KR20080107405A

KR20080107405A - 골격 재료

Info

Publication number: KR20080107405A
Application number: KR1020087021755A
Authority: KR
Inventors: 지아키 후쿠토미; 히로아키 가네코; 에이이치 기타조노; 미카 가야시마; 미유키 나카야마
Original assignee: 데이진 가부시키가이샤
Priority date: 2006-03-06
Filing date: 2007-03-05
Publication date: 2008-12-10
Also published as: US20090076530A1; AU2007222949A1; WO2007102606A1; EP1994949A1; CN101443053A; JPWO2007102606A1; CA2645541A1; JP5119144B2; EP1994949A4; AU2007222949B2

Abstract

본 발명의 목적은 기계적 강도, 세포 증식성이 우수하고, 세포 배양 기재나 보철재로서 바람직한 골격 재료를 제공하는 것에 있다.

본 발명은 섬유의 집합체로 이루어지고, 2 개의 저면 및 측면으로 구성되는 3 차원 구조를 갖고, (1) 섬유는 면 방향으로 배향되고, (2) 섬유의 직경은 0.05 ∼ 50㎛ 이고, (3) 섬유는 생체 적합성 폴리머로 주로 이루어지며, (4) 외관 밀도는 95 ∼ 350㎏/㎥ 인 세포 증식을 위한 골격 재료이다.

Description

골격 재료 {SCAFFOLD MATERIAL}

본 발명은 세포 증식에 이용하는 골격 재료에 관한 것이다. 본 발명은 섬유의 집합체로 이루어지고, 보철재 또는 세포 배양 기재에 바람직한 골격 재료 관한 것이다.

최근 크게 손상된 생체 조직의 치료법으로서 세포의 분화, 증식능을 이용하여 본래의 생체 조직으로 재구축하는 재생 의료의 연구가 활발히 이루어지고 있다. 생체 내에 있어서 세포가 분화·증식하는 경우, 세포 이외의 매트릭스가 골격으로서 기능하여 조직의 구축이 이루어지고 있다. 그러나 조직이 크게 손상된 경우, 세포 자신이 매트릭스를 생성할 때까지 인공 및 천연 재료로 보충할 필요가 있다. 요컨데 골격 재료 (보철재) 는 조직 구축에 있어서 최적의 환경을 부여하는 중요한 팩터이다. 이 골격 재료에 요구되는 특성으로는 1) 생체 흡수성, 2) 세포 접착성, 3) 다공질성, 4) 역학 강도 등을 들 수 있다. 이들 특성을 만족하는 재료를 만들어내는 것을 목적으로 하여, 합성 고분자 (폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프로락톤 등), 천연 고분자 (콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 히알루론산, 알긴산, 키토산 등), 무기 재료 (하이드록시어퍼타이트, β-인산3칼슘), 이들 복합체 등이 지금까지 검토되고 있다.

전술한 바와 같이 골격 재료 (보철재) 에 요구되는 중요한 특성의 하나로서 다공질성이 있다. 이것은 조직을 재생시키는 데 필요한 세포에 대한 충분한 산소 및 영양을 보급하고, 이산화탄소나 노폐물을 신속히 배출하는 의미에 있어서 중요하다. 그 때문에, 골격 재료의 다공질성을 달성하기 위해서 동결 건조법, 상분리법, 발포법 등이 제안되어 있다. 동결 건조법 또는 상분리법에 의해 얻어지는 구조체는 포어의 형상이 인편상으로서, 세포의 침입이 어려워 골격 재료로서 충족하지 않는다는 과제가 있다. 또 발포법에 의해 얻어지는 구조체도 포어가 단독으로 존재하기 때문에 세포의 침입이 곤란하다는 과제가 있다.

또, 열가소성 폴리머로 이루어지는 섬유의 집합체로서, 평균 섬유 직경이 0.1 ∼ 20㎛ 이고, 또한 그 섬유의 임의의 횡단면이 다른 형이며, 또한 평균 외관 밀도가 10 ∼ 95㎏/㎥ 인 부직포가 보고되어 있다 (특허 문헌 1) . 그러나, 골격 재료로서 더욱 좋은 두께와 강도를 갖는 것이 요구되고 있다.

또, 사카로오스 등의 수용성 물질을 함유하는 폴리우레탄 폴리머를 조제한 후, 수욕 중에서 함유하는 수용성 물질을 용해하여 구멍 구조를 형성한 연골 플러그가 제안되어 있다 (특허 문헌 2) . 그러나, 이 방법에 의해 형성되는 구멍은 연속 구멍이 아니어서 세포 증식에는 한도가 있다.

또, 정전 방사법에 의해 나노 화이버가 평면상으로 퇴적된 골격 재료를 제조하고, 이것을 이용하여 세포를 배양하는 것이 제안되어 있다 (비특허 문헌 1). 이 방법은 섬유를 평면상의 포집 전극 상에 포집하기 때문에, 섬유가 일정한 두께 이상으로 퇴적되면 전극이 퇴적물로 덮이게 되어, 일정한 전위차를 유지하는 것이 곤란해져 섬유의 퇴적물의 밀도가 퇴적 방향으로 변화한다는 결점이 있다. 또, 퇴적물은 퇴적 방향에 수직인 면 방향에 있어서도 퇴적 밀도에 불균일이 발생한다. 따라서, 이 퇴적물을 세포 증식의 골격 재료로서 이용하는 데에는 퇴적 밀도를 균일하게 하여 기계적 강도를 개량할 필요가 있다.

(특허 문헌 1) WO2004/88024호

(특허 문헌 2) 일본 공표특허공보 2004-520855호

(비특허 문헌 1) Published online 25 March 2002 in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com)

발명의 개시

본 발명의 목적은 섬유가 고밀도로 집합된 세포 증식에 적합한 골격 재료를 제공하는 것에 있다. 본 발명의 목적은 기계적 강도가 우수한 세포 증식을 위한 골격 재료를 제공하는 것에 있다. 본 발명의 목적은 세포를 양호하게 증식시킬 수 있는 골격 재료를 제공하는 것에 있다. 또 본 발명의 목적은 그 골격 재료의 제조 방법을 제공하는 것에 있다. 또한 본 발명의 목적은 그 골격 재료를 이용한 세포의 증식 방법을 제공하는 것에 있다. 또 본 발명의 목적은 그 골격 재료를 이용한 생체 조직을 재생시키는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자는 정전 방사법에 의해 섬유를 제조하고, 얻어진 섬유를 회전하는 권취축에 퇴적시키면, 퇴적 방향으로 균일한 퇴적 밀도를 갖는 섬유 퇴적물이 얻어지는 것을 알아내었다.

또, 섬유를 회전하는 권취축에 퇴적시키면 권취축과 평행한 평면에 대해서도 균일한 섬유 퇴적물이 얻어지는 것을 알아내었다.

또한, 섬유를 회전축에 권취할 때에, 섬유에 일정한 장력이 가해져 고밀도의 섬유 퇴적물이 얻어지는 것을 알아내었다.

또, 얻어진 섬유 퇴적물은 세포 증식의 골격 재료로서 적당한 강도, 섬유 밀도를 갖는 것을 알아내었다. 본 발명은 이들 지견에 기초한다.

즉 본 발명은 섬유의 집합체로 이루어지고, 2 개의 저면 및 측면으로 구성 되는 3 차원 구조를 갖고,

(1) 섬유는 면 방향으로 배향되고,

(2) 섬유의 직경은 0.05 ∼ 50㎛ 이고,

(3) 섬유는 생체 적합성 폴리머로 주로 이루어지며,

(4) 외관 밀도는 95 ∼ 350㎏/㎥ 인 골격 재료이다.

또 본 발명은 (1) 전극 사이에서 형성된 정전장 내에 생체 적합성 폴리머를 함유하는 도프를 노즐로부터 토출하여 섬유를 형성하고,

(2) 얻어진 섬유를, 권취축을 중심으로 권취하여 섬유가 권취축과 평행한 면의 방향으로 배향된 롤을 형성하고,

(3) 얻어진 롤로부터 3 차원 구조체를 잘라내는 공정을 포함하는 골격 재료의 제조 방법이다.

본 발명은 그 골격 재료를 이용하여 세포를 분열 증식시키는 방법을 포함한다. 또 그 골격 재료를 손상된 환부에 매립하여, 생체 조직을 재생시키는 방법을 포함한다.

도 1 은 정전 방사법에서 이용하는 장치의 일례이다.

도 2 는 정전 방사법에서 이용하는 장치의 일례이다.

도 3 은 정전 방지법에서 이용하는 장치의 일례이다.

도 4 는 정전 방지법에서 이용하는 장치의 일례이다.

도 5 는 본 발명의 제조 방법 중에서 골격 재료를 잘라내는 방법의 예이다.

도 6 은 실시예 2 에서 얻어진 골격 재료의 상저면 이미지이다.

도 7 은 실시예 2 에서 얻어진 골격 재료의 하저면 이미지이다.

도 8 은 실시예 2 에서의 골격 재료를 이용한 배양 1 일째의 염색 이미지이다.

도 9 는 실시예 2 에서의 골격 재료를 이용한 배양 12 일째의 염색 이미지이다.

도 10 은 실시예 3 에서 얻어진 골격 재료의 상저면 이미지이다.

도 11 은 실시예 3 에서 얻어진 골격 재료의 하저면 이미지이다.

도 12 는 실시예 3 에서 얻어진 골격 재료의 단면 이미지의 일례이다.

도 13 은 실시예 3 에서의 골격 재료를 이용한 배양 1 일째의 염색 이미지이다.

도 14 는 실시예 3 에서의 골격 재료를 이용한 배양 12 일째의 염색 이미지이다.

(부호의 설명)

1. 노즐

2. 도프

3. 도프 유지조

4. 정(正)전극

5. 부(負)전극

6. 고전압 발생기

7. 권취 장치

8. 정전 제거 장치

9. 권취축 방향

10. 권취축 방향과 평행하게 잘라진 골격 재료

11. 권취에 대하여 수직인 방향

12. 권취축에 대하여 수직 방향으로 잘라진 골격 재료

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명에 대하여 상세히 서술한다.

<골격 재료>

본 발명의 골격 재료는 2 개의 저면 및 측면으로 구성되는 3 차원 구조를 갖는다. 저면의 형상은 원, 타원, 사각형 등 임의의 형상이다. 저면은 요철이 있는 곡면이어도 된다. 2 개의 저면의 형상, 크기는 상이해도 된다. 저면의 면적은 바람직하게는 0.05 ∼ 8㎠, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 1㎠ 이다. 측면은 연속된 곡면이어도 되고, 복수의 면으로 형성되어 있어도 된다. 즉, 본 발명의 골격 재료의 형상은 바람직하게는 원통체, 다각주 등의 3 차원 구조이다.

본 발명의 골격 재료는 3 차원 구조, 즉 가로 방향 (x 축), 세로 방향 (y 축) 및 높이 방향 (z 축) 의 넓이를 갖는다. 이 점에서, 가로 방향 (x 축) 및 세로 방향 (y 축) 의 넓이를 갖는 평면상의 부직포와는 상이하다. 본 발명의 골격 재료에 있어서, 높이 방향과는 일방의 저면에 대하여 수직인 방향인 것을 말한다.

골격 재료의 높이는 바람직하게는 0.5㎜ 이상, 보다 바람직하게는 2㎜ 이상이다. 높이의 상한은 불문하고, 보철재로서 사용하는 부위에 의존하는 것이라고 할 수 있다. 높이가 0.5㎜ 보다 낮으면 기계 강도가 낮아, 슬관절 등 부하가 높은 조직의 보철재로는 바람직하지 않다. 본 발명의 골격 재료를, 예를 들어 생체의 손상부에 매립하여, 보철재 표면에 세포를 증식시키기 위해서 이용할 수 있다. 골격 재료는 원하는 형상에 맞게 제공할 수 있다.

본 발명의 골격 재료는 섬유의 집합체로 이루어진다. 본 발명에 있어서 면 방향으로 배향한다는 것은, 섬유가 특정한 평면에 대략 평행하게 향하고 있는 것을 의미한다. 섬유는 이 특정 평면에 평행한 한, 가로 방향, 세로 방향, 경사 방향의 어느 방향을 향하고 있어도 된다. 도 5 의 10 또는 12 에 나타내는 원통체 중의 파선으로 나타내는 평면에 대하여 섬유는 대략 평행하게 향하고 있다. 또, 도 5 의 10 또는 12 중에 나타내는 점선부는 동심원상의 곡면을 형성해도 된다. 단, 그 평면상의 섬유 방향은 랜덤하다.

섬유는 도 5 의 10 에 나타내는 바와 같이, 높이 방향에 평행한 면 방향으로 배향되어 있는 것이 바람직하다. 또는 도 5 의 12 에 나타내는 바와 같이, 섬유는 높이 방향과 수직인 면 방향으로 배향되어 있는 것이 바람직하다.

섬유의 직경은 0.05 ∼ 50㎛ 이다. 섬유의 직경이 0.05㎛ 보다 작으면 골격 재료의 강도를 유지할 수 없기 때문에 바람직하지 않다. 또 섬유의 직경이 50㎛ 보다 크면 섬유의 비표면적이 작아 생착되는 세포수가 적어진다. 섬유의 직경은 바람직하게는 0.2 ∼ 50㎛, 더욱 바람직하게는 0.2 ∼ 40㎛ 이다. 섬유의 직경은 예를 들어 주사형 전자 현미경 (배율 200 배 정도) 으로 골격 재료를 관찰하여 구할 수 있다.

또, 섬유의 임의의 횡단면은 대략 진원이어도 되고 이형이어도 된다. 섬유의 임의의 횡단면이 이형인 경우, 섬유의 비면적은 증대되기 때문에 세포의 배양시에 세포가 섬유 표면에 접착하는 충분한 면적을 취할 수 있다.

여기에서, 섬유의 임의의 횡단면이 이형이라는 것은, 섬유의 임의의 횡단면이 대략 진원 형상을 취하지 않는 모든 형상도 가리키고, 섬유 표면이 한결같이 오목부 및/또는 볼록부를 가져 조면화되어 있는 경우를 포함한다.

이형 형상은 섬유 표면의 미세한 오목부, 섬유 표면의 미세한 볼록부, 섬유 표면의 섬유축 방향으로 줄무늬 형상으로 형성된 오목부, 섬유 표면의 섬유축 방향으로 줄무늬 형상으로 형성된 볼록부 및 섬유 표면의 미세 구멍부로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1 종에 의한 것이 바람직하고, 이들은 단독으로 형성되어 있어도 되고 복수가 혼재되어 있어도 된다. 여기에서, 상기「미세한 오목부」, 「 미세한 볼록부」란 섬유 표면에 0.1 ∼ 1㎛ 의 오목부 또는 볼록부가 형성되어 있는 것을 말하고, 「미세 구멍」이란 0.1 ∼ 1㎛ 의 직경을 갖는 미세 구멍이 섬유 표면에 존재하는 것을 말한다. 또, 상기 줄무늬 형상으로 형성된 오목부 및/또는 볼록부는 0.1 ∼ l㎛ 폭의 이랑 형상이 섬유축 방향에 형성되어 있는 것을 말한다.

골격 재료의 외관 밀도는 95 ∼ 350㎏/㎥, 바람직하게는 100 ∼ 300㎏/㎥, 보다 바람직하게는 100 ∼ 250kg/㎥ 이다. 외관 밀도가 95㎏/㎥ 보다 낮으면 세포 침입성은 좋지만 기계 강도가 낮다. 또 350kg/㎥ 보다 높으면 세포가 침입하는 것이 곤란해져 골격 재료로는 바람직하지 않다. 외관 밀도는 얻어진 집합체의 체적 (면적 × 높이) 과 질량을 측정하여 산출할 수 있다.

골격 재료를 이식에 이용하는 경우, 이식 초기에 있어서의 가중 압축에 견디는 기계적 강도가 필요하다. 본 발명의 골격 재료의 섬유 배향 방향을 가중 압축 방향을 향함으로써 압축에 대한 형상 안정성을 부여할 수 있다. 본 발명의 골격 재료의 압축 탄성률은 바람직하게는 0.5㎫ ∼ 5㎫, 보다 바람직하게는 1.5㎫ ∼ 5㎫ 이다.

본 발명의 골격 재료의 다공도는 바람직하게는 75 ∼ 90％, 보다 바람직하게는 78 ∼ 88％ 이다. 다공도는 다공체의 용적에서 폴리머의 용적을 뺀 비율에 따라 구한다.

본 발명의 골격 재료를 구성하는 섬유는 생체 적합성 폴리머로 주로 이루어진다. 섬유는 반복 단위의 바람직하게는 80 ∼ 100몰％, 보다 바람직하게는 90 ∼ 100몰％ 는 생체 적합성 모노머에서 유래된 반복 단위로 이루어지는 것이 바람직하다. 생체 적합성 모노머로서 글리콜산, 락트산, 카프로락톤, 디옥사논 등을 들 수 있다. 또 생체 적합성 폴리머의 블렌드이어도 된다.

생체 적합성 폴리머는 생체 흡수성 폴리머인 것이 바람직하다. 생체 흡수성 폴리머는 바람직하게는 주로 지방족 폴리에스테르로 이루어진다. 지방족 폴리에스테르로는 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리디옥사논, 폴리트리메틸렌카보네이트, 폴리부틸렌숙시네이트, 폴리에틸렌숙시네이트 및 이들의 공중합체 등을 들 수 있다. 이들 중, 지방족 폴리에스테르로는 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프로락톤 및 이들의 공중합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 것이 바람직하다. 특히, 락트산과 글리콜산의 공중합체가 바람직하다. 공중합비는 바람직하게는 전자/후자 (몰) = 20/80 ∼ 80/20, 보다 바람직하게는 40/60 ∼ 75/25 이다.

생체 흡수성 폴리머 이외에도 폴리에스테르, 나일론, 폴리술폰, 폴리우레탄, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리메타크릴산메틸, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리염화비닐, 폴리실록산 등의 생체 적합성 폴리머도 다공체를 구성하는 폴리머로서 이용할 수 있다.

생체 적합성 폴리머의 고유 점도는 0.1 ∼ 1.4dL/g, 바람직하게는 0.4 ∼ 1.3dL/g, 보다 바람직하게는 0.6 ∼ 1.2dL/g (30℃, 헥사플루오로이소프로판올) 이다.

또 본 발명의 골격 재료에는 생체 적합성 폴리머 이외의 제 2 성분을 추가로 함유해도 된다. 그 성분으로는 인지질류, 당질류, 당지질류, 스테로이드류, 폴리아미노산류, 단백질류 및 폴리옥시알킬렌류, FGF (섬유아 세포 증식 인자), EGF (표피 증식 인자), PDGF (혈소판 유래 증식 인자), TGF-β (β 형 형질 전환 증식 인자), NGF (신경 증식 인자), HGF (간세포 증식 인자), BMP (골형성 인자) 등의 세포 증식 인자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 것이 바람직하다. 구체적으로는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤 등의 인지질류 및/또는 폴리갈락투론산, 헤파린, 콘드로이틴황산, 히알론산, 데르마탄황산, 콘드로이틴, 덱스트란황산, 황산화셀룰로오스, 알긴산, 덱스트란, 카르복시메틸키틴, 갈락토만난, 아라비아검, 트라가칸트검, 젤란검, 황산화젤란, 카라야검, 카라기난, 한천, 잔탄검, 커드란, 풀루란, 셀룰로오스, 전분, 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 글루코만난, 키틴, 키토산, 자일로글루칸, 렌티난 등의 당질류 및/또는 갈락토세레브로시드, 글루코세레브로시드, 글로보시드, 락토실세라미드, 트리헥소실세라미드, 파라글로보시드, 갈락토실디아실글리세롤, 술포퀴노보실디아실글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 글리코실폴리프레놀린산 등의 당지질류 및/또는 콜레스테롤, 콜산, 사포게닌, 디기톡신 등의 스테로이드류 및/또는 폴리아스파르트산, 폴리글루타민산, 폴리리신 등의 폴리아미노산 류 및/또는 콜라겐, 젤라틴, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌, 카세인, 케라틴, 세리신, 트롬빈 등의 단백질류 및/또는 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌프로필렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄에테르 등의 폴리옥시알킬렌류 등을 들 수 있다. 제 2 성분의 바람직한 함유량으로는, 생체 적합성 폴리머 100 중량부에 대하여 0.01 ∼ 50 중량부이다.

<제조 방법>

본 발명의 골격 재료는 제 1 ∼ 제 3 공정에 의해 제조할 수 있다.

(제 1 공정)

제 1 공정은 이른바 정전 방사법이다. 제 1 공정은 전극 사이에 형성된 정전장 내에 생체 적합성 폴리머를 함유하는 도프를 노즐로부터 토출하여 섬유를 형성하는 공정이다.

정전장은 한 쌍 또는 복수의 전극 사이에 형성된다. 전극은 금속, 무기물 또는 유기물의 어떠한 것에서도 도전성을 나타내는 것이면 된다. 또, 절연물 상에 도전성을 나타내는 금속, 무기물 또는 유기물의 박막을 갖는 것이어도 된다. 모든 전극에 고전압을 인가해도 된다. 이것은 예를 들어 전압값이 상이한 고전압의 전극이 2 개 (예를 들어 15㎸ 와 10㎸) 와, 어스에 연결된 전극의 합계 3 개의 전극을 이용하는 경우도 포함하거나, 또는 3 개를 초과하는 개수의 전극을 이용하는 경우도 포함한다. 일방의 전극이 노즐이고, 타방의 전극이 포집 전극인 것이 바람직하다.

전극간의 거리는 대전량, 노즐 치수, 방사액 유량, 방사액 농도 등에 의존하는데 10㎸ 정도일 때에는 5 ∼ 20㎝ 의 거리가 적당하다. 인가되는 정전기 전위는 바람직하게는 3 ∼ 100㎸, 보다 바람직하게는 5 ∼ 50㎸, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 30㎸ 이다.

도프는 생체 적합성 폴리머 및 용매를 함유한다. 생체 적합성 폴리머는 전술한 바와 같다. 도프 중의 생체 적합성 폴리머의 농도는 바람직하게는 1 ∼ 30 중량％, 보다 바람직하게는 2 ∼ 20 중량％이다. 생체 적합성 폴리머의 농도가 1 중량％ 보다 낮으면 농도가 지나치게 낮기 때문에 섬유를 형성하는 것이 곤란해져 바람직하지 않다. 또 30 중량％ 보다 높으면 얻어지는 섬유의 직경이 커져 바람직하지 않다.

용매는 생체 적합성 폴리머를 용해하고, 상압에서 비점이 200℃ 이하이며, 실온에서 액체인 물질이 바람직하다. 용매로서 예를 들어 염화메틸렌, 클로로포름, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 톨루엔, 테트라히드로푸란, 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로이소프로판올, 물, 1,4-디옥산, 사염화탄소, 시클로헥산, 시클로헥사논, N,N-디메틸포름아미드, 아세토니트릴 등을 들 수 있다. 이들 중, 생체 적합성 폴리머 특히 지방족 폴리에스테르의 용해성 등에서, 염화메틸렌, 클로로포름, 아세톤이 특히 바람직하다. 이들 용매는 단독으로 이용해도 되고, 복수의 용매를 조합해도 된다. 또 본 발명에 있어서는 본 목적을 저해하지 않는 범위에서 다른 용매를 병용해도 된다.

노즐의 구경은 바람직하게는 0.6 ∼ 1.5㎜ 이다. 도프를 노즐로부터 정전장 내에 공급하는 경우, 수 개의 노즐을 이용하여 섬유상 물질의 생산 속도를 높일 수도 있다.

토출은 주사기와 같은 피스톤을 갖는 시린지로 도프를 밀어냄으로써 실시할 수 있다. 또, 선단에 미세 구멍 (노즐) 을 갖는 관이어도 된다. 이 경우, 도프는 정전기 전위차에 의해 끌려 전극을 향해 예사(曳絲)된다. 섬유란 용매 가 증류 제거된 상태뿐만 아니라, 아직 용매를 함유하고 있는 상태도 포함한다.

노즐과 전극 사이에 정전 제거 장치를 이용하는 것이 바람직하다. 정전 제거 장치란 이온 에어를 섬유에 쐬여 이온 밸런스를 균일하게 유지하고, 전극에 닿기 전에 섬유의 대전 상태를 완화함으로써 공기 중에 분산시키는 장치이다. 이 장치를 이용함으로써 롤의 두께를 증가시킬 수 있다. 롤의 두께를 증가시킴으로써 직경이 큰 골격 재료를 얻을 수 있다.

(제 2 공정)

제 2 공정은 얻어진 섬유를, 회전하는 권취축을 중심으로 권취 퇴적시키고, 섬유가 권취축과 평행한 면에 배향된 롤을 얻는 공정이다.

섬유는 노즐과 포집 전극 사이에 있는 권취 장치의 권취축을 중심으로 퇴적시킨다. 권취축의 형상은 원주상이어도 되고, 각주상이어도 된다.

골격 재료의 평균 외관 밀도는 권취축의 회전수에 의존하기 때문에, 권취축의 회전수를 컨트롤함으로써 원하는 평균 외관 밀도를 갖는 골격 재료를 얻는 것이 가능해진다. 구체적으로는, 회전수가 높은 경우에 있어서는 얻어지는 골격 재료의 평균 외관 밀도는 높다. 그에 반해, 회전수가 낮은 경우에 있어서는 얻어지는 골격 재료의 평균 외관 밀도는 낮다. 권취축의 회전 속도는 바람직하게는 1 ∼ 1000회/분, 보다 바람직하게는 5 ∼ 200회/분이다.

얻어지는 롤은 권취축과 평행한 면에 대하여 대략 배향되어 있다. 롤의 형상은 원주상, 방추상 등 임의의 형상이다.

제 2 공정 후, 얻어진 롤에 대하여 열처리를 하는 것이 바람직하다. 열 처리 온도는 바람직하게는 40 ∼ 90℃ 이다. 열처리를 함으로써 섬유끼리가 열융착하여 우수한 압축 강도를 갖는 골격 재료를 얻을 수 있다.

제 1 및 제 2 공정을 도 1 ∼ 4 에 의해 설명한다. 도 1 은 시린지, 도 2 는 세관상의 토출기를 이용하는 예이다. 도 1 에 있어서, 도프 (2) 는 노즐 (1) 을 갖는 시린지의 도프 유지조 (3) 에 충전한다. 노즐 (1) 에는 고전압 발생기 (6) 에 의해 전압이 걸리고, 정전극 (4) 과 부전극 (5) 사이에 정전장이 형성되어 있다. 도프 (2) 를 노즐 (1) 로부터 밀어내면, 전하를 띤 도프가 정전장 내를 부전극 (5) 을 향해 이동하여 섬유가 형성된다.

또, 도 2 에 나타내는 방법으로 섬유를 형성할 수도 있다. 도프 (2) 는 노즐 (1) 을 갖는 세관상 토출기의 도프 유지조 (3) 에 충전한다. 도프 유지조 (3) 내에는 정전극 (4) 이 삽입되어 고전압 발생기 (6) 에 의해 전압이 걸려, 부전극 (5) 과의 사이에 정전장이 형성되어 있다. 토출기 선단의 노즐 (1) 과 부전극 (5) 의 거리를 조절하면, 노즐 (1) 로부터 전하를 띤 도프가 토출되고, 정전장 내를 부전극 (5) 을 향해 이동하여 섬유가 형성된다. 섬유는 부전극 (5) 의 앞에 있는 권취 장치 (7) 에 권취된다.

본 발명에 있어서는 도프 (2) 를 부전극 (5) 을 향해 예사하는 동안에, 용매가 증발하여 섬유가 형성된다. 통상적인 실온이면 권취 장치 (7) 에 포집될 때까지의 사이에 용매는 완전히 증발되는데, 만약 용매 증발이 불충분한 경우에는 감 압 조건하에서 예사해도 된다. 또, 예사되는 온도는 용매의 증발 거동이나 방사액의 점도에 의존하는데, 통상적으로는 0 ∼ 50℃ 이다.

도 3 및 도 4 는 정전 제거 장치 (8) 를 설치하는 예이다. 노즐 (1) 과 부전극 (5) 사이에 정전 제거 장치 (8) 를 설치하여 방사를 실시하고, 섬유를 권취하는 장치 (7) 에 의해 포집할 수 있다.

(제 3 공정)

제 3 공정은 얻어진 롤로부터 3 차원 구조체를 잘라내는 공정이다. 3 차원 구조체는 예를 들어 원통형의 천공기를 이용하여 도 5 에 나타내는 바와 같이 도려 내어 뚫을 수 있다. 도 5 에 있어서, 3 차원 구조체의 높이 방향과 섬유의 배향 방향을 평행하게 도려 내어 뚫은 (10) 것이 바람직하다. 또, 3 차원 구조체의 높이 방향과 섬유의 배향 방향이 수직이 되도록 도려 내어 뚫은 (12) 것이 바람직하다. 골격 재료 (10) 는 골격 재료 (12) 에 비해 압축 강도가 우수하다.

<세포의 분화 증식>

본 발명의 골격 재료를 이용하여 세포를 분화 증식시킬 수 있다. 세포의 분화 증식은 생체 외, 생체 내의 어느 곳에서 실시해도 된다. 생체 외에서는 세포를 분화 증식하기 위한 배양 기재로서 이용할 수 있다. 생체 내에서는 본 발명의 골격 재료를 보철재로서 이용할 수 있다. 특히 본 발명의 골격 재료를 손상된 환부에 매립함으로써 생체 조직을 재생시킬 수 있다. 또는, 생체 외에서 본 발명의 골격 재료에 세포를 배양한 것을 보철재로서 환부에 매립해도 된다. 생체 조직으로는 예를 들어 골연골 조직을 들 수 있다.

실시예에서 사용한 재료, 측정 방법은 이하와 같다.

(1) 락트산-글리콜산 공중합체 ; LACTEL (DL 락트산/글리콜산 공중합체, 몰비 = 50/50, 고유 점도 : 1.05dL/g, 30℃, 헥사플루오로이소프로판올, Absorbable Polymers International 사 제조)

(2) 염화메틸렌, 에탄올, 포름알데히드 ; 와코 순약 공업 (주) 제조

(3) 래트 간엽계 간세포 ; 다이닛폰 스미토모 제약 (주) 제조

(4) MEM (Minimum Essential Medium), FBS (Fetal Bovine Serum), PBS (Phosphate-bufferd Saline), 항생 물질-항진균제 (Antibiotic-Antimycotic), 0.05％ Trypsin-EDTA 용액 : Invitrogen 제조

(5) L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium salts n-hydrate (함수량 26.7％), β-glycerophosphate disodium n-hydrate, Dexamethason, TritonX-100, Toluidine Blue ; Sigma 제조

(6) Pico Green (등록 상표) ds DNA Quantitation Kit ; Molecular Probe 제조

<실시예 1>

(도프의 조제)

락트산-글리콜산 공중합체 (몰비 = 50/50) 를 염화메틸렌과 에탄올의 혼합 용매에 용해하여 15 중량％ 의 도프를 조제하였다.

(방사)

도 4 에 나타내는 장치를 이용하여 정전 방사법으로 섬유의 집합체로 이루어 지는 원통체상의 롤을 얻었다. 노즐 (1) 의 내경은 1.3㎜ 이다. 노즐 (1) 에서 권취 장치 (7) 까지의 거리는 20㎝, 노즐 (1) 에서 정전 제거 장치 (8) 까지의 거리는 35㎝ 로 하였다. 인가 전압은 15㎸ 로 하였다. 노즐 (1) 과 부전극 (5) 사이에 권취 장치 (7) 및 카스가 전기 (주) 에서 제조된 정전 제거 장치 (8) 를 설치하였다. 도프 유지조 (3) 에는 정전극 (4) 을 삽입하였다. 권취 장치 (7) 의 회전수는 100rpm 으로 설정하였다.

도프 유지조 (3) 에 도프를 넣고, 노즐 (1) 과 부전극 (5) 의 거리를 조정하여 섬유를 노즐 (1) 로부터 토출시켰다. 토출을 120 분간 계속하여, 섬유를 회전하는 권취 장치 (7) 에서 권취 원통체상의 롤을 얻었다. 롤을 항온기에 넣고, 80℃ 로 10 분간 유지하여 열처리를 하였다.

(잘라냄)

얻어진 롤로부터 도 5 에 나타내는 요령으로, 생체 검사 트레판 (카이 인더스트리 (주) 제조) 을 이용하여 도 5 중의 10 으로 나타내는 직경 5㎜ × 높이 5㎜ 의 원통형의 골격 재료를 잘라내었다.

(특성 평가)

얻어진 골격 재료의 특성을 이하의 방법으로 측정하였다. 그 결과를 표 1 에 나타낸다.

(1) 섬유의 직경

섬유의 직경은 디지털 현미경 (주식회사 KEYENCE, VHX DIGITAL MICROSCOPE) 을 이용하여 또는 주사형 전자 현미경 (닛폰 전자 제조, 배율 200 배) 으로 육안으 로 관찰하였다. 전자 현미경 관찰에 있어서 1 시야에 대하여 임의의 10 개를 선택하여 계측하고, 이 조작을 5 시야에 대하여 실시하여 합계 50 개의 평균값을 산출하였다. 단, 섬유 형성 과정에서 발생한 괘상의 이물질, 섬유끼리가 융착하여 번들상으로 되어 있는 것은 계측 대상에서 제외하였다.

(2) 골격 재료의 외관 밀도

골격 재료의 외관 밀도는 하기 식에 따라 산출하였다.

ρ = 4m/πd²h

(ρ : 다공체의 외관 밀도, m : 질량, d : 직경, h : 높이)

(3) 골격 재료의 다공도

골격 재료의 다공도는 하기 식에 따라 산출하였다.

ε = 1-ρ/ρ₀

(ε : 골격 재료의 다공도, ρ : 다공체의 외관 밀도, ρ₀ : 폴리머의 고유 밀도)

(4) 압축 강도

압축 강도는 도 5 의 (10) 에 대응하는 골격 재료에 대하여, JISK7220 에 준거하여 측정하였다. 즉, 섬유가 원통체의 높이 방향과 평행하게 배향되어 있는 골격 재료에 대하여 측정하였다. 시험편을 재료 시험기의 가압면 사이에 두고, 시험편의 중심선을 가압면의 중심선에 일치시키고, 또한, 시험편의 상면과 하면이 가압면과 평행한 것을 확인하였다. 시험 속도 10㎜/min 로 일정 속도로 시험편 에 하중을 가하고, 압축 한계까지 측정을 하였다.

<실시예 2>

(도프의 조제)

실시예 1 에서 동일한 락트산-글리콜산 공중합체를 이용하여 10 중량％ 가 되도록 조제하였다.

(방사)

토출 시간을 90 분간으로 하고, 열처리를 70℃ 에서 10 분간 실시하는 것 이외는 실시예 1 과 같은 방법으로 섬유의 집합체로 이루어지는 원통체상의 롤을 얻었다.

(잘라냄)

얻어진 롤로부터 실시예 1 과 동일한 방법으로, 도 5 의 10 에 대응하는 직경 5㎜ × 높이 5㎜ 의 원통형 골격 재료를 잘라내었다. 도 5 의 10 에 대응하는 골격 재료의 저면에 평행한 단면의 현미경 사진 (배율 15 배) 을 도 6 (상저면) 및 도 7 (하저면) 에 나타낸다. 섬유가 층상으로 퇴적되어 있는 것을 알 수 있다 (특성 평가).

실시예 1 과 동일한 방법으로 특성을 측정하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.

(골격 재료의 생물학적 평가)

(세포의 조제)

골격 재료의 생물학적 평가를 이하의 방법에 따라 실시하였다. 래트 간 엽계 간세포를 15％ FBS 및 1％ Antibiotic-Antimycotic 을 함유하는 MEM 중에서, 37℃, 5％ CO₂ 하에서 3 계대까지 배양을 하였다.

(세포 파종, 배양)

얻어진 골격 재료에, 조제한 래트 간엽계 간세포를 6.0 × 10⁶개/c㎥ 가 되도록 파종하고, 15％ FBS 및 1％ Antibiotic-Antimycotic, 10μM dexamethasone, 50μM L-Ascorbic acid 2-phosphate magnesium salts n-hydrate, 10mM β-glycerophosphate disodium n-hydrate 를 첨가한 MEM 중에서, 37℃, 5％ CO₂ 인큐베이터에서 12 일간 배양하였다. 배지 교환은 주 3 회 실시하였다.

(평가)

배양 1 일째, 6 일째, 12 일째에 골격 재료를 잘라내고, DNA 량의 측정 및 조직학적 평가를 이하의 방법에 따라 실시하였다.

(1) DNA 량

DNA 량은 Pico Green (등록 상표) ds DNA Quantitation Kit 의 측정 매뉴얼에 따라 실시하였다. 측정 시료는 0.2％ Triton-X100 으로 동결·융해를 3 회 반복한 후, 초음파 파쇄하여 세포 현탁액을 얻고, 그것으로부터 추출액을 조제하였다. 96 구멍 마이크로 플레이트에 100㎕ 의 효소 처리를 한 측정 시료를 넣고, TE (pH7.5) 로 200 배 희석한 Pico Green (등록 상표) ds DNA Quantitation Reagent 를 100㎕ 첨가하여, 여기광 485㎚, 형광 535㎚ 의 파장으로 형광의 측정을 하였다. 표준 DNA 용액의 값으로부터 검량선을 작성하고, 그것을 기초로 측정 시료의 DNA 량을 산출하였다. 결과를 표 2 에 나타낸다. DNA 량은 증식된 세포수에 비례한다.

(2) 조직학적 평가

조직학적 평가는 미리 샘플링시에 골격 재료를 10％ 포름알데히드에 침지시켜 두었다. 염색하기 전에, 증류수로 골격 재료를 세정하고 100％ 에탄올에 1 시간 침지를 2 회, 90％ 에탄올 1 시간 침지, 70％ 에탄올 1 시간 침지로 단계적으로 희석하면서 세정하였다. 이것을 증류수에 15 분 침지시킴으로써 세정한 후, 0.4％ 톨루이딘 블루 수용액에 1 분 침지시켰다. 그 후, 1 분간의 유수 세정을 하고 여분의 염색액을 떨어뜨려, 디지털 현미경으로 450 배로 관찰하였다.

(3) 결과

DNA 량의 측정 결과를 표 2 에 나타낸다. 또 배양 1 일째, 12 일째의 골격 재료의 염색 사진을 각각 도 8 및 도 9 에 나타낸다. 배양 12 일째의 골격 재료는 1 일째에 비해 염색 농도가 높고, 또 염색 범위가 골격 재료의 심부까지 도달하여, 세포의 증식과 연골 기질이 양호하게 생성되어 있는 것을 알 수 있다.

<실시예 3>

(골격 재료의 제조)

실시예 2 와 동일한 조작을 반복하여, 도 5 의 12 에 대응하는 직경 5㎜ × 높이 5㎜ 의 원통형 골격 재료를 얻었다. 그 특성을 측정한 결과를 표 1 에 나타낸다.

도 5 의 12 에 대응하는 골격 재료의 저면에 수직인 단면의 현미경 사진 (배 율 200 배) 을 도 10 에 나타낸다. 섬유가 면 방향으로 배향되어 있는 것을 알 수 있다. 또 도 5 의 (12) 에 대응되는 골격 재료의 저면에 평행한 단면의 현미경 사진 (배율 15 배) 을 도 11 (상저면) 및 도 12 (하저면) 에 나타낸다. 섬유가 그물코와 같이 치밀하게 퇴적되어 있는 것을 알 수 있다.

(생물학적 평가)

얻어진 골격 재료를 이용하여, 실시예 2 와 동일한 방법으로 세포를 배양하고 DNA 량을 측정하였다. 그 결과를 표 2 에 나타낸다. 또 배양 1 일째, 12 일째의 골격 재료의 염색 사진을 도 13 및 도 14 에 나타낸다. 실시예 2 와 마찬가지로, 배양 12 일째의 골격 재료는 1 일째의 그것에 비해 염색 농도가 높고, 또 염색 범위가 골격 재료의 표면에서 심부로 확대되고 있어 양호한 세포 증식과 기질 생성을 알 수 있었다.

발명의 효과

본 발명의 골격 재료는 기계적 강도가 우수하고, 이식 초기에 있어서의 가중 압축에 견딜 수 있다. 따라서 연골 손상부 등의 기계적 특성이 필요시되는 부위에 사용할 수 있다. 본 발명의 골격 재료는 생체 적합성 폴리머로 구성되어 있기 때문에 생체에 대한 악영향이 없다. 본 발명의 골격 재료는 일정한 섬유 밀도를 가져, 세포가 용이하게 침입할 수 있고, 또한 산소 및 영양의 보급, 이산화탄소나 노폐물의 배출을 신속히 실시할 수 있다. 따라서 세포를 양호하게 증식시킬 수 있다.

또 본 발명의 제조 방법에 따르면, 그 골격 재료를 간편한 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 따르면, 정전 방사법에 의해 얻어진 섬유를 회전하는 권취축에 퇴적시키기 때문에, 퇴적 방향으로 균일한 퇴적 밀도를 갖는 섬유 퇴적물이 얻어진다. 또, 권취축과 평행한 평면에 대해서도 균일한 섬유 퇴적물이 얻어진다. 또한, 섬유를 회전하는 권취축으로 권취함으로써 섬유에 일정한 장력이 걸려, 고밀도의 섬유 퇴적물이 얻어진다.

본 발명의 세포의 증식 방법에 따르면, 세포를 양호하게 증식시킬 수 있다. 또 본 발명의 생체 조직의 재생 방법에 따르면, 손상된 생체 조직을 양호하게 재생시킬 수 있다.

본 발명의 골격 재료는 재생 의료 분야에 있어서의 세포 배양 기재로서 유용하다. 또 본 발명의 골격 재료는 보철재, 그 중에서도 골연골 손상부 등의 기계적 특성이 중요한 부위에 있어서의 보철재로서 유용하다.

Claims

섬유의 집합체로 이루어지고, 2 개의 저면 및 측면으로 구성되는 3 차원 구조를 갖고,

(1) 섬유는 면 방향으로 배향되고,

(2) 섬유의 직경은 0.05 ∼ 50㎛ 이고,

(3) 섬유는 생체 적합성 폴리머로 주로 이루어지며,

(4) 외관 밀도는 95 ∼ 350㎏/㎥ 인 골격 재료.
제 1 항에 있어서,

섬유는 높이 방향에 평행한 면 방향으로 배향되어 있는 골격 재료.
제 1 항에 있어서,

섬유는 높이 방향과 수직인 면 방향으로 배향되어 있는 골격 재료.
제 1 항에 있어서,

섬유의 직경은 0.2 ∼ 40㎛ 인 골격 재료.
제 1 항에 있어서,

외관 밀도는 100 ∼ 250㎏/㎥ 인 골격 재료.
제 1 항에 있어서,

다공도가 75 ∼ 90％ 인 골격 재료.
제 1 항에 있어서,

높이가 0.5㎜ 이상인 골격 재료.
제 1 항에 있어서,

저면의 면적이 0.05 ∼ 8㎠ 인 골격 재료.
제 1 항에 있어서,

원통체 또는 다각주인 골격 재료.
제 1 항에 있어서,

높이 방향의 압축 탄성률이 0.5 ∼ 5㎫ 인 골격 재료.
제 1 항에 있어서,

생체 적합성 폴리머가 생체 흡수성인 골격 재료.
제 1 항에 있어서,

생체 적합성 폴리머가 지방족 폴리에스테르인 골격 재료.
제 1 항에 있어서,

지방족 폴리에스테르가 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프로락톤 및 이들 공중합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 골격 재료.
제 1 항에 있어서,

보철재 또는 세포 배양 기재인 골격 재료.
(1) 전극 사이에서 형성된 정전장 내에 생체 적합성 폴리머를 함유하는 도프를 노즐로부터 토출하여 섬유를 형성하고,

(2) 얻어진 섬유를 권취축을 중심으로 권취하여, 섬유가 권취축과 평행한 면의 방향으로 배향된 롤을 형성하고,

(3) 얻어진 롤로부터 3 차원 구조체를 잘라내는 공정을 포함하는 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 골격 재료의 제조 방법.
제 14 항에 있어서,

정전 제거 장치를 이용하여 섬유를 형성하는 제조 방법.
제 1 항에 기재된 골격 재료를 이용하여 세포를 분화 증식시키는 방법.
제 1 항에 기재된 골격 재료를 손상된 환부에 매립하여 생체 조직을 재생시키는 방법.