KR20150074672A

KR20150074672A - 세포 배양 및 세포 분화를 위한 탈세포화 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20150074672A
Application number: KR1020130162685A
Authority: KR
Inventors: 조승우; 이정승
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2013-12-24
Publication date: 2015-07-02
Also published as: KR101637548B1

Abstract

본 발명은 간세포의 배양 및 간 세포의 분화를 위한 탈세포화 간 매트릭스 분쇄물 및 이를 포함하는 조성물에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 분쇄물을 이용하여 간 세포를 배양하거나, 간 세포를 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 탈세포화 조직 매트릭스 동결건조 분쇄물 및 이를 함유하는 조성물은, 장기간 보존이 가능하고 다양한 형태로 세포 배양, 세포 분화, 또는 세포 배양 및 세포 분화에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 분쇄물 및 조성물은 동물 세포 배양 및 분화, 또는 장기 이식 등에 매우 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 약물의 in vivo 연구에 이용될 수 있는 장점이 있다.

Description

세포 배양 및 세포 분화를 위한 탈세포화 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물 및 이의 제조 방법{Decellularized organ matrix grinding powder and the method for preparing thereof}

본 발명은 세포 배양 및 세포 분화를 위한 탈세포화 장기(organ) 또는 조직(tissue) 매트릭스 동결건조 분쇄물 및 이를 포함하는 조성물에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 분쇄물 및 조성물을 이용하여 세포를 배양하거나, 세포를 분화시키는 방법에 관한 것이다.

노화 또는 화학 요법 등으로 치료가 어려운 환자에 대한 의료수단으로서 장기 이식에 대한 관심이 커지고 있다. 특히, 심장, 간, 또는 신장 등이 기능을 상실하게 되면, 이를 대체할 수 있는 장기가 없기 때문에 장기 이식을 하지 않으면 생명을 유지하는 것이 불가능하다. 동종에서 유래된 간의 이식은 만성 간경변 및 암에 의해 발생하는 말기 간 질환을 치료하고, 심각하게 손상된 간의 기능을 회복시키기 위해 사용되고 있다. 하지만, 간 이식은 간 공여체가 부족하여 제한적으로 실시되고 있다. 간 조직 계통의 세포의 이식은 간 이식을 대체하는 방법으로 시험하고 있으나, 치료용으로 사용할 수 있는 온전한 기능을 갖춘 충분한 수의 간세포를 얻는데 어려움이 있어서 실용화에는 제한을 받고 있다. 또한, 1차 분리된 간세포는 이식을 위한 배양 과정에서 간 특이적 기능 및 생존능을 쉽게 상실한다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 간세포와 상호간 소통할 수 있는 간 조직 내의 콜라겐, 세포외 기질을 간세포의 배양 및 이식을 위한 배양용 표면의 코팅 및 하이드로젤의 제조에 사용하였다(특허문헌 1). 콜라겐은 생체세포를 포함하는 인공조직을 배양하기 위한 기질로 오랫동안 사용하여 왔으나, 현재 상용화된 콜라겐 기반의 방법은 1차 분리된 간세포의 생존능 및 간 특이적 기능의 보존을 크게 향상시켜야 하는 단점이 있다(비특허문헌 1).

한편, 조직 및 기관(또는 장기)의 탈세포화는 세포 배양 및 이식을 위한 기능성 지지체 또는 스캐폴드(scaffold)를 제조하기 위한 유망한 방안으로써 연구되고 있다(특허문헌 1). 탈세포화 과정에서, 조직으로부터 세포 성분들이 제거되지만, 세포외 기질 및 일부 성장인자 단백질들은 보존된다. 따라서, 탈세포화 조직 내 보존된 콜라겐, 파이브로넥틴(fibronectin) 및 라미닌(laminin)을 포함하는 다양한 세포 외 기질 성분들은 온전한 조직 내와 유사한 삼차원적인 미세환경을 제공함으로써 배양된 세포의 생존, 증식 및 분화를 크게 향상시킨다. 추가적으로, 세포 성분들의 제거는 탈세포화 매트릭스를 세포 이식에 대한 최소한의 면역원성을 가진 기능성 지지체로 변화시킨다. 최근에는, 심장, 혈관, 심장판막, 폐, 뇌 및 신장에서 유래된 여러 가지 형태의 탈세포화 기관을 응용한 기능성 조직공학 지지체에 대한 연구가 진행되고 있다.

장기 또는 조직의 탈세포화는 탈세포화 용액을 사용하여 관류함에 의해 수행되며, 이 과정에서 세포 성분이 완전히 제거되고, 조직 특이적 세포외 기질의 특성과 네트워크는 잘 보존된다. 조직공학 및 장기 이식에 사용할 수 있는 기능성 지지체는 이러한 탈세포화 과정을 통해 제조될 수 있다. 이와 같이, 현재까지 탈세포화된 장기 또는 조직 매트릭스에 대한 연구는, 3차원적 미세환경을 지니는 세포 배양 지지체로서의 기능에 집중되어 왔다. 그러나, 탈세포화된 조직 매트릭스는 이것이 갖는 지지체로서의 장점에도 불구하고, 장기 보존성, 및 세포 배양 및 분화에 대한 구조적 제한 등의 문제점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 장기 보존성이 우수하고, 세포 배양 및 분화에 이용할 수 있는 소재를 개발하고자 노력한 결과, 탈세포화된 장기 또는 조직 매트릭스의 동결건조 분쇄물이 세포 배양 및 세포 분화에 있어서, 놀라운 유용성을 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 또한, 본 발명에 따른 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 함유하는 조성물로 코팅된 플레이트 표면에서의 간 세포 배양 실험결과는 놀라운 간 세포 생존능 및 세포 기능을 제시하였다.

대한민국 공개특허 10-2012-0023626호.

Biomaterials 2003, 24 (19), 3213-3220.

이와 같이, 본 발명의 목적은 탈세포화 장기 또는 기관(organ) 매트릭스 동결건조 분쇄물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 함유하는 조성물로 코팅된 표면을 갖는 세포배양 용기를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 함유하는 조성물로부터 제조된 세포배양 지지체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 탈세포화 장기 또는 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물 또는 이를 함유하는 조성물을 이용하여 세포를 배양하거나 세포를 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 탈세포화 장기 또는 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물 또는 이를 함유하는 조성물을 이용하여 배양된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 탈세포화 장기 또는 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물 또는 이를 함유하는 조성물을 이용하여 분화된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 탈세포화 장기 또는 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물 또는 이를 함유하는 조성물을 이용하여 제조된 장기 또는 기관의 조직을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 일 구체예에서 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 탈세포화 동결건조 분쇄물은, 먼저 체외 분리된 동물의 간 조직, 예를 들어 마우스 또는 랫트의 간 조직을 간 문맥을 통해 증류수로 1회 내지 수회 관류하고, 상기 관류한 간 조직을 탈세포화 용액으로 추가 관류시켜 탈세포화된 간 매트릭스(Decellularized Liver Matrix; DLM)를 수득하며, 상기 수득한 간 매트릭스를 증류수로 1회 내지 수회 추가로 관류하여 세척하고; 상기 세척한 탈세포화 간 매트릭스를 분리하고 동결건조한 후 분쇄하는 것에 의해 제조된다. 상기 탈세포화 용액을 이용한 간의 관류는 1회 수행 시 1 내지 10시간, 바람직하게는 3 내지 5시간, 보다 더 바람직하게는 3.5 내지 4.5 시간 동안 실시할 수 있다. 본 발명에서, 비이온계 계면활성제 및 pH 조절을 위한 pH 첨가제를 포함하는 탈세포화 용액을 사용할 수 있다. 예를 들어, 탈세포화 용액은, 탈세포화 용액 100 중량부에 대하여 0.5 내지 5 중량부의 비이온계 계면활성제, 예를 들어, 트리톤(Triton) X-100, 및 0.005 내지 0.5 중량부의 pH 첨가제, 예를 들어, 수산화암모늄(NH₄0H)을 포함할 수 있다.

본 발명은 다른 일 구체예에서, 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 함유하는 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화를 위한 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 포함하는 조성물은, 종래 기술에서 널리 알려진 방법으로 동결건조 분쇄물을 용해시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 용해는 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물에 대하여 펩신을 포함하는 0.1M 염산을 5 내지 20 중량%로 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 상기 용해는 펩신을 포함하는 0.1M 염산을 탈세포화 간 매트릭스에 대하여 10 중량%를 사용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 다른 일 구체예는, 본 발명의 조성물로 표면 코팅된 세포 배양, 세포 분화, 또는 세포 배양 및 세포 분화용 기질이 제공된다. 이 때, 상기 코팅되는 조성물의 농도는 세포의 종류와 특성 등에 따라 다양하며, 0.2mg/ml 내지 4mg/ml일 수 있다. 바람직하게는, 상기 농도는 1mg/ml 내지 2mg/ml이다.

본 발명의 다른 일 구체예는, 본 발명의 조성물이 코팅된 세포 배양용 기질에서 인간중간엽줄기세포를 간세포로 분화시키는 방법 및 간세포를 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 구체예는, 본 발명의 조성물을 포함하는 세포 배양, 세포 분화, 또는 세포 배양 및 분화용 3차원 구조의 지지체로서 하이드로젤이 제공된다. 본 발명의 조성물을 포함하는 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 3차원 지지체는 하이드로젤 뿐만 아니라, 미세 공극을 지닌 다공체 등 다양한 지지체가 포함될 수 있음은 물론이다. 본 발명의 조성물을 포함하는 하이드로젤을 제조하는 경우, 예를 들어, 본 발명의 조성물은 5mg/ml 내지 40mg/ml 농도, 바람직하게는 10mg/ml 내지 20mg/ml 농도로 적용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "매트릭스"는 탈세포화된 장기 또는 기관의 조직을 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명에서, "장기" 또는 "기관"은 동일한 의미로서 혼용하여 사용된다.

본 발명의 탈세포화 장기 또는 조직 매트릭스 동결건조 분쇄물 및 이를 함유하는 조성물은, 장기간 보존이 가능하고 다양한 형태로 세포 배양, 세포 분화, 또는 세포 배양 및 세포 분화에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 분쇄물 및 조성물은 동물 세포 배양 및 분화, 또는 장기 이식 등에 매우 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 약물의 in vivo 연구에 이용될 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 분쇄물 및 조성물은 장기 이식을 대체하는 세포 이식에 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물 및 이를 이용한 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 제품을 제조하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 간 매트릭스의 특성을 분석한 결과를 보여주는 것이다.
도 3은 본 발명의 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 함유하는 조성물로 코팅된 기질 표면의 특성을 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 함유하는 조성물로부터 제조된 하이드로젤의 전자현미경 사진이다.
도 5는 본 발명의 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 함유하는 조성물로부터 제조된 하이드로젤의 기계적 특성을 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 함유하는 조성물로 코팅된 표면에서 간세포를 배양한 후, 간세포의 생존 및 특성을 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 함유하는 조성물로부터 제조된 하이드로젤 내에서 간세포를 배양한 후, 간세포의 생존 및 특성을 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명의 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 함유하는 조성물로 코팅된 표면에서, 인간 중간엽줄기세포가 간세포로 분화하는 과정 및 그 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 함유하는 조성물로부터 제조된 하이드로젤을 이용하여 간세포를 피하 조직에 이식한 결과이다.

이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통해 보다 더 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

탈세포화 간 매트릭스( Decellularized Liver Matrix , DLM ).

1.1 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물 및 이를 함유하는 조성물의 제조.

도 1에 기재된 방법에 따라 탈세포화 간 매트릭스를 제조하였다. 8주령 수컷 쥐(Sprague Dawley rats, 나라 바이오텍)를 자일라진(xylazine, Bayer Korea) 10mg/kg 및 케타민(Ketamine, Yuhan) 100mg/kg을 사용하여 마취시켰다. 마취시킨 쥐의 간 문맥에 21-게이지 카테터를 삽입하여, 캐뉼라 삽입된 카테터를 통해 30분간 차가운 증류수를 사용하여 관류(perfusion)를 실시하였다. 이후에, 탈세포화 용액(1% (v/v) Triton-X 100[Wako Pure chemical industries, Osaka, Japan] 및 0.1%(v/v) 수산화암모늄[Sigma]을 증류수와 혼합함)을 사용하여 4시간 동안 관류하여 간 내의 세포 성분을 제거하였다. 그 후에, 간을 증류수로 관류시켜서 간 매트릭스 내의 탈세포화 용액을 세척하였다. 수득한 탈세포화 간 매트릭스를 감압 동결건조하여 사용시까지 4˚C에서 보관하였다. 사용시에는 동결건조된 탈세포화 간 매트릭스를 입자 형태로 분쇄하고, 탈세포화 간 매트릭스 분쇄물 100 중량부에 대하여 펩신을 포함하는 0.1M 염산 10 중량부를 사용하여 상온에서 48시간 동안 휘저어서 용해시켰다. 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물의 용해물의 최종 농도는 40mg/ml로 맞추고, 필요에 따라 0.1M 염산 용액으로 희석하였다.

1.2 탈세포화 간 매트릭스의 특성 확인.

세포 성분이 완전하게 제거되어 투명한 상태가 되었음을 확인하였다(도 2a). 또한, 간 조직의 탈세포화를 DNA 함량의 정량 및 조직학적 분석을 통해 검증하였다. 탈세포화 간 매트릭스의 DNA 함량 및 온전한 간 조직의 DNA 함량을 측정하기 위해, DNA 추출 키트(바이오니아㈜, 대한민국)를 사용하여 각각의 시료로부터 DNA를 분리하고, 260nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 온전한 간 조직의 DNA 함량을 100%라 할 때, 탈세포화 간 매트릭스의 DNA 함량은 2.8%였다(도 2b). 조직학적 분석을 시행하기 위해, 온전한 간 및 탈세포화 간 매트릭스를 OCT 냉동-화합물(Leica Microsystems, Benshieim, Germany) 내에 매입시키고, 표본을 6 μm 단면으로 얇게 잘랐다. 단면화된 시료를 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 세포 성분의 제거를 점검하였다. 탈세포화 간 매트릭스에서 세포외 기질(Extracellular Matrix: ECM)의 보존을 검증하기 위해, 조직 단면은 콜라겐 I(1:100 희석, Calbiochem, San Diego, CA, USA), 라미닌(1:100 희석, Abcam, Cambridge, UK), 및 파이브로넥틴(1:100 희석, Abcam)에 결합하는 1차 항체를 사용하여 면역형광 염색을 실시하였다. 염색된 단면은 알렉사(Alexa) 647-결합된 2차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 시각화하였고, 핵을 염색하기 위해 4'-6'-디아미노디노-2-페닐린돌(4'-6'-diamidino-2-phenylindole)(DAPI, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 대조염색을 실시하였다. 탈세포화 간 매트릭스 내에서 핵은 관찰되지 않지만, 간 특이적 효소 및 이의 전구체들을 포함하는 콜라겐 I, 라미닌 및 파이브로넥틴 같은 세포외 기질의 주요 성분들은 탈세포화 후에도 탈세포화 간 매트릭스에 잘 보존되어 있음을 확인하였다(도 2c).

1.3 탈세포화 간 매트릭스 내 단백질 및 펩티드에 대한 질량 분석( mass spectrometry analysis ).

면역염색을 사용하여 탐색하기 어려운 탈세포화 간 매트릭스 내 보존된 단백질과 펩티드는 질량 분석법으로 검증하였다. 탈세포화 간 매트릭스 용액(10 mg/ml)은 원심분리 필터 단위(Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 초원심분리(ultra-centrifuge)하여 조직 내 찌꺼기를 제거하였다. 나노 LC(Tempo nano LC 시스템, MDS SCIEX, Ontario, Canada), 4중극-TOF MS/MS 분광계(QStar Elite, 2.3 keV의 이온 분사 전압에서 나노-전기분사 이온화 소스를 장착한 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 포함하는 통합 시스템을 사용하여 액체-크로마토그래피-연계-질량 분석(LC-MS/MS)을 실시하였다. 탈세포화 간 매트릭스에 대하여 단백질 분해효소인 펩신을 포함하는 O.1M 염산을 10 중량% 사용함으로써 입자 형태로 분쇄한 단백질 단편들을 포함하는 용액은 나노 LC-MS/MS 시스템으로 주입하여, 조르박스(Zorbax) 300 SB-C18 모세관 컬럼(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) 상에서 분리하였다. 주입된 시료는 30분 동안 2-35% 농도 구배의 용매 B를 사용하여 용출하였고, 35-90 농도 구배의 용매 B를 사용하여 10분간 용출하였으며, 이후에 90% 용매 B를 사용하여 5분간 용출하였고, 최종적으로 분당 300nl의 유속에서 15분간 5% 용매 B를 사용하여 용출되었다. 용매 A는 물/아세토나이트릴(98/2 [v/v]) 및 0.1% 포름산으로 구성되어 있고, 용매 B는 물/아세토나이트릴(2/98 [v/v]) 및 0.1% 포름산으로 구성되어 있다. 자료 수집 및 가공은 QS 2.0 분석 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 실시하였다. MS/MS 자료는 프로테인파일롯(ProteinPilot) 소프트웨어(Applied Biosystems 및 MDS SCIEX)를 사용하는 NCBI로부터의 래투스(Rattus) 데이터베이스와 비교하였다.

Q-TOF MS를 사용하여 탈세포화 간 매트릭스 내 단백질 확인.

단백질	Unused Protein Score^a	Number of detected Peptide (≥95%)
Elastin	65.62	66
GF20391-like isoform	28.6	20
Histone H2A type	20.7	66
H2A histone family, member Z	9.33	6
Histone cluster 1, H1c-like	7.26	4
Pro-alpha-2(I) collagen	6.04	13
Urate oxidase	6.00	11
Chain C, H141n mutant of rat liver arginase I	4.79	5
Histone cluster 1, H2ae-like	4.51	15
Collagen, type VI, alpha 1	4.01	4
Procollagen, type VI, alpha 3	3.74	2
H3 Histone	2.83	6
RCG30666, isoform CRA_a	2.00	2
Fibrinogen alpha chain isoform 1 precursor	1.48	1
Isochorismatase domain- containing protein 1	1.47	2

Unused Protein Score는 펩타이드 분포 수치를 모두 합한 결과이다. 상기 표 1에 기재된 모든 단백질은 95% 또는 그 이상의 신뢰도로 검증하였다. 간 특이적 효소들뿐만 아니라 엘라스틴, 콜라겐 VI 형, 피브리노겐 및 이의 전구체들이 탈세포화 간 매트릭스 내에 잘 보존되어 있음을 추가적으로 확인하였다(표 1).

탈세포화 간 매트릭스( DLM ) 기반 2D(이차원) 표면 코팅.

세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 기질 표면을 코팅하기 위해, 탈세포화 간 매트릭스 동결건조 분쇄물을 함유하는 조성물을 실시예 1-1에서와 같이 제조하였다. 수득한 조성물은 0.2 M AcOH(Sigma사)를 사용하여 최종농도 0.2mg/ml 또는 2 mg/ml로 희석하였다. 대조군 코팅 물질로써 0.2 mg/ml 농도의 콜라겐 I (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) 용액을 사용하였다. 상기 용액을 폴리스티렌(PS) 플레이트에 붓고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 코팅된 플레이트는 PBS(Phosphate buffered saline, 이하 PBS, Sigma)를 사용하여 3회 세척하였다. 간의 세포외 기질(ECM)의 주요 단백질인 콜라겐 I의 위치를 시각화하기 위해, 코팅된 플레이트를 콜라겐 I 항체(Calbiochem)을 사용하여 면역형광 염색하였고, 후속하여 알렉사(Alexa) 647-결합된 2차 항체(Invitrogen)로 면역형광 염색을 실시하였다. 콜라겐 I에 대하여 양성으로 염색된 응집 입자가 상기 본 발명의 조성물로 코팅된 기질 상에서도 관찰되었는데, 이러한 결과는 탈세포화 간 매트릭스가 이질적인 간-특이적 ECM 단백질 및 펩타이드를 포함하는 콜라겐-기반 매트릭스임을 제시한다(도 3a).

한편, 수분 접촉 각도는 본 발명의 조성물로 표면 코팅 후 ECM 단백질의 흡착에 의해 유발된 표면 성질의 변화를 보여주는 결과로써, 일정 부피 (15μl)의 물 방울을 코팅된 표면에 올려놓고 피닉스(Phoenix) 300 측각기(Surface Electro Optics Co., Suwon, Korea)를 사용하여 측정하였다(도 3b). X-선 광전자 분광계(XPS, ESCALAB 220i-XL, VG Scientific Instrument, East Grinstead, UK)를 사용하여 코팅된 표면의 원자 화학적 조성물을 분석하였다. 코팅을 실시하지 않은 PS 표면은 C1s 및 O1s에 대한 전형적인 PS 광전자 피크를 나타내고(도 3c), 콜라겐 I 및 탈세포화 간 매트릭스 용액으로 코팅된 PS 표면은 단백질 흡착에 의해 발생하는 N1s 피크가 새로이 관찰되었는데(도 3d), 이는 본 발명의 조성물에 의한 표면 코팅 후, ECM 단백질의 흡착에 의해 유도된 표면 특성의 변화를 검증한 결과이다.

탈세포화 간 매트릭스( DLM ) 기반의 3D(3차원) 하이드로젤 ( hydrogel ).

3.1 하이드로젤의 제조 및 특성 분석.

3D 하이드로젤을 제조하기 위해, 상기 실시예 2의 본 발명의 조성물 또는 콜라겐 I 용액을 증류수로 희석시킨 10% (v/v) 10X PBS와 혼합하였다. 상기 본 발명의 조성물의 pH는 0.5N 수산화나트륨을 이용하여 pH 7.4로 조절하고, 37℃에서 30분간 배양함으로써 DLM 용액 내 교차결합을 유도하였다. 하이드로젤 내의 상기 본 발명의 조성물의 최종 농도는 10mg/ml 또는 20mg/ml로 조정하였다. 하이드로젤 내부 구조는 전계 방사 스캐닝 전자 현미경(FE-SEM, JEOL-7001F, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였다. 탈세포화 간 매트릭스를 사용하여 제작된 삼차원 하이드로젤은 콜라겐 나노섬유 구조로 이루어져 있고, 대조군인 콜라겐 하이드로젤과 달리 콜라겐 섬유다발 특유의 가로 줄무늬 모양이 관찰되었는데, 이는 탈세포화 간 매트릭스로 제작된 하이드로젤이 콜라겐 하이드로젤에 비해 생체 내 콜라겐 구조체와 유사한 환경을 제공해 줄 수 있음을 보여주는 결과이다(도 4).

하이드로젤의 기계적 특성은 회전형 유량계(Bohlin Advanced Rheometer, Malvern Instrument, Worcestershire, UK)를 사용하여 분석하였다. 주파수 대역별 시험 또는 주파수 스윕(frequency sweep) 모드에서, 하이드로젤을 20-mm 평행 플레이트에 배치하였고, 하이드로젤의 저장 모듈러스(탄성률, G') 및 손실 모듈러스(탄성률, G")는 기결정된 주파수 범위(0.079-6.33 Hz) 이내의 1% 변동률에서 기록하였다. 하이드로젤의 저장 모듈러스(G') 및 손실 모듈러스(G")를 일정 주파수(0.159 Hz) 및 일정 압력에서 기록하였다. G'와 G"의 교차 지점을 젤화 시점으로 판단하였다. 상기 실시예 2의 본 발명의 조성물을 포함하는 하이드로젤에 대하여 측정한 저장 모듈은 거의 모든 주파수 영역 내에서 일정하였는데, 이는 탈세포화 간 매트릭스를 포함하는 하이드로젤 내 내부적으로 교차연결된 중합체 네트워크가 안정적으로 균일한 조성임을 보여주는 결과이다(도 5a 및 도 5b). 또한, 1Hz 주파수에서 측정된 콜라겐 I 하이드로젤의 평균 모듈러스(G')는 44.7 ± 23.9 Pa로써, 상기 실시예 2의 조성물을 포함하는 하이드로젤의 수치 (10mg/ml, 268.6 ± 54.7 Pa; 20mg/ml, 401.4 ± 97.0 Pa)에 비해 매우 낮은데, 이는 상기 실시예 2의 조성물을 포함하는 하이드로젤의 모듈러스 수치가 콜라겐 I 하이드로젤에 비해 실제 간의 모듈러스 수치 (~ 640 Pa)와 유사함을 나타내는 결과이다(도 5c). 프리-젤의 혼합물을 10℃ 플레이트에 놓고, 온도를 빠르게 37℃까지 증가시켜 젤화 공정을 완성한 후, 시간 소멸 모드에서 하이드로젤의 젤화 동력학을 관찰하였다. 시간 소멸 모드에서 저장 모듈러스(G')와 손실 모듈러스(G")의 교차 시점이 젤화 시간이다. 상기 실시예 2의 조성물(10mg/ml)을 포함하는 하이드로젤은 젤화 유도 후 약 8-9분이었고, 이는 콜라겐 I 하이드로젤의 젤화 시간과 유사하였다. 더 높은 농도의 상기 실시예 2의 조성물(20mg/ml)을 포함하는 하이드로젤은 보다 더 빠른 젤화 시간(약 4-5분)을 나타내는데(도 5d), 이러한 결과는 20mg/ml 농도의 본 발명의 조성물을 포함하는 하이드로젤이 기존의 콜라겐 하이드로젤보다 빠른 시간 내에 효율적으로 형성될 수 있으며, 이를 포함하는 하이드로젤의 기계적 특성과 젤화 동력학이 젤화에 필요한 본 발명의 조성물의 농도에 의해 조절될 수 있음을 제시한다.

1차 간세포의 배양.

4.1 간세포의 배양.

1차 간세포는 콜라겐 관류 방법을 일부 변형시킨 프로토콜을 사용하여 Sprague Dawley 랫트(8주령 수컷, Nara Biotech) 또는 Balb/c 마우스(8주령 암컷, Nara Biotech)로부터 분리하였다. 수득된 간세포의 생존력은 트립판 블루 배제 시험을 사용하여 측정하였다. 생존력을 측정한 간세포의 80% 이상이 생존하였다. 갓 분리된 1차 간세포를 상기 실시예 2의 조성물(0.2mg/ml) 또는 콜라겐 I (0.2mg/ml)로 코팅된 플레이트 상에 접종하고(1.25 x 10⁵ cell/cm²), 37˚C 및 5% CO²로 습윤된 환경의 간세포 배양 배지(HCM, Lonza, Walkersville, MD, USA)에서 배양하였다(도 6). 간세포의 PS 기질에 대한 흡착은 상기 실시예 2의 조성물을 또는 콜라겐 I 코팅에 의해 크게 증가하였고(도 6a), 흡착된 간세포의 숫자 역시 크게 증가하였음을 확인하였다(도 6b). 또한, 간세포의 생존능이 상기 실시예 2의 조성물이 코팅된 기질에서 가장 높았다(도 6c).

간 세포의 3D(3차원) 배양을 실시하기 위해, 신선한 간세포를 탈세포화 간 매트릭스 또는 콜라겐 I 내에 캡슐화하였다(7.5 x 10⁵ cells/100μl 하이드로젤). 간세포와 프리-젤 용액을 37℃에서 40분간 배양하여 완전히 교차결합시킨 후에, PBS를 사용하여 신중하게 세척하고 HCM 내에 담갔다. 코팅된 기질 상에서 또는 하이드로젤 내에서 배양된 간세포의 생존능은 Live/Dead 생존능/세포독성 키트(Invitrogen)를 사용하여 측정하였다. 상기 키트에서, 칼세인(calcein)은 살아있는 세포의 세포질을 녹색으로 염색하였고, 에티듐 이량체는 죽은 세포의 핵을 적색으로 염색하였다. 상기 실시예 2의 조성물을 포함하는 하이드로젤 내 캡슐화된 간세포의 생존능이 콜라겐 I (1.8mg/ml) 하이드로젤 내에 캡슐화된 간세포의 생존능에 비해 매우 높다는 것을 확인하였다. 도 7a-b에 나타낸 바와 같이 간세포 생존율이 0일, 1일째, 3일째 및 7일째에 각각 60.7%, 50.8%, 44.7% 및 39.9%로 나타났다.

4.2 간세포의 기능 분석.

간세포의 알부민 분비 및 요소 합성을 분석하여 배양된 간세포의 기능을 평가하였다. 2D 및 3D 배양 중에, 배양 배지는 매일 회수하여 분석 시까지 -80℃에 저장하였다. 배지 내 알부민의 양은 효소면역측정법(ELISA, Koma Biotech Inc., Korea)를 사용하여 측정하였다. 배지 시료 내 요소 농도는 제조자의 매뉴얼에 따라 Stanbio urea nitrogen(BUN) 키트(Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA)를 사용하여 측정하였다. 상기 실시예 2의 조성물로 코팅된 표면 및 상기 실시예 2의 조성물을 포함하는 하이드로젤은, 콜라겐 I 코팅된 표면 및 콜라겐 I 하이드로젤보다 알부민 분비와 요소 합성에 의해 측정된 간세포-특이적 기능이 더 우수함을 보여 주었다(도 6d-e 및 도 7c-d). 이러한 결과는 기존의 콜라겐 코팅된 표면에서 배양된 간세포보다 상기 실시예 2의 조성물로 코팅된 표면에서 배양된 간세포의 생존능 및 기능이 더 우수함을 제시하고, 콜라겐 I 하이드로젤보다는 상기 실시예 2의 조성물을 포함하는 하이드로젤 내에 실제 간과 유사한 3D 세포외질 미세환경이 잘 구축되어 있음을 반영하는 결과이다.

인간중간엽줄기세포의 간세포 분화.

5.1 간세포 분화.

인간 중간엽줄기세포(hADSCs)는 Invitrogen으로부터 구입하였고 기본 배지: 중탄산나트륨(3.7g/L), 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100mg/ml) 및 우태아 혈청(Gibco BRL)을 보충한 배지(low-glucose Dulbecco? Modified Eagle? Medium(DMEM), Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에서 증식하였다. 접종된 인간 중간엽줄기세포가 배양 기질 면적의 90% 이상을 점유하는 시점에, 변형된 3단계 프로토콜에 따라 2 가지 다른 농도(1mg/ml 및 2mg/ml)의 상기 실시예 2의 조성물로 코팅된 배양 기질 표면에서 인간 중간엽줄기세포의 간세포 분화를 실시하였다(도 8a): 1) 중배엽 유도: 세포를 activin A(50ng/ml, Pepro Tech, Rocky Hill, NJ, USA) 및 섬유아세포 성장인자-4(FGF-4, 10ng/ml, PeproTech)으로 보충한 기본 배지에서 처음 3일 동안 배양, 2) 간모세포 유도: 세포를 FGF-4(30ng/ml), 간세포 성장인자(HGF, 50ng/ml, PeproTech), oncostatin M(OSM, 20ng/ml, PeproTech) 및 니코틴아마이드(4.9 mmol/L, Sigma)를 보충한 기본 배지에서 이후 7일 동안 배양, 3) 간세포 유도: 세포를 HGF(40ng/ml), 상피세포 성장인자(20ng/ml, PeproTech), OSM(10ng/ml), 및 덱사메사손(10^-7 mol/L, Sigma)을 보충한 기본 배지에서 이후 11일 동안 배양.

5.2 분화마커의 확인( Quantitative Real - time polymerase chain reaction , qRT - PCR ).

21일의 인간 중간엽줄기세포의 분화 후, 간세포로 분화된 인간 중간엽줄기세포 내 간 마커의 유전자 발현을 qRT-PCR을 통해 검사하였다. 전체 RNA는 RNeasy 미니 키트(Qiagen, Chatsworth, CA, USA)를 사용하여 각 시료(각 그룹별 n=3)로부터 추출하였다. 역 전사 반응은 Takara PrimeScript II 1^st strand cDNA 합성 키트(Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 실시하였다. qRT-PCR는 TaqMan Fast Universal PCR Master Kit(Applied Biosystem) 및 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 실시하였다. 각각 마커의 유전자 발현은 TaqMan Gene Expression assays(Applied Biosystems)을 사용하여 인간 알부민(Hs00910225_m1), 인간 HGF(Hs00300159_m1), 인간 알파1-안티트립신(A1AT)(Hs00165475_m1) 및 인간 글리세르알데히드-3-인산 탈수소화효소(GAPDH)(Hs02758991_g1)에 대하여 정량분석하였다. 유전자 발현의 수준은 표적 유전자가 내재적인 기준(GAPDH)에 대하여 표준화되는 Comparative C_t 방법으로 측정하였다. 탈세포화 간 매트릭스 또는 콜라겐 I으로 코팅된 표면에서 배양한 인간 중간엽줄기세포를 간세포로 분화시킨 세포에서 각각의 간세포 특이적 마커에 대한 상대적인 유전자 발현은 코팅을 실시하지 않은 표면에서 배양한 인간중간엽줄기세포를 간세포로 분화시킨 세포의 유전자 발현을 기준으로 표준화하였다. 코팅을 실시하지 않은 표면 또는 콜라겐 I 코팅된 표면에 비해, 상기 실시예 2의 조성물로 코팅된 표면에서 인간 중간엽줄기세포로부터 분화된 간세포의 간세포 특이적 마커(HGF: 도 8b, A1AT: 도 8c, 알부민: 도 8d)의 발현이 증가하였다.

간 조직의 이식.

상기 실시예 2의 조성물을 포함하는 하이드로젤 또는 콜라겐 I 하이드로젤에서 3D 배양한 1차 랫트 간세포를 사용하여 무흉선 마우스(Balb/c 마우스, 8 주령 암컷, Nara Biotech)의 이소성 위치로의 간세포 이식을 실시하였다. 세포 이식에 대한 동물 실험은 Yonsei Laboratory Animal Research Center(IACUC protocol number: 2010-0049)에서의 기관 동물 보호 및 사용 위원회의 승인 하에 실시하였다. 3D 배양한 1차 랫트 간세포(7.5 x 10⁵ cells/100μl 하이드로젤)는 프리-젤의 용액과 혼합하였고, 31-게이지 주사를 이용하여 마우스의 등 측면으로 피하 주사하였다. 이식 1주일 이내에 콜라겐 하이드로젤은 부피가 크게 감소하였지만, 상기 실시예 2의 조성물을 포함하는 하이드로젤은 이식된 부위에서 부피가 보존되었으며(도 9a), 이식 7일 후에 회수된 하이드로젤의 무게가 콜라겐 I 하이드로젤의 무게보다 매우 컸다(도 9b). 이는 상기 실시예 2의 조성물을 포함하는 하이드로젤 내에서 간세포 증식에 필요한 세포외 기질 미세환경이 잘 보존됨을 나타내는 결과이다. 회수된 하이드로젤을 OCT 냉동-화합물 내에 고정시키고, 조직학적 분석(n=4)을 위해 단면을 절단하였다. 단면을 잘라낸 조직은 H&E 염색법을 사용하여 염색하였고, 랫트 알부민 항체(1:100 희석, Santa Cruz Biotechnology, USA) 및 알렉사 647-결합된 2차 항체(Invitrogen)를 사용하여 면역형광 염색을 실시하였다. 이식된 대부분의 간세포는 하이드로젤 주위에 전반적으로 잘 분산되어 있고(도 9c), 상기 실시예 2의 조성물을 포함하는 하이드로젤 내에 이식된 간세포에서의 알부민 발현이 콜라겐 I 하이드로젤 내 이식된 간세포보다 훨씬 더 높음을 면역조직화학 방법을 통해 확인하였다(도 9d).

하이드로젤 내 이식된 간세포의 간 유전자 발현 수준을 qRT-PCR 방법으로 검사하기 위해, 상기 실시예 2의 조성물을 포함하는 하이드로젤 또는 콜라겐 I 하이드로젤을 사용하여 마우스의 피하 공간으로 마우스 간세포를 이식하였다. 간 유전자 발현은 TaqMan Gene Expression Assays(Applied Biosystem) 및 qRT-PCR을 사용하여 마우스 알부민(Mm00802090_m1), 마우스 간세포 핵 인자-4α(HNF-4α)(Mm00433964_m1), 및 마우스 GAPDH(Mm99999915_g1)에 대하여 정량분석하였다. 상기 실시예 2의 조성물을 포함하는 하이드로젤 내 이식된 간세포의 각 마커의 상대적인 유전자 발현은 콜라겐 I 하이드로젤 내 이식된 간세포 내 각 마커의 유전자 발현에 대하여 표준화하였다. qRT-PCR 분석 결과는, 콜라겐 I 하이드로젤을 사용하여 이식한 간세포보다 상기 실시예 2의 조성물을 포함하는 하이드로젤을 사용하여 이식한 간세포에서, 간 특이적 마커로서 알부민(도 9e) 및 HNF-4α(도 9f)의 발현이 크게 증가하였음을 제시한다.

지금까지 예시적인 실시예를 참조하여 본 발명을 기술하였으나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시예로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 조성물의 제조에 사용되는 탈세포화 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물을 제조하는 방법으로서,
i) 동물에서 분리된 기관(organ)을 증류수로 관류시키고,
ii) 상기 증류수로 관류시킨 기관을 탈세포화 용액으로 관류시켜 탈세포화 기관 매트릭스를 수득하며,
iii) 상기 탈세포화 기관 매트릭스를 증류수로 추가 관류시켜 세척하고,
iv) 상기 세척한 기관 매트릭스를 동결건조 한 후 분쇄하는 것을 포함하는,
탈세포화 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물을 제조하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 기관이 간(liver)임을 특징으로 하는, 탈세포화 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물을 제조하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 ii)의 탈세포화 용액을 이용한 간의 관류가 3 내지 5시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 탈세포화 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물을 제조하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 ii) 탈세포화 기관 매트릭스 내 DNA 함량이, 온전한 기관 내 DNA 함량의 5% 이하인 것을 특징으로 하는, 탈세포화 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물을 제조하는 방법.
제 1항 또는 제 2항의 방법에 따라 제조된 탈세포화 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물을 용해시킨 용해물을 포함하는,
세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 조성물.
제 5항의 조성물로 코팅된 표면을 갖는, 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 기질.
제 6항에 있어서,
상기 조성물은 0.2mg/ml 내지 4mg/ml 농도임을 특징으로 하는, 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 기질.
제 6항 또는 제 7항에 있어서,
상기 코팅된 표면의 수분접촉각도가 40도 내지 55도인 것을 특징으로 하는, 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 기질.
제 6항 또는 제 7항에 있어서,
상기 코팅된 표면에서의 세포 생존능이 70% 이상이고, 코팅된 표면에 흡착되는 세포수가 1.0 x 10⁵/cm² 이상인 것을 특징으로 하는, 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 기질.
제 6항 또는 제 7항의 기질에서 인간 중간엽줄기세포를 분화시키는 방법.
제 10항의 방법에 따라 분화된 세포.
제 11항에 있어서,
상기 세포는 간 세포인 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
제 10항에 따라 인간 중간엽줄기세포로부터 분화된 간 세포.
제 13항에 있어서,
상기 분화된 간 세포에서, 인간 알파1-항트립신(AIAT, 인간 알파1 -안티트립신)의 발현이 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)의 발현에 비해 1.4배 이상인 것을 특징으로 하는, 분화된 간 세포.
제 5항의 조성물을 포함하는, 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 3차원 구조의 지지체.
제 15항에 있어서,
상기 지지체는 하이드로젤(hydrogel)인 것을 특징으로 하는, 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 3차원 구조의 지지체.
제 15항 또는 제 16항에 있어서,
상기 3차원 구조의 지지체 내의 세포 생존율이 40% 이상인 것을 특징으로 하는, 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 3차원 구조의 지지체.
제 16항 또는 제 17항에 있어서,
상기 하이드로젤의 평균 모듈러스는 하이드로젤 농도 10㎎/㎖에서 200Pa 내지 300Pa이고 하이드로젤 농도 20mg/ml에서 350Pa 내지 450Pa 인 것을 특징으로 하는, 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 3차원 구조의 지지체.
제 16항 또는 제 17항에 있어서,
상기 하이드로젤의 모듈러스는 200Pa 이상인 것을 특징으로 하는, 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 3차원 구조의 지지체.
제 15항 또는 제 16항에 있어서,
상기 지지체 내 간 세포의 알부민 발현이, 콜라젠 하이드로젤 내 간 세포의 알부민 발현에 비해 3배 이상이고, 간세포 핵 인자-4 알파(HNF-4 α, hepatocyte nuclear factor-4α)의 발현이 콜라젠 하이드로젤 내 간 세포의 간세포 핵 인자-4 알파의 발현에 비해 5배 이상인 것을 특징으로 하는, 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 3차원 구조의 지지체.
제 15항 또는 제 16항의 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 3차원 구조의 지지체에서 세포를 배양하는 방법.
제 21항에 있어서,
상기 세포가 간 세포인 것을 특징으로 하는, 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 3차원 구조의 지지체에서 세포를 배양하는 방법.
제 15항 또는 제 16항의 세포 배양, 세포 분화 또는 세포 배양 및 세포 분화용 3차원 구조의 지지체를 포함하는 조직 이식용 소재.