有针对癌症细胞研发专一性更高的标靶药物，但是并非每种癌症都有对应的标靶药物，且现有的标靶药物由于制备困难、产量较低等原因，普遍价格高昂，会给患者造成很大的经济负担；因此，迫切需要研发一种能应用于多种癌症、且对癌细胞专一性高的抗癌组成物。
发明内容
为制得能应用于多种癌症、且对癌细胞专一性高的抗癌组成物，本申请提供一种干细胞条件培养基在制备抗癌组成物中的应用、抗癌组成物及应用。
第一方面，本申请提供一种干细胞条件培养基在制备抗癌组成物中的应用，采用如下的技术方案：
干细胞条件培养基在制备抗癌组成物中的应用，所述干细胞条件培养基可与细胞激素联用制成抗癌组成物，用以抑制癌细胞的生长。
优选的，所述的干细胞条件培养基为瓦顿式凝胶间叶干细胞条件培养基，并采用如下制备方法制得：
将瓦顿式凝胶间叶干细胞预培养于α-MEM完全培养基中，再收取培养基并进行离心、过滤、无菌处理，所得滤液即为瓦顿式凝胶间叶干细胞条件培养基。
优选的，所述的瓦顿式凝胶间叶干细胞以1X104-5X104个/ml的细胞浓度培养于α-MEM完全培养基中。
第二方面，本申请提供一种抗癌组成物，采用如下的技术方案：
一种抗癌组成物，包括上述干细胞条件培养基和细胞激素，所述细胞激素为自由骨塑型蛋白-4、Dickkopf相关蛋白、干扰素β以及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体中的一种或多种。
优选的，所述细胞激素中骨塑型蛋白-4的使用浓度为10-1000ng/mL；Dickkopf相关蛋白的使用浓度为10-1000ng/mL；干扰素β的使用浓度为1-100pg/mL；以及该肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的使用浓度为1-100ng/mL。
优选的，所述细胞激素系由骨塑型蛋白-4、Dickkopf相关蛋白、干扰素β以及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体所组成。
优选的，所述骨塑型蛋白-4的使用浓度为10-1000ng/mL；所述Dickkopf相关蛋白的使用浓度为10-1000ng/mL；所述干扰素β的使用浓度为1-100pg/mL；以及该肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的使用浓度为1-100ng/mL。
优选的，所述骨塑型蛋白-4的使用浓度为50ng/mL；所述Dickkopf相关蛋白的使用浓度为10ng/mL；所述干扰素β的使用浓度为10pg/mL；以及该肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的使用浓度为1ng/mL。
第三方面，本申请提供一种抗癌组成物的应用，采用如下的技术方案：
一种抗癌组成物的应用，所述的抗癌组成物可应用于制备抗癌药物及产品，或直接用于抑制癌细胞的生长，尤其适用于抑制人类恶性黑色素瘤细胞或是乳癌细胞的生长。
综上所述，本申请通过干细胞条件培养基与细胞激素的联用，可有效的抑制癌细胞的生长，且本发明使用的细胞激素，并不会影响正常细胞的生长，具有极高的安全性。
附图说明
图1为不同细胞激素影响A375细胞生长分析图；
图2为不同细胞激素影响MCF-7细胞生长分析图；
图3为细胞激素搭配干细胞条件培养基影响A375细胞生长分析图；
图4为细胞激素搭配干细胞条件培养基影响MCF-7细胞生长分析图；
图5为细胞激素搭配干细胞条件培养基影响A375细胞生长显微镜观察照片；
图6为细胞激素搭配干细胞条件培养基影响MCF-7细胞生长显微镜观察照片；
图7为不同细胞激素影响WJMSC生长分析图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图1-7对本申请作进一步详细说明：
实施例
实施例1
一种干细胞条件培养基，具体为瓦顿式凝胶间叶干细胞条件培养基，通过如下步骤制备获得：
先将细胞数为2X105个的瓦顿式凝胶间叶干细胞培养于75cm2的flask(细胞培养瓶)内，再加入10mL之α-MEM完全培养基，使得瓦顿式凝胶间叶干细胞的细胞浓度为2X104个/ml；
其中瓦顿氏凝胶间叶干细胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell，后简称WJMSC)是从中国台湾财团法人食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(后简称BCRC)获得，其BCRC编号为RM60596。
然后于37℃、5％二氧化碳(CO2)浓度的培养条件下预培养3-5天，本申请仅以4天为例(其中培养天数过少时，干细胞分泌的抑癌激素不足，天数太多细胞生長太密，影响细胞正常生长)，待收取培养基后，先以4℃、2000r/min的转速离心10min后,再以0.22μm的网筛过滤去除离心后上清液中的杂质，所得滤液即为WJMSC条件培养基(conditionedmedium，后简称为WJMSC-CM)；
将WJMSC-CM分装并保存于4℃，并在2日内使用完毕，否则弃之。
细胞激素使用浓度性能检测试验
对各应用例所得抗癌组成物和对比例中的组成物进行性能测试，分别测得其处理前后的细胞数，本测试分别使用人类黑色素瘤A375细胞株以及人类乳腺癌MCF-7细胞株进行试验，其中A375细胞株以及MCF-7细胞株都是购自于BCRC，A375细胞株的编号为60039，MCF-7细胞株的编号为60436；
具体培养方法和检测步骤如下：将A375细胞以1X104细胞/培养孔的数目，以及将MCF-7 细胞以2X104细胞/培养孔的数目，分别培养于6孔细胞培养盘，使用的细胞培养基为DMEM完全培养基(含有10％FBS之高葡萄糖DMEM培养基)；培养隔日后，删除细胞培养基，并以PBS缓冲液清洗细胞2次，再加入2mL新鲜DMEM完全培养基、2mL各应用例中所得的抗癌组成物或对比例中的组成物处理8日后，计算A375细胞的细胞数，处理第10 日后，计算MCF-7细胞的细胞数。
应用例
应用例1
一种抗癌组成物，包括由实施例1制得的干细胞条件培养基和细胞激素，细胞激素为自由骨塑型蛋白-4(Bone Morphogenetic Protein-4，后简称BMP-4)，BMP-4的使用浓度为10ng/mL，并采用上述培养方法进行培育。
应用例2
一种抗癌组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为自由骨塑型蛋白-4(Bone Morphogenetic Protein-4，后简称BMP-4)，BMP-4的使用浓度为50ng/mL。
应用例3
一种抗癌组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为自由骨塑型蛋白-4(Bone Morphogenetic Protein-4，后简称BMP-4)，BMP-4的使用浓度为100ng/mL。
应用例4
一种抗癌组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为Dickkopf相关蛋白(Dickkopf-relatedprotein，后简称Dkk)，Dkk的使用浓度为10ng/mL。
应用例5
一种抗癌组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为Dickkopf相关蛋白(Dickkopf-relatedprotein，后简称Dkk)，Dkk的使用浓度为50ng/mL。
应用例6
一种抗癌组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为Dickkopf相关蛋白(Dickkopf-relatedprotein，后简称Dkk)，Dkk的使用浓度为100ng/mL。
应用例7
一种抗癌组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为干扰素β(Interferon-β，后简称IFN-β)，IFN-β的使用浓度为1pg/mL。
应用例8
一种抗癌组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为干扰素β(Interferon-β，后简称IFN-β)，IFN-β的使用浓度为10pg/mL。
应用例9
一种抗癌组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为干扰素β(Interferon-β，后简称IFN-β)，IFN-β的使用浓度为50pg/mL。
应用例10
一种抗癌组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，后简称TRAIL)，TRAIL的使用浓度为1ng/mL。
应用例11
一种抗癌组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，后简称TRAIL)，TRAIL的使用浓度为5ng/mL。
应用例12
一种抗癌组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，后简称TRAIL)，TRAIL的使用浓度为10ng/mL。
对比例1
一种组成物，与应用例1的不同之处在于，不包含细胞激素和WJMSC条件培养基，仅使用 DMEM完全培养基进行培养，即DMEM组。
对比例2
一种组成物，与应用例1的不同之处在于，没有联用细胞激素，仅使用WJMSC条件培养基进行培养，即WJMSC-CM组。
对比例3
一种组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为介白素-18(Interleukin-18，后简称IL-18)，TRAIL的使用浓度为1ng/mL。
对比例4
一种组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为介白素-18(Interleukin-18，后简称IL-18)，TRAIL的使用浓度为10ng/mL。
对比例5
一种组成物，与应用例1的不同之处在于，所用细胞激素为介白素-18(Interleukin-18，后简称IL-18)，TRAIL的使用浓度为50ng/mL。
抽取应用例1-12中制得的抗癌组成物和对比例1-5中制得的组成物，按上述检测步骤和处理时间计算处理后A375细胞的细胞数和MCF-7细胞的细胞数及其标准偏差STD，测试结果记入下表和图1-2。
Figure BDA0003500238100000051
Figure BDA0003500238100000061
从上表和附图可以看出，应用1-12所得的抗癌组成物，均具有较优的抗癌效果，其A375细胞数为2.1-64.73333X104，相比未经任何处理的对比例1，其细胞数降低了66-99％，且STD仅为0.11547-6.149255，数据较为精准，有效减少了因试验误差所带来的影响；
其MCF-7细胞数为6.233333-14.93333X104，相比未经任何处理的对比例1，其细胞数降低了83-93％，且STD仅为0.152753-1.855622，综上，上述组分的细胞激素，均能有效的与 WJMSC-CM联用，以抑制癌细胞的生长。
从上表和附图还可以看出，应用例1-3以BMP-4为细胞激素，均具有优良的抑制癌细胞生长的效果，A375细胞数为35.6-52.36667X104；MCF-7细胞数为9.633333-14.93333X104；
且应用例2-3的抗癌效果更优，可见BMP-4的用量优选为50ng/mL和100ng/mL，二组别的细胞数差异不大，因此综合考虑，后续以50ng/mL的浓度处理细胞。
从上表和附图还可以看出，应用例4-6以Dkk为细胞激素，均具有优良的抑制癌细胞生长的效果，A375细胞数为2.166667-2.233333X104；MCF-7细胞数为7.933333- 8.1X104；
且三组细胞数无明显差异，可见Dkk的用量优选为10ng/mL、50ng/mL和100ng/mL，因此综合考虑，后续以10ng/mL的浓度处理细胞。
从上表和附图中还可以看出，应用例7-9以IFN-β为细胞激素，均具有优良的抑制癌细胞生长的效果，A375细胞数为54.6-64.73333X104；MCF-7细胞数为12.33333-12.86667X104；
且应用例8-9的抗癌效果更优，可见IFN-β的用量优选为10pg/mL和50pg/mL，二组别的细胞数差异不大，因此综合考虑，后续以10pg/mL的浓度处理细胞。
从上表和附图还可以看出，应用例10-12以TRAIL为细胞激素，均具有优良的抗癌效果，A375细胞数为2.1-2.166667X104；MCF-7细胞数为6.233333-6.366667X104；
且三组细胞数无明显差异，可见TRAIL的用量优选为1ng/mL、5ng/mL和10ng/mL，因此综合考虑，后续以1ng/mL的浓度处理细胞。
从上表和附图还可以看出，由于对比例2没有采用任何细胞激素，仅单独使用WJMSC条件培养基进行培养，其抗癌效果有限，A375细胞数为72.16667X104，相比对比例1下降了62％；MCF-7细胞数为15.1X104，相比对比例1下降了17％；
对比例3-5则是使用了IL-18作为细胞激素，但与对比例2即空白细胞激素对照组的差异性不大，A375细胞数为65.06667-65.93333X104；MCF-7细胞数为14.23333-14.3X104；可见仅有特定的细胞激素才能起到优良的抗癌效果。
WJMSC条件培养基与细胞激素联用性能检测试验
对各应用例所得抗癌组成物和对比例中的组成物进行性能测试，分别测得其处理前后的细胞数，本测试分别使用人类黑色素瘤A375细胞株以及人类乳腺癌MCF-7细胞株进行试验，其中A375细胞株以及MCF-7细胞株都是购自于BCRC，A375细胞株的编号为60039，MCF-7细胞株的编号为60436；
具体培养方法和检测步骤如下：将WJMSC、A375细胞以及MCF-7细胞，分别以1X104细胞/培养孔、1X104细胞/培养孔，以及1X105细胞/培养孔的数目，分别培养于6孔细胞培养盘，WJMSC使用的培养基为α-MEM完全培养基，而A375细胞以及MCF-7细胞使用的培养基为DMEM完全培养基；将细胞培养于37℃、提供5％二氧化碳(CO2)的培养箱内；隔夜培养后，删除细胞培养基，并且加入含有不同细胞激素的新鲜培养基，再继续培养5天之后，计算细胞数，以评估细胞的生长情形。
应用例13
一种抗癌组成物，所用的细胞激素为50ng/mL的BMP-4，所用的培养基为DMEM完全培养基，并采用上述的培养方法进行培育和检测。
应用例14
一种抗癌组成物，与应用例13的不同之处在于，所用的细胞激素为10ng/mL的Dkk。
应用例15
一种抗癌组成物，与应用例13的不同之处在于，所用的细胞激素为10pg/mL的INF-β。
应用例16
一种抗癌组成物，与应用例13的不同之处在于，所用的细胞激素为1ng/mL的TRAIL。
应用例17
一种抗癌组成物，与应用例13的不同之处在于，所用的细胞激素为BMP-4、Dkk、INF-β以及TRAIL的组合，其中BMP-4使用浓度为50ng/mL，Dkk使用浓度为10ng/mL，INF-β使用浓度为10pg/mL，以及TRAIL的使用浓度为1ng/mL。
应用例18
一种抗癌组成物，与应用例13的不同之处在于，所用的细胞激素为BMP-4、Dkk、INF-β以及TRAIL的组合，其中BMP-4使用浓度为50ng/mL，Dkk使用浓度为10ng/mL，INF-β使用浓度为10pg/mL，以及TRAIL的使用浓度为1ng/mL，其中所用的培养基为WJMSC 条件培养基。
对比例6
一种组成物，与应用例13的不同之处在于，不包含细胞激素和WJMSC条件培养基，WJMSC使用的培养基为DMEM完全培养基，即DMEM组。
对比例7
一种组成物，与应用例13的不同之处在于，不包含细胞激素和WJMSC条件培养基，WJMSC使用的培养基为α-MEM完全培养基，即α-MEM组。
对比例8
一种组成物，与应用例13的不同之处在于，不包含细胞激素，WJMSC使用的培养基为 WJMSC条件培养基，即WJMSC-CM组。
抽取应用例13-17中制得的抗癌组成物和对比例6-8中制得的组成物，按上述检测步骤和处理时间计算处理后A375细胞的细胞数和MCF-7细胞的细胞数及其标准偏差STD，测试结果记入下表和图3-4。
Figure BDA0003500238100000091
从上表和附图可以看出，应用例13-18所得的抗癌组成物，均具有较优的抗癌效果，其A375细胞数为9.933333-93.96667X104，MCF-7细胞数为2.023333-5.916667X105，相比对比例6-7，均有不同程度的下降，其中WJMSC-CM为优选培养基；
从上表和附图还可以看出应用例17-18为优选例，相比单一的任一细胞激素，采用四种激素共同作用于癌细胞，其能更有效的抑制A375细胞株和MCF-7细胞株的生长，具有显著的抗癌效果，其A375细胞数为9.933333-21.9X104，MCF-7细胞数为2.023333-3.07X105，且通过与WJMSC-CM联用，可以进一步抑制癌细胞的生长，参见应用例18。
综上，上述组分的细胞激素间具有复配效果，当WJMSC条件培养基与四种细胞激素同时作用时，能更有效的抑制A375细胞株的生长，且从图5(A375细胞株各组别的显微镜照片)和图6(MCF-7细胞株各组别的显微镜照片)可以看到，可以观察到激素混合物/WJMSC_CM组的细胞数，明显少于其它组别。
此外上述所得的抗癌组成物，其四种细胞激素，不论是单独处理，或是共同处理WJMSC，都不会对其的生长产生影响，具体参见图7，其中α-MEM组为未添加细胞激素的组别，使用的细胞激素分别为BMP-4、Dkk、INF-β以及TRAIL，激素混合物组则是将上述四种细胞激素混合后、共同处理细胞；此试验中BMP-4使用浓度为50ng/mL，Dkk使用浓度为10ng/mL，INF-β使用浓度为10pg/mL，以及TRAIL的使用浓度为1ng/mL。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.干细胞条件培养基在制备抗癌组成物中的应用，其特征在于，所述干细胞条件培养基可与细胞激素联用制成抗癌组成物，用以抑制癌细胞的生长。
2.根据权利要求1所述的干细胞条件培养基在制备抗癌组成物中的应用，其特征在于，所述的干细胞条件培养基为瓦顿式凝胶间叶干细胞条件培养基，并采用如下制备方法制得：
将瓦顿式凝胶间叶干细胞预培养于α-MEM完全培养基中，再收取培养基并进行离心、过滤、无菌处理，所得滤液即为瓦顿式凝胶间叶干细胞条件培养基。
3.根据权利要求1所述的干细胞条件培养基在制备抗癌组成物中的应用，其特征在于，所述的瓦顿式凝胶间叶干细胞以1X104-5X104个/ml的细胞浓度培养于α-MEM完全培养基中。
4.一种抗癌组成物，其特征在于，包括权利要求1-3任一干细胞条件培养基和细胞激素，所述细胞激素为自由骨塑型蛋白-4、Dickkopf相关蛋白、干扰素β以及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的一种抗癌组成物，其特征在于，所述细胞激素中骨塑型蛋白-4的使用浓度为10-1000 ng/mL；Dickkopf相关蛋白的使用浓度为10-1000 ng/mL；干扰素β的使用浓度为1-100 pg/mL；以及该肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的使用浓度为1-100 ng/mL。
6.根据权利要求4所述的一种抗癌组成物，其特征在于，所述细胞激素系由骨塑型蛋白-4、Dickkopf相关蛋白、干扰素β以及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体所组成。
7.根据权利要求6所述的一种抗癌组成物，其特征在于，所述骨塑型蛋白-4的使用浓度为10-1000 ng/mL；所述Dickkopf相关蛋白的使用浓度为10-1000 ng/mL；所述干扰素β的使用浓度为1-100 pg/mL；以及该肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的使用浓度为1-100 ng/mL。
8.根据权利要求7所述的一种抗癌组成物，其特征在于，所述骨塑型蛋白-4的使用浓度为50 ng/mL；所述Dickkopf相关蛋白的使用浓度为10 ng/mL；所述干扰素β的使用浓度为10pg/mL；以及该肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的使用浓度为1 ng/mL。
9.一种权利要求4-8任一所述抗癌组成物的应用，其特征在于，所述的抗癌组成物可应用于制备抗癌药物及产品，或直接用于抑制癌细胞的生长，尤其适用于抑制人类恶性黑色素瘤细胞或是乳癌细胞的生长。
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