CN108276484B - 阶梯控温水解制备柞蚕丝素肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种阶梯控温水解制备柞蚕丝素肽的方法,依次按照如下步骤进行:取脱胶后的柞蚕丝与质量浓度85%的磷酸按质量比为1:9~10混合,在10℃~25℃条件下反应3~5天,得溶丝液;将溶丝液在40℃~100℃内的至少三个温度点进行水解反应,三个温度点由低至高且梯度为20~30℃,每个温度点水解反应1~6小时;停止加热,调节酸度为50%后自然降温;脱盐、浓缩及干燥后得柞蚕丝素肽。
Description
技术领域
本发明属于柞蚕丝深加工领域,尤其涉及一种阶梯控温水解制备柞蚕丝素肽的方法。
背景技术
丝素肽是将蚕丝脱胶后进行处理的副产品,具有皮肤保湿、降血压、解酒保肝、抗疲劳及提高免疫力等功能。柞蚕(Antheraepernyi)丝素蛋白属于天然的昆虫大分子蛋白,其氨基酸中丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和酪氨酸含量占90%左右,精氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸还可以形成独特的功能性RGD(Arg-Gly-Asp)三肽序列氨基酸,组成与人体相近,易被吸收利用。但是,柞蚕丝素蛋白主要由疏水性氨基酸组成,丝素分子中含有-NH,-OH,-COOH等官能团,能与其它官能团形成氢键,丝素分子内和分子间通过氢键能形成很强的作用力,并且丝素纤维大分子链间含有二硫键,比桑蚕丝素更难溶解,故现有制备丝素肽大多以桑蚕丝为原料。
目前,已有多种生产丝素肽的方法,但是均存在着不同程度的问题。如中国专利公开号为CN102206695A的发明专利申请,公开了“一种用废蚕丝制备丝短肽及丝氨基酸的方法”,是以废蚕丝为原料,采用蒸汽爆破法进行预处理,再在一定压力下用稀硫酸水解,进行适当脱酸处理后,接着加入酸性蛋白酶水解,然后进行脱色、中和、精制,最后进行真空浓缩及调配得到丝短肽及丝氨基酸,不仅工艺复杂,而且所得到的丝短肽是分子量500~1000Da的纳滤截留液,即分子量大于500~1000Da,分布广不集中,产品功能广泛但针对性差。中国专利公开号为CN105385728A的发明专利申请,公开了“一种联产分子量分布均匀丝素多肽和丝胶多肽及其制备方法”,该方法由清洗、蒸汽膨润、高压脱胶、二次酶解、超滤、膜分离浓缩、干燥等工序组成,工艺复杂且只能得到占比达到80%以上分子量在500~5000Da的丝素多肽或丝胶多肽,产品针对性强,但功能单一。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题,提供一种阶梯控温水解制备柞蚕丝素肽的方法。
本发明的技术解决方案是:一种阶梯控温水解制备柞蚕丝素肽的方法,其特征在于依次按照如下步骤进行:
a. 取脱胶后的柞蚕丝与质量浓度85%的磷酸按质量比为1:9~10混合,在10℃~25℃条件下反应3~5天,得溶丝液;
b. 将溶丝液在40℃~100℃内的至少三个温度点进行水解反应,三个温度点由低至高且梯度为20~30℃,每个温度点水解反应1~6小时;
c. 停止加热,调节酸度为50%后自然降温;
d. 脱盐、浓缩及干燥后得柞蚕丝素肽。
所述b步骤为三个温度点,分别为40℃、60℃、90℃,每个温度点对应水解反应时间分别为4小时、4小时、6小时。
所述b步骤为四个温度点,分别为40℃、60℃、90℃、100℃,每个温度点对应水解反应时间分别为4小时、4小时、3小时、2小时,90℃水解反应后将酸度调至80%。
所述b步骤为三个温度点,分别为40℃、60℃、90℃,每个温度点对应水解反应时间分别为4小时、4小时、3小时,b步骤后加温加压至116℃~124℃、0.08Mpa~0.14 Mpa,水解反应2小时,再进行c步骤。
本发明选择了溶丝的温度及时间,无论长短柞蚕丝都可以一次性加入实现低温均匀溶丝,降低了溶丝成本且可保证后续水解的均一性;生产工艺简单,可操作性强,无需超滤等辅助操作,即可以生产多种分子量分布集中且功能性强的丝素肽产品(保湿、降血糖及降血脂);通过调节酸度、自然降温控制反应温和进行,避免过反应产生氨基酸现象,使目标产品得率达到75%以上。
附图说明
图1是本发明实施例1柞蚕丝素肽1号产品的GPC凝胶色谱分析示意图。
图2是本发明实施例1柞蚕丝素肽1号产品和对照品的保湿性能实验效果图。
图3是本发明实施例2柞蚕丝素肽2号产品的GPC凝胶色谱分析示意图。
图4是本发明实施例2柞蚕丝素肽2号产品产品和对照组的降血糖性能实验效果图。
图5是本发明实施例3柞蚕丝素肽3号产品的GPC凝胶色谱分析示意图。
图6是本发明实施例3柞蚕丝素肽3号产品和对照组的降血脂性能实验效果图。
具体实施方式
实施例1:
a. 取300g脱胶后的柞蚕丝(长丝和3~5cm短丝)与质量浓度85%的磷酸按质量比为1:9混合,在室温(10℃~25℃)条件下反应3天达到透明,即得到溶丝液。
脱胶可以按照现有技术,亦可以采用如下方法:将柞蚕废茧壳用清水清洗过后,在1%碳酸钠溶液中煮沸1 h,脱去丝胶,然后用双氧水60℃漂煮1 h,水洗去蚕丝上附着的碱液和漂洗液,在50℃条件下烘干即可。
不同时间及配比的柞蚕丝酸溶反应状态见表1及表2。
表1:长短柞蚕丝的酸溶状况
表2:不同料液比柞蚕丝在室温下的酸溶状况
b. 将溶丝液在40℃、60℃、90℃三个温度点进行水解反应,40℃水解4小时、60℃水解4小时、90℃水解6小时;
c. 停止加热,加水调节酸度为50%,自然降温至室温,在降温过程中反应结束,避免出现氨基酸等过反应产品;
d. 可按照现在技术,采用氧化钙进行脱盐,利用旋转蒸发仪进行浓缩,之后通过小型喷雾干燥机得到柞蚕丝素肽1号产品。
对比例:
取300g脱胶处理好的柞蚕丝剪成3~5cm,使用85%的磷酸,按1:6的料液比添加柞蚕丝和磷酸,在90℃条件下水解6h,按照实施例1的方法脱盐、浓缩及干燥后得柞蚕丝素肽对照品。
利用GPC色谱法检测本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品和柞蚕丝素肽对照品的分子量分布,色谱条件包括检测器:DAWN HELEOSⅡ18角度激光光散射仪(美国Wyatt公司);色谱柱:Shodex OHpak SB-804 HQ,SB-806 HQ;流动相:0.1 mol/L硝酸钠溶液;流速:1 ml/min;柱温:25℃。
本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品分子量分布如图1所示。
本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品与柞蚕丝素肽对照品的分子量分布结果如表3所示。
表3
结果表明:本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品分子量主要集中在0.1-2.0 kD,占比90%左右,2.0-3.0 kD区间占比约10%;而丝素肽对照品的分子量分布比较分散,0.1-1.0 kD区间占比26.6%,1.0-2.0 kD区间占比20.1%,2.0-3.0 kD区间占比27.5%,3.0-5.0kD区间占比20.8%,5.0-8.0 kD区间占比3.8%,>8.0 kD区间占比1.2%。
本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品和柞蚕丝素肽对照品的保湿性实验:温度为20℃时,在干燥器底部盛装200g经干燥过的变色硅胶,然后放入本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品和柞蚕丝素肽对照品进行保湿试验。每隔12h将结晶皿取出精确称取试样重量,由公式保湿率(%)=Hn/H0×100%,计算样品的保湿率,式中:H0和Hn分别为放置前、后的水分质量。以甘油作为保湿性实验的对照(CON),测定方法同上。对每次保湿实验重复三次,取三次结果的平均值,结果如图2所示。从图2可以看到,本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品在12到48小时的保湿性好于柞蚕丝素肽对照品。
实施例2:
除b 步骤外,其它步骤同实施例1。
b 步骤是将溶丝液在40℃、60℃、90℃及100℃四个温度点进行水解反应,40℃水解4小时、60℃水解4小时、90℃水解3小时,100℃水解2小时,90℃水解反应后将酸度调至80%,即100℃水解是在酸度80%下进行。
d步骤干燥后得到柞蚕丝素肽2号产品。
利用GPC色谱法检测本发明实施例2的柞蚕丝素肽2号产品和柞蚕丝素肽对照品的分子量分布,色谱条件同实施例1。
本发明实施例2的柞蚕丝素肽2号产品分子量分布如图3所示。
本发明实施例2的柞蚕丝素肽2号产品与柞蚕丝素肽对照品的分子量分布结果如表4所示。
表4
结果表明:本发明实施例2的柞蚕丝素肽2号产品分子量主要集中在2.0-3.0 kD,占比15.3%,3.0-5.0 kD占比76.5%,5.0-8.0 kD占比8.2%;而柞蚕丝素肽对照品的分子量分布比较分散,0.1-1.0 kD区间占比26.6%,1.0-2.0 kD区间占比20.1%,2.0-3.0 kD区间占比27.5%,3.0-5.0 kD区间占比20.8%,5.0-8.0 kD区间占比3.8%,>8.0 kD区间占比1.2%。
本发明实施例2柞蚕丝素肽2号产品降血糖功能实验:选取清洁级(SPF)昆明种小鼠(大连医科大学动物中心,动物繁殖的合格证号(SCXK(辽)2008-0002)),♀、♂各半,适应性喂养1个星期,随机取10只作为正常对照(CON),其余小鼠以四氧嘧啶诱导制作糖尿病模型。以空腹血糖水平≥11.0mmol/L和≤30.0 mmol/L作为造模成功的标准,将造模成功的模型中选取30只小鼠用于实验,血糖未达标准者剔除。按血糖值、体质量随机分成3组:模型对照组(MOL),柞蚕丝素肽2号产品组和柞蚕丝素肽对照品组。正常对照组和模型组每天灌服蒸馏水,柞蚕丝素肽2号产品组和柞蚕丝素肽对照品组每天灌服4g/kg,连续给药20d。柞蚕丝素肽2号产品组和柞蚕丝素肽对照品组在实验期间,在第0d、7d、14d分别于尾部采血测量空腹血糖(FBG),每次测血糖前禁食4h,结果如图4所示。从图4的降血糖实验可以看到,与模型组(MOL)相比,柞蚕丝素肽2号产品组在7-14d的降血糖效果显著,柞蚕丝素肽对照品组虽然也有降血糖作用,但效果不显著。
实施例3:
步骤基本同实施例1,b步骤亦为三个温度点,分别为40℃、60℃、90℃,区别是每个温度点对应水解反应时间分别为4小时、4小时、3小时,b步骤后加温加压至116℃~124℃、0.08Mpa~0.14 Mpa,水解反应2小时,再进行c步骤。
d步骤干燥后得到柞蚕丝素肽3号产品。
利用GPC色谱法检测本发明实施例3的柞蚕丝素肽3号产品和柞蚕丝素肽对照品的分子量分布,色谱条件同实施例1。
本发明实施例3的柞蚕丝素肽3号产品分子量分布如图5所示。
本发明实施例3的柞蚕丝素肽3号产品与柞蚕丝素肽对照品的分子量分布结果如表5所示。
表5
结果表明:本发明实施例3的柞蚕丝素肽3号产品分子量主要集中在主要集中在1.0-2.0 kD,占比89.7%,2.0-3.0 kD占比9.1%,3.0-5.0 kD占比1.2%;而柞蚕丝素肽对照品的分子量分布比较分散,0.1-1.0 kD区间占比26.6%,1.0-2.0 kD区间占比20.1%,2.0-3.0kD区间占比27.5%,3.0-5.0 kD区间占比20.8%,5.0-8.0 kD区间占比3.8%,>8.0 kD区间占比1.2%。
本发明实施例3柞蚕丝素肽3号产品降血糖功能实验:选取清洁级(SPF)昆明种小鼠(大连医科大学动物中心,动物繁殖的合格证号(SCXK(辽)2008-0002)),♀、♂各半,适应性喂养1个星期,随机取10只作为正常对照(CON),灌胃生理盐水,其余小鼠灌胃60°白酒(15mL/kg/d)制作酒精性脂肪肝模型。按体质量随机分成3组:模型对照组(MOL),柞蚕丝素肽3号组和柞蚕丝素肽对照组每日灌胃4g/kg柞蚕丝素肽。连续给药4周后,禁食(自由饮水)12h,眼眶取血,分离血清,待自然凝聚后,2-8℃,1000g离心l0min,取上清液冻存,留作血脂生化指标(TC,TG,LDLC,HDLC)的检测,按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书操作,制备空白管、标准管和测定管;充分混匀后,于37℃保温5min;于500nm处,lcm光径,空白管调零,测各管吸光度值;记录各管OD值,按公式计算TC含量,以mmol/L表示,结果如图6。从图6可以看出,与模型组(MOL)相比,本发明实施例柞蚕丝素肽3号产品能够降低血脂各项指标的水平并能显著降低TG和LDLC水平,而柞蚕丝素肽对照品虽也有降血脂作用,但只有降低TG水平具有显著性。
Claims (1)
1.一种阶梯控温水解制备柞蚕丝素肽的方法,其特征在于依次按照如下步骤进行:
a. 取脱胶后的柞蚕丝与质量浓度85%的磷酸按质量比为1:9~10混合,在10℃~25℃条件下反应3~5天,得溶丝液;
b. 将溶丝液在40℃~100℃内的至少三个温度点进行水解反应,三个温度点由低至高且梯度为20~30℃,每个温度点水解反应1~6小时;
c. 停止加热,调节酸度为50%后自然降温;
d. 脱盐、浓缩及干燥后得柞蚕丝素肽;
所述b步骤为三个温度点,分别为40℃、60℃、90℃,每个温度点对应水解反应时间分别为4小时、4小时、6小时;
或者所述b步骤为四个温度点,分别为40℃、60℃、90℃、100℃,每个温度点对应水解反应时间分别为4小时、4小时、3小时、2小时,90℃水解反应后将酸度调至80%;
或者所述b步骤为三个温度点,分别为40℃、60℃、90℃,每个温度点对应水解反应时间分别为4小时、4小时、3小时,b步骤后加温加压至116℃~124℃、0.08Mpa~0.14 Mpa,水解反应2小时,再进行c步骤。
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