ES2590759T3 - Procedimiento de espectrometría de masas para el análisis de mezclas de sustancias - Google Patents

Abstract

Procedimiento de espectrometría de masas para el análisis de mezclas de sustancias con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo, ionizándose las mezclas de sustancias antes del análisis, caracterizado porque el procedimiento comprende los siguientes pasos: a) selección de al menos un cociente de masa/carga (m/z) de iones resultantes por ionización en un primer cuadrupolo (I) analítico del espectrómetro de masas, b) fragmentación del (de los) ión (iones) elegido(s) en (a) aplicándose una tensión de aceleración en otro cuadrupolo (III) subsiguiente, el cual está lleno de un gas de colisión y que funciona como cámara de colisión, c) selección de un cociente de masa/carga de un ión de fragmentación resultante de la fragmentación (b), en otro cuadrupolo (III) subsiguiente y su análisis, realizándose los pasos de procedimiento (a) a (c) al menos una vez y d) análisis de los cocientes masa/carga de todos los iones presentes en la mezcla de sustancias por la ionización, estando lleno el cuadrupolo (III) de gas de colisión, no aplicándose sin embargo durante el análisis, ninguna tensión de aceleración, pudiendo realizarse los pasos (a) a (c) y el paso (d) también en orden inverso.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Procedimiento de espectrometna de masas para el analisis de mezclas de sustancias

La presente invencion se refiere a un procedimiento de espectrometna de masas para el analisis de mezclas de sustancias con un espectrometro de masas de triple cuadrupolo.

Durante el analisis de mezclas de sustancias complejas de origen biologico y/o qmmico, el analizador, ademas de la tarea de la identificacion de la estructura de sustancias individuales contenidas en la mezcla, se encuentra una y otra vez con el problema de detectar, y en la medida de lo posible cuantificar, todas las sustancias presentes en la mezcla. Esto debena ocurrir en la medida de lo posible rapidamente y con una alta precision, esto quiere decir, con una reducida desviacion de error. Esto cobra una mayor importancia cuando han de lograrse informaciones sobre un sistema biologico, por ejemplo, sobre un microorganismo cultivado en determinadas condiciones de fermentacion o sobre una planta con crecimiento en diferentes condiciones de entorno o sobre un organismo tipo natural como un microorganismo o una planta en comparacion con sus mutantes modificados geneticamente. Este tipo de comparaciones son necesarias para posibilitar una asignacion de mutaciones de genes desconocidos en el genoma de estos organismos a un determinado fenotipo metabolico.

El exito durante el analisis de estas mezclas de sustancias, por ejemplo, de principios de smtesis qrnmica de la qrnmica combinatoria o de extractos de microorganismos, plantas o partes de plantas, depende en este caso en gran medida de la rapidez y reproducibilidad de la tecnica analftica usada. En un cribado de este tipo han de examinarse una pluralidad de muestras, son necesarios por lo tanto procedimientos de analisis rapidos, sencillos, altamente sensibles y altamente espedficos.

Un problema principal de esta tecnica analftica es la identificacion rapida, sencilla, reproducible y cuantificable de las sustancias contenidas en las mezclas. Normalmente se usan para el analisis de los productos procedimientos de separacion, como la cromatograffa de capa fina (=DC por sus siglas en aleman, Dunnschichtchromatographie), la cromatograffa ftquida de alta eficacia (=HPLC por sus siglas en ingles) o la cromatograffa de gases (=GC por sus siglas en ingles). Con la ayuda de estos procedimientos cromatograficos no obstante, no puede identificarse ni cuantificarse de manera rapida ni sencilla una gama amplia de sustancias. Tambien se describen procedimientos como NMR (por sus siglas en ingles, Nuclear Magnetic Resonance, resonancia magnetica nuclear) o espectrometna de masas para esta tarea. Normalmente es necesaria no obstante, una cierta preparacion de las muestras para estos procedimientos de analisis, como preparacion mediante por ejemplo, precipitacion de sales y/o cromatograffa posterior, concentracion, desalinizacion de las muestras, intercambio de tampon o eliminacion de detergentes contenidos eventualmente en la muestra. Tras este tratamiento previo pueden usarse las muestras para las tecnicas anaffticas mencionadas anteriormente y pueden identificarse y cuantificarse sustancias individuales en muestras seleccionadas. Estos procedimientos requieren no obstante mucho tiempo, y solo permiten un numero de muestras limitado, de manera que este tipo de procedimientos de analisis no pueden usarse en el llamado cribado de alto rendimiento (HTS por sus siglas en ingles, High Throughput Screening) o en el cribado amplio de mezclas de sustancias en muestras biologicas o qmmicas. Es ventajoso en el caso de procedimientos muy precisos, como la espectrometna NMR o IR (por sus siglas en ingles Infrared Spectroscopy, espectroscopia infrarroja), que ofrecen informaciones tanto sobre la estructura como tambien eventualmente sobre la cantidad de una sustancia.

Para posibilitar un numero de muestras mayor en el HTS, se usan a menudo procedimientos indirectos, de facil mesura, como reacciones colorimetricas en el rango visible, mediciones de la turbiedad, fluorescencia, mediciones de conductividad, etc. Estos si bien en principio son muy sensibles, tambien son propensos a errores. Es desventajoso en este caso sobre todo, que al proceder de esta manera se analizan muchas muestras con falso positivo y dado que se trata de procedimientos de deteccion indirectos, no existen informaciones sobre la estructura y/o la cantidad de un compuesto. Para poder excluir los falsos positivos durante el resto del procedimiento se usan por norma procedimientos de analisis adicionales tras un primer analisis rapido, como por ejemplo, NMR, IR, HPLC/MS (por sus siglas en ingles, Mass Spectrometry, espectrometna de masas) o GC/MS. Esto por su parte requiere mucho tiempo.

En general puede decirse que la mejora de la sensibilidad y del valor informativo de los procedimientos de deteccion conduce a una ralentizacion en la velocidad de una tecnica analftica.

En el caso del trabajo con mezclas biologicas complejas, como por ejemplo, extractos de microorganismos, plantas y/o animales, ha de tenerse en cuenta ademas de ello, que los compuestos individuales en las mezclas solo se presentan en cantidades muy reducidas o solo estan a disposicion cantidades muy reducidas de la muestra individual misma para la tecnica analftica, de manera que el procedimiento usado tiene que tener una sensibilidad muy alta. Ademas de ello, para algunos procedimientos de analisis, los tampones y/o sales no volatiles presentes habitualmente en muestras biologicas representan un problema, dado que estos influyen negativamente en la sensibilidad de los procedimientos o incluso en su uso. Lo mismo es valido para la presencia de detergentes en estas muestras.

Para el analisis de mezclas de muestras complejas, se conocen del estado de la tecnica procedimientos de espectrometna de masas, que abarcan por ejemplo, el analisis de muestras de la qrnmica sintetica, de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

petroqmmica, de muestras del medio ambiente y de material biologico. Estos procedimientos se usan no obstante solo para el analisis de compuestos conocidos individuales en estas muestras. No se describen series de medicion amplias por ejemplo en el marco de un HTS o en la identificacion y cuantificacion de una pluralidad de compuestos en estas muestras.

Se usa en este caso el acoplamiento de cromatograffa de gases y espectrometna de masas (= GC/MS) para sustancias que son extrafbles de las mezclas de sustancias y ligeramente volatiles. Para el analisis de sustancias o analitos, que no pueden llevarse facilmente o solo diffcilmente a la fase gaseosa, y en cuyo caso ha de eliminarse aqu un gran excedente de disolvente presente, se usa la llamada cromatograffa ffquida o la cromatograffa lfquida de alta eficacia-espectrometffa de masas (= HPLC/MS). Un resumen de los diferentes procedimientos LC (por sus siglas en ingles, Liquid Chromatography, cromatograffa lfquida)/MS y su equipamiento se desprende de la publicacion de Niessen et al. (Journal of Chromatography A, 703, 1995: 37 - 57). En las publicaciones estadounidenses US 4,540,884 y US 5,397,894 se describen y reivindican espectrometros de masas y su estructura.

Con la ayuda de los procedimientos mencionados anteriormente pueden determinarse sustancias en un rango de peso molecular de hasta 100 KD (= kiloDalton), esto quiere decir que puede determinarse una amplia gama de sustancias por ejemplo en un rango de masa inferior de hasta aproximadamente 5000 D (= Dalton), como acidos grasos, aminoacidos, acidos carbonicos, oligo o polisacaridos, esteroides, etc., y/o en un rango de masa superior de mas de 5000 D, como peptidos, protemas, oligonucleotidos u oligosacaridos o demas polfmeros. Tambien pueden analizarse materiales de gran peso molecular, como alquitran de hulla, acido humico, acido fulvico o querogenos (Zenobie and Knochenmuss, Mass Spec. Rev., 1998, 17, 337 - 366). Pueden determinarse tanto la identidad como tambien la estructura de sustancias, no siendo sin embargo siempre inequvoco el analisis de la estructura, de manera que tiene que ser confirmado con otros procedimientos, por ejemplo, NMR.

E. L. Esmans et al. (J. Chromatogr. A 794, 109 - 127 (1998) divulga particularmente procedimientos LC-MS para el analisis de nucleobases, nucleosidos, nucleotidos, oligonucleotidos y ADN.

G. Hopfgartner y F. Vilbois (Analusis, 2001, 28, n° 10, 906 - 914) describe un procedimiento para el cribado con la ayuda de LC/MS de metabolitos resultantes in vitro o in vivo de compuestos estructuralmente conocidos, que se presentan como sustancia activa en diferentes fases del desarrollo de la sustancia activa. Este procedimiento se desarrolla en dos pasos. En el primer paso de busqueda se detectan iones interesantes en un “modo de escaneo completo” rapido, los cuales se tienen en consideracion como candidatos para el resto de las pruebas. En este caso puede tratarse de iones que se corresponden con iones de una intensidad particularmente alta o que se tienen en consideracion como candidatos de posibles productos de descomposicion o metabolitos de las sustancias activas. Estos iones se usan en un segundo cribado para la identificacion de la estructura qmmica de estos iones o compuestos tras una fragmentacion en una camara de colision del espectrometro de masas. Para posibilitar un esclarecimiento rapido de la estructura de los iones o metabolitos, la camara de colision contiene constantemente gas de colision. Es desventajoso en la determinacion de la estructura, que es necesaria una masa conocida de un ion precursor, de un fragmento o de un aducto ionico. Ventajosamente la estructura de partida de la sustancia a examinar debeffa ser conocida para la HPLC/MS en estos experimentos. Dado que la HPLC/MS sola no es adecuada para la determinacion de la estructura absoluta. Si se conoce sin embargo, la estructura del compuesto de partida, pueden hacerse declaraciones sobre la estructura de eventuales metabolitos. Dado que la estructura de la sustancia, la cual ha de desarrollarse como sustancia activa, se conoce, pueden hacerse declaraciones con algo de seguridad sobre la estructura de los metabolitos desconocidos de la sustancia activa. No obstante, la declaracion es dificultada o impedida debido a posibles superposiciones de compuestos de la misma masa diferentes de ensuciamientos existentes. No es posible una cuantificacion de los compuestos con este procedimiento.

En el documento US 2001/052569 y en el documento GB 2 363249 se divulgan procedimientos mejorados para el cribado de ion precursor.

Ademas de ello, se describe en el documento US 6,140,638 un procedimiento para la reduccion de senales de interferencia isobaricas, en cuanto que se establece mediante la colocacion de un campo adecuado en la celula de colision, un filtro, el cual excluye al menos algunos iones precursores e intermediarios, que conduciffan de lo contrario a interferencias isobaricas.

Una identificacion y cuantificacion de una pluralidad o de todos los componentes individuales en una mezcla de sustancias sin sustancias puras a disposicion representa aun a dfa de hoy un problema no solucionado en la espectrometna de masas.

Exisffa por lo tanto la tarea de desarrollar un procedimiento para el analisis de una pluralidad de compuestos y preferiblemente para su cuantificacion.

Esta tarea se soluciono mediante un procedimiento de espectrometna de masas para el analisis de mezclas de sustancias con un espectrometro de masas de triple cuadrupolo, ionizandose las mezclas de sustancias antes del analisis, caracterizado porque el procedimiento comprende los siguientes pasos:

a) seleccion de al menos un cociente de masa/carga (m/z) de un ion resultante por ionizacion en un primer

cuadrupolo (I) anafftico del espectrometro de masas,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

b) fragmentacion del (de los) ion (iones) elegido(s) en (a) aplicandose una tension de aceleracion en otro cuadrupolo (III) subsiguiente, el cual esta lleno de un gas de colision y que funciona como camara de colision,

c) seleccion de un cociente de masa/carga de un ion de fragmentacion resultante de la fragmentacion (b), en otro cuadrupolo (III) subsiguiente y su analisis, realizandose los pasos de procedimiento (a) a (c) al menos una vez y

d) analisis de los cocientes masa/carga de todos los iones presentes en la mezcla de sustancias por la ionizacion, estando lleno el cuadrupolo (III) con gas de colision, no aplicandose sin embargo durante el analisis ninguna tension de aceleracion,

pudiendo llevarse a cabo los pasos (a) a (c) y el paso (d) tambien en orden inverso.

Con mezclas de sustancias en el sentido de la invencion han de entenderse principalmente todas las mezclas, las cuales contienen mas de una sustancia, como por ejemplo, mezclas de reaccion complejas de smtesis qmmicas, como productos de smtesis de la qrnmica combinatoria o mezclas de sustancias de origen biologico, como caldos de fermentacion de una fermentacion aerobia o anaerobia, fluidos corporales como sangre, linfa, orina o heces, productos de reaccion de una smtesis biotecnologica con una o varias enzimas libres o ligadas, extractos de material animal, como extractos de diferentes organos o tejidos, o extractos vegetales, como extractos de la totalidad de la planta o de organos individuales, como rafz, tallo, hoja o semillas o sus mezclas. Ventajosamente se analizan en este procedimiento mezclas de sustancias de origen biologico, como extractos de origen animal o de origen vegetal, ventajosamente de origen vegetal.

Los espectrometros de masas que pueden usarse en el procedimiento se componen por norma de un sistema de entrada de muestras, de un espacio de ionizacion, de una interfaz, de una optica de iones, de uno o varios filtros de masa y de un detector.

Para la produccion de iones en el procedimiento, pueden usarse en principio todas las fuentes de iones conocidas por el experto. Estas fuentes de iones se acoplan dependiendo de las fuentes de iones usadas, a traves de una llamada interfaz, a los siguientes componentes del espectrometro de masas, por ejemplo, a la optica de iones, al o a los filtros de masa o al detector. La interconexion de una interfaz tiene la ventaja de que el analisis puede llevarse a cabo sin demora. Ademas de ello, pueden llevarse a la fase gaseosa directamente a traves de la fuente de iones sustancias no volatiles y/o volatiles, preferiblemente no volatiles. Debido a ello tambien pueden llevarse a cabo limpiezas previas de mezclas de sustancias mediante separacion cromatografica ventajosa, que presentan flujos de material de diferente anchura en la tecnica analftica, dado que pueden procesarse estos flujos de material a traves de la interfaz. Las muestras a analizar o las sustancias contenidas en estas pueden enriquecerse tambien debido a ello. Ademas de ello puede procesarse una amplia gama de disolventes con una perdida minima de muestra.

Durante la ionizacion se usan esencialmente tres procesos para la produccion de las partmulas cargadas (iones):

a) evaporacion de las mezclas de sustancias e ionizacion de las moleculas o de la mezcla de sustancias en la fase gaseosa, por ejemplo, como en el caso de la ionizacion por impacto electronico (EI por sus siglas en ingles, Electron Ionization) en la que las moleculas se evaporan con un flujo de electrones en una camara de ionizacion a baja presion (< 10-2 Pa) o como en el caso de la ionizacion qrnmica (CI por sus siglas en ingles, Chemical Ionisation) con un gas reactante en la que los iones se producen con una presion aumentada de aproximadamente 100 Pa. Son gases reactantes tfpicos por ejemplo metano, isobutano, amonio, argon o hidrogeno. Si se lleva a cabo la ionizacion qrnmica con presion atmosferica, entonces se habla de la llamada ionizacion qrnmica a presion atmosferica (APCI por sus siglas en ingles, Atmospheric-Pressure Chemical Ionization).

b) Desorcion de las mezclas de sustancias de una superficie como por ejemplo como en el caso de la desorcion por plasma (PD por sus siglas en ingles, Plasma Desorption), la espectrometna lfquida de masas de iones secundarios (LSIMS por sus siglas en ingles, Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry), el bombardeo rapido de atomos (FAB por sus siglas en ingles, Fast Atom Bombardment), la desorcion laser (LD por sus siglas en ingles, Laser Desorption) oder la desorcion/ionizacion mediante laser asistida por matriz (MALDI por sus siglas en ingles, Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation). En todos estos procedimientos se estimulan las mezclas de sustancias mediante la entrada de partmulas ricas en energfa (fragmentacion radioactiva, fotones UV, IR, iones Ar+- o Cs+-, rayos laser) en una cascada de colision vibratoria y de esta manera se ionizan.

c) Pulverizacion de las mezclas de sustancias en el campo electrico, como en el caso de la ionizacion por electrospray (ESI por sus siglas en ingles, Electrospray Ionization). Durante la pulverizacion de las mezclas de sustancias en el campo electrico se pulverizan las muestras a presion atmosferica.

La ionizacion por electrospray es un procedimiento muy respetuoso. Durante la ESI se conforman iones continuamente. Esta conformacion de iones continua tiene la ventaja de que puede acoplarse sin esfuerzo en union con casi cualquier tipo de analizador y de que puede conectarse sin problemas con una separacion cromatografica, como una separacion a traves de electroforesis capilar (CE por sus siglas en ingles, Capillary Electrophoresis), cromatograffa lfquida (LC) o cromatograffa lfquida de alta eficacia (HPLC), dado que tienen una buena tolerancia para caudales altos de hasta 2 ml/min de eluato. En este caso se refuerza la pulverizacion del eluente

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

neumaticamente mediante un llamado gas de nebulizacion, por ejemplo, nitrogeno. Para ello se pulveriza el gas con una presion de hasta 4 bares, preferiblemente de hasta 2 bares desde un capilar, que rodea los capilares de entrada del eluente. En principio tambien son posibles presiones mayores. En la separacion cromatografica preconectada se prefieren las llamadas columnas de fase normal (por ejemplo columnas de gel de sflice, de oxido de aluminio, de aminodesoxihexosa, de aminodesoxi-d-glucosa, de tetrilentetramina, de oxido de polietileno o aminodicraboxflicas) y/o de fase inversa, preferiblemente columnas de fase inversa como columnas con una fase estacionaria de C4, C8 o C18. En condiciones estandar la tecnica de electrospray conduce debido a la ionizacion particularmente respetuosa al (casi) ion molecular. Habitualmente esto son eductos con iones ya presentes en la solucion de muestra (por ejemplo, protones, iones alcalinos y/o de amonio). Es ventajoso ademas de ello, que tambien pueden detectarse iones multiplemente cargados, de manera que pueden detectarse iones con un peso molecular de hasta cien mil Dalton, ventajosamente pueden detectarse en el procedimiento segun la invencion, pesos moleculares en un rango de 1 a 10000 Dalton, preferiblemente en un rango de 50 a 8000 Dalton, de manera particularmente preferida en un rango de 100 a 4000 Dalton. Como otros procedimientos a modo de ejemplo se mencionan la ionizacion por pulverizacion de iones, la ionizacion a presion atmosferica (APCI) o la ionizacion por pulverizacion termica.

En los procedimientos de ionizacion mencionados anteriormente el proceso de ionizacion se desarrolla bajo presion atmosferica y se estructura esencialmente en tres fases: primeramente se pulveriza la solucion a analizar en un campo electroestatico fuerte, el cual se genera mediante la produccion de una diferencia de potencial de 2 - 10 kV, preferiblemente de 2 - 6 kV, entre los capilares de entrada y un electrodo contrario. Un campo electrico entre la punta de capilar de entrada y el espectrometro de masas atraviesa en este caso la solucion de analito y separa con ello los iones en un campo electrico. Los iones positivos se atraen en este caso en el llamado modo positivo, hacia la superficie del lfquido, los iones negativos en la direccion contraria o a la inversa en mediciones en el llamado modo positivo. Los iones positivos acumulados en la superficie se continuan atrayendo en lo sucesivo en direccion del catodo. Al usarse capilares de pulverizacion (nanopulverizacion), en los que la solucion a examinar no se presiona hacia el exterior de los capilares debido a la aplicacion de presion, se conforma un cono de lfquido, el llamado cono de Taylor, dado que la tension de la superficie del lfquido actua en contra del campo electrico. Si el campo electrico es lo suficientemente fuerte, el cono es estable y emite en su punta un flujo de corriente continuo. En el caso de la pulverizacion reforzada por presion de la solucion a examinar (por ejemplo con HPLC), el cono de Taylor no es tan pronunciado.

En este caso se conforma correspondientemente un aerosol, que consiste en analito y disolvente. En la siguiente fase se produce la desolvatacion de las gotas conformadas, lo que conduce a la reduccion sucesiva del tamano de las gotas. La evaporacion del disolvente se logra mediante actuacion termica, por ejemplo mediante el suministro de gas inerte caliente. Mediante la evaporacion en relacion con las fuerzas electroestaticas aumenta constantemente la densidad de carga en la superficie de las gotitas de mezcla de sustancias pulverizadas. En caso de superar finalmente la densidad de carga o sus fuerzas de repulsion de carga la tension de la superficie de las gotitas (el llamado lfmite Rayleigh), entonces explotan (explosion Coulomb) estas gotitas en gotitas parciales mas pequenas. Este proceso “evaporacion de disolvente/explosion Coulomb” se realiza varias veces hasta que finalmente los iones pasan a la fase gaseosa. Para obtener buenos resultados de medicion, el flujo de gas en la interfaz, la temperatura de calentamiento aplicada, el caudal del gas de calentamiento, la presion del gas de nebulizacion y la tension capilar tienen que supervisarse y controlarse de manera precisa.

Con los diferentes procedimientos de ionizacion pueden producirse iones de carga simple o multiple. Para el procedimiento segun la invencion se usan ventajosamente como procedimientos de ionizacion, procedimientos para la pulverizacion de la mezcla de sustancias en el campo electrico, como el procedimiento de pulverizacion termica, de electrospray (= ES) o de ionizacion qrnmica a presion atmosferica (=APCI). En la ionizacion APCI la ionizacion se produce con un llamado efecto corona. Se prefiere el procedimiento de pulverizacion termica o de electrospray, se prefiere particularmente el procedimiento de electrospray. El espacio de ionizacion esta en contacto a traves de una interfaz, es decir, a traves de una microabertura (100 pm) con el subsiguiente espectrometro de masas. En el lado de la camara de ionizacion hay dispuesta otra placa de interfaz con una abertura mayor. Entre esta placa y el llamado “orificio” se insufla un gas portador calentado (=gas cortina), por ejemplo, nitrogeno. El nitrogeno colisiona en este caso con los iones producidos por ejemplo mediante electrospray, los cuales se generaron en la mezcla de sustancias. Al insuflarse el gas cortina se evita ventajosamente que se aspiren partfculas neutrales al alto vacfo del subsiguiente espectrometro de masas. Ademas de ello, se refuerza la desolvatacion de los iones mediante el gas cortina.

El procedimiento segun la invencion puede llevarse a cabo con todos los espectrometros de masas cuadrupolo, asf como espectrometros de masas de triple cuadrupolo conocidos por el experto. En el documento US 2,939,952 Paul et al. Describe y reivindica un primer aparato de este tipo. Estos aparatos tienen un rango de masas ventajoso de hasta aproximadamente m/z = 4000 y alcanzan valores de resolucion de entre 500 y aproximadamente 5000. Tienen una alta transmision de iones desde la fuente hasta el detector, son faciles de focalizar y de calibrar y tienen ventajosamente una alta estabilidad de calibrado durante el funcionamiento continuo. Los instrumentos de triple cuadrupolo conforman los instrumentos estandar para los estudios de activacion de colision de baja energfa. Estos aparatos consisten habitualmente en un primer cuadrupolo, el cual es adecuado para el analisis del cociente masa/carga (m/z) de los iones contenidos en la mezcla de sustancias en el alto vacfo (aproximadamente 10-5 Torr) tras la ionizacion, pudiendo medirse la(s) masa(s) de iones individuales, de varios o de todos los iones. A este cuadrupolo analftico (= I o Q1) pueden haber preconectados uno o varios cuadrupolos (= Q0), que normalmente se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

usan para la focalizacion de los iones. En lugar de este o de estos cuadrupolos preconectados tambien pueden usarse llamados “conos”, lentes o sistemas de lentes para la focalizacion e introduccion de los iones en el primer cuadrupolo analftico. Tambien se realizan y pueden usarse combinaciones de cuadrupolos y conos.

Otro cuadrupolo (= II o Q2) que sigue a Q1 sirve como camara de colision. En el se fragmentan los iones ventajosamente mediante la aplicacion de una tension de fragmentacion. Para la fragmentacion se aplican potenciales de ionizacion en el rango de 5 - 11 electronvoltios (eV), preferiblemente de 8 - 11 electronvoltios (eV). Q2 esta ademas de ello lleno con un gas de colision, como un gas noble como argon o helio u otro gas como CO2 o nitrogeno o mezclas de estos gases como argon/helio o argon/nitrogeno, para la fragmentacion en el procedimiento segun la invencion. Debido a motivos de coste, se prefieren argon y/o nitrogeno. En la camara de colision el gas de colision se presenta en el procedimiento segun la invencion con una presion de 1 x 10-5 a 1 x 10-1 Torr, preferiblemente 10-2. Es particularmente preferido el nitrogeno. Tambien puede producirse una fragmentacion individualizada de los iones en la camara de colision en presencia de un gas de colision sin la aplicacion de una tension de fragmentacion. Entre el cuadrupolo Q1 y Q2 pueden haber otros cuadrupolos o conos para la conduccion de los iones.

Al cuadrupolo Q2, el cual sirve como camara de colision, se une finalmente otro cuadrupolo (= III o Q3). En este Q3 pueden o bien determinarse los cocientes m/z de fragmentos seleccionados individuales, de varios o de tambien todos los cocientes m/z presentes en las mezclas de sustancias tras la ionizacion (denominados en esta solicitud por motivos de simplificacion como masa o masas). Entre los cuadrupolos Q2 y Q3 tambien puede haber otros cuadrupolos o conos para la conduccion de los iones.

En el procedimiento segun la invencion, pueden funcionar cuadrupolos individuales para el acumulamiento de iones tambien como trampa de iones, de las cuales se liberan entonces nuevamente los iones tras un determinado tiempo para el analisis.

Los cuadrupolos usados en los espectrometros de masas de triple cuadrupolo generan un campo electrico tridimensional en el que pueden mantenerse o conducirse los iones generados. Consisten por norma en 4, 6 u 8 barras o varillas con cuya ayuda se genera un campo electrico oscilante, estando conectadas electricamente barras opuestas. Ademas de la denominacion cuadrupolo, tambien se usan las denominaciones hexapolo u octapolo. En la presente solicitud estas denominaciones quedan comprendidas cuando se usa el concepto cuadrupolo. Ventajosamente en los cuadrupolos del espectrometro de masas de triple cuadrupolo para la conduccion de los iones solo son necesarias tensiones de aceleracion reducidas de unos pocos voltios, preferiblemente de unos 10 V.

En el procedimiento segun la invencion se usan ventajosamente mezclas de sustancias como extractos animales o vegetales, preferiblemente extractos vegetales.

En el procedimiento segun la invencion, tras la ionizacion de las mezclas de sustancias se realizan los siguientes pasos de procedimiento

I) en los pasos de procedimiento (a) hasta (c) se analiza y se selecciona la masa de al menos un ion presente en la mezcla se sustancias tras la ionizacion en Q1. Este ion seleccionado se fragmenta a continuacion en Q2 en presencia de gas de colision y una tension de fragmentacion y despues de ello se identifica uno de los iones fragmentados resultantes en otro cuadrupolo Q3 analftico y ventajosamente tambien se cuantifica. En este caso la seleccion del ion fragmentado a analizar se realiza de tal manera, que este ion tiene ventajosamente una alta intensidad, una masa caractenstica facilmente identificable y que permite en una forma de realizacion ventajosa del procedimiento una cuantificacion facil.

II) A continuacion, se analizan en el paso de procedimiento (d) las masas de todos los iones presentes tras la ionizacion en la mezcla de sustancias, estando el cuadrupolo Q2 usado como camara de colision siempre lleno de gas de colision, no aplicandose sin embargo en el paso de procedimiento (d) ninguna tension de fragmentacion en Q2. Este analisis puede producirse principalmente tanto con Q1 como tambien con Q3, es mas ventajoso sin embargo, llevar a cabo el analisis con Q3, dado que entre Q1 y el detector que se conecta con el espectrometro de masas, se encuentra el cuadrupolo Q2 usado como camara de colision. En caso de producirse en Q2 una fragmentacion a pesar de la falta de aplicacion de tension de fragmentacion, esto no tiene ninguna influencia en una posible deteccion de las masas de iones en el detector. En el caso de un analisis de masas con Q1, una fragmentacion de este tipo en Q2 conducina no obstante a errores en la deteccion. Por lo tanto se prefiere una deteccion de masas con Q3, dado que se eliminan o pueden despreciarse posibles fuentes de error.

Los pasos de proceso (I) o (II) indicados anteriormente tambien pueden llevarse a cabo en orden inverso. De la figura 1 se desprende el desarrollo del procedimiento segun la invencion. En el procedimiento segun la invencion se llevan a cabo los pasos de procedimiento (a) hasta (c) y (d) preferiblemente en, de 0,1 a 10 segundos al menos una vez, preferiblemente entre, de 0,2 a 6 segundos al menos una vez, de manera particularmente preferida entre, de 0,2 a 2 segundos, de manera muy particularmente preferida una vez entre, de 0,3 a por debajo de 2 segundos. Para posibilitar una evaluacion de las mediciones estadfsticamente ventajosa, los pasos de procedimiento se llevan a cabo entre, de 0,2 a 6 segundos de dos a tres, preferiblemente tres veces. Para posibilitar este tipo de mediciones que se producen rapidamente unas tras otras, el cuadrupolo Q2 que funciona como camara de colision esta lleno

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

permanentemente con gas de colision. Como mostraron las mediciones propias, esto no tiene ningun efecto negativo sobre la reproducibilidad de las mediciones.

Durante un analisis pueden analizarse en el procedimiento segun la invencion entre 1 y 100 cocientes de masa/carga de diferentes iones resultantes y seleccionados en el paso (a). Ventajosamente se identifican y/o cuantifican al menos 20 cocientes m/z, preferiblemente al menos 40 cocientes m/z, de manera particularmente preferida al menos 60 cocientes m/z, de manera muy particularmente preferida al menos 80 cocientes m/z de diferentes iones o mas.

Con la ayuda del procedimiento segun la invencion pueden analizarse ventajosamente ademas del analisis de todas las masas presentes en una masa de sustancias, tambien sustancias individuales o sus masas y cuantificarse ventajosamente.

Una limpieza de las mezclas de sustancias en principio no es necesaria en el procedimiento segun la invencion. Las mezclas de sustancias pueden medirse directamente tras la introduccion en una fuente de iones. Esto tambien es valido para mezclas de sustancias complejas. Tampoco tienen que anadirse a las mezclas de sustancias como estandares internos ningunas sustancias puras marcadas o no marcadas de sustancias posiblemente contenidas en las mezclas, si bien esto naturalmente es posible y facilita una cuantificacion posterior de las sustancias contenidas en las mezclas.

Es ventajosa no obstante, una limpieza mediante procedimientos conocidos por el experto, como procedimientos cromatograficos. Debido al procedimiento de ionizacion preferido en el procedimiento segun la invencion a traves de una pulverizacion de las mezclas de sustancias en el campo electrico, pueden acoplarse una limpieza y/o una limpieza previa de las mezclas de sustancias por ejemplo mediante una cromatograffa de manera muy sencilla al analisis de espectrometna de masas. Como procedimientos cromatograficos pueden usarse en este caso todos los procedimientos de separacion conocidos por el experto, como LC, HPLC o electroforesis capilar. Pueden usarse los procedimientos de separacion que se basan en la cromatograffa de adsorcion, permeacion de gel, de par de iones, de intercambio de iones, de exclusion, de afinidad, de fase normal o de fase inversa, por nombrar solo algunos de los posibles. Ventajosamente se usan cromatograffas basadas en fase normal y/o en fase inversa, preferiblemente columnas de fase inversa con diferentes materiales hidrofobos modificados como C4-, Ca- o C18-.

En el procedimiento segun la invencion es posible por ejemplo, un acoplamiento de procedimientos de limpieza, preferiblemente de procedimientos de cromatograffa con una velocidad de flujo del eluente (analitos + disolvente) de ventajosamente entre 1 pl/min hasta 2000 pl/min, preferiblemente entre 5 pl/min hasta 600 pl/min, de manera particularmente preferida entre 10 pl/min a 500 pl/min. Tambien pueden usarse velocidades de flujo menores o mayores sin dificultades en el procedimiento segun la invencion.

Como disolvente para el procedimiento de limpieza pueden usarse en principio todos los disolventes proticos o aproticos polares o no polares, los cuales son compatibles con la posterior tecnica analffica. Si un disolvente es compatible con la espectrometna de masas puede ser determinado facilmente por el experto mediante sencillas muestras de prueba. Los disolventes adecuados son por ejemplo disolventes, los cuales no poseen o solo poseen cargas bajas, como disolventes aproticos no polares, los cuales estan caracterizados por una constante dielectrica baja (Et<15), momentos dipolares bajos (p<2,5D) y valores EtN- (0,0 - 0,5). Pero tambien son adecuados para el procedimiento segun la invencion disolventes organicos dipolares o sus mezclas como disolventes. Como disolventes adecuados se nombran en este caso a modo de ejemplo, metanol, etanol, acetonitrilo, eter, heptano. Tambien son adecuados disolventes acidos bajos como acido formico, acido acetico o acido trifluoroacetico de 0,01 - 0,1 %. Son adecuados tambien disolventes de base baja como trietilamina o amoniaco de 0,01 - 0,1 %. Tambien son adecuados principalmente como disolventes, disolventes muy acidos o muy basicos como HCL de 5 % o trietilamina de 5 %. Tambien son ventajosas mezclas de los disolventes mencionados anteriormente. Tambien son adecuados como disolventes los tampones habituales en la bioqmmica, usandose ventajosamente tampones de < 200 mM, preferiblemente de < 100 mM, de manera particularmente preferida de < 50 mM, de manera muy particularmente preferida de < 20 mM. Tambien es ventajoso cuando se usan tampones de < 100 mM para la produccion de las mezclas de sustancias, que los tampones se eliminen total o parcialmente por ejemplo mediante una dialisis. Como tampones se nombran a modo de ejemplo tampon de acetato, de formiato, de fosfato, de tris, de MOPS, de HEPES o sus mezclas. Unos tampones y/o concentraciones de sales altos influyen negativamente en los procesos de ionizacion y eventualmente han de evitarse.

En el procedimiento segun la invencion pueden determinarse moleculas, las cuales estan contenidas en las mezclas de sustancias, de 100 Dalton (= D) a 100 kiloDalton (= kD), preferiblemente de 100 D a 20 kD, de manera particularmente preferida de 100 D - 10 kD, de manera muy particularmente preferida de 100 D a 2000 D, esto quiere decir, identificarse y eventualmente tambien cuantificarse.

Ventajosamente las mezclas de sustancias para el procedimiento segun la invencion, las cuales por lo demas solo pueden determinarse diffcilmente o no pueden determinarse, pueden derivatizarse antes del analisis y de esta manera finalmente analizarse. Una derivatizacion es particularmente ventajosa en casos en los que se introducen en compuestos hidrofobos o volatiles, como por ejemplo, ester, amidas, lactonas, aldetffdos, cetonas, alcoholes, etc., grupos hidrofilos, que ventajosamente tienen tambien una funcionalidad ionizable. Ejemplos de este tipo de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

derivatizaciones son transformaciones de aldetudos o cetonas en oxinas, hidrazonas o sus derivados, o alcoholes en esteres, por ejemplo, con antudridos simetricos o mixtos. Debido a ello puede ampliarse ventajosamente el espectro de determinacion del procedimiento.

Ventajosamente se anade para el analisis de las mezclas de sustancias en el procedimiento segun la invencion, un estandar interno como por ejemplo, peptido, aminoacidos, coenzimas, azucar, alcoholes, alquenos conjugados, acidos organicos o bases. Este estandar interno posibilita ventajosamente la cuantificacion de los compuestos en la mezcla. Las sustancias contenidas en la mezcla de sustancias pueden analizarse de esta manera mas facilmente y finalmente cuantificarse.

Como estandar interno se usan ventajosamente sustancias marcadas, pero principalmente tambien son adecuadas sustancias no marcadas como estandar interno. Este tipo de compuestos qmmicos parecidos son por ejemplo los llamados compuestos de una sucesion homologa, cuyos miembros solo se diferencian por ejemplo, por un grupo de metileno adicional. Como estandar interno se usan preferiblemente sustancias marcadas por al menos un isotopo elegido del grupo 2H, 13C, 15N, 17O, 18O, 33S, 34S, 36S, 35CI, 37CI, 29Si, 30Si, 74Se o sus mezclas. Preferiblemente se usa como isotopo debido a motivos de costes y debido a motivos de accesibilidad, 2H o 13C. Estos estandares internos no tienen que estar completamente marcados para el analisis, es decir, totalmente marcados. Un marcado parcial es totalmente suficiente. Ventajosamente tambien se elije en el caso de un estandar interno marcado, una sustancia que tiene una composicion qmmica lo mas homologa posible a las sustancias a analizar en la mezcla, esto quiere decir, similitud estructural con la que va a medirse. Cuanto mayor es la similitud estructural, mejores son los resultados de la medicion y con mayor exactitud puede producirse la cuantificacion del compuesto.

Para el procedimiento segun la invencion y particularmente para la cuantificacion de las sustancias presentes en la mezcla, es ventajoso usar el estandar interno en una proporcion ventajosa con respecto a la sustancia a medir. Proporciones de analito (=compuesto a determinar) con respecto al estandar interno mayores a 1:15 no conducen a ninguna mejora en el resultado de medicion, pero en principio son posibles. Ventajosamente se ajusta una proporcion de analito con respecto al estandar interno en un rango de 10:1 a 6:1, preferiblemente en un rango de 6:1 a 4:1, de manera particularmente preferida en un rango de 2:1 a 1:1

Las muestras de mezclas de sustancias en el procedimiento segun la invencion pueden prepararse manual o ventajosamente de manera automatica con robots de laboratorio habituales. El analisis con el espectrometro de masas tras eventual separacion cromatografica tambien puede llevarse a cabo manual o ventajosamente de manera automatica. Mediante la automatizacion del procedimiento segun la invencion, la espectrometna de masas puede usarse ventajosamente para el cribado rapido de diferentes mezclas de sustancias, por ejemplo, extractos de plantas en el cribado de alto rendimiento. El procedimiento segun la invencion se caracteriza en este caso por una alta sensibilidad, una buena cuantificabilidad, una excelente reproducibilidad, con un uso de muestra mmimo. Con el procedimiento pueden encontrarse por lo tanto rapidamente en mezclas de origen biologico, por ejemplo, nuevos mutantes de actividades enzimaticas conocidas o no conocidas tras una mutagenesis, por ejemplo tras una mutagenesis clasica con agentes qmmicos como NTG, radiacion, como radiacion UV o radiacion de rayos X o tras una llamada mutagenesis de sitio dirigido, mutagenesis PCR, mutagenesis de transposones o el llamado barajado de genes.

El procedimiento segun la invencion posibilita el analisis de una amplia gama de sustancias en un amplio rango de medicion, con una buena a muy buena resolucion, con una transmision de iones alta desde la fuente al detector, con una alta velocidad de cribado tanto en el modo de cribado completo de todas las sustancias en las mezclas de sustancias [= FS (por sus siglas en ingles, Full Scan-Modus), paso de procedimiento (d)], como tambien en el modo de monitorizacion de reaccion multiple [= MRM (por sus siglas en ingles, Multiple Reaction Monitoring-Modus), pasos de procedimiento (a) hasta (c)]. El procedimiento tiene ademas de ello, una sensibilidad de recepcion muy alta y una extraordinaria estabilidad de calibracion. Ademas de ello, es muy adecuado para el funcionamiento continuo y con ello para el uso en un cribado HTS.

La invencion se explica con mayor detalle mediante los siguientes ejemplos:

Ejemplos

1. Ejemplos: mediciones MRM + FS

a) TIC de la medicion MRM + FS

En la figura 2 se representa el cromatograma ionico total de una medicion MRM + cribado completo [MRM - Multiple Reaction Monitoring, monitorizacion de reaccion multiple, FS - Full Scan, cribado completo, TlC - Total Ion Chromatogram, cromatograma ionico total, XIT = suma de varios cromatogramas ionicos totales]. Se midio una muestra de control de calidad. Este tipo de muestra contiene una cantidad definida de analitos. Estos analitos se consiguieron comercialmente y se disolvieron en concentraciones conocidas en disolvente adecuado.

La representacion de la medicion elegida en la figura 2 muestra la suma de las intensidades (eje y) medidas en el detector en los correspondientes momentos (eje x) de los dos experimentos de espectrometna de masas de la monitorizacion de reaccion multiple (MRM) y del cribado completo (FS). El cromatograma de la figura 2 representa

5

10

15

20

25

30

35

40

45

por lo tanto la suma de los cromatogramas TIC de los dos experimentos de espectrometna de masas mencionados anteriormente

b) TIC del experimento MRM

En la figura 3 se representa el cromatograma ionico total del experimento MRM de una medicion MRM + FS.

La representacion de la medicion MRM elegida en la figura 3 muestra la suma de las intensidades (eje y) medidas en el detector en los correspondientes momentos (eje x) de los de los pasos de masa predefinidos del experimento MRM. La representacion elegida en la figura 4 muestra los correspondientes resultados de medicion de cada paso de masa individual (en este caso 30) en un eje de coordenadas.

c) TIC del experimento FS

En el TIC de la figura 5 se representa el experimento FS medido de manera alterna con respecto al experimento MRM.

En la figura 6 se representa el TIC del experimento FS. La suma de todos los espectros de masa FS que se recogieron en el intervalo temporal representado de manera sombreada se representan en la figura 7.

d) TIC de un experimento MRM

En la figura 8 se representa como en la figura 3 un cromatograma ionico total de una medicion MRM + cribado completo. Se midio una muestra de calibracion.

La representacion de la medicion elegida en la figura 8 muestra la suma de las intensidades (eje y) medidas en el detector en los correspondientes momentos (eje x) del experimento de espectrometna de masas de la monitorizacion de reaccion multiple.

La figura 9 reproduce un cromatograma extrafdo, en el que se identifico la coenzima Q 10.

La figura 10 y la figura 11 reflejan la identificacion de respectivamente capsantina y bixina.

La figura 12 refleja un cromatograma ionico total de un cribado completo de un extracto vegetal.

Las figuras 13 a 15 muestran las masas de diferentes analitos en el cromatograma extrafdo, cuya asignacion a una estructura espedfica aun tiene que ocurrir.

En el procedimiento descrito pudieron detectarse selectivamente hasta el momento 200 analitos mas.

Figuras:

Figura 1: representacion esquematica del procedimiento de analisis. Despues de que en el paso de proceso

I se han realizado los pasos de procedimiento (a) hasta (c) se realiza en el paso de proceso II el paso de procedimiento (d), y a la inversa.

Figura 2: representacion de la suma de los cromatogramas ionicos totales (TIC) de una medicion de

monitorizacion de reaccion multiple (MRM) (pasos de procedimiento (a) hasta (c) del procedimiento) y de una medicion de cribado completo (FS) (paso de procedimiento (d) del procedimiento) de la muestra 2.

Figura 3: representacion del cromatograma ionico total (TIC) en relacion con la parte de la monitorizacion de

reaccion multiple (MRM) (pasos de procedimiento (a) hasta (c) del procedimiento) con 30 pasos de masa predefinidos (llamados pares), basandose la medicion misma tanto en una medicion MRM (pasos de procedimiento (a) hasta (c)) como tambien en una medicion FS (paso de procedimiento (d)) de la muestra 2.

Figura 4: representacion del cromatograma ionico total (TIC) en relacion con la parte de la monitorizacion de

reaccion multiple (MRM) (pasos de procedimiento (a) hasta (c) del procedimiento) con 30 pasos de masa predefinidos (llamados pares), basandose la medicion misma tanto en una medicion MRM (pasos de procedimiento (a) hasta (c)) como tambien en una medicion FS (paso de procedimiento (d)) de la muestra 2, y representandose cada par individualmente.

Figura 5: representacion del cromatograma ionico total (TIC) en relacion con la parte de cribado completo

(FS) (paso de procedimiento (d) del procedimiento), basandose la medicion misma tanto en una medicion MRM (pasos de procedimiento (a) hasta (c)) como tambien en una medicion FS (paso de procedimiento (d)) de la muestra 2.

Figura 6: representacion del cromatograma ionico total (TIC) en relacion con la parte de cribado completo

(FS) (paso de procedimiento (d) del procedimiento), basandose la medicion misma tanto en una

Figura 7: 5

Figura 8:

10

Figura 9: 15

Figura 10:

medicion MRM (pasos de procedimiento (a) hasta (c)) como tambien en una medicion FS (paso de procedimiento (d)) de la muestra 2, como en la figura 5, destacandose de forma sombreada un intervalo temporal.

representacion del cromatograma ionico total (TIC) en relacion con la parte de cribado completo (FS) (paso de procedimiento (d) del procedimiento), la cual se recogio en la figura 6 en el intervalo temporal representado de manera sombreada (1,491 a 2,004), basandose la medicion misma tanto en una medicion MRM (pasos de procedimiento (a) hasta (c)) como tambien en una medicion FS (paso de procedimiento (d)) de la muestra 2.

representacion del cromatograma ionico total (TIC) en relacion con la parte de la monitorizacion de reaccion multiple (MRM) (pasos de procedimiento (a) hasta (c) del procedimiento) con 36 pasos de masa predefinidos (llamados pares), basandose la medicion misma tanto en una medicion MRM (pasos de procedimiento (a) hasta (c)) como tambien en una medicion FS (paso de procedimiento (d)) de una muestra de calibracion.

representacion del cromatograma ionico total extrafdo para el paso de masa m/z 863.7 tras 197 (coenzima Q10) de una muestra de calibracion, en el que la parte MRM comprendio 36 pares.

representacion del cromatograma ionico total extrafdo para el paso de masa m/z 585.4 tras 109.1 (capsantina) de una muestra de calibracion, en el que la parte MRM comprendio 36 pares.

Figura 11:

20 Figura 12:

Figura 13: Figura 14: Figura 15:

representacion del cromatograma ionico total extrafdo para el paso de masa m/z 395.1 tras 91.1 (bixina) de una muestra de calibracion, en el que la parte MRM comprendio 36 pares.

representacion del cromatograma ionico total (TIC) de un extracto vegetal en relacion con la parte FS (paso de procedimiento (d) del procedimiento).

representacion del cromatograma ionico total extrafdo para m/z = 518.4 de la muestra 4.

representacion del cromatograma ionico total extrafdo para m/z = 609.2 de la muestra 4.

representacion del cromatograma ionico total extrafdo para m/z = 210.0 de la muestra 4.

25

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de espectrometna de masas para el analisis de mezclas de sustancias con un espectrometro de masas de triple cuadrupolo, ionizandose las mezclas de sustancias antes del analisis, caracterizado porque el procedimiento comprende los siguientes pasos:

   a) seleccion de al menos un cociente de masa/carga (m/z) de iones resultantes por ionizacion en un primer cuadrupolo (I) analftico del espectrometro de masas,

   b) fragmentacion del (de los) ion (iones) elegido(s) en (a) aplicandose una tension de aceleracion en otro cuadrupolo (III) subsiguiente, el cual esta lleno de un gas de colision y que funciona como camara de colision,

   c) seleccion de un cociente de masa/carga de un ion de fragmentacion resultante de la fragmentacion (b), en otro cuadrupolo (III) subsiguiente y su analisis, realizandose los pasos de procedimiento (a) a (c) al menos una vez y

   d) analisis de los cocientes masa/carga de todos los iones presentes en la mezcla de sustancias por la ionizacion, estando lleno el cuadrupolo (III) de gas de colision, no aplicandose sin embargo durante el analisis, ninguna tension de aceleracion,

   pudiendo realizarse los pasos (a) a (c) y el paso (d) tambien en orden inverso.
2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado porque la ionizacion de la mezcla de sustancias va precedida de una separacion cromatografica.
3. 3. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque en el caso de la separacion cromatografica se trata de una separacion por cromatograffa de alta eficacia (HpLC).
4. 4. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los pasos (a) a (d) se realizan al menos una vez en, en el intervalo de 0,1 a 10 segundos.
5. 5. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los pasos (a) a (d) se realizan al menos una vez en, en el intervalo de 0,2 a 2 segundos.
6. 6. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la ionizacion se produce por evaporacion de la mezcla de sustancias e ionizacion en la fase gaseosa, por desorcion de la mezcla de sustancias en una superficie o por pulverizacion de la mezcla de sustancias en el campo electrico.
7. 7. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la ionizacion se produce por pulverizacion de la mezcla de sustancias en el campo electrico.
8. 8. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque en el paso (a) se analizan entre 1 y 100 cocientes de masa/carga de diferentes iones resultantes por ionizacion y seleccionados.
9. 9. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la mezcla de sustancias tiene origen biologico o qrnmico.
10. 10. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque las mezclas de sustancias se derivatizan antes del analisis o antes de la separacion cromatografica segun las reivindicaciones 2 o 3.
11. 11. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo manual o automaticamente.
12. 12. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el procedimiento se usa en un cribado de alto rendimiento.
13. 13. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se cuantifican

    (i) el ion fragmentado analizado en el paso (c) y los cocientes (m/z) analizados en paso (d) de todos los iones presentes en la mezcla de sustancias, o

    (ii) el ion fragmentado analizado en el paso (c), o

    (iii) los cocientes (m/z) analizados en el paso (d) de todos los iones presentes en la mezcla de sustancias.