KR20230046507A - 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔, 그의 제조방법 및 이를 사용한 살균 방법 - Google Patents
캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔, 그의 제조방법 및 이를 사용한 살균 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔, 그의 제조방법 및 이를 사용한 살균 방법에 관한 것이며, 구체적으로는 실리콘에 기반한 Ni 복합 나노플라워(Si-based composite nanoflower)를 제조하여 주사 가능한(injectable) 형태로 제조하는 단계에 의하여 제조된 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔, 그의 제조방법 및 이를 사용한 살균 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔, 그의 제조방법 및 이를 사용한 살균 방법에 관한 것이며, 구체적으로는 실리콘에 기반한 Ni 복합 나노플라워(Si-based composite nanoflower)를 제조하여 주사 가능한(injectable) 형태로 제조하는 단계에 의하여 제조된 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔, 그의 제조방법 및 이를 사용한 살균 방법에 관한 것이다.
박테리아 감염은 오늘날 가장 큰 세계적인 공중 보건 문제 중 하나이다. 특히 상처 드레싱, 카테터, 관절 임플란트 및 콘택트 렌즈와 같은 생체 재료 및 의료 제품의 급속한 발전으로 인해 의료 관련 감염(HAI)은 임상의들의 심각한 문제로 간주되었다. 세균 감염에 대한 현재 치료법은 주로 다양한 항생제의 사용에 의존한다. 그러나, 항생제의 사용으로 인해 세균의 다약제 내성이 심각해지고 치료효과가 급격히 감소하게 되었다. 따라서, 세균의 약제 내성 위험을 감소시키고 약제를 조절 및 연장할 수 있고 항생제의 독성을 조절할 수 있는 효율적이고 안전한 약제 전달 시스템이 요구되고 있다. 최근에는 은(Ag), 금(Au), 구리(Cu), 산화구리(CuO), 산화아연(ZnO), 이산화티타늄(TiO2), 산화니켈(NiO)과 같은 다양한 금속 및 금속 산화물이 높은 표면/부피 비율과 양의 표면 전하로 인해 항균 응용 분야에 사용되었다. 더욱 최근에는 Si 기반의 나노복합물이 높은 이론적 비표면적과 크기 및 모양의 용이한 조정과 같은 바람직한 특성으로 인해 주목을 받았다. 특히, 이러한 나노 지지체에 금속 나노입자를 감싸는 것은 에너지 관련 및 의약 응용을 위한 새로운 기술로 시도된 코어-쉘(core-shell) 및 난황-쉘(yolk-shell) 구조의 개발로 이어졌다. 높은 표면적 때문에 나노플라워와 같은 코어-쉘(core-shell) 구조는 구형 또는 막대 구조보다 더 나은 항균 활성을 제공한다. 그러나, 이러한 물질은 병원성 미생물뿐만 아니라 인체의 정상 세포도 억제하고 죽일 수 있어 잠재적인 적용이 제한된다. 따라서, 부작용을 감소시킬 뿐만 아니라 표적 부위 근처에 약물을 방출함으로써 약물의 효능을 증가시킬 수 있는 강력한 전달 시스템에 대한 요구가 있다.
다량의 물과 가교된 폴리머 네트워크로 구성된 하이드로겔은 약물 전달 시스템의 매력적인 유형의 재료이다. 하이드로겔은 다양한 조직의 세포외 기질과 물리적, 생물학적 유사성을 제공하며 수분 함량이 높고 생체적합성이 우수하며 친수성 약물을 쉽게 캡슐화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 하이드로겔을 주사 가능하게 만들 수 있다면, 침습적 수술 없이 표적 부위에 간단히 적용할 수 있다. 특히, 화학물질, 온도, pH 또는 빛 자극에 반응하여 현장 겔 형성 능력을 가진 주사 가능한 하이드로겔은 침습적 수술 없이 표적 부위에 적용할 수 있다. 주사 가능한 하이드로겔은 많은 장점이 있지만, 일정한 단점도 있다. 예를 들어, 대부분의 주사 가능한 하이드로겔은 상당한 겔화 기간이 필요하며, 이는 성능에 부정적인 영향을 미치고 환자에게 통증 및 감염 위험을 초래할 수 있다. 광가교성 하이드로겔의 사용은 이러한 문제 중 일부를 해결하는 데 도움이 될 수 있다. 이러한 광가교성 하이드로겔은 생물학적 조직의 명백한 pH 또는 온도 변화를 피하면서 시공간적으로 제어되는 방식으로 생리학적 조건에서 원하는 위치에서 신속하게 치유될 수 있어 상처 치료 또는 약물 전달 시스템을 위한 현장 주사 가능한 하이드로겔에 이상적이다.
자외선(UV)은 광가교의 일반적인 광원으로 알려져 있다. 그러나, 자외선에 노출되면 세포가 손상되고 세포 기능이 약화될 수 있다. 더욱이, 상업적으로 이용가능한 UV 광개시제인 Irgacure 2959는 낮은 수용해도를 가지고 있다. 대조적으로, 가시광선 광개시제인 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP)는 더 높은 수용해도를 가지며, 더 낮은 광개시제 농도에서 세포 캡슐화를 허용하며, 더 긴 광 파장(405 nm)에서 광중합을 시작하여 Irgacure 2959보다 더 효율적인 중합을 촉진한다. 또한, 가시광선은 자외선에 비해 낮은 에너지로 세포에 손상을 덜 일으키고 더 깊은 곳에서 조직을 침투할 것으로 기대된다. 이러한 유리한 특성으로 인해 가시광선은 최소 침습 절차에 사용되는 현장 주사 가능한 재료를 개발하는 데 적합하다. Yang 등은 베타시클로덱스트린/트리클로산을 함유한 가시광선 경화 메타크릴레이트 콜라겐 하이드로겔을 기반으로 항균 드레싱제를 개발하여 상처 치유 능력을 입증했다. Annabi 등은 임플란트 주위 질환의 치료를 위한 가시광선 가교성 항균 하이드로겔을 조사했다. 이 항균성 하이드로겔은 광가교성 젤라틴 메타크릴로일 하이드로겔에 양이온성 항균성 펩타이드를 결합하여 조작되었으며 임플란트 주변 질병의 발병 기전에 관여하는 그람음성균인 Porphyromonas gingivalis에 대한 항균성을 나타냈다. 문헌 조사에 의하면 금속 산화물 캡슐화된 광가교 항균성 하이드로겔을 조사한 발명는 소수에 불과하다.
참고비특허문헌 1: Zhou, C.; Li, P.; Qi, X.; Sharif, A. R. M.; Poon, Y. F.; Gao, Y.; Chang, M. W.; Leong, S. S. J.; Chan-Park, M. B. A Photopolymerized Antimicrobial Hydrogel Coating Derived from Epsilon-poly-L-lysine. Biomaterials 2011, 32, 2704-2712. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2010.12.040
참고비특허문헌 2: Gao, Q.; Yu, M.; Su, Y.; Xie, M.; Zhao, X.; Lo, P.; Ma, P. X. Rationally Designed Dual Functional Block Copolymers for Bottlebrush-like Coatings: In Vitro and In Vivo Antimicrobial, Antibiofilm, and Antifouling Properties. Acta Biomater. 2017, 51, 112-124. DOI: 10.1016/j.actbio.2017.01.061
참고비특허문헌 3: Su, Y.; Zhi, Z.; Gao, Q.; Xie, M.; Yu, M.; Lei, B.; Li, P.; Ma, P. X. Autoclaving-Derived Surface Coating with In Vitro and In Vivo Antimicrobial and Antibiofilm Efficacies. Adv. Healthcare Mater. 2017, 6, 1601173. DOI: 10.1002/adhm.201601173
참고비특허문헌 4: Zhi, Z.; Su, Y.; Xi, Y.; Tian, L.; Xu, M.; Wang, Q.; Padidan, S.; Li, P.; Huang, W. Dual-Functional Polyethylene Glycol-b-polyhexanide Surface Coating with In Vitro and In Vivo Antimicrobial and Antifouling Activities. ACS Appl. Mater. Interfaces 2017, 9, 10383-10397. DOI: 10.1021/acsami.6b12979
참고비특허문헌 5: Chen, Z.; Wang, Z.; Ren, J.; Qu, X. Enzyme Mimicry for Combating Bacteria and Biofilms. Acc. Chem. Res. 2018, 51, 789-799. DOI: 10.1021/acs.accounts.8b00011
본 발명에서 잠재적인 항균 응용을 위한 주사 가능한 광가교 히알루론산(HA) 하이드로겔을 개발했다. 먼저, 항균 물질로써 NiO 시트(Si@NiO)로 코팅된 Si 입자를 합성했다. 그런 다음, 광가교 과정을 통해 HA 하이드로겔에 Si@NiO를 캡슐화했다. 항균성 하이드로겔의 항균성 및 시험관 내 생체 적합성뿐만 아니라 화학적 조성, 기계적 특성, 팽윤 거동, 생분해성, 금속 이온 방출 프로파일을 확인했다. 구체적으로, Si@NiO-하이드로겔은 세 가지 박테리아 균주(녹농균, 폐렴간균 및 메티실린 내성 황색포도구균(>99.9% 살균율))에 대해 우수한 항균 특성을 나타내고 쥐 배아 섬유아세포에 대해서는 무시할 수 있는 정도의 세포 독성을 나타냈다. 따라서, Si@NiO-하이드로겔은 주사성, 가시광선 가교성, 분해성, 생체 안전성 및 우수한 항균성으로 인해 향후 조직 공학 및 생물 의학 응용 분야에서 사용될 가능성이 있다.
본 발명의 일 실시형태인 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔은 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 Si@NiO-하이드로겔 복합체이다.
상기 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 PBS에서 팽윤시킨 후, 상기 Si@NiO-하이드로겔을 총 폴리머 농도가 3%(w/v)에서 7%(w/v)로 증가했을 때, 0.47 ± 0.15kPa에서 3.88 ± 0.51kPa로 증가된 저장 모듈러스를 나타내고, ESR 은 39.6 ± 3.6에서 22.4 ± 0.8로 감소한다.
본 발명의 일 실시형태인 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔의 제조방법은 실리콘에 기반한 Ni 복합 나노플라워(Si-based composite nanoflower)를 제조하는 제1 단계; 상기 제1 단계에서 제조된 실리콘에 기반한 Ni 복합 나노플라워를 주사 가능한(injectable) 형태로 제조하는 제2 단계;를 포함한다.
여기서, 상기 제1 단계의 실리콘에 기반한 Ni 복합 나노플라워를 제조하는 단계는, 플라즈마 합성된 Si 나노입자를 물과 에탄올을 함유하는 용매에 혼합하는 제1-1 공정; 상기 제1-1 공정 후의 혼합물을 초음파 처리하여 제1 용액을 얻는 제1-2 공정; Ni(CH3COO)2·4H2O 및 과산화이황산칼륨을 물 및 에탄올을 포함하는 용매에 혼합하여 제2 용액을 얻는 제1-3 공정; 상기 제1 용액을 100rpm 내지 300rpm의 마그네틱 교반 하에서 상기 제2 용액을 혼합하여 제3 용액을 얻는 제1-4 공정; NH3·H2O를 탈이온수에 질량비로 1: 30 내지 100의 비율에서 희석하고, 상기 제3 용액에 적가하고, 30분 내지 40분 교반하는 제1-5 공정; 상기 제1-5 공정 후의 침전물에 부착된 SO4 2-, K+, Ni2+, CH3COO- 에서 선택되는 1종 및 2종 이상의 군에서 선택되는 흡착 이온을 제거하기 위하여 탈이온수로 세척하는 제1-6 공정; 상기 제1-6 공정에서 세척된 침전물을 50℃ 내지 70℃의 온도로 5시간 내지 7시간 건조하여 갈색의 Si@NiOOH 나노입자를 얻는 제1-7 공정;을 포함한다.
상기 제1-1 공정에서, 플라즈마 합성된 Si 나노입자 10mg 내지 30mg을 물 3mL 내지 5mL, 에탄올 1mL 내지 3mL을 함유하는 용매, 바람직하게는 플라즈마 합성된 Si 나노입자 15mg 내지 25mg을 물 3.5mL 내지 4.5mL, 에탄올 1.5mL 내지 2.5mL을 함유하는 용매에 혼합한다.
상기 제1-3 공정에서, Ni(CH3COO)2·4H2O 0.1g 내지 0.5g 및 과산화이황산칼륨 0.01g 내지 0.8g을 물 3mL 내지 5mL 및 에탄올 1mL 내지 3mL을 포함하는 용매에 혼합하여 제2 용액을 얻을 수 있다.
특히, 상기 제1-7 공정에서 건조하는 공정을 완료한 갈색의 Si@NiOOH 나노입자를 Ar 분위기에서 1℃ 내지 3℃·min-1의 가열 속도로 340℃ 내지 360℃까지 온도를 증가시키면서 NiO 코팅된 Si 나노입자인 Si@NiO 나노입자를 제조하는 제1-8 공정;을 더욱 포함한다.
한편, 상기 제2 단계의 주사 가능한(injectable) 형태로 제조하는 단계는, HA(Hyaluronic acid)-MA(Methacrylic anhydride) 합성물을 제조하는 제2-1 공정; 상기 HA-MA 합성물을 사용하여 Si@NiO가 혼합된 고분자 전구체 용액을 제조하는 제2-2 공정; 상기 Si@NiO가 혼합된 고분자 전구체 용액을 사용하여 광가교가 가능하고 주사가 가능한 Si@NiO-하이드로겔을 제조하는 제2-3 공정;을 포함한다.
또한, 상기 HA(Hyaluronate)-MA(Methacrylic anhydride) 합성물을 제조하는 제2-1 공정은, 소듐 HA(sodium Hyaluronate)을 탈이온수에 용해하는 제2-1-1 공정; 상기 탈이온수에 용해된 소듐 HA에 MA(Methacrylic anhydride)를 첨가하고 얼음배스(ice bath)에 10시간 내지 12시간 반응시키는 제2-1-2 공정; 상기 제2-1-2 공정 후의 HA-MA 생성물을 무수에탄올에 침전하는 제2-1-3 공정; 상기 무수에탄올에 침전된 HA-MA 생성물을 3℃ 내지 4℃에서 4,000rpm 내지 6,000rpm 에서 4분 내지 6분간 원심분리하는 제2-1-4 공정; 상기 제2-1-4 공정에서 원심분리 후, 상층액을 제거하고 침전물을 탈이온수로 재용해 하는 제2-1-5 공정; 상기 제2-1-5 공정에서 탈이온수로 재용해된 침전물에서 미반응 시약을 제거하기 위하여 투석 백을 사용하여 3일 내지 4일 투석하는 제2-1-6 공정; 상기 제2-1-6 공정에서 투석된 침전물을 동결 건조하고 -30℃ 내지 -20℃에서 HA-MA 합성물을 보관하는 제2-1-7 공정;을 포함한다.
또한, 상기 제2-1-2 공정에서 소듐 HA에 MA를 첨가한 후, pH의 값을 8 내지 10으로 유지하기 위하여 NaOH를 1N 또는 5N을 혼합한다.
또한, 상기 HA-MA 합성물을 사용하여 Si@NiO가 혼합된 고분자 전구체 용액을 제조하는 제2-2 공정은, 4-Arm폴리(에틸렌 글리콜)티올(PEG4SH) 및 HA-MA 합성물을 0.01M 내지 0.05M의 pH 7.2 내지 pH 7.5의 인산 완충 식염수에 용해시켜 고분자 용액을 얻는 제2-2-1 공정; 3mM 내지 6mM의 리튬페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트를 상기 고분자 용액에 혼합하는 제2-2-2 공정; NaOH 또는 HCl을 사용하여 상기 제2-2-2 공정의 고분자 용액의 pH를 8.0 내지 8.5로 조절하는 제2-2-3 공정; 상기 Si@NiO 나노입자를 상기 pH가 조절된 고분자 용액에 혼합하여 Si@NiO가 혼합된 고분자 전구체 용액을 제조하는 제2-2-4 공정;을 포함한다.
나아가, 상기 광가교가 가능하고 주사가 가능한 Si@NiO-하이드로겔을 제조하는 제2-3 공정은, 상기 Si@NiO가 혼합된 고분자 전구체 용액을 원통형 PDMS 웰에 주입하는 제2-3-1 공정; 상기 상기 Si@NiO가 혼합된 고분자 전구체 용액에 100mW·cm-2 내지 300mW·cm-2에서 1분 내지 3분 동안 400nm 내지 500nm의 광을 조사하는 제2-3-2 공정;을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)을 살균하는 방법은 농도가 150 ㎍/mL 내지 250 ㎍/mL 인 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔을 사용하여 하기 화학식으로 정의되는 살균율에서 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)을 99%이상 살균한다.
(여기서, 살균율(bactericidal rate)에서, A는 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 갖지 않는 경우의 박테리아가 배양된 CFU, B는 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 갖지 않는 경우의 박테리아가 배양된 CFU를 나타낸다)
본 발명의 일 실시형태인 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus, MRSA)을 살균하는 방법은 농도가 150 ㎍/mL 내지 250 ㎍/mL 인 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔을 사용하여 하기 화학식으로 정의되는 살균율에서 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus, MRSA)을을 99%이상 살균한다.
(여기서, 살균율(bactericidal rate)에서, A는 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 갖지 않는 경우의 박테리아가 배양된 CFU, B는 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 갖지 않는 경우의 박테리아가 배양된 CFU를 나타낸다)
본 발명의 일 실시형태인 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)을 살균하는 방법은 농도가 150 ㎍/mL 내지 250 ㎍/mL 인 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔을 사용하여 하기 화학식으로 정의되는 살균율에서 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)을 99%이상 살균한다.
(여기서, 살균율(bactericidal rate)에서, A는 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 갖지 않는 경우의 박테리아가 배양된 CFU, B는 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 갖지 않는 경우의 박테리아가 배양된 CFU를 나타낸다)
본 발명의 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔, 그의 제조방법 및 이를 사용한 살균 방법에 의하면, 녹농균, 폐렴간균 및 메티실린 내성 황색포도구균에 대해 매우 향상된 항균 특성을 나타내고 쥐 배아 섬유아세포에 대해서는 무시할 수 있는 정도의 세포 독성을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔, 그의 제조방법 및 이를 사용한 살균 방법에 의하면, 주사성, 가시광선 가교성, 분해성, 생체 안전성 및 우수한 항균성으로 인해 향후 조직 공학 및 생물 의학 응용 분야에서 사용될 가능성이 있다.
도 1(A)는 실리콘(Si) 나노입자와 Ni(II) 아세테이트(Ni(CH3COO)2)를 사용하여 제조된 Si@NiO의 개략도이며, 도 1(B)는 Si(왼쪽) 및 Si@NiO(오른쪽)의 SEM(상단 행) 및 TEM(하단 행) 이미지이다.
도 2(A)는 HA와 MA 사이의 에스테르 교환 반응을 통한 HA-MA 합성을 나타내며, 도 2(B) HA-MA의 H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3(A)는 5 mM LAP의 흡수 스펙트럼을 나타내며, 도 3(B)는 LAP 존재 하에서의 메타크릴화된 HA와 혼합된 PEG4SH를 나타내며, 도 3(C)는 Si@NiO 혼합 폴리머 용액을 주사기로 옮기고 PDMS 몰드에 피하 주입하는 것을 나타낸다.
도 4(A)는 대조군 하이드로겔, Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔의 PXRD 패턴을 나타내며, 도 4(B)는 FT-IR 스펙트럼을 나타내며, 도 4(C)는 TGA 프로파일을 나타내며, 도 4(D)는 대조군 하이드로겔과 Si@NiO-하이드로겔의 SEM 이미지를 나타낸다.
도 5(A)는 팽윤된 상태의 저장 모듈러스를 나타내며, 도 5(B)는 다양한 농도의 대조용 하이드로겔 및 Si@NiO-하이드로겔용 ESR을 나타내며, 도 5(C)는 대조군 하이드로겔과 Si@NiO-하이드로겔의 48시간 팽창 전후 사진(스케일 바: 5mm)을 나타낸다.
도 6은 10, 50, 100 및 500IU·mL-1의 HAse 농도에서 대조군 하이드로겔 및 Si@NiO-하이드로겔의 효소 분해성을 나타낸다.
도 7(A)는 10, 50, 100 및 500IU·mL-1 히알루로니다제에 의한 대조군 하이드로겔의 효소 분해를 나타내며, 도 7(B)는 10, 50, 100 및 500IU·mL-1 히알루로니다제에 의한 Si@NiO-하이드로겔의 효소 분해를 나타낸다.
도 8은 1mL PBS에서 400μg의 Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔에서 방출된 Ni 이온의 농도를 나타낸다.
도 9(A)는 대조군 하이드로겔과 비교하여 24시간 배양 후 다양한 조건에서 성장한 박테리아의 대표적인 이미지를 나타내며, 도 9(B)는 녹농균, 폐렴간균 및 메티실린 내성 황색포도구균에 대한 하이드로겔, Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔의 항균 효율을 나타낸다.
도 10(A)는 1일 및 3일 동안 대조군 하이드로겔, Si@NiO 또는 Si@NiO-하이드로겔과 접촉한 후 MEF의 live/dead 염색 이미지를 나타내며, 도 10(B)는 MED에 대한 대조군 하이드로겔, Si@NiO 또는 Si@NiO-하이드로겔의 추출물 용액의 시험관내 세포독성(스케일 바: 200mm)을 나타낸다.
도 11은 P. aeruginosa, K. pneumoniae, and MRSA에 대하여 대조군 하이드로겔, Si@NiO 또는 Si@NiO-하이드로겔의 항균 활동을 나타낸다.
도 2(A)는 HA와 MA 사이의 에스테르 교환 반응을 통한 HA-MA 합성을 나타내며, 도 2(B) HA-MA의 H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3(A)는 5 mM LAP의 흡수 스펙트럼을 나타내며, 도 3(B)는 LAP 존재 하에서의 메타크릴화된 HA와 혼합된 PEG4SH를 나타내며, 도 3(C)는 Si@NiO 혼합 폴리머 용액을 주사기로 옮기고 PDMS 몰드에 피하 주입하는 것을 나타낸다.
도 4(A)는 대조군 하이드로겔, Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔의 PXRD 패턴을 나타내며, 도 4(B)는 FT-IR 스펙트럼을 나타내며, 도 4(C)는 TGA 프로파일을 나타내며, 도 4(D)는 대조군 하이드로겔과 Si@NiO-하이드로겔의 SEM 이미지를 나타낸다.
도 5(A)는 팽윤된 상태의 저장 모듈러스를 나타내며, 도 5(B)는 다양한 농도의 대조용 하이드로겔 및 Si@NiO-하이드로겔용 ESR을 나타내며, 도 5(C)는 대조군 하이드로겔과 Si@NiO-하이드로겔의 48시간 팽창 전후 사진(스케일 바: 5mm)을 나타낸다.
도 6은 10, 50, 100 및 500IU·mL-1의 HAse 농도에서 대조군 하이드로겔 및 Si@NiO-하이드로겔의 효소 분해성을 나타낸다.
도 7(A)는 10, 50, 100 및 500IU·mL-1 히알루로니다제에 의한 대조군 하이드로겔의 효소 분해를 나타내며, 도 7(B)는 10, 50, 100 및 500IU·mL-1 히알루로니다제에 의한 Si@NiO-하이드로겔의 효소 분해를 나타낸다.
도 8은 1mL PBS에서 400μg의 Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔에서 방출된 Ni 이온의 농도를 나타낸다.
도 9(A)는 대조군 하이드로겔과 비교하여 24시간 배양 후 다양한 조건에서 성장한 박테리아의 대표적인 이미지를 나타내며, 도 9(B)는 녹농균, 폐렴간균 및 메티실린 내성 황색포도구균에 대한 하이드로겔, Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔의 항균 효율을 나타낸다.
도 10(A)는 1일 및 3일 동안 대조군 하이드로겔, Si@NiO 또는 Si@NiO-하이드로겔과 접촉한 후 MEF의 live/dead 염색 이미지를 나타내며, 도 10(B)는 MED에 대한 대조군 하이드로겔, Si@NiO 또는 Si@NiO-하이드로겔의 추출물 용액의 시험관내 세포독성(스케일 바: 200mm)을 나타낸다.
도 11은 P. aeruginosa, K. pneumoniae, and MRSA에 대하여 대조군 하이드로겔, Si@NiO 또는 Si@NiO-하이드로겔의 항균 활동을 나타낸다.
하기에 나타난 도면에서 동일한 참조부호는 동일한 구성요소를 지칭하며, 도면상에서 각 구성요소의 크기는 설명의 명료성과 편의상 과장되어 있을 수 있다. 한편, 이하에 설명되는 실시예는 단지 예시적인 것에 불과하며, 이러한 실시예로부터 다양한 변형이 가능하다. 이하에서, 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
1. 재료와 방법
1.1. 재료
소듐 히알루로네이트(Mw: 40 kDa)은 Bloomage Freda Biopharm Co., Ltd.(Jinan, China)에서 구입했다. 4-Arm 폴리(에틸렌 글리콜) 티올(PEG4SH; Mw: 10 kDa)은 Sunbio Inc.(Anyang, Korea)에서 구입했다. 메타크릴산 무수물(MA), 중수소 산화물(D2O), 소 고환의 히알루로니다제(HAse), 에틸 알코올(200 프루프, ≥99.5%), 플라즈마 합성 실리콘 나노입자(20 mg, 입자 크기: 50-100 nm, 순도: 99%), 니켈(II) 아세테이트(Ni(CH3COO)2·4H2O) 및 과산화이황산칼륨(K2S2O8)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. LAP는 Cellink Life Sciences(Boston, MA, USA)에서 입수했다. 투석막은 Spectrum Laboratories(Rancho Dominguez, CA, USA)에서 구입했다. 폴리디메틸실록산(PDMS, SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트)은 Dow Corning(Midland, MI, USA)에서 구입했다. Dulbecco의 modified eagle medium(DMEM), 소 태아 혈청(FBS), 페니실린/스트렙토마이신 및 콜라겐 I(쥐 꼬리)는 Gibco(Grand Island, NY, USA)에서 구입했다. MTS 분석 키트(세포 증식)는 Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 구입했다. 일회용 플라스틱 주사기, 쥐 배아 섬유아세포(MEF) 및 LIVE/DEAD 분석 키트는 ThermoFisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입했다.
1.2. Si 기반의 Ni 복합 나노플라워(Si@NiO)의 제조
Si@NiO는 화학조 증착(CBD)에 의해 합성되었다. 플라즈마 합성 실리콘 나노입자(20mg)를 물(4mL)과 에탄올(2mL)의 혼합물이 포함된 비커에 분산시키고 2시간 동안 초음파 처리했다(용액 1). Ni(CH3COO)2·4H2O(0.25g) 및 과산화이황산칼륨(0.05g)을 물(4mL) 및 에탄올(2mL)을 포함하는 다른 비커에 용해시켰다(용액 2). 용액 1을 200rpm에서 자기 교반 하에 용액 2와 혼합하였다(용액 3). NH3·H2O(28-37%, 0.2mL)를 탈이온수(10mL)에 희석하고, 희석된 용액을 용액 3에 교반하면서 적가(1 drop·s-1)하였다. 황색을 띤 용액은 몇 분 후에 천천히 어두워졌다. 반응은 NH3·H2O 첨가 후 30분 동안 계속되었고 침전물은 다른 흡착 이온(SO4 2-, K+, Ni2+, CH3COO- 등)을 제거하기 위해 다량의 탈이온수로 세척되었다. 갈색 Si@NiOOH 나노플라워를 얻었고, 이는 60℃의 오븐에서 6시간 동안 건조되었다. 건조된 Si@NiOOH는 주변 온도로 자연 냉각하기 전에 온도 제어 프로그램을 이용하여 아르곤 흐름과 함께 2℃·min-1의 가열 속도로 350℃까지 온도를 증가시키면서 관로에서 전자를 가열함으로써 NiO 코팅된 Si(Si@NiO)로 변형되었다.
1.3. 주사 가능한 Si@NiO-하이드로겔의 제조
(1단계 : HA-MA 합성)
광중합을 실현하기 위해 광반응기를 도입하여 변형된 HA를 설계하고 합성했다. 간단히 하자면, 소듐 히알루로네이트(200mg)을 탈이온수(20mL)에 용해했다. 용해 후, 5배 몰 과량의 MA를 천천히 첨가하였다. 반응은 얼음 배스에서 12시간 동안 진행하였으며, 1N 또는 5N NaOH를 첨가하여 pH 값을 8~10으로 유지하였다. 최종 생성물(HA-MA)을 5배 과량의 차가운 무수 에탄올에 침전시켰다. 4℃에서 5000rpm으로 5분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 침전물을 탈이온수(20mL)에 재용해했다. 미반응 시약을 제거하기 위해 용액을 투석 백(Mw cut-off: 3.5 kDa)에 넣고 3일 동안 투석하였다. 생성된 용액을 3일 동안 동결 건조(Sentry 2.0, SP Scientific, Warminster, PA, USA)하고 나중에 사용하기 위해 -20℃에서 보관했다. 메타크릴레이트의 정도는 400MHz 분광계(JEOL RESONANCE ECZ 400S, JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하여 D2O에서 H 핵 자기 공명(NMR) 분광법으로 특성화했다.
(2단계 : Si@NiO 혼합 고분자 전구체 용액의 제조)
항균 Si@NiO-하이드로겔을 제조하기 위해 광가교를 위한 전구체 용액을 다음과 같이 제조하였다. 먼저, PEG4SH 및 HA-MA(1:1 몰비의 티올/아크릴레이트)를 0.01M 인산완충식염수(PBS, pH: 7.4)에 순차적으로 용해시켰다. LAP(100mM)의 다른 용액도 증류수에서 준비됐다. 다음으로, 이 고분자 용액에 최종 농도가 5mM인 LAP를 첨가하고, 1N NaOH 또는 HCl을 이용하여 고분자 용액의 pH를 8.0으로 조절하였다. 가교 전에 Si@NiO 나노플라워(0.2%(w/v))를 상기 고분자 용액과 더 혼합하였다. 그런 다음, 혼합 용액을 플라스틱 주사기에 넣고 25 게이지 바늘을 통해 흐르게 하였다.
(3단계 : 광가교가 가능하고 주사가 가능한 Si@NiO-하이드로겔의 제조)
원통형 PDMS 웰을 만들기 위해 PDMS 베이스와 경화제를 10:1 비율로 혼합하고 혼합물을 15cm 페트리 접시에 부었다. 접시를 진공 데시케이터에 30분 동안 놓아 기포를 모두 제거한 후 PDMS를 80℃ 대류 오븐에서 2시간 동안 굽는다. PDMS를 페트리 접시에서 벗겨낸 다음 스테인레스강 펀치(직경: 1.2cm)를 사용하여 펀칭했다. PDMS 조각은 산소 플라즈마 처리(G-500 플라즈마 세척 시스템, Yield Engineering Systems, Livermore, CA, USA) 후 유리 슬라이드에 결합되었다. Si@NiO 혼합 폴리머 용액을 1.2cm 원통형 PDMS 웰에 주입하였다. 그런 다음 웰은 200mW·cm-2에서 1분 동안 400-500nm 대역 통과 필터를 사용하는 OmniCure S2000 Spot UV 경화 시스템(Excelitas Technologies, Waltham, MA, USA)을 사용하여 청색광에 노출되었다. 명확성을 위해 Si@NiO가 포함된 하이드로겔 및 Si@NiO가 없는 하이드로겔은 각각 Si@NiO-하이드로겔 및 대조군 하이드로겔로 표시된다.
1.4. Si@NiO의 특성
Si 나노입자와 Si@NiO 나노플라워의 형태는 10kV의 가속 전압에서 주사 전자 현미경(SEM; Hitachi SU8230, Hitachi High-Tec, Tokyo, Japan)과 120kV에서 투과 전자 현미경(TEM; Tecnai G2 F20 TWIN TMP, FEI, Hillsboro, OR, USA) )에 의해 특성화되었다.
1.5. Si@NiO-하이드로겔의 특성
Si@NiO, Si@NiO-하이드로겔 및 대조군 하이드로겔의 분말 X선 회절(PXRD) 패턴은 Cu Kα 방사선 및 40kV 및 30mA에서 작동되는 Ni 필터가 있는 회절계를 사용하여 기록되었다(SmartLab, Rigaku, Tokyo, Japan). 회절계의 X선 튜브는 40kV 및 30mA에서 4°/min의 스캔 속도 및 0.02°의 간격으로 작동되었다. 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR) 스펙트럼은 KBr 펠릿이 있는 Bio-Rad사의 FTS 135 분광계(Hercules, CA, USA)에 기록되었다. 열적 특성은 열중량 분석기(TGA; TG 209 F3 Tarsus, NETZSCH, Selb, Germany)를 사용하여 평가되었다. 유변학적 측정을 위해 Si@NiO-하이드로겔과 대조군 하이드로겔은 광가교 공정을 통해 실린더 모양의 PDMS 몰드(직경: 1.2 cm, 깊이: 1 mm)에서 제조되었다.
형성된 하이드로겔을 몰드에서 제거하고 오비탈 쉐이커에서 37℃에서 2일 동안 0.01M PBS(pH: 7.4)로 팽윤되도록 하였다. 유량계(Discovery HR 10, TA Instruments, New Castle, DE, USA)를 사용하여 주파수 스윕 테스트(0.01 ~ 100rad·s-1)를 25℃에서 1%의 일정한 변형률로 수행했다. 두 개의 하이드로겔 샘플은 광학 현미경(Stemi DV4 Stereomicroscope, Carl Zeiss, NJ, USA)에 의해 팽윤 과정 전후에 이미지화되었다. Si@NiO-하이드로겔과 대조군 하이드로겔의 수분 흡수 능력을 결정하기 위해 팽윤 특성을 조사하였다. 완전히 팽윤된 원통형 하이드로겔을 PBS 용액에서 꺼내고 여과지로 부드럽게 닦아 과잉 표면수를 제거하고 즉시 무게를 잰다(이 무게는 Ws로 표시됨). 그런 다음, 하이드로겔을 -80℃에서 동결한 후 24시간 동안 동결건조시켰다. 다음으로, 건조 상태에서의 중량을 측정하였다(이 중량을 Wd로 표기함). 평형 팽윤비(ESR)는 팽윤 후 샘플의 질량 값과 동결건조 후 건조된 샘플의 질량 값의 비율로 계산되었다(식 1).
동결건조된 Si@NiO-하이드로겔과 대조군 하이드로겔의 형태학적 특성을 SEM으로 분석하였다. SEM 분석 전에 동결건조된 하이드로겔을 30초 동안 금-팔라듐(Au-Pd) 합금으로 코팅했다. 시험관내 분해 발명의 위해 5%(w/v) 광가교결합된 하이드로겔을 0.01M PBS(1mL, pH: 7.4)에서 48시간 동안 팽윤시키기 위해 배양했다. 완전히 팽윤된 원통형 하이드로겔을 PBS 용액에서 꺼내고, 하이드로겔 표면의 잔류 수분을 여과지를 사용하여 배수하고, 하이드로겔을 개별적으로 무게를 쟀다(이 무게는 Wi로 표시됨). 그런 다음, 샘플을 오실레이터(25℃, 80rpm)에서 10-500 IU·mL-1 HAse를 포함하는 PBS 용액(1mL)에 담갔다. 효소 활성이 지속되도록 효소 용액을 미리 결정된 지점에서 새로 고쳤다. 소정의 간격을 두고 효소 용액에서 잔여 하이드로겔을 꺼내어, 잔여 수분을 조심스럽게 제거하고, 하이드로겔의 무게를 잰다(이 무게를 Wt로 표시함). 중량 잔류비(WRR)는 식 2에 따라 정의되었다
여기서 Wi와 Wt는 각각 시간 t에 대한 분해 전후의 샘플의 무게이다.
1.6. 금속 이온 방출의 평가
Si@NiO 또는 Si@NiO-하이드로겔이 트립신 한천 플레이트에서 금속 이온을 방출할 수 있는지 평가하기 위해 Si@NiO 또는 Si@NiO-하이드로겔(400μg)을 PBS(1 mL)에 넣고 25℃에서 6-48시간 동안 교반했다. 이 용액을 25°C 및 5000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 반응 튜브에서 분리했다. 샘플에서 방출된 금속 이온의 양은 유도 결합 플라즈마 광학 방출 분광법(ICP-OES; iCAP 7400 ICP-OES Duo, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 의해 측정되었다. 매체로 방출된 금속 이온의 농도는 ppm 단위로 보고된다.
1.7. 항균성 평가
대조군 하이드로겔, Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔의 세 가지 박테리아 균주: 녹농균(ATCC 15442), 폐렴간균(ATCC 4352) 및 메티실린 내성 황색포도구균(MRSA; ATCC 33591)에 대한 항균 활성은 이전에 발표된 방법에 따라 99.9% 이상의 박테리아를 사멸시키는 최소 살균 농도(MBC)의 측면에서 결정되었다. 구체적으로 말하면, 3개의 박테리아 균주에 대한 Si@NiO-하이드로겔의 항균 활성을 측정하기 위해 3개의 하이드로겔 시트(2mg·mL-1, 5 x 5 ± 0.2cm2) 및 블랭크용 스토머 필름을 준비하고 테스트했다. 비교를 위해 동일한 방법으로 대조군 하이드로겔(Si@NiO 없음)도 준비했다. 에탄올을 적신 거즈로 2~3회 닦은 후 시험편의 표면을 완전히 건조시켰다. (1-4)x105 콜로니 형성 단위(CFU)·mL-1 농도의 사전 배양된 시험 박테리아의 혈소판을 일상적으로 접종하였다. 각 테스트 샘플을 테스트 면이 위로 향하게 하여 페트리 접시에 놓았다. 그 후, 시험 용액의 분취액(0.2mL)을 피펫을 사용하여 각 시험 샘플에 접종하였다. 떨어뜨린 시험균을 필름으로 덮고 필름을 가볍게 눌러 시험균을 퍼뜨렸다. 시험 균주를 접종한 시험 샘플과 대조군 히드로겔을 함유하는 페트리 접시를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 접종 직후 시험균이 코팅되지 않은 시험 시료를 멸균 핀셋으로 분리하여 용액이 흐르지 않도록 하고, 대두 카제인 소화 레시틴 폴리소르베이트 배지(10mL)를 첨가하여 시험 균을 씻어내었다. 세척액은 생존 세포 수를 빠르게 측정하는 데 사용되었다. 다음으로 생리식염수(9mL)가 들어있는 시험관에 세척액(1mL)을 넣고 잘 섞는다. 이 과정에서 세척 용액을 단계적으로 희석하고 희석된 용액(0.1mL)을 3개의 영양 한천 플레이트에 플레이팅하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행되었다.
박테리아 살균율(Bactericidal rate)은 식 3을 사용하여 계산하였다.
여기서 A는 스토머 필름의 존재 하에 배양된 박테리아의 CFU를 나타내고 B는 대조군 하이드로겔, Si@NiO 또는 Si@NiO-하이드로겔의 존재 하에 배양된 박테리아의 CFU를 나타낸다.
1.8. 시험관내 세포 독성 분석
Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔의 세포 독성은 이전에 설명한 대로 직접 접촉 방법으로 평가되었다. 간단히 말해서, Si@NiO 혼합 폴리머 용액(2 mg·mL-1)을 원통형 PDMS 몰드(직경: 1.2cm, 깊이: 1mm) 주입하고 하이드로겔을 동일한 방식으로 형성하였다. 한편, C콜라겐 I(10νg·mL-1)을 5 × 104 cells·cm-1의 밀도로 코팅한 유리 슬라이드에 섬유아세포 단층을 형성하고 3시간 동안 배양하였다. 그 다음, 부착되지 않은 세포를 DMEM(10%(v/v) FBS, 200 IU·mL-1 페니실린, 200μg·mL-1 스트렙토마이신 첨가)으로 세척하고 12-웰 플레이트에 옮기고 5% CO2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37℃의 세포 배양 배지에서 배양하였다. 다음 날, 제조된 Si@NiO-하이드로겔과 대조군 하이드로겔을 세포 단층에 조심스럽게 놓거나, Si@NiO(0.2%(w/v))를 세포 단층에 조심스럽게 혼합한 후 1일 또는 3일간 배양하였다. 그 후, 세포를 live/dead 분석 키트(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 의해 분석하였고, 여기서 살아있는 세포는 녹색 형광으로 가시화되고 죽은 세포는 적색으로 가시화되었다. 간단히 말해서, MEF 세포를 PBS로 헹군 다음 4μM 칼세인-AM 및 2μM 에티듐 호모다이머-1(EtBr-1)을 함유하는 PBS에서 30분 동안 배양했다. PBS 세척 후, 염색된 세포를 역형광현미경(IX83, Olympus, Center Valley, PA, USA)으로 관찰하였다. 세포 생존율은 총 세포 수에 대해 살아있는 세포의 비율을 계산하여 정량화되었다.
또한, 세포 생존율은 MTT 분석과 유사하고 세포의 대사율을 측정하는 MTS 분석에 의해 정량적으로 분석되었다. 이를 위해 이전 보고서에 서술된 대로 Si@NiO-하이드로겔과 하이드로겔 또는 Si@NiO를 세포 배양 배지에서 24시간 동안 배양하여 추출물 용액을 얻었고, 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 5×104 세포의 밀도로 접종했다. 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 각 웰의 배양 배지를 추출물 용액(200μL)이 포함된 DMEM으로 교체했다. 24시간 동안 배양한 후 DMEM 함유 추출물 용액을 조심스럽게 제거했다. 그런 다음, MTS 세포 증식 분석 키트 용액(20μL)과 신선한 배지(200μL)를 각 웰에 첨가했다. 추가 4시간 동안 배양한 후, 마이크로플레이트 판독기(Synergy H1, BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 490nm 파장에서 흡광도를 측정했다. 증식된 세포의 수는 세포의 표준 곡선을 사용하여 정량화되었다.
1.9. 통계 분석
모든 데이터는 적어도 삼중의 샘플을 사용하여 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. 통계적으로 유의한 차이는 t-test로 평가하였고, 통계적 유의성은 p(*) < 0.05, p(**) < 0.01, p(***) < 0.001로 간주하였다.
2. 결과와 토론
본 발명는 다음의 3가지 목적을 달성하기 위해 수행되었다. (1) 항균 Si@NiO 나노플라워의 합성, (2) 가시광선-광가교 접근법을 통한 항균 나노플라워 캡슐화 하이드로겔(Si@NiO-하이드로겔) 제조, (3) 새로운 주사 가능한 항균 하이드로겔 개발하기 위해 Si@NiO-하이드로겔의 항균성과 생체외 생체적합성뿐만 아니라 화학적 및 기계적 특성을 검증하였다.
2.1. Si@NiO 나노플라워의 특성
Si@NiO 나노플라워는 도 1(A)에 개략적으로 표시된 대로 보고된 방법의 수정된 버전을 사용하여 제조되었다. CBD 공정 동안, Si 나노입자는 다공성 플라워와 같은 NiOOH 쉘(즉, Si@NiOOH)에 캡슐화되었고, Si@NiOOH는 아르곤 흐름으로 최대 350℃까지 온화한 가열에 의해 다공성 플라워와 같은 NiO 쉘로 환원되어 Si@NiO를 생성했다. SEM 및 TEM 이미지는 Si 나노입자가 평균 크기가 100nm인 구형을 가짐을 보여주었으며, Si@NiO는 플라워와 같은 코어-쉘 구조를 나타내었으며(도 1(B)), 실리콘 코어는 얇은 나노플라워 같은 NiO 쉘로 균일하게 덮여 있었다. 플라워와 같은 형태는 추가 어닐링 공정 후에도 안정적이고 잘 유지되었다. 이전에 보고된 결과에서 알 수 있듯이, 다공성 쉘 층은 TEM(도 1(B), 하단)에서 관찰된 바와 같이 10-30nm의 균일한 두께를 가졌다.
2.2. HA-MA의 합성 및 특성
본 발명에서는 생체 적합성 및 생분해성 고분자로 잘 확립되어 있고, 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받았으며, 조직 공학 스캐폴드 및 제어된 약물 전달 시스템의 개발에 오랫동안 사용되어 온 HA를 골격 고분자로 사용했다. 더욱이, HA는 풍부하게 이용 가능한 히드록실기와 카르복실산기를 이용하여 다양한 작용기를 사용하여 쉽게 변형될 수 있다. 첫째, 광중합성기를 가진 HA로 변형시키기 위해 HA의 1차 수산기를 에스테르 교환 반응을 통해 메타크릴기로 전환시켰다(도 2(A)). HA-MA의 NMR 스펙트럼은 6.1 및 5.6ppm의 피크가 MA의 비닐 그룹에 할당되었고, HA-MA 합성이 성공적임을 나타낸다. 1.9ppm에서 HA의 N-아세틸기의 메틸 피크 면적과 5.6 및 6.1ppm에서 MA의 메타크릴레이트 피크 면적을 비교한 결과, 메타크릴화 정도는 50%로 결정되었다(도 2(B)).
2.3. Si@NiO-하이드로겔의 제조와 특성
광가교결합된 하이드로겔을 생성하기 위해 자외선과 가시광선 모두 광중합을 시작하는 데 일반적으로 사용된다. 그러나, 자외선은 세포 손상을 유발할 수 있고 세포 기능을 손상시킬 수 있다. 또한, 상용 UV 광개시제 Irgacure 2959는 0.5wt% 미만의 낮은 수용해도를 가지고 있다. 따라서, 우리는 LAP의 우수한 수용해도, 세포 적합성 및 가시광 개시 특성으로 인해 광개시제로 LAP를 사용했다. 도 3(A)에 도시된 바와 같이, LAP는 405nm에서 흡수를 나타내었고, 이렇게 LAP는 다른 UV 광개시제(예: Irgacure 2959)보다 더 세포 친화적인 조건에서 광가교를 허용했다. Si@NiO-하이드로겔은 LAP를 광개시제로 사용하여 PEG4SH와 HA-MA 사이의 가시광 개시 광중합을 통해 제조되었다(도 3(B) 및 3(C)). 가시광선 노출(400-500nm) 시, 405nm에서 흡수를 나타내는 LAP가 여기되어 PEG4SH에서 수소를 추출하여 티일 라디칼을 형성한다. 이 라디칼은 HA-MA의 메타크릴 그룹을 공격하여 탄소 라디칼을 형성한다. 이러한 라디칼은 HA-MA의 다른 메타크릴 부분을 통해 전파되거나 PEG4SH의 다른 티올 부분에서 수소를 추가로 추출하여 광가교된 Si@NiO-하이드로겔을 생성한다(도 3(C)).
조성을 특성화하기 위해 대조군 하이드로겔, Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔의 PXRD 패턴 및 FT-IR 스펙트럼을 분석했다. 도 4(A)에 도시된 바와 같이, Si@NiO의 경우 Si에 해당하는 2θ = 28°, 47°, 56°, 76°, 88°에서 고강도 회절 피크가 관찰되었고, 코팅된 NiO에 해당하는 2θ = 35°, 44° 및 60°에서 추가 피크가 관찰되었다. 하이드로겔은 2θ = 19° 및 23°에서 주요 PXRD 피크를 나타내고 2θ = 26°, 36°, 39° 및 45°에서 약간의 작은 피크를 나타내는 것으로 관찰되었다. Si@NiO-하이드로겔의 경우 유사한 피크가 관찰되었으며, 2θ = 28°, 35°, 44° 및 47°에서 몇 개의 추가 피크가 관찰되었다. 이러한 추가 피크는 Si@NiO에 해당한다. 대조군 하이드로겔 및 Si@NiO-하이드로겔에 대해 FT-IR 스펙트럼 분석을 수행했다. 도 4(B)는 대조군 하이드로겔 샘플에서의 O-H 신축(3428cm-1), C-H 신축, 피라노스 고리(2892cm-1), C=O 신축, NH-Ac(1644cm-1) 및 C-N 신축(1473cm-1)을 보여준다. Si@NiO-하이드로겔은 대조군 하이드로겔과 유사한 특징적인 피크를 보였다.
대조군 하이드로겔과 Si@NiO-하이드로겔의 열적 안정성을 TGA로 조사하였고, 그 결과를 도 4(C)에 나타내었다. 대조군 하이드로겔과 Si@NiO-하이드로겔은 흡수된 물의 손실로 인해 최대 200℃까지 각각 무게의 약 8.3%와 14.4%를 잃었다. 대조군 하이드로겔과 Si@NiO-하이드로겔의 TGA 온도기록은 하이드로겔의 열분해가 하나의 주요 단계에서 발생했으며 초기 분해가 210℃에서 시작되어 350℃까지 종료되었으며 중량 손실은 각각 65.8% 및 60.0%로 증가했음을 나타냈다. 마지막으로 800℃에서 무게 손실은 각각 84.7%와 69.6%였다.
대조군 하이드로겔과 Si@NiO-하이드로겔의 표면 지형을 조사하기 위해 탈이온수에서 완전히 팽윤된 하이드로겔을 동결건조하고 SEM으로 특성화했다. 도 4(D)에서 볼 수 있듯이 모든 하이드로겔은 다공성이고 불규칙한 네트워크 구조를 가지고 있으며 나노 크기의 Si@NiO가 하이드로겔 네트워크에 잘 캡슐화되어 있다(도 4(D), 오른쪽).
대조군 하이드로겔과 Si@NiO-하이드로겔의 저장 모듈은 주로 폴리머 네트워크의 가교 밀도에 의해 결정되고 하이드로겔 기능에 큰 영향을 줄 수 있는 기계적 특성을 평가하기 위해 결정되었다. 전구체 농도가 높을수록 가교 밀도를 증가시키고, 이것은 얻어진 하이드로겔의 모듈러스는 더 높고 ESR은 더 낮게한다. 본 발명의 결과는 PBS에서 팽윤시킨 후 Si@NiO-하이드로겔이 총 폴리머 농도가 3%(w/v)에서 7%(w/v)로 증가했을 때, 0.47 ± 0.15kPa에서 3.88 ± 0.51kPa로 증가된 저장 모듈러스를 나타내었고, ESR이 39.6 ± 3.6에서 22.4 ± 0.8로 감소했음을 보여주었다. 또한, 대조군 하이드로겔에 대한 결과를 비교하였다. 예상대로 총 폴리머 농도가 3%에서 7%(w/v)로 증가하면 저장 모듈러스가 0.14 ± 0.04 kPa에서 2.38 ± 0.29kPa로 눈에 띄게 증가하고 ESR이 44.5 ± 3.6에서 26.9 ± 0.8로 감소했다(도 5(A) 및 5(B)). 하이드로겔의 기계적 특성에 대한 Si@NiO 캡슐화 효과를 조사하기 위해 동일한 폴리머 농도에서 Si@NiO-하이드로겔과 대조군 하이드로겔의 기계적 특성을 비교했다. Si@NiO 나노플라워가 넣어졌을 때, 저장 탄성률은 대조군 하이드로겔의 저장 모듈러스와 비교하여 3%(w/v), 5%(w/v), 7%(w/v)로 Si@NiO-하이드로겔의 경우 각각 3.3, 1.3, 1.6배로 증가했다. Si@NiO 나노플라워를 하이드로겔에 통합하면 Ni(II) 이온과의 배위 또는 나노플라워 표면의 산화물 음이온을 통한 수소 결합으로 인해 더 많은 가교점을 제공했다. 이는 분자간 가교 및 하이드로겔 강성의 개선뿐만 아니라 ESR 및 기공 크기의 감소를 초래할 수 있다. 또한, 대조군 하이드로겔과 Si@NiO-하이드로겔 모두 팽윤 전후에 이미지화되었다. 도 5(C)에 도시된 바와 같이, 대조군 하이드로겔의 직경 증가는 팽윤 후 Si@NiO-하이드로겔의 직경 증가보다 더 컸다. 이는 나노플라워 표면의 Ni(II) 이온 또는 산화물 이온이 하이드로겔에 배위되기 때문에 대조군 베어 하이드로겔에 비해 Si@NiO-하이드로겔의 분자간 가교 밀도가 향상되었기 때문일 수 있다. Si@NiO 나노플라워는 하이드로겔에 고르게 분산된 반면, 대조군 하이드로겔은 투명했다. 또한, 캡슐화된 Si@NiO는 PBS에서 연장된(48시간) 배양 후에도 하이드로겔에서 유지되었다. 이러한 데이터는 Si@NiO 나노플라워가 광가교 과정 동안 하이드로겔에 잘 캡슐화되어 있고 Si@NiO 나노플라워가 하이드로겔에서 안정적임을 확인한다.
2.4. 분해 특성
HA 기반 스캐폴드는 조직 공학 및 약물 전달을 위한 유망한 후보가 되었다. 잠재적인 생체 내 적용을 위해 임플란트 재료(봉합사, 거즈 또는 하이드로겔)는 생분해성이어야 임플란트를 제거하기 위한 2차 수술이 필요하지 않다. 따라서, 우리는 유망한 치료 및 생체내 적용 가능성으로 인해 HAse에 대한 대조군 하이드로겔 및 Si@NiO-하이드로겔의 생분해성을 평가했다. Si@NiO-하이드로겔과 대조군 하이드로겔을 0.01M PBS 또는 HAse 용액(10-500IU·mL-1)에 넣고 결과적인 중량 손실 백분율을 모니터링했다. 도 6 및 도 7은 시험관 내 분해 거동을 보여준다. HAse에 노출되면 각 하이드로겔은 명백한 분해 거동을 나타내지만 분해 속도는 다르다. 첫째, 효소 분해 경향은 HAse 농도(10-500 IU·mL-1)와 하이드로겔의 Si@NiO 혼입 모두에 의해 크게 영향을 받았다. 예를 들어, Si@NiO-하이드로겔을 10, 50, 100, 500IU·mL-1 HAse를 함유한 용액에 넣었을 때 분해율은 각각 1.2%, 1.4%, 1.5%, 2.2%였다. 대조군 하이드로겔의 경우 해당 분해율은 각각 1일 중량 감소의 3.0%, 5.8%, 6.8% 및 8.2%였다. Si@NiO-하이드로겔과 PBS와 함께 배양된 대조군 하이드로겔은 모두 무시할 수 있는 중량 감소를 겪었다.
또한, 12일 동안 500IU·mL-1의 고정된 HAse 농도에서 Si@NiO-하이드로겔과 대조군 하이드로겔을 비교했다. 12일 만에 대조군 하이드로겔은 완전히 분해된 반면 Si@NiO-하이드로겔은 25% 미만으로 분해되었다(도 7). Si@NiO-하이드로겔의 분해 속도는 대조군 하이드로겔의 분해 속도보다 느렸으며, 이는 Si@NiO 혼입이 효소 분해에 대한 하이드로겔의 민감도에 영향을 미쳤음을 의미한다. 앞서 서술한 바와 같이, 하이드로겔에 Si@NiO를 첨가하면 가교점을 증가시켜 분자간 가교 및 하이드로겔 강성을 개선하고 효소 분해율을 감소시킨다.
2.5. 이온 방출 테스트
Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔의 분해는 PBS의 400μg·mL-1 에서 6, 12, 24 및 48시간 동안 25℃에서 테스트되었다. 샘플에서 방출된 Ni 이온의 양은 ICP-OES로 측정되었다. 도 8에서 볼 수 있듯이, Si@NiO에서 방출된 Ni 이온의 농도는 6시간 후 8.01ppm에서 48시간 후 18.04ppm으로 증가하여 Si@NiO가 PBS에서 플라워와 같은 구조를 강력하게 유지했음을 나타낸다. 특히, Si@NiO-하이드로겔에서 방출된 Ni(II) 이온의 양은 Si@NiO에 의해 방출된 것보다 50배 감소(48시간 후 0.36ppm)를 나타냈다. 내부 폴리머 네트워크에 고정된 Si@NiO는 수용액과의 직접적인 접촉에 의해 약간 억제되어 금속 이온 방출량이 감소시켰다. 대조군 하이드로겔에서 방출된 Ni(II) 이온의 양은 무시할 수 있었다.
2.6. 항균 활성
항균 하이드로겔의 생리활성을 조사하기 위해 대조군 하이드로겔, Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔의 항균활성을 200μg·mL-1 ~ 2mg·mL-1 농도 범위에서 3회 실험하였다. 녹농균, 폐렴간균 및 메티실린 내성 황색포도구균의 CFU는 Si 나노입자와 함께 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 계산되었다. Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔의 살균율은 각각 200μg·mL-1 및 2mg·mL-1에서 세 가지 시험된 종 모두에 대해 99.9%였다(도 9(A) 및 9(B)). 대조적으로, 대조군 하이드로겔은 동일한 필름 크기(5 × 5cm2)에서 시험된 모든 박테리아에 대해 매우 낮은 항균 활성을 나타냈다: 녹농균(5.1%), 폐렴간균(11.9%) 및 메티실린 내성 황색포도구균(6.7%). 여기서, 금속 코팅된 나노입자 표면의 높은 양전하가 박테리아 세포 표면의 음전하와의 상호작용을 통해 효과적인 살균 활성을 제공할 수 있다.
따라서, 200μg·mL-1의 낮은 MBC에서, 2가의 양전하를 갖는 Si@NiO는 나노 크기의 Ag/Cu-그래핀과 같은 다른 중성으로 하전된 나노입자보다 더 강한 살균 특성을 보였다. Si@NiO-하이드로겔에서 방출되는 Ni(II) 이온의 양이 HA 히드로겔에 Si@NiO의 캡슐화로 인해 Si@NiO에서 방출된 것에 비해 줄었더라도, Si@NiO-히드로겔의 살균율은 2mg·mL-1의 농도에서 99.9%였다. 이러한 결과로부터, Si@NiO-하이드로겔의 살균 과정은 나노플라워에서 방출된 항균성 금속 이온이 세포 내로 유입되는 것이 아니라 세포막과의 직접적인 접촉을 통해 진행되어 박테리아를 사멸시키는 것으로 추측할 수 있다.
2.7. 세포 독성
마지막으로 직접 접촉 방법을 기반으로 Si@NiO-하이드로겔의 세포 생체 적합성을 발명했다. 대조군 하이드로겔, Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔의 독성을 확인하기 위해 3개의 테스트 샘플을 같은 방법을 사용하여 준비했다. 또한, 추가적인 양성 대조군(블랭크)으로 접촉이 없는 MEF 단층을 준비하였다. 음성 대조군으로 10% EtOH 용액과 MEF 단층 접촉을 사용했다. MEF 생존력은 live/dead 염색 및 비색 MTS 분석에 의해 모니터링되었다. 형광 현미경 이미지(도 10(A))에서 볼 수 있듯이, 블랭크, Si@NiO, Si@NiO-하이드로겔 및 대조군 하이드로겔 샘플에 대한 세포 생존율은 배양 1일 후 98%를 초과한 반면, EtOH에 노출된 MEF 단층의 경우, 대부분의 세포는 사멸되었다. 세포는 3일 동안 생존하는 합류층을 형성하기 전에 접종 후 표면에 점차적으로 부착, 확산 및 평평해지는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 EtOH 그룹의 경우에는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 Si@NiO-하이드로겔이나 Si@NiO 및 대조군 하이드로겔이 세포에 독성이 없음을 나타낸다. 추가 정량화는 MTS 분석(도 10(B))에 의해 수행되었으며, 여기서 Si@NiO, 대조군 하이드로겔 및 Si@NiO-하이드로겔은 세포 배양 배지 용액에서 추출되어 연속적으로 희석되었다. 예를 들어, 100%는 원래 추출 매체를 나타내고 25%는 원래 추출 매체에서 4배 희석을 나타낸다. MEF 단층 형성 후 배양액을 원하는 농도의 추출액이 포함된 배지로 교체하여 배양하였다. 얻어진 MTS 결과는 Si@NiO-하이드로겔이 모든 경우에서 MEF 생존율이 95% 이상임을 고려할 때 우수한 세포적합성을 가짐을 입증했다. 그러나, 대부분의 MEF는 EtOH에 노출되면 사멸되어 Si@NiO 및 Si@NiO-하이드로겔 추출물의 낮은 세포독성을 확인했다.
3. 결론
본 발명에서는 항균성이 우수한 주사 가능한 가시광 매개 하이드로겔을 설계하였다. Si@NiO 나노플라워는 광가교 과정 동안 하이드로겔에서 높은 안정성으로 잘 캡슐화되었다. Si@NiO-하이드로겔의 물리적 및 화학적 특성은 PXRD, FT-IR, TGA, SEM 및 ICP-OES로 특성화되었다. Si@NiO-하이드로겔의 기계적 특성(즉, 유변학 및 팽윤 거동)은 폴리머 전구체 용액을 변화시켜 조절될 수 있다. 또한, Si@NiO-하이드로겔은 2mg·mL-1 농도에서 3가지 박테리아(녹농균, 폐렴간균 및 메티실린 내성 황색포도구균)에 대해 우수한 항균 특성(>99.9% 살균율)을 나타내었으며 MEF에 대한 세포 독성에서 무시할 만한 수준을 나타냈다. 가시광선의 사용은 독성 개시제 또는 자외선의 사용과 관련된 잠재적인 생물안전성 문제를 우회하는 데 도움이 될 수 있다. Si@NiO-하이드로겔의 주입성과 생분해성은 조직 공학 및 생의학 응용 분야를 위한 유망한 플랫폼이 된다. 그러나, 생체 내 실험을 포함한 추가 작업이 광범위한 응용 분야에서 강력하고 효율적인 차세대 항균 하이드로겔로 Si@NiO-하이드로겔의 향후 사용을 촉진하기 위해 필요하다.
본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (13)
- 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 Si@NiO-하이드로겔 복합체인 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔.
- 청구항 1에 있어서,
상기 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 PBS에서 팽윤시킨 후, 상기 Si@NiO-하이드로겔을 총 폴리머 농도가 3%(w/v)에서 7%(w/v)로 증가했을 때, 0.47 ± 0.15kPa에서 3.88 ± 0.51kPa로 증가된 저장 모듈러스를 나타내고, ESR 은 39.6 ± 3.6에서 22.4 ± 0.8로 감소하는 것을 특징으로 하는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔. - 실리콘에 기반한 Ni 복합 나노플라워(Si-based composite nanoflower)를 제조하는 제1 단계;
상기 제1 단계에서 제조된 실리콘에 기반한 Ni 복합 나노플라워를 주사 가능한(injectable) 형태로 제조하는 제2 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔의 제조방법. - 청구항 3에 있어서,
상기 제1 단계의 실리콘에 기반한 Ni 복합 나노플라워를 제조하는 단계는,
플라즈마 합성된 Si 나노입자를 물과 에탄올을 함유하는 용매에 혼합하는 제1-1 공정;
상기 제1-1 공정 후의 혼합물을 초음파 처리하여 제1 용액을 얻는 제1-2 공정;
Ni(CH3COO)2·4H2O 및 과산화이황산칼륨을 물 및 에탄올을 포함하는 용매에 혼합하여 제2 용액을 얻는 제1-3 공정;
상기 제1 용액을 100rpm 내지 300rpm의 마그네틱 교반 하에서 상기 제2 용액을 혼합하여 제3 용액을 얻는 제1-4 공정;
NH3·H2O를 탈이온수에 질량비로 1: 30 내지 100의 비율에서 희석하고, 상기 제3 용액에 적가하고, 30분 내지 40분 교반하는 제1-5 공정;
상기 제1-5 공정 후의 침전물에 부착된 SO4 2-, K+, Ni2+, CH3COO- 에서 선택되는 1종 및 2종 이상의 군에서 선택되는 흡착 이온을 제거하기 위하여 탈이온수로 세척하는 제1-6 공정;
상기 제1-6 공정에서 세척된 침전물을 50℃ 내지 70℃의 온도로 5시간 내지 7시간 건조하여 갈색의 Si@NiOOH 나노입자를 얻는 제1-7 공정;을 포함하는 것을 특징으로 하는 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔의 제조방법. - 청구항 4에 있어서,
상기 제1-7 공정에서 건조하는 공정을 완료한 갈색의 Si@NiOOH 나노입자를 Ar 분위기에서 1℃ 내지 3℃·min-1의 가열 속도로 340℃ 내지 360℃까지 온도를 증가시키면서 NiO 코팅된 Si 나노입자인 Si@NiO 나노입자를 제조하는 제1-8 공정;을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔의 제조방법. - 청구항 5에 있어서,
상기 제2 단계의 주사 가능한(injectable) 형태로 제조하는 단계는,
HA(Hyaluronic acid)-MA(Methacrylic anhydride) 합성물을 제조하는 제2-1 공정;
상기 HA-MA 합성물을 사용하여 Si@NiO가 혼합된 고분자 전구체 용액을 제조하는 제2-2 공정;
상기 Si@NiO가 혼합된 고분자 전구체 용액을 사용하여 광가교가 가능하고 주사가 가능한 Si@NiO-하이드로겔을 제조하는 제2-3 공정;을 포함하는 것을 특징으로 하는 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔의 제조방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 HA(Hyaluronate)-MA(Methacrylic anhydride) 합성물을 제조하는 제2-1 공정은,
소듐 HA(sodium Hyaluronate)을 탈이온수에 용해하는 제2-1-1 공정;
상기 탈이온수에 용해된 소듐 HA에 MA(Methacrylic anhydride)를 첨가하고 얼음 중탕(ice bath)에 10시간 내지 12시간 반응시키는 제2-1-2 공정;
상기 제2-1-2 공정 후의 HA-MA 생성물을 무수에탄올에 침전하는 제2-1-3 공정;
상기 무수에탄올에 침전된 HA-MA 생성물을 3℃ 내지 4℃에서 4,000rpm 내지 6,000rpm 에서 4분 내지 6분간 원심분리하는 제2-1-4 공정;
상기 제2-1-4 공정에서 원심분리 후, 상층액을 제거하고 침전물을 탈이온수로 재용해 하는 제2-1-5 공정;
상기 제2-1-5 공정에서 탈이온수로 재용해된 침전물에서 미반응 시약을 제거하기 위하여 투석 백을 사용하여 3일 내지 4일 투석하는 제2-1-6 공정;
상기 제2-1-6 공정에서 투석된 침전물을 동결 건조하고 -30℃ 내지 -20℃에서 HA-MA 합성물을 보관하는 제2-1-7 공정;을 포함하는 것을 특징으로 하는 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔의 제조방법. - 청구항 7에 있어서,
상기 제2-1-2 공정에서 소듐 HA에 MA를 첨가한 후, pH의 값을 8 내지 10으로 유지하기 위하여 NaOH를 1N 또는 5N을 혼합하는 것을 특징으로 하는 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔의 제조방법. - 청구항 7에 있어서,
상기 HA-MA 합성물을 사용하여 Si@NiO가 혼합된 고분자 전구체 용액을 제조하는 제2-2 공정은,
4-Arm폴리(에틸렌 글리콜)티올(PEG4SH) 및 HA-MA 합성물을 0.01M 내지 0.05M의 pH 7.2 내지 pH 7.5의 인산 완충 식염수에 용해시켜 고분자 용액을 얻는 제2-2-1 공정;
3mM 내지 6mM의 리튬페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트를 상기 고분자 용액에 혼합하는 제2-2-2 공정;
NaOH 또는 HCl을 사용하여 상기 제2-2-2 공정의 고분자 용액의 pH를 8.0 내지 8.5로 조절하는 제2-2-3 공정;
상기 Si@NiO 나노입자를 상기 pH가 조절된 고분자 용액에 혼합하여 Si@NiO가 혼합된 고분자 전구체 용액을 제조하는 제2-2-4 공정;을 포함하는 것을 특징으로 하는 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔의 제조방법. - 청구항 9에 있어서,
상기 광가교가 가능하고 주사가 가능한 Si@NiO-하이드로겔을 제조하는 제2-3 공정은,
상기 Si@NiO가 혼합된 고분자 전구체 용액을 원통형 PDMS 웰에 주입하는 제2-3-1 공정;
상기 상기 Si@NiO가 혼합된 고분자 전구체 용액에 100mW·cm-2 내지 300mW·cm-2에서 1분 내지 3분 동안 400nm 내지 500nm의 광을 조사하는 제2-3-2 공정;을 포함하는 것을 특징으로 하는 캡슐화된 Si 기반 NiO 나노플라워를 갖는 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔의 제조방법. - 농도가 150 ㎍/mL 내지 250 ㎍/mL 인 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔을 사용하여 하기 화학식으로 정의되는 살균율에서 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)을 99%이상 살균하는 방법.
(여기서, 살균율(bactericidal rate)에서, A는 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 갖지 않는 경우의 박테리아가 배양된 CFU, B는 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 갖지 않는 경우의 박테리아가 배양된 CFU를 나타낸다) - 농도가 150 ㎍/mL 내지 250 ㎍/mL 인 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔을 사용하여 하기 화학식으로 정의되는 살균율에서 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus, MRSA)을 99%이상 살균하는 방법.
(여기서, 살균율(bactericidal rate)에서, A는 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 갖지 않는 경우의 박테리아가 배양된 CFU, B는 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 갖지 않는 경우의 박테리아가 배양된 CFU를 나타낸다) - 농도가 150 ㎍/mL 내지 250 ㎍/mL 인 가시광선-가교된 히알루론산 하이드로겔을 사용하여 하기 화학식으로 정의되는 살균율에서 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)을 99%이상 살균하는 방법.
(여기서, 살균율(bactericidal rate)에서, A는 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 갖지 않는 경우의 박테리아가 배양된 CFU, B는 Si@NiO-하이드로겔 복합체를 갖지 않는 경우의 박테리아가 배양된 CFU를 나타낸다)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102644350B1 (ko) | 2024-03-05 |
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