CN105497985B - 一种脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组织工程领域，具体涉及一种改性脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法。所述方法包括以下步骤：(1)将脱细胞角膜基质预处理；(2)用氨基酸与经过预处理的脱细胞角膜基质进行反应，对脱细胞角膜基质进行接枝改性；(3)将接枝改性后的脱细胞角膜基质进行后期处理，除去接枝改性处理过程中的残留物质，即得改性的脱细胞角膜基质。所述改性的脱细胞角膜基质既具有良好的机械性能、生物相容性，又具有优异的复水和保水性，植入后可快速恢复透明性，可以用于组织工程研究、临床角膜移植手术等。

Description

一种脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法
技术领域
本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法。
背景技术
角膜位于眼球前壁，是一种透明组织，主要行使屏障和屈光功能。由于角膜直接与外界接触，极易受到机械外伤、热灼伤、酸碱侵蚀等，从而引起角膜病的发生，严重者甚至失明。角膜移植是临床现有唯一的治疗方法，但受限于角膜捐赠供体数量的严重匮乏，很多角膜患者在等待中失去了希望。随着组织工程和再生医学的发展，体外构建与角膜功能类似的组织功能角膜代替物成为可能，有望解决角膜供体不足的问题。
选取载体支架是成功构建组织工程角膜的关键。目前应用于组织工程角膜构建的载体支架材料主要包括天然材料和合成材料，其中天然材料主要包括羊膜、胶原、丝素蛋白、细胞外基质；合成材料主要包括聚羟基乙酸和聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物。哺乳动物中猪和人在解剖学上比较相似且来源广泛，因此对猪角膜进行各种脱细胞方法处理，获取可用于组织工程角膜的载体支架已越来越受到关注。
目前制备的脱细胞角膜基质具有较好的生物相容性，但由于角膜原有的胶原网络结构不可避免的遭到各种程度的破坏，糖胺聚糖等天然成分大量流失，导致其力学强度、耐降解性和生物活性等有所降低。我们前期使用的国家专利《一种制备脱细胞基质的方法》(专利号200810026972.2)只针对细胞的特异性脱细胞方法，得到保留角膜精密结构的脱细胞角膜基质，临床试用具有显著的效果，在生理范围内，角膜基质愈合较好，但也存在移植术后透明性恢复较慢，极端炎症下脱细胞基质降解较快的现象。为提高其临床效果，脱细胞角膜基质需要进一步改性，使其与天然的角膜细胞外基质更加接近。
现有的脱细胞角膜基质改性方法主要是使用物理、化学、酶等方法实现脱细胞角膜胶原之间的交联，起到了改善脱细胞的机械性能、耐降解性和生物活性等。但上述改性方法在产业化应用时都面临着不同的问题。具体为：物理法，主要通过引入离子型或者两亲性交联剂，借助范德华力、离子键、氢键、亲疏水作用力等实现改性，此方法的优点是操作简单，残留物容易去除，但此方法的缺点是稳定性差，交联效率较低且不可控，而且容易降解、流失，同时改变角膜基质的电位及亲疏水性，存在引发免疫排斥的隐患；化学法和酶法，通过引入交联剂(如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1,1-羰基二咪唑、京尼平、氧化海藻酸钠、戊二醛等)、酶(转谷氨酰胺酶、辣根过氧化物酶、酪氨酸酶、赖氨酰氧化酶和辣根过氧化物酶等)或者光(紫外、X射线等)催化等方法实现角膜基质中胶原相互交联，优点是形成的共价键十分稳定，高效，且条件可控，缺点是交联后生理条件下是不可逆，破坏角膜内胶原动态六方晶格结构，对脱细胞角膜基质造成二次损伤，而且此方法还存在交联剂、酶以及副产物残留的问题。
上述改性方法还存在一个共同的问题：仅试图修复脱细胞角膜基质的胶原网络结构，在设计上未涉及角膜生理功能的修复，不能满足临床快速实现角膜透明性恢复的需要。从角膜的生理功能来说，角膜含有的结合水、自由水与其透明性密切相关，二者主要是通过氢键、胶原纤维的六方晶格排列得到，如果不能很好的解决脱细胞角膜基质含水率的问题，移植后就会延缓脱细胞角膜透明性恢复的时间，并在临床上存在移植后出现干眼症的隐患。总之，在改性时除了提高其机械性能等，还必须改善角膜含水率，综合实现脱细胞角膜基质生物稳定性的提高。因此设计一种可以既改善脱细胞角膜基质的物理、生物稳定性，同时又可以改善角膜生理功能的方法，是解决脱细胞角膜基质广泛应用于临床的关键。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法，该方法可以既改善脱细胞角膜基质的物理、生物稳定性，同时又可以改善角膜的生理功能，使改性后的脱细胞角膜基质在临床上可以快速恢复透明性。
实现上述目的的具体技术方案如下。
一种脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法，包括以下步骤：
(1)将脱细胞角膜基质预处理；
(2)通过氨基酸与经过预处理的脱细胞角膜基质进行反应，对脱细胞角膜基质进行接枝改性；
(3)将接枝改性后的脱细胞角膜基质进行后期处理，除去接枝改性处理过程中的残留物质，即得改性的脱细胞角膜基质。
本发明的脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法是使用氨基酸对脱细胞角膜基质进行改性，借助氨基酸的氨基和羧基，达到改善脱细胞角膜基质含水率和生物稳定性的目的。
在其中一些实施例中，所述的氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸或其衍生物、低聚物或高聚物中的一种或一种以上。
在其中一些实施例中，所述氨基酸的浓度为2μg/mL-2g/mL。
在其中一些实施例中，所述氨基酸的浓度为5mg/mL-2g/mL。
在其中一些实施例中，步骤(2)中接枝改性时：先对脱细胞角膜基质和/或氨基酸用活化羧基或氨基的试剂进行活化，再将脱细胞角膜基质与氨基酸进行反应。使用活化羧基或氨基的试剂对氨基或羧基进行活化，可以增加接枝到脱细胞角膜基质中的氨基酸含量，提高改性效果。
在其中一些实施例中，所述活化羧基或氨基的试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和/或N-羟基琥珀酰亚胺。
在其中一些实施例中，将脱细胞角膜基质进行活化时的pH为4-8，将氨基酸进行活化时的pH为6-9，所述活化在超声波或微波的条件下进行。
在其中一些实施例中，步骤(2)中的反应在温度为0-65℃，pH为2.5-9的条件下进行；和/或步骤(2)中的反应在光催化、微波或超声波的条件下进行。
接枝改性时，活化或者反应在超声波、微波或光催化的条件下进行，调节超声的功率、频率；微波的功率；光催化剂量、时间等参数可进一步增加接枝到脱细胞角膜基质中的氨基酸含量，提高改性效果。
在其中一些实施例中，所述超声波的功率为100～600W，频率为30-80KHz。
在其中一些实施例中，所述微波的功率为80-120W。
在其中一些实施例中，所述光催化的剂量为20-30KyG、时间为4-8min。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述的预处理包括如下的步骤A，或步骤A和步骤B，或步骤A～C：
A、使用生理盐水、磷酸盐缓冲溶液或超纯水浸泡脱细胞角膜基质；
B、用去离子水清洗浸泡后的脱细胞角膜基质；
C、风干或冷冻干燥后，在干燥器中保存备用。
所述的风干或冷冻干燥目的在于促进氨基酸溶液和活化试剂进入角膜内部，提高改性效果。以复水实验中改性后脱细胞角膜基质的含水率为指标，复水10分钟，含水率可以从53％(预处理时不经过冷冻干燥)提高到79％(预处理时经过冷冻干燥)；复水24h，即充分复水后，含水率可以从81.2％(预处理时不经过冷冻干燥)提升到93％(预处理时经过冷冻干燥)。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述的后期处理的方法为：将接枝改性后的脱细胞角膜基质用去离子水、生理盐水或磷酸盐缓冲溶液冲洗，再用截留分子量为100～200000Da的透析装置进行透析，透析液为生理盐水、磷酸盐缓冲溶液或超纯水，最后经过灭菌即得。
本发明的另一目的在于提供一种改性的脱细胞角膜基质。
具体技术方案如下。
一种改性的脱细胞角膜基质，由上述脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法制备得到。该改性的脱细胞角膜基质，使用的改性剂，安全无毒；具有良好的复水和保水性，植入后具有很好的透明性和含水率；角膜内胶原的交联是适度的，且在生理条件下是可逆，植入后角膜可以自身实现“修正”。
本发明的原理如下：1.角膜中的结合水主要是通过胶原以及糖胺聚糖形成的氢键结合。2.糖胺聚糖在角膜中主要通过N-糖苷键与胶原上的天门冬氨酸结合，因此使用氨基酸进行改性，无毒，且形成的肽键在生理条件下可逆。3.角膜中的胶原网络结构主要通过肽键和氢键维持，氨基酸的引入可以修复脱细胞过程中对肽键的损伤，而氨基酸游离的氨基和羧基均能形成稳定的氢键，二者协同作用有利于角膜内胶原网络结构的修复，从而提高脱细胞角膜基质的生物稳定性。4.氨基酸，尤其是聚氨基酸游离的氨基和羧基具有很好的吸水和保水性(例如聚谷氨酸的保湿锁水功效是透明质酸的500倍)，有利于恢复角膜含水率。
因此，本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)用本发明的脱细胞角膜基质的改性方法进行改性后的脱细胞角膜基质具有良好的物理、生物稳定性，比未改性的脱细胞角膜基质具有更高的吸水性、复水和保水性，复水后透明性和弹性模量也得到了改善，提高了脱细胞角膜基质的生物稳定性，植入后具有很好的透明性和含水率；
(2)本发明的脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法中，接枝改性时对脱细胞角膜基质和/或氨基酸用活化羧基或氨基的试剂进行活化，活化和/或反应在超声波、微波或光催化的条件下进行，可以增加接枝到脱细胞角膜基质中的氨基酸含量，进一步提高改性效果；预处理时对脱细胞角膜基质进行风干或冷冻干燥，可以进一步促进氨基酸溶液和活化试剂进入角膜内部，进一步提高改性效果，使改性后的脱细胞角膜基质具有更高的吸水性、复水和保水性；
(3)通过本发明的改性方法改性后的脱细胞角膜基质含有大量的氨基和羧基，植入后可以吸附生理分泌的糖胺聚糖，且键合方式与天然角膜相同，可以发挥氨基和羧基的氢键作用力维持胶原结构以及角膜含水率；
(4)本发明的改性方法中使用氨基酸单体、小分子以及聚氨基酸，无免疫原性和毒副作用；
(5)通过本发明的改性方法改性后的脱细胞角膜基质角膜内胶原的交联是适度的，且在生理条件下是可逆的，植入后角膜可以自身实现“修正”；
(6)通过本发明的改性方法改性后的脱细胞角膜基质便于进一步改性，如胶原内交联、接枝生长因子、接枝药物等。
附图说明
图1为实施例1中的脱细胞角膜基质改性前后的傅里叶变换红外光谱谱图；
图2为实施例1中的脱细胞角膜基质的复水实验照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例的改性脱细胞角膜基质由以下方法制备得到：
(1)脱细胞角膜基质的预处理
取猪脱细胞角膜基质浸入5mL生理盐水中，在4℃冰箱静置过夜，使用眼科钻裁取透明部分，用去离子水冲洗3次后在-20℃冰箱冷冻4h，冷冻干燥，室温下在干燥器中保存备用。
(2)脱细胞角膜基质的接枝改性
将步骤(1)干燥的猪脱细胞角膜基质浸泡在5mL(6mg/mL)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.25)中，4℃超声2h(300W，40Hz)。在2mL(6mg/mL)天冬氨酸(过饱和)的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液(pH＝6.0)中加入1mL(13mg/mL)的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，4℃活化2h，再加入NHS浸泡后的猪脱细胞角膜基质，置于40rad/min的摇床上，4℃下反应24h。
(3)接枝改性后的脱细胞角膜基质的后期处理
将步骤(2)经过接枝改性处理的猪脱细胞角膜基质用去离子水冲洗6次后，在生理盐水中透析24h，使用钴60(15KyG)照射灭菌15min，得到改性的脱细胞角膜基质。
将本实施例制备得到的改性脱细胞角膜基质进行如下性能检测：
1化学结构分析
使用傅立叶变换红外光谱仪(EQUINOX-70,Bruker,德国)检测脱细胞角膜基质改性前后的化学结构，结果如附图1所示。图中可见，脱细胞角膜基质使用天冬氨酸改性后，3316cm-1处-OH及-NH伸缩振动峰增强，1635cm-1处-NH(面内)弯曲振动峰峰强增加，1234cm-1和1045cm-1处出现C-N伸缩振动峰，在735cm-1附近(650-856cm-1范围内)的-NH(面外)弯曲振动峰峰面积增加，表明大量的氨基和羧基已被引入脱细胞角膜基质，即天冬氨酸已接枝到脱细胞角膜基质中。
2力学检测
将人工前房的一条注气管连接于压力表，另一条连于自动注射器，待检样本(未改性脱细胞角膜基质与本实施例制备的改性脱细胞角膜基质)固定于人工前房，检测样本在0～100mmHg范围内的力学性质。10mmHg基础压强下，使用2mm直径的环钻沾取阿尔辛兰染液后，在样本中央表面做一环形标记，作为基础面积(S0)，使用照相机拍摄该环形面积S0。向人工前房中继续注气，拍摄并记录其后各压强测量点(20,30,40,50,60,70,80,90,100,110mmHg)时标记环的面积(St)。使用Image-Pro Plus Version 6.0软件测量S0和St的大小，计算各压强检测点与基础压强的压强差P’(即10,20,30,40,50,60,70,80,90,100mmHg)。最后，按以下公式计算面应变和面膜量。面应变γ＝(St-S0)/S0，面模量E＝P’/γ。(测试方法参考：Wu,Z.,et al.,The use of phospholipase A(2)to prepareacellular porcine corneal stroma as a tissue engineeringscaffold.Biomaterials,2009.30(21):3513-3522)
实验结果表明在0～100mmHg的压力差范围内，本实施例制备的氨基酸改性后的脱细胞角膜基质面模量可达到860mmHg，而未改性组的脱细胞角膜基质面模量仅为400mmHg。
3生物稳定性
脱细胞角膜基质的生物稳定性通过测定其在生物酶中降解产物L-羟脯氨酸的含量进行评价。
3.1羟脯氨酸标准曲线的测定
在试管中配置L-羟脯氨酸的标准母液(质量浓度分别为10、20、30、40、50g/mL)20mL，各加入0.05mol/L的对甲苯磺酰氯胺钠10mL，摇匀,于室温放置氧化20min后，加0.35mol/L的高氯酸溶液10mL，摇匀，静置5min终止氧化。最后，加入对二甲氨基苯甲醛试剂10mL，摇匀，于60℃水浴中显色20min，冷却后使用721型分光光度计在560nm处测定吸光度值。以L-羟脯氨酸质量浓度(g/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制出标准曲线，并回归出标准曲线方程。
3.2脱细胞基质中的羟脯氨酸的测定
将未改性的脱细胞角膜基质和本实施例的改性的脱细胞角膜基质浸入0.25％胰酶/EDTA溶液中,置于37℃培养箱消化，24h后终止消化并更换培养液；将消化液置于冰水浴中冷却,然后离心20min(3000r/min),取上清液,加浓度为6mol/L的盐酸溶液,于110℃下水解12h,用721型分光光度计测定上清液中羟脯氨酸的含量。(测试方法参考：Pieper J S,Oosterhof A,Dijkstra P J,et a l.Preparation and characterization of porouscross linking collagenous matrices containing bioavailable chondroitinsulphate[J].Biomaterials,1999,20(9):847-858.)
测试结果表明，24h后每毫克未改性的脱细胞角膜基质材料降解产物中羟脯氨酸的浓度为7.825±0.03μg/mL，而每毫克本实施例的改性后的脱细胞角膜基质材料降解产物中羟脯氨酸的浓度为4.225±0.0001μg/mL，存在显著性差异，表明本实施例制备的氨基酸改性后的脱细胞角膜基质的稳定性显著提高。
4复水实验
将本实施例得到的改性后的脱细胞角膜基质置于培养皿中，使用封口膜封口，用1mL的注射器针头扎孔，自然风干，得到实验组脱细胞角膜基质，称重m0。未改性处理的脱细胞角膜基质作为对照组，与实验组分别加入到24孔板中，加入2mL超纯水，在回旋振荡器上以80rad/min，震荡24h，使用滤纸吸去表面水分称重m1。角膜24h复水后含水率＝(m1-m0)/m1。
结果表明，未改性脱细胞角膜基质24h复水后含水率为73％，本实施例得到的改性后脱细胞角膜基质含水率为93％(p＜0.0001)。复水效果如附图2所示，图中可见，相较于对照组，实验组吸水后角膜厚度明显提高，具有优异的复水和保水能力。
5移植效果评估
按常规板层角膜移植术方法实施手术，评价改性后脱细胞角膜基质的整体功能。以新西兰大白兔右眼为手术眼，移植植片(6.25mm直径，100μm厚度)分别为自体板层角膜基质(原位移植)、未改性脱细胞角膜基质和本实施例的改性脱细胞角膜基质。术后给予地塞米松和妥布霉素眼膏，一日3次，持续7天，每日裂隙灯下观察植片变化。术后7天，每组随机取4只动物，进行免疫荧光染色检测Dio标记物(5ug/ml,Invitrogen V22886)，评价种植细胞的转归和植床细胞的长入情况，并对取材后的角膜基质分别进行体外透光率和兔Ⅲ型胶原染色(Acris，AF5810)。(实验方法参考：Wu,Z.,et al.,The use of phospholipase A(2)to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold[J].Biomaterials,2009.30(21):3513-3522)组织学检测显示本实施例的改性脱细胞角膜基质术后3天被DIO标记的种植细胞与周边植床细胞融合良好，术后15天受体基质细胞分泌Ⅲ型胶原修复创面，而未改性的脱细胞角膜基质实现上述效果需要45天。
体外透光率检测：对样品进行紫外可见光分光光度计检测，从300～800nm的波长范围内，每10nm就对脱细胞角膜进行透光性检测。(Mehrdad Rafat,Fengfu Li,PerFagerholm,Neil S.Lagali,Mitchell A.Watsky,Rejean Munger,Takeshi Matsuura,MayGriffith,PEG stabilized carbodiimide crosslinked collagen–chitosan hydrogelsfor corneal tissue engineering[J].Biomaterials,2008.29(29):3960–3972)结果表明，术后7天，在300-800nm的可见光范围内，本实施例的改性后脱细胞角膜基质与自体角膜比较无明显差异，显示出高度透明，而未改性组的猪脱细胞角膜基质87天后才有此效果。
实施例2
本实施例的改性脱细胞角膜基质由以下方法制备得到：
(1)脱细胞角膜基质的预处理
取猪脱细胞角膜基质浸入5mL生理盐水中，在4℃冰箱静置过夜，使用眼科钻裁取透明部分，用去离子水冲洗3次后，4℃冰箱保存备用。
(2)脱细胞角膜基质的接枝改性
同实施例1。
(3)接枝改性后的脱细胞角膜基质的后期处理
同实施例1。
对本实施例制备得到的改性脱细胞角膜基质进行复水实验(测试方法同实施例1)，测试结果表明：复水10分钟后，本实施例得到的改性后脱细胞角膜基质含水率为53％；复水24h后，本实施例得到的改性后脱细胞角膜基质含水率为81.2％，低于实施例1的改性后脱细胞角膜基质。
实施例3
本实施例的改性脱细胞角膜基质由以下方法制备得到：
(1)脱细胞角膜基质的预处理
取兔子脱细胞角膜基质浸入10mL超纯水中，室温下静置过夜，使用眼科钻裁取透明部分，4℃冰箱保存备用。
(2)脱细胞角膜基质的接枝改性
将步骤(1)处理过的兔子脱细胞角膜基质浸泡在5mL(0.08g/mL)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PBS(pH＝7.25)溶液中，4℃超声2h(500W,40Hz)。在4mL(10μg/mL)谷氨酸的硼砂-氢氧化钠缓冲溶液中(pH＝9)，加入NHS浸泡后的兔子脱细胞角膜基质，置于80rad/min的摇床上，0℃下反应24h，再使用钴60进行光催化(25KyG，5min)。
(3)接枝改性后的脱细胞角膜基质的后期处理
将步骤(2)经过接枝改性处理的兔子脱细胞角膜基质用去离子水冲洗6次后，在水中透析24h，使用钴60(15KyG)照射灭菌15min，得到改性的脱细胞角膜基质。
将本实施例制备得到的改性脱细胞角膜基质进行如下性能测试：
1化学结构分析
测试方法同实施例1，结果表明谷氨酸已接枝到脱细胞角膜基质中。
2力学检测
测试方法同实施例1。实验结果表明在0～100mmHg的压力差范围内，本实施例制备的氨基酸改性后的脱细胞角膜基质面模量可达到690mmHg，而未改性组的脱细胞角膜基质面模量为394mmHg。
3生物稳定性
测试方法同实施例1。结果表明，24h后每毫克未改性的脱细胞角膜基质材料降解产物中羟脯氨酸的浓度为7.949±0.11μg/mL，而每毫克本实施例改性后的脱细胞角膜基质材料降解产物中羟脯氨酸的浓度为6.45±0.0001μg/mL，存在显著性差异，表明本实施例制备的氨基酸改性后的脱细胞角膜基质的稳定性显著提高。
4复水实验
测试方法同实施例1。结果表明，未改性脱细胞角膜基质24h复水后含水率为75％，本实施例得到的改性后脱细胞角膜基质含水率为79％。
5移植效果评估
测试方法同实施例1。组织学检测显示改性脱细胞角膜基质术后7天被DIO标记的种植细胞与周边植床细胞融合良好，术后18天受体基质细胞分泌Ⅲ型胶原修复创面，而未改性的脱细胞角膜基质实现上述效果需要花费51天时间。
体外透光率检测表明，术后19天，在300-800nm的可见光范围内，本实施例的改性后脱细胞角膜基质与自体角膜比较无明显差异，显示出高度透明，而未改性的脱细胞角膜基质89天后才有此效果。
实施例4
本实施例的改性脱细胞角膜基质由以下方法制备得到：
(1)脱细胞角膜基质的预处理
取狗脱细胞角膜基质浸入5mLPBS溶液中，在4℃冰箱静置过夜，用去离子水冲洗3次后在-20℃冰箱冷冻4h，冷冻干燥，室温下在干燥器中保存备用。
(2)脱细胞角膜基质的接枝改性
将步骤(1)干燥的狗脱细胞角膜基质浸泡在10mL(2g/mL)脯氨酸(过饱和)的PBS缓冲溶液(pH＝8)中，在微波条件下(100W，60℃)下反应5min。
(3)接枝改性后的脱细胞角膜基质的后期处理
将步骤(2)经过接枝改性处理的兔子脱细胞角膜基质用超纯水冲洗6次后，在水中透析24h，使用钴60(10KyG)照射灭菌15min，得到改性的脱细胞角膜基质。
将本实施例制备得到的改性脱细胞角膜基质进行如下性能测试：
1化学结构分析
测试方法同实施例1，结果表明脯氨酸已接枝到脱细胞角膜基质中。
2力学检测
测试方法同实施例1。实验结果表明在0～100mmHg的压力差范围内，本实施例制备的氨基酸改性后的脱细胞角膜基质面模量可达到730mmHg，而未改性组的脱细胞角膜基质面模量为412mmHg。
3生物稳定性
测试方法同实施例1。结果表明，24h后每毫克未改性后的脱细胞角膜基质材料降解产物中羟脯氨酸的浓度为9.117±0.817μg/mL，而每毫克本实施例改性后的脱细胞角膜基质材料降解产物中羟脯氨酸的浓度为4.311±0.0001μg/mL，存在显著性差异，表明本实施例制备的氨基酸改性后的脱细胞角膜基质的稳定性显著提高。
4复水实验
测试方法同实施例1。结果表明，未改性脱细胞角膜基质24h复水后含水率为71％，本实施例得到的改性后脱细胞角膜基质含水率为87％。
5移植效果评估
测试方法同实施例1。组织学检测显示改性脱细胞角膜基质术后5天被DIO标记的种植细胞与周边植床细胞融合良好，术后14天受体基质细胞分泌Ⅲ型胶原修复创面，而未改性的脱细胞角膜基质实现上述效果需要花费49天的时间。
体外透光率检测表明，术后11天，在300-800nm的可见光范围内，本实施例的改性后脱细胞角膜基质与自体角膜比较无明显差异，显示出高度透明，而未改性组的脱细胞角膜基质91天后才有此效果。
实施例5
本实施例的改性脱细胞角膜基质由以下方法制备得到：
(1)脱细胞角膜基质的预处理
取猴脱细胞角膜基质浸入8mL生理盐水中，在4℃冰箱静置过夜，使用眼科钻裁取透明部分，用去离子水冲洗3次后在-20℃冰箱冷冻4h，冷冻干燥，室温下在干燥器中保存备用。
(2)脱细胞角膜基质的接枝改性
将步骤(1)干燥的猴脱细胞角膜基质浸泡在4mL(1g/mL)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PBS(pH＝7.4)溶液中，4℃超声2h(300W，40Hz)。在2mL(5mg/mL)精氨酸的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液(pH＝6)中加入1mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC，800mg/mL)，4℃活化20min，再加入NHS浸泡后的猴脱细胞角膜基质，置于40rad/min的摇床上，4℃下反应24h。
(3)接枝改性后的脱细胞角膜基质的后期处理
将步骤(2)经过接枝改性处理的猴脱细胞角膜基质用去离子水冲洗6次后，在水中透析24h，使用钴60(15KyG)照射灭菌15min，得到改性的脱细胞角膜基质。
将本实施例制备得到的改性脱细胞角膜基质进行如下性能测试：
1化学结构分析
测试方法同实施例1，结果表明精氨酸已接枝到脱细胞角膜基质中。
2力学检测
测试方法同实施例1。实验结果表明在0～100mmHg的压力差范围内，本实施例制备的氨基酸改性后的脱细胞角膜基质面模量可达到847mmHg，而未改性的脱细胞角膜基质面模量为388mmHg。
3生物稳定性
测试方法同实施例1。结果表明，24h后每毫克未改性后的脱细胞角膜基质材料降解产物中羟脯氨酸的浓度为9.11±0.117μg/mL，而每毫克本实施例改性后的脱细胞角膜基质材料降解产物中羟脯氨酸的浓度为3.247±0.0001μg/mL，存在显著性差异，表明本实施例制备的氨基酸改性后的脱细胞角膜基质的稳定性显著提高。
4复水实验
测试方法同实施例1。结果表明，未改性脱细胞角膜基质24h复水后含水率为76％，本实施例得到的改性后脱细胞角膜基质含水率为92％。
5移植效果评估
测试方法同实施例1。组织学检测显示改性脱细胞角膜基质术后4天被DIO标记的种植细胞与周边植床细胞融合良好，术后11天受体基质细胞分泌Ⅲ型胶原修复创面，而未改性的脱细胞角膜基质实现上述效果需要花费56天的时间。
体外透光率检测表明，术后9天，在300-800nm的可见光范围内，本实施例的改性后脱细胞角膜基质与自体角膜比较无明显差异，显示出高度透明，而未改性组的脱细胞角膜基质93天后才有此效果。
实施例6
本实施例的改性脱细胞角膜基质由以下方法制备得到：
(1)脱细胞角膜基质的预处理
取羊脱细胞角膜基质浸入5mL生理盐水中，在4℃冰箱静置过夜，使用眼科钻裁取透明部分，用去离子水冲洗3次，风干，室温下在干燥器中保存备用。
(2)脱细胞角膜基质的接枝改性
将步骤(1)干燥的羊脱细胞角膜基质浸泡在9mL(1g/mL)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PBS(pH＝7.4)溶液中，4℃超声2h(300W，40Hz)。在6mL(5mg/mL)组氨酸的柠檬酸缓冲溶液(pH＝3)中，加入NHS浸泡后的羊脱细胞角膜基质，置于40rad/min的摇床上，37℃下反应24h。
(3)接枝改性后的脱细胞角膜基质的后期处理
将步骤(2)经过接枝改性处理的羊脱细胞角膜基质用去离子水冲洗6次后，在水中透析24h，使用钴60(15KyG)照射灭菌15min，得到改性的脱细胞角膜基质。
将本实施例制备得到的改性脱细胞角膜基质进行如下性能测试：
1化学结构分析
测试方法同实施例1，结果表明组氨酸已接枝到脱细胞角膜基质中。
2力学检测
测试方法同实施例1。实验结果表明在0～100mmHg的压力差范围内，本实施例制备的氨基酸改性后的脱细胞角膜基质面模量可达到821mmHg，而未改性的脱细胞角膜基质面模量为367mmHg。
3生物稳定性
测试方法同实施例1。结果表明，24h后每毫克未改性后的脱细胞角膜基质材料降解产物中羟脯氨酸的浓度为8.83±0.25μg/mL，而每毫克本实施例改性后的脱细胞角膜基质材料降解产物中羟脯氨酸的浓度为2.117±0.0001μg/mL，存在显著性差异，表明本实施例制备的氨基酸改性后的脱细胞角膜基质的稳定性显著提高。
4复水实验
测试方法同实施例1。结果表明，未改性脱细胞角膜基质24h复水后含水率为69％，本实施例得到的改性后脱细胞角膜基质含水率为89.3％。
5移植效果评估
测试方法同实施例1。组织学检测显示改性脱细胞角膜基质术后6天被DIO标记的种植细胞与周边植床细胞融合良好，术后10天受体基质细胞分泌Ⅲ型胶原修复创面，而未改性的脱细胞角膜基质实现上述效果需要花费52天的时间。
体外透光率检测表明，术后10天，在300-800nm的可见光范围内，本实施例的改性后脱细胞角膜基质与自体角膜比较无明显差异，显示出高度透明，而未改性组的脱细胞角膜基质79天后才有此效果。
实施例7
本实施例的改性脱细胞角膜基质由以下方法制备得到：
(1)脱细胞角膜基质的预处理
取捐赠者的脱细胞角膜基质浸入5mL生理盐水中，在4℃冰箱静置过夜，使用眼科钻裁取透明部分，用去离子水冲洗3次后在-20℃冰箱冷冻4h，冷冻干燥，室温下在干燥器中保存备用。
(2)脱细胞角膜基质的接枝改性
将步骤(1)干燥的捐赠者的脱细胞角膜基质浸泡在2mL(0.3g/mL)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的柠檬酸-柠檬酸钠(pH＝4)溶液中，4℃超声2h(300W，40Hz)。在10mL(1g/mL)聚赖氨酸的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液(pH＝6.0)中加入NHS浸泡后的捐赠者的脱细胞角膜基质，4℃超声2h(500W，40Hz)。置于40rad/min的摇床上，25℃下反应24h。
(3)接枝改性后的脱细胞角膜基质的后期处理
将步骤(2)经过接枝改性处理的志愿者的脱细胞脱细胞角膜基质用去离子水冲洗8次后，在水中透析24h，使用钴60(10KyG)照射灭菌15min，得到改性的脱细胞角膜基质。
将本实施例制备得到的改性脱细胞角膜基质进行如下性能测试：
1化学结构分析
测试方法同实施例1，结果表明聚赖氨酸已接枝到脱细胞角膜基质中。
2力学检测
测试方法同实施例1。实验结果表明在0～100mmHg的压力差范围内，本实施例制备的氨基酸改性后的脱细胞角膜基质面模量可达到849mmHg，而未改性的脱细胞角膜基质面模量为421mmHg。
3生物稳定性
测试方法同实施例1。结果表明，24h后每毫克未改性后的脱细胞角膜基质材料降解产物中羟脯氨酸的浓度为9.345±0.113μg/mL，而每毫克本实施例改性后的脱细胞角膜基质材料降解产物中羟脯氨酸的浓度为2.343±0.0001μg/mL，存在显著性差异，表明本实施例制备的氨基酸改性后的脱细胞角膜基质的稳定性显著提高。
4复水实验
测试方法同实施例1。结果表明，未改性脱细胞角膜基质24h复水后含水率为68％，本实施例得到的改性后脱细胞角膜基质含水率为90％。
5移植效果评估
测试方法同实施例1。组织学检测显示改性脱细胞角膜基质术后5天被DIO标记的种植细胞与周边植床细胞融合良好，术后12天受体基质细胞分泌Ⅲ型胶原修复创面，而未改性的脱细胞基质实现上述效果需要花费61天的时间。
体外透光率检测表明，术后10天，在300-800nm的可见光范围内，本实施例的改性后脱细胞角膜基质与自体角膜比较无明显差异，显示出高度透明，而未改性组的脱细胞角膜基质98天后才有此效果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将脱细胞角膜基质预处理；
(2)通过氨基酸与经过预处理的脱细胞角膜基质进行反应，对脱细胞角膜基质进行接枝改性；
(3)将接枝改性后的脱细胞角膜基质进行后期处理，除去接枝改性过程中的残留物质，即得改性的脱细胞角膜基质。
2.根据权利要求1所述的脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸或其衍生物、低聚物或高聚物中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法，其特征在于，步骤(2)中所述氨基酸的浓度为2μg/mL-2g/mL。
4.根据权利要求1所述的脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法，其特征在于，步骤(2)中接枝改性时：先对脱细胞角膜基质和/或氨基酸用活化羧基或氨基的试剂进行活化，再将脱细胞角膜基质与氨基酸进行反应。
5.根据权利要求4所述的脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法，其特征在于，所述活化羧基或氨基的试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和/或N-羟基琥珀酰亚胺。
6.根据权利要求4所述的脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法，其特征在于，将脱细胞角膜基质进行活化时的pH为4-8，将氨基酸进行活化时的pH为6-9，所述活化在超声波或微波的条件下进行。
7.根据权利要求1-6任一项所述的脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法，其特征在于，步骤(2)中的反应在温度为0-65℃，pH为2.5-9的条件下进行；和/或步骤(2)中的反应在光催化、微波或超声波的条件下进行。
8.根据权利要求1-6任一项所述的脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的预处理包括如下的步骤A，或步骤A和步骤B，或步骤A～C：
A、使用生理盐水、磷酸盐缓冲溶液或超纯水浸泡脱细胞角膜基质；
B、用去离子水清洗浸泡后的脱细胞角膜基质；
C、风干或冷冻干燥后，在干燥器中保存备用。
9.根据权利要求1-6任一项所述的脱细胞角膜基质复水保水快速复明的方法，其特征在于，步骤(3)所述的后期处理的方法为：将接枝改性后的脱细胞角膜基质用去离子水、生理盐水或磷酸盐缓冲溶液冲洗，再用截留分子量为100～200000Da的透析装置进行透析，透析液为生理盐水、磷酸盐缓冲溶液或超纯水，最后经过灭菌即得。
10.一种改性的脱细胞角膜基质，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的方法制备得到。
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