WO2007102606A1 - 足場材料 - Google Patents

足場材料 Download PDF

Info

Publication number
WO2007102606A1
WO2007102606A1 PCT/JP2007/054739 JP2007054739W WO2007102606A1 WO 2007102606 A1 WO2007102606 A1 WO 2007102606A1 JP 2007054739 W JP2007054739 W JP 2007054739W WO 2007102606 A1 WO2007102606 A1 WO 2007102606A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
scaffold material
fiber
fibers
material according
scaffold
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/054739
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Chiaki Fukutomi
Hiroaki Kaneko
Eiichi Kitazono
Mika Kayashima
Miyuki Nakayama
Original Assignee
Teijin Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Teijin Limited filed Critical Teijin Limited
Priority to CA002645541A priority Critical patent/CA2645541A1/en
Priority to US12/281,923 priority patent/US20090076530A1/en
Priority to JP2008503918A priority patent/JP5119144B2/ja
Priority to AU2007222949A priority patent/AU2007222949B2/en
Priority to EP07738224A priority patent/EP1994949A4/en
Publication of WO2007102606A1 publication Critical patent/WO2007102606A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/18—Macromolecular materials obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01D—MECHANICAL METHODS OR APPARATUS IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS
    • D01D5/00—Formation of filaments, threads, or the like
    • D01D5/0007—Electro-spinning
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F6/00—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof
    • D01F6/02—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof from homopolymers obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • D01F6/04—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof from homopolymers obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds from polyolefins
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F6/00—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof
    • D01F6/02—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof from homopolymers obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • D01F6/20—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof from homopolymers obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds from polymers of cyclic compounds with one carbon-to-carbon double bond in the side chain
    • D01F6/22—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof from homopolymers obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds from polymers of cyclic compounds with one carbon-to-carbon double bond in the side chain from polystyrene
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F6/00—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof
    • D01F6/58—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof from homopolycondensation products
    • D01F6/66—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof from homopolycondensation products from polyethers
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D04—BRAIDING; LACE-MAKING; KNITTING; TRIMMINGS; NON-WOVEN FABRICS
    • D04H—MAKING TEXTILE FABRICS, e.g. FROM FIBRES OR FILAMENTARY MATERIAL; FABRICS MADE BY SUCH PROCESSES OR APPARATUS, e.g. FELTS, NON-WOVEN FABRICS; COTTON-WOOL; WADDING ; NON-WOVEN FABRICS FROM STAPLE FIBRES, FILAMENTS OR YARNS, BONDED WITH AT LEAST ONE WEB-LIKE MATERIAL DURING THEIR CONSOLIDATION
    • D04H3/00—Non-woven fabrics formed wholly or mainly of yarns or like filamentary material of substantial length
    • D04H3/02—Non-woven fabrics formed wholly or mainly of yarns or like filamentary material of substantial length characterised by the method of forming fleeces or layers, e.g. reorientation of yarns or filaments
    • D04H3/07—Non-woven fabrics formed wholly or mainly of yarns or like filamentary material of substantial length characterised by the method of forming fleeces or layers, e.g. reorientation of yarns or filaments otherwise than in a plane, e.g. in a tubular way
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers

Definitions

  • the present invention relates to a scaffold material used for cell growth.
  • the present invention relates to a scaffold material comprising an assembly of fibers and suitable for a prosthetic material or a cell culture substrate.
  • the extracellular matrix functions as a scaffold and constructs tissues.
  • the scaffold material prosthetic material
  • the properties required for this scaffold material include 1) bioabsorbability, 2) cell adhesion, 3) porosity, 4) mechanical strength and the like.
  • synthetic polymers polyglycolic acid, polylactic acid, polystrength prolacton, etc.
  • natural polymers collagen, gelatin, elastin, hyaluronic acid, algin
  • Acid chitosan, etc.
  • inorganic materials hydroxypatite,] 8-tricalcium phosphate
  • porosity As mentioned above, one of the important properties required for scaffold materials (prosthetic materials) is porosity. This is important in terms of providing sufficient oxygen and nutrients to the cells necessary to regenerate the tissue and expelling carbon dioxide and waste products quickly. For this reason, freeze-drying methods, phase separation methods, foaming methods, etc. have been proposed in order to achieve the porosity of the scaffold material.
  • the structure obtained by the freeze-drying method or the phase separation method has a pore-like shape, which makes it difficult for cells to invade and has an unsatisfactory problem as a scaffold material.
  • the structure obtained by the foaming method has pores alone, so that cells can enter the structure. There is a problem that it is difficult.
  • Non-patent Document 1 it has been proposed to produce a scaffold material in which nanofibers are deposited in a planar shape by an electrospinning method, and to culture cells using this scaffold material.
  • the fibers are collected on a flat collecting electrode, so if the fibers are deposited to a certain thickness or more, the electrodes are covered with deposits, making it difficult to maintain a constant potential difference.
  • the density force of fiber deposits s has the disadvantage of changing in the direction of deposition.
  • deposits are uneven in the deposition density even in the plane direction perpendicular to the deposition direction. Therefore, in order to use this deposit as a scaffold for cell growth, it is necessary to make the deposition density uniform and improve the mechanical strength.
  • Patent Document 1 WO 2 0 0 4/8 8 0 2 4
  • Patent Document 2 (Patent Document 2) Special Table 2 0 0 4— 5 2 0 8 5 5
  • Non-Patent Document 1 Publ ished online 25 March 2002 in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com) Disclosure of Invention
  • An object of the present invention is to provide a scaffold material suitable for cell growth in which fibers are gathered at a high density.
  • An object of the present invention is to provide a scaffold material for cell growth having excellent mechanical strength.
  • An object of the present invention is to provide a scaffold material capable of favorably growing cells.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing the scaffold material.
  • an object of the present invention is to provide a method for proliferating cells using the scaffold material. To provide a law.
  • Another object of the present invention is to provide a method for regenerating a living tissue using the scaffold material.
  • the present inventor has found that when a fiber is produced by an electrospinning method and the obtained fiber is deposited on a rotating winding shaft, a fiber deposit having a uniform deposition density in the deposition direction can be obtained.
  • the obtained fiber deposit was found to have an appropriate strength and fiber density as a scaffold material for cell growth.
  • the present invention is based on these findings.
  • the present invention comprises a three-dimensional structure composed of an aggregate of fibers, composed of two bottom surfaces and side surfaces,
  • the diameter of the fiber is 0.05-50 ⁇
  • the fibers are mainly composed of biocompatible polymers
  • the present invention also provides: (1) A dope containing a biocompatible polymer is ejected from a nozzle in an electrostatic field formed between electrodes to form fibers;
  • the present invention includes a method of dividing and proliferating cells using the scaffold material. Also included is a method of regenerating biological tissue by implanting the scaffold material into a damaged affected area.
  • Fig. 1 An example of an apparatus used in the electrospinning method.
  • Fig. 2 An example of an apparatus used in the electrospinning method.
  • Fig. 3 An example of a device used in the antistatic method.
  • Fig. 4 shows an example of a device used in the antistatic method.
  • FIG. 5 shows an example of a method for cutting out a scaffold material in the production method of the present invention.
  • FIG. 6 is an upper bottom image of the scaffold material obtained in Example 2.
  • FIG. 7 is a lower bottom image of the scaffold material obtained in Example 2.
  • FIG. 8 is a stained image of the first day of culture using the scaffold material in Example 2.
  • FIG. 9 is a stained image of the first day of culture 1 using the scaffold material in Example 2.
  • FIG. 10 is an upper bottom image of the scaffold material obtained in Example 3.
  • FIG. 1 1 is a lower bottom image of the scaffold material obtained in Example 3.
  • FIG. 12 is an example of a cross-sectional image of the scaffold material obtained in Example 3.
  • FIG. 1 3 is a stained image of the first day of culture using the scaffold material in Example 3.
  • FIG. 14 is a stained image of culture on day 1 using the scaffold material in Example 3.
  • the scaffold material of the present invention has a three-dimensional structure composed of two bottom surfaces and side surfaces.
  • the shape of the bottom can be any shape such as a circle, ellipse, or rectangle.
  • the bottom surface may be an uneven curved surface.
  • the shape and size of the two bottom surfaces may be different.
  • the area of the bottom surface is preferably 0 0 5 to 8 cm 2, more preferably 0 1: a L cm 2...
  • the side surface may be a continuous curved surface or a plurality of surfaces. That is, the shape of the scaffold material of the present invention is preferably a three-dimensional structure such as a cylindrical body or a polygonal column.
  • the scaffold material of the present invention has a three-dimensional structure, that is, a lateral direction (X axis), a longitudinal direction (y axis), and a height direction (z axis). In this respect, it is different from a planar nonwoven fabric having a spread in the horizontal direction (X axis) and the vertical direction (y axis).
  • the height direction means a direction perpendicular to one bottom surface.
  • the height of the scaffold material is preferably 0.5 mm or more, more preferably 2 mm or more. Regardless of the upper limit of the height, it can be said that it depends on the site used as the prosthetic material. If the height is less than 0.5 mm, the mechanical strength is low, and it is not preferable as a prosthetic material for tissues with high loads such as knee joints.
  • the scaffold material of the present invention can be used, for example, to be embedded in a damaged part of a living body and to proliferate cells on the surface of the prosthesis. Scaffolding material can be provided in any desired shape.
  • the scaffold material of the present invention comprises an aggregate of fibers.
  • the orientation in the plane direction means that the fibers are oriented substantially parallel to a specific plane. As long as the fiber is parallel to this specific plane, the fiber may be oriented in any of the lateral direction, the longitudinal direction, and the oblique direction.
  • the fibers are oriented substantially parallel to the plane indicated by the broken line in the cylindrical body indicated by 10 or 12 in FIG. Further, the dotted line portion shown in 10 or 12 of FIG. 5 may form a concentric curved surface.
  • the orientation of the fibers on the plane is random.
  • the fibers are preferably oriented in a plane direction parallel to the height direction as indicated by 10 in FIG. Or, as shown in Fig. 5, 1 2, the fibers are perpendicular to the height direction. It is preferable to be oriented in the direction.
  • the diameter of the fiber is 0.05 to 5 0. If the fiber diameter is smaller than 0.05 m, the strength of the scaffold material cannot be maintained, which is not preferable. On the other hand, when the fiber diameter is larger than 50 m, the specific surface area of the fiber is small and the number of engrafted cells is reduced.
  • the diameter of the fiber is preferably 0.2 to 50 m, more preferably 0.2 to 40 mm. The diameter of the fiber can be determined by observing the scaffold material with, for example, a scanning electron microscope (magnification of about 200 times).
  • the arbitrary cross section of the fiber may be a substantially perfect circle or an irregular shape. If the cross section of an arbitrary fiber is irregular, the specific area of the fiber increases, so that a sufficient area for the cell to adhere to the fiber surface can be taken during cell culture.
  • an arbitrary cross section of the fiber is an irregular shape refers to any shape in which the arbitrary cross section of the fiber does not take a substantially circular shape, and the fiber surface has a uniform recess and / or protrusion. And the case where it is roughened.
  • the irregular shape includes fine concave portions on the fiber surface, fine convex portions on the fiber surface, concave portions formed in a streak shape in the fiber axis direction on the fiber surface, convex portions formed in a streaky shape in the fiber axis direction on the fiber surface and It is preferable to use at least one selected from the group consisting of fine pores on the fiber surface, and these may be formed singly or in combination.
  • the above-mentioned “fine concave portions” and “fine convex portions” mean that 0.1 to lm concave portions or convex portions are formed on the fiber surface, and “fine pores” means , 0.1 to 1 zm of the pores are present on the fiber surface.
  • the concave portion and the Z or convex portion formed in the above-described streak shape means that a hook shape having a width of 0.1 to 1 m is formed in the fiber axis direction.
  • Apparent density of the scaffold is, 9 5 ⁇ 3 5 0 kg / m 3, preferably 1 0 0 ⁇ 3 0 0 kg / m 3, more preferably 1 0 0 ⁇ 2 5 0 k gZm 3 .
  • Low and enteroinvasive than the apparent density of 9 5 kg / m 3 has a low mechanical strength of the good ones. If it is higher than 3500 kg Zm 3, it is difficult for cells to enter, and the preferred apparent density as a scaffold material is calculated by measuring the volume (area X height) and mass of the obtained aggregate. can do.
  • scaffold materials When scaffold materials are used for transplantation, they must have mechanical strength that can withstand weight compression in the initial stage of transplantation.
  • Shape stability against compression can be imparted by directing the fiber orientation direction of the scaffold material of the present invention in the weighted compression direction.
  • the compression elasticity of the scaffold material of the present invention is preferably 0.5 MPa to 5 MPa, more preferably 1.5 MPa to 5 MPa.
  • the porosity of the scaffold material of the present invention is preferably 75 to 90%, more preferably 78 to 88%.
  • the porosity is determined by the ratio of the volume of the porous material minus the volume of the polymer.
  • the fibers constituting the scaffold material of the present invention are mainly composed of a biocompatible polymer.
  • the fiber is preferably composed of 80 to 100 mol% of repeating units, more preferably 90 to 100 mol% of repeating units derived from biocompatible monomers.
  • biocompatible monomers include glycolic acid, lactic acid, force prolactone, and dioxanone. It may also be a blend of biocompatible polymers.
  • the biocompatible polymer is preferably a bioabsorbable polymer.
  • the bioabsorbable polymer is preferably mainly composed of an aliphatic polyester.
  • the aliphatic polyester include polydaricholic acid, polylactic acid, poly force prolactone, polydioxanone, polytrimethylene carbonate, polybutylene succinate, polyethylene succinate, and copolymers thereof.
  • the aliphatic polyester is preferably at least one selected from the group consisting of polydaricholic acid, polylactic acid, polystrength prolacton, and copolymers thereof.
  • a copolymer of lactic acid and glycolic acid is preferred.
  • biocompatible polymers such as polyester, nylon, polysulfone, polyurethane, polyethylene, polypropylene, polymethyl methacrylate, polyhydroxychetyl methacrylate, polychlorinated vinyl, and polysiloxane are also available. It can be used as a polymer constituting the porous body.
  • the intrinsic viscosity of the biocompatible polymer is from 0.1 to: I .4 d LZ g, preferably 0.0. 4-1.3 d LZ g, more preferably 0.6-1.2 d LZ g (30 ° C., hexafluoroisopropanol).
  • the scaffold material of the present invention may further contain a second component other than the biocompatible polymer.
  • the ingredients include phospholipids, carbohydrates, glycolipids, steroids, polyamino acids, proteins, and polyoxyalkylenes, FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), PDGF (Platelet-derived growth factor), TGF—; 6 (; 6 type transforming growth factor), NGF (nerve growth factor), HG F (hepatocyte growth factor), BMP (bone morphogenetic factor) and other cell growth factors
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • PDGF Platinum-derived growth factor
  • TGF— fibroblast growth factor
  • 6 6 type transforming growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • HG F hepatocyte growth factor
  • BMP bone morphogenetic factor
  • the scaffold material of the present invention can be produced by the first to third steps.
  • the first step is the so-called electrospinning method.
  • the first step is a step in which a fiber containing a biocompatible polymer is discharged from a nozzle in an electrostatic field formed between electrodes to form fibers.
  • the electrostatic field is formed between a pair or a plurality of electrodes.
  • the electrode may be any metal, inorganic, or organic material that exhibits electrical conductivity.
  • a thin film of a metal, an inorganic material, or an organic material exhibiting conductivity may be provided over an insulator.
  • a high voltage may be applied to any electrode. This includes, for example, the case of using a total of three electrodes, one with high voltage (for example, 15 kV and 10 kV) with different voltage values, and the other connected to earth, or more than three. This includes the use of several electrodes. It is preferable that one electrode is a nozzle and the other electrode is a collecting electrode.
  • the applied electrostatic potential is preferably 3 to 100 kV, more preferably 5 to 50 kV, and even more preferably 5 to 30 kV.
  • the dope contains a biocompatible polymer and a solvent.
  • the biocompatible polymer is as described above.
  • the concentration of the biocompatible polymer in the mold is preferably 1 to 30% by weight, more preferably 2 to 20% by weight. If the concentration of the biocompatible polymer is lower than 1% by weight, it is not preferable because the concentration is too low to form fibers. On the other hand, if it is higher than 30% by weight, the diameter of the resulting fiber is unfavorable.
  • the solvent is preferably a substance that dissolves the biocompatible polymer, has a boiling point of 200 ° C. or less at normal pressure, and is a liquid at room temperature.
  • the solvent include methylene chloride, chloroform, acetone, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, toluene, tetrahydrofuran, 1, 1, 1, 3, 3, 3, 3-hexafluoroisopropyl.
  • Examples include propanol, water, 1,4-dioxane, carbon tetrachloride, cyclohexane, cyclohexanone, N, N-dimethylformamide, and acetonitrile.
  • methylene chloride, chloroform, and acetone are particularly preferable from the viewpoint of solubility of biocompatible polymers, particularly aliphatic polyesters.
  • These solvents may be used alone, or a plurality of solvents may be combined. In the present invention, other solvents may be used in combination as long as the object is not impaired.
  • the nozzle diameter is preferably 0.6 to 1.5 mm.
  • several nozzles can be used to increase the production rate of the fibrous material.
  • the discharge can be performed by extruding the dope with a syringe having a piston such as a syringe.
  • a tube having a fine hole (nozzle) at the tip may also be used.
  • the dope is pulled by the electrostatic potential difference and threaded toward the electrode.
  • the fiber includes not only the state where the solvent is distilled off but also the state where the solvent is still contained. It is preferable to use an electrostatic eliminator between the nozzle and the electrode.
  • An electrostatic removal device is a device that disperses the air in the air by applying ion air to the fiber to maintain a uniform ion balance and relaxing the charged state of the fiber before reaching the electrode. By using this device, the thickness of the roll can be increased. By increasing the thickness of the roll, a scaffold material having a large diameter can be obtained.
  • the second step is a step of winding and depositing the obtained fiber around a rotating winding shaft to obtain a roll in which the fiber is oriented in a plane parallel to the winding shaft.
  • the fiber is deposited around the take-up shaft of the take-up device between the nozzle and the collecting electrode.
  • the winding shaft may be cylindrical or prismatic.
  • the average apparent density of the scaffold material depends on the number of revolutions of the winding shaft, it is possible to obtain a scaffold material having a desired average apparent density by controlling the number of revolutions of the winding shaft. Specifically, when the rotational speed is high, the average apparent density of the obtained scaffold material is high. On the other hand, when the rotational speed is low, the average apparent density of the obtained scaffold material is low.
  • the rotation speed of the winding shaft is preferably :! To 1000 times / min, more preferably 5 to 200 times Z min.
  • the resulting roll is substantially oriented with respect to a plane parallel to the winding axis.
  • the shape of the roll may be any shape such as a columnar shape or a spindle shape.
  • the heat treatment temperature is preferably 40 to 90 ° C.
  • FIGS. Fig. 1 shows an example using a syringe
  • Fig. 2 shows an example using a thin tube-like dispenser.
  • the syringe (2) fills the syringe holding tank (3) of the syringe having the nozzle (1).
  • a voltage is applied to the nozzle (1) by a high voltage generator (6), and an electrostatic field is formed between the positive electrode (4) and the negative electrode (5).
  • the dope (2) is pushed out of the nozzle (1), the charged dopant moves in the electrostatic field toward the negative electrode (5), forming a fiber.
  • the fiber can be formed by the method shown in FIG.
  • the nozzle (2) is filled into a nozzle holding tank (3) of a thin tubular discharger having a nozzle (1).
  • a positive electrode (4) is inserted into the dope holding tank (3), and a voltage is applied by a high voltage generator (6) to form an electrostatic field with the negative electrode (5).
  • the distance between the nozzle (1) at the tip of the discharger and the negative electrode (5) is adjusted, the charged dope is discharged from the nozzle (1) and moves in the electrostatic field toward the negative electrode (5).
  • a fiber is formed.
  • the fiber is wound on a winding device (7) in front of the negative electrode (5).
  • the solvent evaporates to form fibers.
  • the solvent completely evaporates until it is collected by the winder (7), but if the solvent is insufficiently evaporated, it may be spun under reduced pressure conditions.
  • the spinning temperature is a force that depends on the evaporation behavior of the solvent and the viscosity of the spinning solution. Usually, it is 0-50 ° C.
  • Figures 3 and 4 are examples of installing the static eliminator (8).
  • An electrostatic removal device (8) is installed between the nozzle (1) and the negative electrode (5) to perform spinning, and the fiber can be collected by the winding device (7).
  • the third step is a step of cutting a three-dimensional structure from the obtained roll.
  • the 3D structure can be pierced as shown in Fig. 5 using, for example, a cylindrical punch.
  • FIG. 5 it is preferable to penetrate the height direction of the three-dimensional structure and the fiber orientation direction in parallel (10). Further, it is preferable that the three-dimensional structure is perforated so that the height direction of the three-dimensional structure is perpendicular to the fiber orientation direction (12).
  • the scaffold material (10) is superior in compressive strength to the scaffold material (12). Differentiation and proliferation of cells>
  • Cells can be differentiated and proliferated using the scaffold material of the present invention. Differentiation and proliferation of cells can be performed in vitro or in vivo. In vitro, they can be used as a culture substrate for differentiating and proliferating cells. In vivo, the scaffold material of the present invention can be used as a prosthetic material. In particular, the living tissue can be regenerated by embedding the scaffold material of the present invention in the affected area. Alternatively, a material obtained by culturing cells on the footpad material of the present invention in vitro may be embedded in the affected area as a prosthetic material. Examples of the living tissue include osteochondral tissue. Example
  • Rat mesenchymal stem cells manufactured by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
  • MEM Minimum Essential Medium 3 ⁇ 4 FBS (Fetal Bovine Serum), PBS (Phosphate-buff erd Saline), Antibiotic-Antimycotic,
  • a cylindrical roll made of an aggregate of fibers was obtained by an electrostatic spinning method.
  • the inner diameter of the nozzle (1) is 1.3 mm.
  • the distance from the nozzle (1) to the winding device (7) was 20 cm, and the distance from the nozzle (1) to the static eliminator (8) was 35 cm.
  • the applied voltage was 15 kV.
  • a winding device (7) and an electrostatic removal device (8) manufactured by Kasuga Electric Co., Ltd. were installed between the nozzle (1) and the negative electrode (5).
  • the positive electrode (4) was inserted into the dope holding tank (3).
  • the rotation speed of the winding device (7) was set to 100 rpm.
  • a dope was placed in the dope holding tank (3), the distance between the nozzle (1) and the negative electrode (5) was adjusted, and the fibers were discharged from the nozzle (1). Discharging was continued for 120 minutes, and a winding cylindrical roll was obtained with a winding device (7) that rotates the fiber. The roll was placed in a thermostat and kept at 80 ° C for 10 minutes for heat treatment.
  • a cylindrical scaffold material having a diameter of 5 mm and a height of 5 mm as shown in 10 in FIG. 5 was cut out using a biopsy trepan (manufactured by KAI Industries Co., Ltd.) in the manner shown in FIG.
  • the diameter of the fiber was visually observed with a digital microscope (KEYENCE, VHX DIGITAL MICROSCOPE) or with a scanning electron microscope (manufactured by JEOL Ltd., magnification 200 times). In electron microscope observation, select any 10 lines per field of view. This operation was carried out for 5 fields of view, and an average value of a total of 50 lines was calculated. However, lump-like foreign matters generated in the fiber formation process and those in which the fibers were fused and bundled were excluded from the measurement target.
  • the apparent density of the scaffold material was calculated by the following formula.
  • the porosity of the scaffold material was calculated by the following formula.
  • the compressive strength was measured according to J I SK72 20 for the scaffold material corresponding to (1 0) in FIG. That is, the measurement was performed on a scaffold material in which the fibers are oriented parallel to the height direction of the cylindrical body.
  • the test piece was placed between the pressing surfaces of the material testing machine, the center line of the test piece was aligned with the center line of the pressing surface, and it was confirmed that the upper and lower surfaces of the test piece were parallel to the pressing surface.
  • a load was applied to the specimen at a constant speed of 10 mmZmin and the measurement was performed up to the compression limit.
  • Example 2 Using the same lactic acid monoglycolic acid copolymer as in Example 1, it was prepared to be 10% by weight.
  • a cylindrical roll made of an aggregate of fibers was obtained in the same manner as in Example 1 except that the discharge time was 90 minutes and the heat treatment was performed at 70 for 10 minutes.
  • Biological evaluation of the scaffold material was performed by the following method. Rat mesenchymal stem cells were cultured in MEM containing 15% FBS and l% Antibiotic-antimycotic for up to 3 passages at 37 ° C and 5 CO 2 .
  • the obtained scaffold material is seeded with prepared rat mesenchymal stem cells to 6.0 ⁇ 10 6 cells / cm 3 , and 15% FBS and l% Antibiotic- AnUmycotic, 10 M dexamethasone, 50 yM L - at Ascorbic acid 2-phosphate magnesium salts n -hydrate, 1 OmM j6- glycerophosphate disodium n- hydrate ME M in which was added and incubated 12 days at 37 ° C, 5% C0 2 incubator. The medium was changed 3 times a week.
  • the footpad material was taken out on the 1st, 6th, and 12th days of culture, and the amount of DNA and histological evaluation were performed by the following methods.
  • the amount of DNA was determined according to the measurement manual of Pico Green (registered trademark) ds DNA Quantitation Kit.
  • the sample to be measured was frozen and thawed three times with 0.2% Triton-X100, and then ultrasonically disrupted to obtain a cell suspension, from which an extract was prepared.
  • 9 Place a measurement sample that has been treated with 10 O enzyme in a 6-well microplate, add 100 1 of PicoGreen (registered trademark) ds DNAQuanUtation Reagent diluted 200-fold with ⁇ ( ⁇ 7.5), excitation light 485 nm, Fluorescence was measured at a wavelength of 535 nm.
  • a calibration curve was created from the values of the standard DNA solution, and the DNA amount of the measurement sample was calculated based on it. The results are shown in Table 2.
  • the amount of DNA is proportional to the number of cells grown To do.
  • the scaffold material was previously soaked in 10% formaldehyde at the time of sampling. Before staining, wash the scaffold material with distilled water, soak in 100% ethanol twice for 1 hour, 90% ethanol for 1 hour, 70% ethanol
  • Washing was carried out with immersion for 1 hour and dilution stepwise. This was washed by immersing it in distilled water for 15 minutes, and then immersed in 0.4% toluidine aqueous solution for 1 minute.
  • Table 2 shows the measurement results for the amount of DNA.
  • Figures 8 and 9 show dyeing photographs of the scaffold material on day 1 and day 12, respectively. Scaffolding material on the 12th day of culture has higher staining concentration than that on the 1st day, and the staining range has reached the deep part of the scaffolding material, indicating that cell growth and cartilage matrix are well produced. .
  • Example 2 The same operation as in Example 2 was repeated to obtain a cylindrical scaffold material having a diameter of 5 mm and a height of 5 mm corresponding to 12 in FIG. Table 1 shows the measured results.
  • Figure 10 shows a photomicrograph (200x magnification) of a cross section perpendicular to the bottom surface of the scaffold material corresponding to 12 in Fig. 5. You can see the force S that the fibers are oriented in the plane direction.
  • Figure 5 (1
  • Figure 1 shows a micrograph (magnification 15x) of the cross section parallel to the bottom surface of the scaffold material corresponding to 2).
  • Fig. 13 and Fig. 14 show staining photographs of the scaffold material on day 1 and day 12 of culture.
  • the scaffold material on the 12th day of culture has a higher staining concentration than that on the 1st day, and the staining range is deeper than the surface of the scaffold material. And found good cell growth and substrate production.
  • the scaffold material of the present invention is excellent in mechanical strength and can withstand weight compression in the initial stage of transplantation. Therefore, it can be used for parts that require mechanical characteristics such as cartilage damage. Since the scaffold material of the present invention is composed of a biocompatible polymer, there is no adverse effect on the living body.
  • the footpad material of the present invention has a constant fiber density, allows cells to easily enter, and can quickly supply oxygen and nutrients, and discharge carbon dioxide and waste products. Therefore, the cells can be grown well.
  • the scaffold material can be produced by a simple method.
  • the fibers obtained by the electrospinning method are deposited on the rotating take-up shaft, so that a fiber deposit having a uniform deposition density in the deposition direction can be obtained.
  • a uniform fiber deposit can be obtained with respect to a plane parallel to the winding axis.
  • a constant tension is applied to the fiber, and a high-density fiber deposit is obtained.
  • cells can be grown well.
  • damaged biological tissue can be regenerated well.
  • the scaffold material of the present invention is useful as a cell culture substrate in the field of regenerative medicine.
  • the scaffold material of the present invention is useful as a prosthetic material, especially a prosthetic material in a site where mechanical properties are important, such as an osteochondral lesion.

Abstract

本発明の目的は、機械的強度、細胞増殖性に優れ、細胞培養基材や補綴材として好適な足場材料を提供することにある。本発明は、繊維の集合体からなり、2つの底面および側面から構成される3次元構造を有し、(1)繊維は面方向に配向し、(2)繊維の直径は0.05～50μmであり、(3)繊維は生体適合性ポリマーから主としてなり、(4)見掛け密度は95～350kg/m3である、細胞増殖のための足場材料である。

Description

足場材料 技術分野
本発明は細胞増殖に用いる足場材料に関する。本発明は繊維の集合体からなり、 補綴材若しくは細胞培養基材に好適な足場材料に関する。 明
背景技術
田
近年、 大きく損傷した生体組織の治療法として、 細胞の分化、 増殖能を利用し 元の生体組織に再構築する再生医療の研究力活発になってきている。 生体内にお いて細胞が分化 ·増殖する場合、 細胞外マトリックスが足場として機能し、，組織 の構築を行っている。 しかし組織力大きく損傷している場合、 細胞自身がマトリ ックスを産生するまで人工および天然材料で補う必要がある。つまり足場材料 (補 綴材） は組織構築の上で最適な環境を与える重要なファクターである。 この足場 材料に求められる特性としては、 1 ) 生体吸収性、 2 ) 細胞接着性、 3 ) 多孔質 性、 4 ) 力学強度などが挙げられる。 これらの特性を満足する材料を創生するこ とを目的として、 合成高分子 （ポリグリコール酸、 ポリ乳酸、 ポリ力プロラクト ンなど）、 天然高分子（コラーゲン、 ゼラチン、 エラスチン、 ヒアルロン酸、 アル ギン酸、 キトサンなど）、 無機材料（ハイドロキシァパタイト、 ]8—リン酸三カル シゥム）、 これらの複合体などがこれまで検討されている。
前述したように、 足場材料 （補綴材） に求められる重要な特性の 1つとして多 孔質性がある。 これは組織を再生させるのに必要な細胞への十分な酸素および栄 養を補給し、 二酸化炭素や老廃物を速やかに排出する意味において重要である。 そのため、 足場材料の多孔質性を達成するために凍結乾燥法、 相分離法、 発泡法 などが提案されている。 凍結乾燥法または相分離法により得られる構造体は、 ポ ァの形状が鱗片状であり、 細胞の侵入が難しく足場材料として未充足な課題があ る。 また発泡法により得られる構造体もポアが単独に存在するため細胞の侵入が 困難であるという課題がある。
また、 熱可塑性ポリマーからなる繊維の集合体であって、 平均繊維径が 0 . 1 〜2 0 zmであり、 かつ該繊維の任意の横断面が異形であり、 更に平均見掛け密 度が 1 0〜9 5 k g/m3である不織布が報告されている（特許文献 1 )。しかし、 足場材料としてさらなる厚みと強度を有するものが求められている。
また、 サッカロースなどの水溶性物質を含有するポリウレタンポリマーを調製 した後、 水浴中で含有する水溶性物質を溶解して孔構造を形成した軟骨プラグが 提案されている （特許文献 2 )。 しかし、 この方法で形成される孔は連続孔ではな く細胞増殖には限度がある。
また、 静電紡糸法でナノファイバーが平面状に堆積された足場材料を製造し、 これを用いて細胞を培養すること力 S提案されている (非特許文献 1 )。この方法は、 繊維を平面状の捕集電極上に捕集するため、繊維が一定の厚さ以上に堆積すると、 電極が堆積物で覆われることになり、一定の電位差を維持することが困難になり、 繊維の堆積物の密度力 s堆積方向で変化するという欠点がある。 また、 堆積物は、 堆積方向に垂直な面方向においても堆積密度に斑が生じる。 よって、 この堆積物 を細胞増殖の足場材料として用いるには、 堆積密度を均一にして機械的強度を改 良する必要がある。
(特許文献 1 ) WO 2 0 0 4/ 8 8 0 2 4号公報
(特許文献 2 ) 特表 2 0 0 4— 5 2 0 8 5 5号公報
(非特許文献 1 ) Publ ished onl ine 25 March 2002 in Wiley InterScience (www. interscience. wi ley. com) 発明の開示
本発明の目的は、 繊維が高密度に集合した細胞増殖に適した足場材料を提供す ることにある。 本発明の目的は、 機械的強度に優れた細胞増殖のための足場材料 を提供することにある。 本発明の目的は、 細胞を良好に増殖させることができる 足場材料を提供することにある。 また本発明の目的は、 該足場材料の製造方法を 提供することにある。 さらに本発明の目的は、 該足場材料を用いた細胞の増殖方 法を提供することにある。 また本発明の目的は、 該足場材料を用いた生体組織を 再生させる方法を提供することにある。
本発明者は、 静電紡糸法で繊維を製造し、 得られた繊維を回転する巻き取り軸 に堆積させると、 堆積方向に均一な堆積密度を有する繊維堆積物が得られること を見出した。
また、 繊維を回転する巻き取り軸に堆積させると巻き取り軸に平行な平面に対 しても均一な繊維堆積物が得られることを見出した。
さらに、 繊維を回転軸に巻き取る際に、 繊維に一定の張力がかかり、 高密度の 繊維堆積物が得られることを見出した。
また、 得られた繊維堆積物は、 細胞増殖の足場材料として、 適度な強度、 繊維 密度を有することを見出した。 本発明はこれらの知見に基づく。
すなわち本発明は、 繊維の集合体からなり、 2つの底面および側面から構成さ れる 3次元構造を有し、
(1) 繊維は面方向に配向し、
(2) 繊維の直径は 0. 05〜50 ΠΙであり、
(3) 繊維は生体適合性ポリマーから主としてなり、
(4) 見掛け密度は 95〜350 k g/m3である、
足場材料である。
また本発明は、 （1)電極間で形成された静電場中に、生体適合性ポリマーを含 むドープをノズルから吐出し、 繊維を形成し、
(2) 得られた繊維を、 巻き取り軸を中心に巻き取り、 繊維が巻き取り軸に平行 な面の方向に配向したロールを形成し、
(3) 得られたロールから 3次元構造体を切り出す、
工程を含む足場材料の製造方法である。
本発明は、 該足場材料を用いて細胞を分裂増殖させる方法を包含する。 また該 足場材料を損傷した患部に埋め込み、 生体組織を再生させる方法を包含する。 図面の簡単な説明 図 1 静電紡糸法で用いる装置の一例である。
図 2 静電紡糸法で用いる装置の一例である。
図 3 静電防止法で用いる装置の一例である。
図 4 静電防止法で用レ ^る装置の一例である。
図 5 本発明の製造方法の中で、 足場材料を切り出す方法の例である。 図 6 実施例 2において得られた足場材料の上底面像である。
図 7 実施例 2において得られた足場材料の下底面像である。
図 8 実施例 2における足場材料を用いた培養 1日目の染色像である。 図 9 実施例 2における足場材料を用いた培養 1 2日目の染色像である。 図 1 0 実施例 3において得られた足場材料の上底面像である。
図 1 1 実施例 3において得られた足場材料の下底面像である。
図 1 2 実施例 3において得られた足場材料の断面像の一例である。
図 1 3 実施例 3における足場材料を用いた培養 1日目の染色像である。 図 1 4 実施例 3における足場材料を用いた培養 1 2日目の染色像である。
(符号の説明）
1 . ノズル
2 . ドープ
3 . ド―プ保持槽
4. 正電極
5 . 負電極
6 . 高電圧発生器
7 . 巻き取り装置
8 . 静電除去装置
9 . 巻き取り軸方向
1 0 . 巻き取り軸方向に平行に切り出された足場材料
1 1 . 巻き取りに対し垂直な方向
1 2 . 巻き取り軸に対し垂直方向に切り出された足場材料 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳述する。
ぐ足場材料 >
本発明の足場材料は、 2つの底面および側面から構成される 3次元構造を有す る。 底面の形状は、 円、 楕円、 四角形など任意の形状である。 底面は凹凸のある 曲面であっても良い。 2つの底面の形状、 大きさは異なっていても良い。 底面の 面積は、好ましくは 0 . 0 5〜8 c m2、より好ましくは 0 . 1〜： L c m2である。 側面は連続した曲面でも、 複数の面から形成されていても良い。 即ち、 本発明の 足場材料の形状は、 好ましくは、 円筒体、 多角柱などの 3次元構造である。 本発明の足場材料は 3次元構造、 即ち、 横方向 （X軸)、 縦方向 （y軸） および 高さ方向 （z軸） の広がりを有する。 この点において、 横方向 （X軸） および縦 方向 （y軸） の広がりを有する平面状の不織布とは相違する。 本発明の足場材料 において、 高さ方向とは一方の底面に対して垂直な方向のことをいう。
足場材料の高さは、 好ましくは 0 . 5 mm以上、 より好ましくは 2 mm以上で ある。 高さの上限は問わず、 補綴材として使用する部位に依存するといえる。 高 さが 0 . 5 mmより低いと機械強度が低く、 膝関節など負荷の高い組織の補綴材 としては好ましくない。 本発明の足場材料を、 例えば生体の損傷部に埋入し、 補 綴材表面に細胞を増殖させるために用いることができる。 足場材料は所望の形状 に合わせて提供できる。
本発明の足場材料は繊維の集合体からなる。 本発明において、 面方向に配向す るとは、 繊維が特定の平面に略平行に向いていることを意味する。 繊維は、 この 特定平面に平行な限り、 横方向、 縦方向、 斜め方向のいずれの方向を向いていて もよい。 図 5の 1 0または 1 2に示す円筒体中の破線に示す平面に対して繊維は 略平行に向いている。 また、 図 5の 1 0あるいは 1 2中に示す点線部は、 同心円 状の曲面を形成してもよい。 伹し、 該平面上の繊維の向きはランダムである。 繊維は、 図 5の 1 0に示すように、 高さ方向に平行な面方向に配向しているこ とが好ましい。 あるいは図 5の 1 2に示すように、 繊維は高さ方向に垂直な面方 向に配向していることが好ましい。
繊維の直径は、 0 . 0 5〜5 0 ΠΙである。 繊維の直径が、 0 . 0 5 ^mより も小さいと足場材料の強度が保てないため好ましくない。 また繊維の直径が 5 0 mよりも大きいと繊維の比表面積が小さく生着する細胞数が少なくなる。 繊維 の直径は、 好ましくは 0 . 2〜5 0 m、 さらに好ましくは 0 . 2〜4 0 ΠΙで ある。 繊維の直径は、 例えば走査型電子顕微鏡 （倍率 2 0 0倍程度） で足場材料 を観察して求めることができる。
また、 繊維の任意の横断面は略真円でも異形でも良い。 繊維の任意の横断面が 異形であると、 繊維の比面積は増大するので、 細胞の培養時に、 細胞が繊維表面 に接着する十分な面積をとることができる。
ここで、 繊維の任意の横断面が異形であるとは、 繊維の任意の横断面が略真円 形状をとらないいずれの形状も指し、 繊維表面が一様に凹部および/または凸部 を有して粗面化されている場合を含む。
異形形状は、 繊維表面の微細な凹部、 繊維表面の微細な凸部、 繊維表面の繊維 軸方向に筋状に形成された凹部、 繊維表面の繊維軸方向に筋状に形成された凸部 および、 繊維表面の微細孔部からなる群から選ばれた少なくとも 1種によること が好ましく、 これらは単独で形成されていても複数が混在していても良い。 ここ で、 上記の 「微細な凹部」、 「微細な凸部」、 とは、 繊維表面に 0 . l〜l mの凹 部または凸部が形成されていることをいい、 「微細孔」 とは、 0 . l〜l zmの径 を有する細孔が繊維表面に存在することをいう。 また、 上記筋状に形成された凹 部および Zまたは凸部は、 0 . 1〜1 m幅の畝形状が繊維軸方向に形成されて いることをいう。
足場材料の見掛け密度は、 9 5〜 3 5 0 k g /m3、 好ましくは 1 0 0〜 3 0 0 k g /m3, より好ましくは 1 0 0〜2 5 0 k gZm3である。 見掛け密度が 9 5 k g /m3より低いと細胞侵入性は良いものの機械強度が低い。 また 3 5 0 k g Zm3より高いと細胞が侵入するのが困難となり足場材料としては好ましくな レ^ 見掛け密度は、 得られた集合体の体積 （面積 X高さ） と質量とを測定し算出 することができる。 足場材料を移植に用いる場合、 移植初期における加重圧縮に耐える機械的強度 が必要となる。 本発明の足場材料の繊維の配向方向を加重圧縮方向に向けること で圧縮に対する形状安定性を付与することができる。 本発明の足場材料の圧縮弾 性率は、 好ましくは 0. 5 MP a〜5 MP a、 より好ましくは 1 . 5 MP a〜5 MP aである。
本発明の足場材料の多孔度は、 好ましくは 7 5〜9 0 %、 より好ましくは 7 8 〜8 8 %である。 多孔度は多孔体の容積からポリマーの容積を差し引いた割合に より求める。
本発明の足場材料を構成する繊維は生体適合性ポリマーから主としてなる。 繊 維は、 繰り返し単位の好ましくは 8 0〜1 0 0モル％、 より好ましくは 9 0〜1 0 0モル％は生体適合性のモノマー由来の繰り返し単位からなることが好ましい。 生体適合性のモノマーとして、 グリコール酸、 乳酸、 力プロラクトン、 ジォキサ ノンなどが挙げられる。 また生体適合性ポリマ一のプレンドでもよい。
生体適合性ポリマ一は生体吸収性ポリマーであることが好ましい。 生体吸収性 ポリマ一は、 好ましくは主として脂肪族ポリエステルからなる。 脂肪族ポリエス テルとしては、 ポリダリコール酸、 ポリ乳酸、 ポリ力プロラクトン、 ポリジォキ サノン、 ポリトリメチレンカーボネート、 ポリブチレンサクシネート、 ポリェチ レンサクシネート、 およびこれらの共重合体などが挙げられる。 これらのうち、 脂肪族ポリエステルとしては、 ポリダリコール酸、 ポリ乳酸、 ポリ力プロラクト ン、 およびこれらの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも一種であること が好ましい。 就中、 乳酸とグリコール酸との共重合体が好ましい。 共重合比は好 ましくは前者 Z後者 （モル） = 2 0 Z 8 0〜8 0ノ2 0、 より好ましくは 4 0 / 6 0〜7 5 / 2 5である。
生体吸収性ポリマ一以外でも、 ポリエステル、 ナイロン、 ポリスルフォン、 ポ リウレタン、 ポリエチレン、 ポリプロピレン、 ポリメタクリル酸メチル、 ポリヒ ドロキシェチルメタクリレー卜、 ポリ塩化ビエル、 ポリシロキサンなどの生体適 合性ポリマーも、 多孔体を構成するポリマーとして用いることができる。
生体適合性ポリマーの固有粘度は 0. 1〜： I . 4 d LZ g、好ましくは 0. 0 . 4〜1 . 3 d LZ g、 より好ましくは 0 . 6〜1 . 2 d LZ g ( 3 0 °C、 へキサ フルォロイソプロパノール） である。
また本発明の足場材料には、 生体適合性ポリマ一以外の第 2成分をさらに含有 しても良い。 該成分としては、 リン脂質類、 糖質類、 糖脂質類、 ステロイド類、 ポリアミノ酸類、 タンパク質類、 およびポリオキシアルキレン類、 F G F (繊維 芽細胞増殖因子)、 E G F (上皮増殖因子)、 P D G F (血小板由来増殖因子)、 T G F— ;6 ( ;6型形質転換増殖因子)、 N G F (神経増殖因子)、 HG F (肝細胞増 殖因子)、 BM P (骨形成因子）などの細胞増殖因子からなる群から選ばれる少な くとも 1種であることが好ましい。 具体的には、 ホスファチジルコリン、 ホスフ ァチジルエタノールァミン、 ホスファチジルセリン、 ホスファチジルグリセロー ルなどのリン脂質類および/またはポリガラクチュロン酸、 へパリン、 コンドロ ィチン硫酸、 ヒアルロン酸、 デルマタン硫酸、 コンドロイチン、 デキストラン硫 酸、 硫酸化セルロース、 アルギン酸、 デキストラン、 カルボキシメチルキチン、 ガラク卜マンナン、 アラビアガム、 卜ラガン卜ガム、 ジエランガム、 硫酸化ジェ ラン、 カラャガム、 カラギーナン、 寒天、 キサンタンガム、 カードラン、 プルラ ン、 セルロース、 デンプン、 カルボキシメチルセルロース、 メチルセルロース、 ダルコマンナン、 キチン、 キトサン、 キシログルカン、 レンチナンなどの糖質類 および Zまたはガラクトセレブ口シド、 ダルコセレブ口シド、 グロポシド、 ラク トシルセラミド、 トリへキソシルセラミド、 パラグロポシド、 ガラクトシルジァ シルグリセロール、 スルホキノポシルジァシルグリセロール、 ホスファチジルイ ノシトール、 グリコシルポリプレノールリン酸などの糖脂質類および/またはコ レステロール、 コール酸、 サポゲニン、 ジギトキシンなどのステロイド類および /またはポリアスパラギン酸、 ポリグルタミン酸、 ポリリジンなどのポリアミノ 酸類および Zまたはコラーゲン、 ゼラチン、 フイブロネクチン、 フイブリン、 ラ ミニン、 カゼイン、 ケラチン、 セリシン、 トロンビンなどのタンパク質類および Zまたはポリオキシエチレンアルキルエーテル、 ポリオキシエチレンプロピレン アルキルエーテル、 ポリオキシエチレンソルビタンエーテルなどのポリオキシァ ルキレン類などが挙げられる。 第 2成分の好ましい含有量としては、 生体適合性 ポリマー 1 0 0重量部に対して 0 . 0 1〜5 0重量部である。
ぐ製造方法 >
本発明の足場材料は、 第 1〜第 3工程により製造することができる。
(第 1工程）
第 1工程は、 いわゆる静電紡糸法である。 第 1工程は、 電極間で形成された静 電場中に、 生体適合性ポリマーを含むド一プをノズルから吐出し、 繊維を形成す る工程である。
静電場は、 一対または複数の電極間で形成される。 電極は、 金属、 無機物また は有機物のいかなるものでも導電性を示すものであれば良い。 また、 絶縁物上に 導電性を示す金属、 無機物または有機物の薄膜を持つものであっても良い。 いず れの電極に高電圧を印加しても良い。 これは例えば電圧値が異なる高電圧の電極 カ^つ （例えば 1 5 k Vと 1 0 k V) と、 アースに繋がった電極の合計 3つの電 極を用いる場合も含み、 または 3本を超える数の電極を使う場合も含む。 一方の 電極がノズルで、 他方の電極が捕集電極であることが好ましい。
電極間の距離は、 帯電量、 ノズル寸法、 紡糸液流量、 紡糸液濃度等に依存する 力 1 0 k V程度のときには 5〜2 0 c mの距離が適当である。 印加される静電 気電位は、 好ましくは 3〜1 0 0 k V、 より好ましくは 5〜5 0 k V、 さらに好 ましくは 5〜3 0 k Vである。
ドープは、 生体適合性ポリマーおよび溶媒を含有する。 生体適合性ポリマーは 前述の通りである。 ド一プ中の生体適合性ポリマーの濃度は、 好ましくは 1〜3 0重量％、 より好ましくは 2〜2 0重量％である。 生体適合性ポリマーの濃度が 1重量％より低いと、 濃度が低すぎるため繊維を形成することが困難となり好ま しくない。 また 3 0重量％より高いと得られる繊維の直径が大きくなり好ましく ない。
溶媒は、 生体適合性ポリマーを溶解し、 常圧で沸点が 2 0 0 °C以下であり、 室 温で液体である物質力好ましい。 溶媒として例えば、 塩ィ匕メチレン、 クロ口ホル ム、 アセトン、 メタノール、 エタノール、 プロパノール、 イソプロパノ一ル、 ト ルェン、 テトラヒドロフラン、 1 , 1 , 1， 3 , 3 , 3—へキサフルォロイソプ ロパノール、 水、 1， 4—ジォキサン、 四塩化炭素、 シクロへキサン、 シクロへ キサノン、 N， N—ジメチルホルムアミド、 ァセトニトリルなどが挙げられる。 これらのうち、 生体適合性ポリマー特に脂肪族ポリエステルの溶解性等から、 塩 化メチレン、 クロ口ホルム、 アセトンが特に好ましい。 これらの溶媒は単独で用 いても良く、 複数の溶媒を組み合わせても良い。 また本発明においては、 本目的 を損なわない範囲で他の溶媒を併用しても良い。
ノズルの口径は、 好ましくは 0 . 6〜1 . 5 mmである。 ド一プをノズルから 静電場中に供給する場合、 数個のノズルを用いて繊維状物質の生産速度を上げる こともできる。
吐出は、 注射器のようなピストンを有するシリンジでドープを押し出すことに より行うことが出来る。 また、 先端に細孔 （ノズル） を有する管でも良い。 この 場合、 ドープは静電気電位差により引っ張られ電極に向かって曳糸される。 繊維 とは、 溶媒が留去された状態のみならず、 いまだ溶媒を含んでいる状態も含む。 ノズルと電極の間に静電除去装置を使用することが好ましい。 静電除去装置と は、 イオンエアーを繊維に当てイオンバランスを均一に保ち、 電極に届く前に繊 維の帯電状態を緩和することで空気中に分散させる装置である。 この装置を用い ることによってロールの厚みを増すことが可能である。 ロールの厚みを増すこと により、 径の大きい足場材料を得ることができる。
(第 2工程）
第 2工程は、得られた繊維を、回転する巻き取り軸を中心に巻き取り堆積させ、 繊維が巻き取り軸に平行な面に配向したロールを得る工程である。
繊維は、 ノズルと捕集電極との間にある巻き取り装置の巻き取り軸を中心に堆 積させる。 巻き取り軸の形状は円柱状でも、 角柱状でもよい。
足場材料の平均見掛け密度は巻き取り軸の回転数に依存するため、 巻き取り軸 の回転数をコントロールすることで、 所望の平均見掛け密度を有する足場材料を 得ることが可能となる。 具体的には、 回転数が高い場合においては、 得られる足 場材料の平均見掛け密度は高い。 それに対し、 回転数が低い場合においては、 得 られる足場材料の平均見掛け密度は低い。 巻き取り軸の回転速度は、 好ましくは ：!〜 1000回/分、 より好ましくは 5〜 200回 Z分である。
得られるロールは、 巻き取り軸に平行な面に対し略配向している。 ロールの形 状は、 円柱状、 紡錘状など任意の形状である。
第 2工程の後、 得られたロールについて熱処理を行うことが好ましい。 熱処理 温度は、 好ましくは 40〜90°Cである。 熱処理を行うことにより、 繊維同士が 熱融着し、 優れた圧縮強度を有する足場材料を得ることができる。
第 1および第 2工程を図 1〜4により説明する。 図 1はシリンジ、 図 2は細管 状の吐出器を用いる例である。 図 1において、 ド一プ （2) は、 ノズル （1) を 有するシリンジのド一プ保持槽 (3) に充填する。 ノズル （1) には高電圧発生 器 （6) により電圧がかけられ、 正電極 (4) と負電極 （5) との間に静電場が 形成されている。 ドープ （2) をノズル （1) 力 押し出すと、 電荷を帯びたド 一プが静電場中を負電極 (5) に向かって移動し繊維が形成される。
また、 図 2に示す方法で繊維を形成することもできる。 ド一プ （2) は、 ノズ . ル （1) を有する細管状の吐出器のド一プ保持槽 （3) に充填する。 ドープ保持 槽 （3) 内には正電極 （4) が挿入され高電圧発生器 (6) により電圧がかけら れ、 負電極（5) との間に静電場が形成されている。 吐出器の先端のノズル（1) と負電極 （5) との距離を調節すると、 ノズル （1) から電荷を帯びたドープが 吐出され、静電場中を負電極 (5)に向かって移動し繊維が形成される。繊維は、 負電極 (5) の手前にある巻き取り装置 （7) に巻き取る。
本発明においては、 ドープ （2) を負電極 （5) に向けて曳糸する間に、 溶媒 が蒸発して繊維が形成される。 通常の室温であれば巻き取り装置 （7) に捕集さ れるまでの間に溶媒は完全に蒸発するが、 もし溶媒蒸発が不十分な場合は減圧条 件下で曳糸しても良い。 また、 曳糸する温度は溶媒の蒸発挙動や紡糸液の粘度に 依存する力 通常は 0〜50°Cである。
図 3および図 4は、 静電除去装置 （8) を設置する例である。 ノズル （1) と 負電極 (5) の間に静電除去装置 （8) を設置して紡糸を行い、 繊維を巻取り装 置 （7) により捕集することができる。
(第 3工程） 第 3工程は、 得られたロールから 3次元構造体を切り出す工程である。 3次元 構造体は、 例えば円筒形の穿孔器を用いて図 5に示すように刳り貫くことができ る。 図 5において、 3次元構造体の高さ方向と繊維の配向方向とを平行に刳り貫 く （10) ことが好ましい。 また、 3次元構造体の高さ方向と繊維の配向方向と が垂直になるように刳り貫く （12) こと力好ましい。 足場材料 （10) は、 足 場材料 （12) に比べ圧縮強度に優れる。 ぐ細胞の分化増殖 >
本発明の足場材料を用いて細胞を分化増殖させることができる。 細胞の分化増 殖は生体外、 生体内のいずれで行ってもよレ^ 生体外では、 細胞を分化増殖する ための培養基材として用いることができる。 生体内では、 本発明の足場材料を補 綴材として用いることができる。 特に、 本発明の足場材料を損傷した患部に埋め 込むことによって生体組織を再生させることができる。 あるいは、 生体外で本発 明の足塲材料に細胞を培養したものを補綴材として患部に埋め込んでもよい。 生 体組織としては、 例えば骨軟骨組織を挙げることができる。 実施例
実施例で使用した材料、 測定方法は以下の通りである。
( 1 ) 乳酸ーグリコ一ル酸共重合体； L A C T E L (DL乳酸/グリコ一ル酸共 重合体、 モル比 =50Z50、 固有粘度： 1. 05dLZg、 30°C、 へキサフ ルォロイソプロパノール、 Absorbable Polymers International社製）
(2) 塩化メチレン、 エタノール、 ホルムアルデヒド； 和光純薬工業 （株） 製
(3) ラット間葉系幹細胞； 大日本住友製薬 （株） 製
(4) MEM (Minimum Essential Medium) ¾ FBS (Fetal Bovine Serum)、 P B S (Phosphate- buff erd Saline)、抗生物質一抗真菌剤 (Antibiotic - Ant imycotic)、
0.05% Trypsin- EDTA溶液； Invitrogen製
(5) L-ascorbic acid 2- phosphate magnesium salts n - hydrate (含水量 26.7%)、 ^-glycerophosphate disodium n-hydrate, Dexamet ason> TritonX- 100、 Toluidine Blue; Sigma製
(6) Pico Green (登録商標) ds DNA Quantitation Kit; Molecular Probe製 <実施例 1>
(ドープの調製）
乳酸—グリコール酸共重合体 （モル比 =50/50) を、 塩化メチレンとエタ ノールの混合溶媒に溶解し、 15重量％のド一プを調製した。
(紡糸）
図 4に示す装置を用いて静電紡糸法で繊維の集合体からなる円筒体状のロール を得た。 ノズル （1) の内径は 1. 3 mmである。 ノズル （1) から巻き取り装 置 （7) までの距離は 20cm、 ノズル （1) から静電除去装置 （8) までの距 離は 35 c mとした。 印加電圧は 15 k Vとした。 ノズル （ 1 ) と負電極 ( 5 ) との間に巻き取り装置 （7) および春日電機 （株） 製の静電除去装置 （8) を設 置した。 ドープ保持槽 （3) には正電極 （4) を挿入した。 巻き取り装置 （7) の回転数は 100 r pmに設定した。
ドープ保持槽 （3) にド一プを入れ、 ノズル （1) と負電極 (5) との距離を 調整し、 繊維をノズル （1) から吐出させた。 吐出を 120分間継続し、 繊維を 回転する巻き取り装置 （7) で巻き取り円筒体状のロールを得た。 ロールを恒温 器に入れ、 80°Cで 10分間保持し熱処理を行った。
(切り出し）
得られたロールから図 5に示す要領で、 生検トレパン （カイインダストリーズ (株） 製） を用いて図 5中の 10に示すような直径 5mmx高さ 5mmの円筒状 の足場材料を切り出した。
(特性評価）
得られた足場材料の特性を以下の方法で測定した。 その結果を表 1に示す。 (1) 繊維の直径
繊維の直径は、 デジタルマイクロスコープ (株式会社 KEYENCE、VHX DIGITAL MICROSCOPE)を用いてあるいは走査型電子顕微鏡（日本電子製、倍率 200倍）で 目視観察した。 電子顕微鏡観察において 1視野につき任意の 10本を選択して計 測し、この操作を 5視野について実施し、計 50本の平均値を算出した。ただし、 繊維形成過程で発生した塊状の異物、 繊維同士が融着しバンドル状になっている ものは計測対象から除外した。
(2) 足場材料の見掛け密度
足場材料の見掛け密度は下記式により算出した。
p = 4 m/ 7C d 2 h
(p ：多孔体の見掛け密度、 m：質量、 d：直径、 h：高さ）
(3) 足場材料の多孔度
足場材料の多孔度は下記式により算出した。
ε = 1— p / ρ 0
(ε ：足場材料の多孔度、 ρ ：多孔体の見掛け密度、 pQ :ポリマーの固 有密度）
(4) 圧縮強度
圧縮強度は、 図 5の （1 0) に対応する足場材料について、 J I SK72 20 に準拠して測定した。 即ち、 繊維が円筒体の高さ方向に平行に配向している足場 材料について測定した。 試験片を材料試験機の加圧面の間に置き、 試験片の中心 線を加圧面の中心線に一致させ、 かつ、 試験片の上面と下面が加圧面と平行であ ることを確認した。 試験速度 1 0 mmZm i nにて一定速度で試験片に荷重を加 え、 圧縮限界まで測定を行った。
<実施例 2>
(ドープの調製）
実施例 1と同じ乳酸一グリコ一ル酸共重合体を用いて 1 0重量％になるように 調製した。
(紡糸）
吐出時間を 9 0分間とし、 熱処理を 70でで 1 0分間行う以外は実施例 1と同 じ方法で繊維の集合体からなる円筒体状のロールを得た。
(切り出し）
得られたロールから実施例 1と同じ方法で、 図 5の 1 0に対応する直径 5mm X高さ 5mmの円筒状の足場材料を切り出した。 図 5の 10に対応する足場材料 の底面に平行な断面の顕微鏡写真 （倍率 15倍） を、 図 6 (上底面） および図 7
(下底面） に示す。 繊維が層状に堆積しているのが分かる。 （特性評価） 実施例 1と同じ方法で特性を測定した。 結果を表 1に示す。
(足場材料の生物学的評価）
(細胞の調製）
足場材料の生物学的評価を以下の方法により行った。 ラット間葉系幹細胞を 1 5%FBSおよび l%Antibiotic- Antimycotic を含む MEM中にて、 37°C、 5 CO 2下で 3継代まで培養を行った。
(細胞播種、 培養）
得られた足場材料に、 調製したラット間葉系幹細胞を 6. 0X 106個/ cm3 になるように播種し、 1 5%FBSおよび l%Antibiotic- AnUmycotic、 10 M dexamethasone, 5 0 yM L- Ascorbic acid 2-phosphate magnesium salts n-hydrate, 1 OmM j6- glycerophosphate disodium n- hydrateを添加した ME M中にて、 37°C、 5 %C02インキュベーターで 12日間培養した。 培地交換 は週 3回行った。
(評価）
培養 1日目、 6日目、 12日目に足塲材料を取り出し、 DNA量の測定および 組織学的評価を以下の方法で行った。
(1) DNA量
DNA量は、 Pico Green (登録商標） ds DNA Quantitation Kitの測定マニュ アルに従って行った。 測定試料は 0. 2%Tr i t on— X100で凍結 ·融解 を 3回繰り返した後、 超音波破碎して細胞懸濁液を得、 そこから抽出液を調製し た。 9 6穴マイクロプレートに 1 0 O 1の酵素処理を行った測定試料を入れ、 ΤΕ(ρΗ7. 5)で 200倍希釈した PicoGreen (登録商標） ds DNAQuanUtation Reagent を 100 1加え、 励起光 485 nm、 蛍光 535 nmの波長にて蛍光 の測定を行った。 標準 DNA溶液の値から検量線を作成し、 それを基に測定試料 の DNA量を算出した。 結果を表 2に示す。 DNA量は、 増殖した細胞数に比例 する。
(2) 組織学的評価
組織学的評価は、 あらかじめサンプリング時に足場材料を 10%ホルムアルデ ヒドに浸潰しておいた。 染色する前に、 蒸留水で足場材料を洗浄し、 100%ェ 夕ノールに 1時間浸漬を 2回、 90%エタノール 1時間浸漬、 70%エタノール
1時間浸漬と段階的に希釈しながら洗浄した。 これを蒸留水に 15分浸漬させる ことによって洗浄したのち、 0.4%トルイジンブル一水溶液に 1分浸漬させた。
その後、 1分間の流水洗浄を行って余分な染色液を落とし、 デジタルマイクロス コープにて 450倍で観察した。
(3) 結果
DN A量の測定結果を表 2に示す。 また培養 1日目、 12日目の足場材料の染 色写真をそれぞれ図 8および図 9に示す。 培養 12日目の足場材料は 1日目に比 ベて染色濃度が高く、 また染色範囲が足場材料の深部まで達しており、 細胞の増 殖と軟骨基質が良好に産生していることが分かる。
<実施例 3>
(足場材料の製造）
実施例 2と同じ操作を繰り返し、 図 5の 12に対応する直径 5mmX高さ 5m mの円筒状の足場材料を得た。 その特性を測定した結果を表 1に示す。
図 5の 12に対応する足場材料の底面に垂直な断面の顕微鏡写真 （倍率 200 ' 倍） を図 10に示す。 繊維が面方向に配向しているの力 S分かる。 また図 5の （1
2) に対応する足場材料の底面に平行な断面の顕微鏡写真 （倍率 15倍） を図 1
1 (上底面） および図 12 (下底面） に示す。 繊維力網の目のように徽密に堆積 しているのが分かる。
(生物学的評価）
得られた足場材料を用いて、 実施例 2と同様の方法で細胞を培養し DNA量を 測定した。 その結果を表 2に示す。 また培養 1日目、 12日目の足場材料の染色 写真を図 13および図 14に示す。 実施例 2と同等に、 培養 12日目の足場材料 は 1日目のそれに比べて染色濃度が高く、 また染色範囲が足場材料の表面から深 部に広がっており、 良好な細胞増殖と基質産生が分かった。
表 1
Figure imgf000020_0001
* 1 ：巻き取り装置の回転数（rpm)
0 表 2
Figure imgf000020_0002
発明の効果
本発明の足場材料は、 機械的強度に優れ、 移植初期における加重圧縮に耐える ことができる。 よつて軟骨損傷部などの機械的特性力必要とされる部位へ使用す ることができる。 本発明の足場材料は、 生体適合性ポリマーから構成されている ので、 生体への悪影響がない。 本発明の足塲材料は、 一定の繊維密度を有し、 細 胞が容易に侵入することができ、 かつ酸素および栄養の補給、 二酸化炭素や老廃 物の排出を速やかに行うことができる。 よって細胞を良好に増殖させることがで きる。
また本発明の製造方法によれば、 該足場材料を簡便な方法で製造することがで きる。 本発明の製造方法によれば、 静電紡糸法で得られた繊維を回転する巻き取 り軸に堆積させるので、 堆積方向に均一な堆積密度を有する繊維堆積物が得られ る。 また、 巻き取り軸に平行な平面に対しても均一な繊維堆積物が得られる。 さ らに、 繊維を回転する巻き取り軸に巻き取ることにより、 繊維に一定の張力がか かり、 高密度の繊維堆積物が得られる。
本発明の細胞の増殖方法によれば、 細胞を良好に増殖させることができる。 ま た本発明の生体組織の再生方法によれば、 損傷した生体組織を良好に再生させる ことができる。 産業上の利用可能性
本発明の足場材料は、 再生医療分野における細胞培養基材として有用である。 また本発明の足場材料は、 補綴材、 なかでも骨軟骨損傷部などの機械的特性が重 要な部位における補綴材として有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 繊維の集合体からなり、 2つの底面および側面から構成される 3次元構造 を有し、
(1) 繊維は面方向に配向し、
(2) 繊維の直径は 0. 05〜50 mであり、
(3) 繊維は生体適合性ポリマーから主としてなり、
(4) 見掛け密度は 95〜35 OkgZm3である、
足場材料。
2. 繊維は、高さ方向に平行な面方向に配向している請求項 1記載の足場材料。
3. 繊維は、高さ方向に垂直な面方向に配向している請求項 1記載の足場材料。
4. 繊維の直径は、 0. 2〜40 imである請求項 1記載の足場材料。
5. 見掛け密度は 100〜 250k gZm3である請求項 1記載の足場材料。
6. 多孔度が 75〜 90 %である請求項 1記載の足場材料。
7. 高さが 0. 5 mm以上である請求項 1記載の足場材料。 .
8. 底面の面積が 0. 05〜 8 c m2である請求項 1記載の足場材料。
9. 円筒体若しくは多角柱である請求項 1記載の足場材料。
10. 高さ方向の圧縮弾性率が 0. 5〜5MP aである請求項 1記載の足場材 料。
1 1 . 生体適合性ポリマーが生体吸収性である請求項 1記載の足場材料。
1 2 . 生体適合性ポリマ一が脂肪族ポリエステルである請求項 1記載の足場材 料。
1 3 . 脂肪族ポリエステルが、 ポリグリコール酸、 ポリ乳酸、 ポリ力プロラク トン、 およびこれらの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも 1種である請 求項 1記載の足場材料。
1 4 . 補綴材若しくは細胞培養基材である請求項 1記載の足場材料。
1 5 . ( 1 ) 電極間で形成された静電場中に、 生体適合性ポリマーを含むド一 プをノズルから吐出し、 繊維を形成し、
( 2 ) 得られた繊維を、 巻き取り軸を中心に巻き取り、 維が巻き取り軸に平行 な面の方向に配向したロールを形成し、
( 3 ) 得られたロールから 3次元構造体を切り出す、
工程を含む請求項 1〜 1 2いずれか一項に記載の足場材料の製造方法。
1 6 . 静電除去装置を用いて繊維を形成する請求項 1 4に記載の製造方法。
1 7. 請求項 1に記載の足場材料を用いて細胞を分化増殖させる方法。
1 8 . 請求項 1に記載の足場材料を損傷した患部に埋め込み、 生体組織を再生 させる方法。
PCT/JP2007/054739 2006-03-06 2007-03-05 足場材料 WO2007102606A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002645541A CA2645541A1 (en) 2006-03-06 2007-03-05 Scaffold material
US12/281,923 US20090076530A1 (en) 2006-03-06 2007-03-05 Scaffold
JP2008503918A JP5119144B2 (ja) 2006-03-06 2007-03-05 足場材料
AU2007222949A AU2007222949B2 (en) 2006-03-06 2007-03-05 Scaffold material
EP07738224A EP1994949A4 (en) 2006-03-06 2007-03-05 MATERIAL FOR MATRIX

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006-059393 2006-03-06
JP2006059393 2006-03-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007102606A1 true WO2007102606A1 (ja) 2007-09-13

Family

ID=38475025

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/054739 WO2007102606A1 (ja) 2006-03-06 2007-03-05 足場材料

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20090076530A1 (ja)
EP (1) EP1994949A4 (ja)
JP (1) JP5119144B2 (ja)
KR (1) KR20080107405A (ja)
CN (1) CN101443053A (ja)
AU (1) AU2007222949B2 (ja)
CA (1) CA2645541A1 (ja)
WO (1) WO2007102606A1 (ja)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011125232A (ja) * 2009-12-15 2011-06-30 Hoya Corp 細胞培養担体および細胞培養担体の製造方法
JP2012192105A (ja) * 2011-03-17 2012-10-11 Sunstar Inc 細胞足場材
JP2012231743A (ja) * 2011-05-02 2012-11-29 National Institute For Materials Science 短繊維足場材料、短繊維−細胞複合凝集塊作製方法及び短繊維−細胞複合凝集塊
JP2015504676A (ja) * 2012-01-13 2015-02-16 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 単離ヒト肺前駆細胞およびその使用
WO2015030153A1 (ja) 2013-08-30 2015-03-05 日産化学工業株式会社 繊維形成用組成物及びその繊維を用いた生体適合材料
WO2015093589A1 (ja) 2013-12-20 2015-06-25 日産化学工業株式会社 繊維、当該繊維の製造用組成物、および当該繊維を含む生体適合材料
US11369465B2 (en) 2013-01-14 2022-06-28 Scripps Health Tissue array printing
EP3992276A4 (en) * 2019-06-27 2022-09-07 Showa Denko Materials Co., Ltd. CELL SCAFFOLD MATERIAL, SUPPORT AND METHOD FOR CELL CULTURE
US11497830B2 (en) 2014-03-14 2022-11-15 Scripps Health Electrospinning of cartilage and meniscus matrix polymers

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9345486B2 (en) * 2009-03-16 2016-05-24 University Of Washington Nanofibrous conduits for nerve regeneration
JP2014525279A (ja) 2011-08-12 2014-09-29 カーディアック ペースメイカーズ， インコーポレイテッド エレクトロスピニング法およびメルトブロー法を用いてデバイスをコーティングする方法
WO2013165975A1 (en) * 2012-04-30 2013-11-07 The Johns Hopkins University Electro-mechanically stretched micro fibers and methods of use thereof
US11779682B2 (en) 2012-04-30 2023-10-10 The Johns Hopkins University Electro-mechanically stretched micro fibers and methods of use thereof
WO2015066526A1 (en) * 2013-10-31 2015-05-07 The Johns Hopkins University Elecrostretched polymer microfibers for microvasculature development
US20150025608A1 (en) 2013-07-22 2015-01-22 Cardiac Pacemakers, Inc. Lubricious, biocompatible hydrophilic thermoset coating using interpenetrating hydrogel networks
US10240122B2 (en) 2014-02-14 2019-03-26 Nissan Chemical Industries, Ltd. Active-ester-group-containing composition for producing fibers, and cell culture scaffold material using fibers produced from active-ester-group-containing composition
CA2979982A1 (en) * 2015-03-17 2016-09-22 President And Fellows Of Harvard College Automated membrane fabrication system
US9855415B2 (en) 2015-07-25 2018-01-02 Cardiac Pacemakers, Inc. Medical electrical lead with biostable PVDF-based materials
CN105963753A (zh) * 2016-06-16 2016-09-28 湖州科达化工燃料有限公司 一种抗感染的医用薄膜
BE1024733B1 (fr) 2016-11-09 2018-06-14 Univercells Sa Matrice de croissance cellulaire
CN110325224B (zh) 2016-12-27 2023-01-31 波士顿科学国际有限公司 用于电纺的可降解支架
US20180222145A1 (en) * 2017-02-07 2018-08-09 Kabushiki Kaisha Toshiba Fiber-oriented material and method for manufacturing the same
WO2019079681A1 (en) * 2017-10-20 2019-04-25 President And Fellows Of Harvard College METHODS FOR PRODUCING MATURE ADIPOCYTES AND METHODS OF USE
US20200248122A1 (en) 2019-02-05 2020-08-06 Corning Incorporated Packed-bed bioreactor systems and methods of using the same
US11118151B2 (en) 2019-11-05 2021-09-14 Corning Incorporated Fixed bed bioreactor and methods of using the same
CN111603608B (zh) * 2020-05-15 2021-12-10 南通大学 普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架及其制备方法
CN113913805B (zh) * 2021-10-20 2023-08-22 中南大学湘雅医院 一种冷喷涂改性层及其应用
CN114949353B (zh) * 2022-01-24 2023-05-30 东华大学 一种生物功能差异化的适配肌骨系统修复体及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5140476A (ja) * 1974-08-05 1976-04-05 Ici Ltd
JP2004520855A (ja) 2000-03-14 2004-07-15 シモン，ティモシー 軟骨修復プラグ
WO2004088024A1 (ja) 2003-03-31 2004-10-14 Teijin Limited 不織布およびその製造方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5681353A (en) * 1987-07-20 1997-10-28 Regen Biologics, Inc. Meniscal augmentation device
ATE412383T1 (de) * 1997-05-30 2008-11-15 Osteobiologics Inc Faserverstärkte,poröse,biologisch abbaubare implantatvorrichtung
US7374777B2 (en) * 1999-04-14 2008-05-20 Collagen Matrix, Inc. Oriented biopolymeric membrane for meningeal tissue repair

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5140476A (ja) * 1974-08-05 1976-04-05 Ici Ltd
JP2004520855A (ja) 2000-03-14 2004-07-15 シモン，ティモシー 軟骨修復プラグ
WO2004088024A1 (ja) 2003-03-31 2004-10-14 Teijin Limited 不織布およびその製造方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOLAND E.D. ET AL.: "Electrospinning of bioresorbable polymers for tissue engineering scaffolds", ACS SYMPOSIUM SERIES, vol. 918, February 2006 (2006-02-01), pages 188 - 204, XP003017642 *
MATTHEWS J.A. ET AL.: "Electrospinning of Collagen Nanofibers", BIOMACROMOLECULES, vol. 3, no. 2, 2002, pages 232 - 238, XP003005525 *
See also references of EP1994949A4

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011125232A (ja) * 2009-12-15 2011-06-30 Hoya Corp 細胞培養担体および細胞培養担体の製造方法
JP2012192105A (ja) * 2011-03-17 2012-10-11 Sunstar Inc 細胞足場材
JP2012231743A (ja) * 2011-05-02 2012-11-29 National Institute For Materials Science 短繊維足場材料、短繊維−細胞複合凝集塊作製方法及び短繊維−細胞複合凝集塊
JP2015504676A (ja) * 2012-01-13 2015-02-16 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 単離ヒト肺前駆細胞およびその使用
JP2018198614A (ja) * 2012-01-13 2018-12-20 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 単離ヒト肺前駆細胞およびその使用
US11369465B2 (en) 2013-01-14 2022-06-28 Scripps Health Tissue array printing
WO2015030153A1 (ja) 2013-08-30 2015-03-05 日産化学工業株式会社 繊維形成用組成物及びその繊維を用いた生体適合材料
US9957644B2 (en) 2013-08-30 2018-05-01 Nissan Chemical Industries, Ltd. Fiber-forming composition and bio-compatible material using said fiber
WO2015093589A1 (ja) 2013-12-20 2015-06-25 日産化学工業株式会社 繊維、当該繊維の製造用組成物、および当該繊維を含む生体適合材料
US11497830B2 (en) 2014-03-14 2022-11-15 Scripps Health Electrospinning of cartilage and meniscus matrix polymers
EP3992276A4 (en) * 2019-06-27 2022-09-07 Showa Denko Materials Co., Ltd. CELL SCAFFOLD MATERIAL, SUPPORT AND METHOD FOR CELL CULTURE

Also Published As

Publication number Publication date
JP5119144B2 (ja) 2013-01-16
KR20080107405A (ko) 2008-12-10
AU2007222949B2 (en) 2011-04-21
EP1994949A4 (en) 2012-07-18
CN101443053A (zh) 2009-05-27
CA2645541A1 (en) 2007-09-13
JPWO2007102606A1 (ja) 2009-07-23
AU2007222949A1 (en) 2007-09-13
US20090076530A1 (en) 2009-03-19
EP1994949A1 (en) 2008-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5119144B2 (ja) 足場材料
Zhang et al. Electrospun PDLLA/PLGA composite membranes for potential application in guided tissue regeneration
JP4481994B2 (ja) 生体吸収性多孔体
Moroni et al. Fiber diameter and texture of electrospun PEOT/PBT scaffolds influence human mesenchymal stem cell proliferation and morphology, and the release of incorporated compounds
Sun et al. Electrospun anisotropic architectures and porous structures for tissue engineering
EP1868660B1 (en) Medical scaffold, methods of fabrication and using thereof
Tan et al. Electrospun vein grafts with high cell infiltration for vascular tissue engineering
JP5046651B2 (ja) 円筒体の製造方法
Skotak et al. Improved cellular infiltration into nanofibrous electrospun cross-linked gelatin scaffolds templated with micrometer-sized polyethylene glycol fibers
Chen et al. A three-dimensional dual-layer nano/microfibrous structure of electrospun chitosan/poly (d, l-lactide) membrane for the improvement of cytocompatibility
JP5010854B2 (ja) 血管再生材料
WO2008069760A1 (en) Three-dimensional porous hybrid scaffold and manufacture thereof
WO2012006072A2 (en) Air impedance electrospinning for controlled porosity
WO2006022430A1 (ja) リン脂質を含有する繊維構造体
WO2009150644A2 (en) Nonwoven structure and method of fabricating the same
Ding et al. Establishment of 3D culture and induction of osteogenic differentiation of pre-osteoblasts using wet-collected aligned scaffolds
JP4988221B2 (ja) 複合材料
EP2878315A1 (en) Artificial tissue
Stodolak-Zych et al. The membrane with polylactide and hyaluronic fibers for skin substitute
JP5038639B2 (ja) 培養人工骨
US20230002935A1 (en) Electrospinning collector for the production of three-dimensional electrospun constructs
O'Connor Electrospinning of tissue engineered blood vessel scaffolds utilising multimodal fibre distributions and dynamic liquid collected yarns
Qi et al. Biomimic tubulose scaffolds with multilayer prepared by electrospinning for tissue engineering
Shanmugasundaram et al. The contribution of electrospinning to tissue engineering and related fields
Tahmasebi et al. BIOCOMPATIBILITY ASSESSMENT OF ELECTROSPUN AND SOLVENT-CAST POLY (Ε-CAPROLACTONE) SUBSTRATA

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2008503918

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007222949

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12281923

Country of ref document: US

Ref document number: 2645541

Country of ref document: CA

Ref document number: 1020087021755

Country of ref document: KR

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2007222949

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20070305

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007738224

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200780016461.6

Country of ref document: CN