CN117295950A - 用于脓毒症的早期检测的ngal标志物组 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诊断学领域。具体地，本发明涉及一种用于评定具有疑似感染的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：确定在所述受试者的样品中第一生物标志物的量，所述第一生物标志物为NGAL；确定在所述受试者的样品中第二生物标志物的量，其中所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM‑1和BNP型肽；将所述生物标志物的量与所述生物标志物的参考进行比较和/或基于所述生物标志物的量来计算用于评定具有疑似感染的所述受试者的评分；以及基于所述比较和/或所述计算来评定所述受试者。本发明还涉及第一生物标志物和第二生物标志物或者与所述第一生物标志物特异性结合的检测剂和与所述第二生物标志物特异性结合的检测剂用于评定具有疑似感染的受试者的用途，所述第一生物标志物为NGAL，所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM‑1和BNP型肽。此外，本发明进一步涉及一种用于评定具有疑似感染的受试者的计算机实现方法以及用于评定具有疑似感染的受试者的装置和试剂盒。

Description

用于脓毒症的早期检测的NGAL标志物组
本发明涉及诊断学领域。具体地，本发明涉及一种用于评定具有疑似感染的受试者的方法，该方法包括以下步骤：确定在受试者的样品中第一生物标志物的量，所述第一生物标志物为NGAL；确定在受试者的样品中第二生物标志物的量，其中所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽，将生物标志物的量与所述生物标志物的参考进行比较和/或基于生物标志物的量来计算用于评定具有疑似感染的受试者的评分，以及基于该比较和/或该计算来评定所述受试者。本发明还涉及第一生物标志物和第二生物标志物或者与所述第一生物标志物特异性结合的检测剂和与所述第二生物标志物特异性结合的检测剂用于评定具有疑似感染的受试者的用途，所述第一生物标志物为NGAL，所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽。此外，本发明进一步涉及用于评定具有疑似感染的受试者的计算机实现方法以及用于评定具有疑似感染的受试者的装置和试剂盒。
感染，特别是在具有更严重的体征和症状的患者(诸如在急诊室就诊的患者)中发生的感染，有时可能发展成更危及生命的医疗状况，包括全身性炎症应答综合征(SIRS)和脓毒症。
根据第3阶段脓毒症的定义，脓毒症被定义为由于宿主对感染的应答失调而导致的危及生命的器官功能障碍。由于脓毒症发展迅速，早期识别对于脓毒症患者管理和开始正确的治疗措施非常重要，该治疗措施包括入院的第一个小时内适当的抗生素疗法，以及开始使用静脉输液和血管活性药物进行复苏(2016年拯救脓毒症运动指南)。每延误一小时，发病率和死亡率就会逐渐增加。
脓毒症的诊断基于非特异性的临床体征和症状，并且很容易被漏诊。因此，患者经常被误诊并且疾病的严重性经常被低估。迄今为止，总体上尚无脓毒症诊断的金标准，特别是在急诊科。在高收入国家，急诊科经常使用c反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)和白细胞(WBC)计数来检测处于发展脓毒症风险的具有血液感染的患者，并与乳酸一起用于检测脓毒性休克。在低收入国家，诊断主要基于临床体征和症状，并且在某些情况下还基于SIRS和SOFA标准。然而，在最新的指南中，除了乳酸之外，没有列出用于诊断脓毒症的生物标志物(临床化学、BGE和SOFA评分的血液学成分除外)。然而，仅在有中等证据的情况下，才建议PCT来潜在地降低抗生素疗法的剂量。PCT在脓毒症诊断中的局限性主要是中等的敏感性和特异性。
WO 2007/009071公开了一种基于sFlt-1在测试受试者中诊断炎症性应答的方法。所公开的方法进一步包括分析VEGF、PlGF5、TNF-α、IL-6、D-二聚体、P-选择素、ICAM-I、VCAM-I、Cox-2或PAI-I中的至少一者的水平。
EP 2 174 143 B1公开了一种用于患有非感染原发疾病的患者的预后的体外方法，该方法包括确定降钙素原的水平。
多种标志物已被认为可用于检测或诊断脓毒症。这些标志物包括PCT、Presepsin、GDF-15、sFLT、炎症标志物如CRP或白细胞介素、或器官衰竭的特异性标志物等(参见，例如，Spanuth，2014，Comparison of sCD14-ST(presepsin)with eight biomarkers formortality prediction in patients admitted with acute heart failure，2014AACCAnnual Meeting Abstracts.B-331；van Engelen，2018，Crit Care Clin 34(1)：139-152.)
WO2015/031996描述了用于早期确定对疾病和/或治疗应答的关键或危及生命的应答的生物标志物。
然而，仍然需要生物标志物，以便对表现出感染体征和症状的患者进行可靠且早期的评定。
因此，本发明提供了符合这些需求的手段和方法。
本发明涉及一种用于评定具有疑似感染的受试者的方法，该方法包括以下步骤：
(a)确定在受试者的样品中第一生物标志物的量，所述第一生物标志物为NGAL；
(b)确定在受试者的样品中第二生物标志物的量，其中所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽；
(c)将生物标志物的量与所述生物标志物的参考进行比较和/或基于生物标志物的量来计算用于评定具有疑似感染的受试者的评分；
以及
(d)基于在步骤(c)中进行的比较和/或计算来评定所述受试者。
应当理解，如说明书和权利要求书中所用，“一”或“一个”可意指一个或多个，取决于其所用的上下文。因此，例如，对“一个”项目的提及可意指能够利用至少一个项目。
如下文所使用的，术语“具有”、“包括”或“包含”或它们的任意语法变化形式以非排他性方式使用。因此，这些术语既可以指除了由这些术语引入的特征之外，在此上下文中描述的实体中不存在其他特征的情况，也可以指存在一个或多个其他特征的情况。作为示例，表述“A具有B”、“A包括B”和“A包含B”既可以指其中除B之外，A中不存在其他要素的情况(即，其中A由B单独且唯一地组成的情况)，也可以指其中除B之外，实体A中还存在一个或多个其他要素(诸如要素C、要素C和要素D或甚至其他要素)的情况。术语“包含”还涵盖其中仅存在所提及的项目的实施方案，即，其具有在“由……组成”的意义上的限制性含义。
进一步地，如下文所使用的，术语“特别地”、“更特别地”、“通常地”和“更通常地”或类似的术语与附加/替代特征结合使用，而不限制替代的可能性。因此，由这些术语引入的特征是附加/替代特征，并且无意以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员将认识到的，本发明可以通过使用替代性特征来执行。类似地，由“在本发明的实施例中”引入的特征或类似表述意图成为附加/替代特征，而对本发明的替代实施例没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对将以这种方式引入的特征与本发明的其他附加/替代或非附加/替代特征相结合的可能性也没有任何限制。
进一步地，应当理解，如本文所用的术语“至少一个”意指根据本发明可以使用该术语后面提及的项目中的一者或多者。例如，如果该术语指示应当使用至少一个采样单元，则可以被理解为一个采样单元或多于一个采样单元，即两个、三个、四个、五个或任何其他数量。根据该术语所指的项目，技术人员将理解该术语可以指代的上限(如果有的话)。
如本文所用的术语“约”意指相对于所述术语之后引用的任何数字，存在能够实现技术效果的区间精度。因此，本文所述的约优选地是指精确数值或所述精确数值±20％、优选地±15％、更优选地±10％、或甚至更优选地±5％的范围。
此外，说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”等用于区分相似的元件，而不一定用于描述顺序或时间顺序。
本发明的方法可以由上述步骤组成，或者可以包括附加的步骤，诸如用于进一步评估在步骤(d)中获得的评定的步骤、推荐治疗措施(诸如治疗)的步骤等。此外，它可以包括步骤(a)(诸如与样品预处理有关的步骤)之前的步骤。然而，优选地，设想上述方法是一种不需要在人体或动物身上进行任何步骤的离体方法。此外，该方法可以通过自动化辅助。通常，生物标志物的确定可以由机器人设备来支持，而比较和评定可以由数据处理设备(诸如计算机)来支持。
本文使用的术语“评定”是指评定受试者是否患有脓毒症、是否处于患脓毒症的风险、是否表现出关于总体健康状况或关于脓毒症或伴随脓毒症和/或感染的体征和症状恶化的医学状况。因此，本文使用的评定包括诊断脓毒症、预测发展脓毒症的风险和/或预测受试者健康状况的任何恶化，特别是关于伴随脓毒症和/或感染的体征和症状。
通常，根据本发明所指的评定是对发展脓毒症的风险的评定(以及因此对发展脓毒症的风险的预测)。替代性地，评定是对受试者状况将恶化的风险的预测。此外，应当理解，如果预测发展脓毒症的风险或健康状况恶化的风险，则通常在预测窗口内进行预测。更通常地，所述预测窗口为优选地在获得样品之后约8h、约10h、约12h、约16h、约20h、约24h、约48h、特别是至少约48h。进一步，可以预测优选地在获得测试样品之后24小时或48小时内发展脓毒症的风险。
在一个实施例中，预测24小时内发展脓毒症的风险。
在替代实施例中，预测48小时内发展脓毒症的风险。
在实例部分测试了48小时的时间段。
在又一个实施例中，评定是对受试者的(健康)状况在未来将恶化或不恶化的风险的预测。术语疑似患有感染和/或正在患有感染的受试者“状况恶化”是技术人员熟知的。该术语通常涉及状况的恶化，可能最终导致进一步的药物治疗或其他干预。
优选地，如果受试者的疾病严重程度增加、如果受试者的抗生素疗法加强、如果受试者被送入ICU或另一单元接受更高水平的护理、如果受试者需要紧急手术、如果受试者在医院死亡、如果受试者在入院后30天内死亡，如果受试者在出院后30天内再次住院，如果受试者经历器官功能障碍或衰竭(如例如使用SOFA评分测量的)、和/或如果受试者需要器官支持，受试者的状况恶化。
本领域技术人员理解受试者的状况何时没有恶化。通常，如果受试者没有前一段中提到的结果，则受试者的状况没有恶化。
在一个实施例中，如果受试者具有以下结果中的一种或多种，则受试者的状况恶化：如果受试者被送入ICU、如果受试者在医院死亡、如果受试者在入院后30天内死亡和/或如果受试者在出院后30天内再次住院。
在一个实施例中，对受试者的状况将恶化的风险的预测是对受试者的抗生素疗法加强的风险的预测。
在一个实施例中，对受试者的状况将恶化的风险的预测是对受试者被送入ICU的风险的预测。因此，评估受试者是否有处于被送入ICU的风险。
在另一个实施例中，对受试者的状况将恶化的风险的预测是对受试者在医院死亡的风险的预测。因此，评定受试者是否处于在医院死亡的风险。
在又一个实施例中，对受试者的状况将恶化的风险的预测是对受试者入院30天内死亡的风险的预测。因此，评定受试者是否处于入院后30天内死亡的风险。
在又一个实施例中，对受试者的状况将恶化的风险的预测是对受试者在出院后30天内再次住院的风险的预测。因此，评定受试者是否处于在出院后30天内再次住院的风险。
在又一个实施例中，对受试者的状况将恶化的风险的预测是对受试者经历器官功能障碍或衰竭的风险的预测。器官功能障碍和衰竭可以是例如经由SOFA评分进行评定。因此，本发明进一步涉及预测受试者的SOFA评分将增加或不增加的风险(在获得测试样品之后)。SOFA评分的增加(诸如增加至少一分、至少两分、至少三分或至少四分等)被认为是状况的恶化。相反，如果SOFA评分没增加(假设受试者没有最高的SOFA评分)，则状况通常不会恶化。预测窗口可以是如上所述的用于预测发展脓毒症的风险的预测窗口。
序贯器官衰竭评定(SOFA)是一种经过验证的评分，结合了临床评定和实验室测量，定量地描述器官功能障碍/衰竭。呼吸、凝血、肝脏、心血管系统、中枢神经系统和肾脏功能障碍单独评分，并汇总到SOFA评分，范围从0至24。优选地，SOFA评分如Vincent 1996中所描述的那样确定(Vincent等人IntensiVe Care Med.1996Jul；22(7)：707-10.doi：10.1007/BF01709751.PMID：8844239.)。
在又一个实施例中，对受试者的状况将恶化的风险的预测是对受试者需要器官支持的风险的预测，诸如对受试者需要血管活性疗法、血流动力学支持(诸如液体疗法)、氧气供应(例如通过通气或体外膜肺氧合)和/或肾脏替代疗法的风险的预测。预测窗口可以是如上所述的用于预测发展脓毒症的风险的预测窗口，例如在获得样品后的24小时或48小时内。
在一个实施例中，术语“评定”是指脓毒症的诊断。因此，诊断具有疑似感染的受试者是否患有脓毒症。优选地，评定是指脓毒症的早期检测。
如本领域技术人员将理解的，根据本发明进行的评定虽然是优选的，但可能通常不会对100％的被研究的受试者都是正确的。该术语通常要求能够正确评定统计上显著部分的受试者。本领域技术人员可使用各种众所周知的统计评定工具(例如，确定置信区间、确定p值、学生t检验、曼-惠特尼检验等)毫不费力地确定一部分是否具有统计学意义。详细信息请参见Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York1983。通常设想的置信区间为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％。p值通常为0.2、0.1、0.05。
如本文所用的术语“受试者”是指动物，优选地哺乳动物，并且更典型地指人。通过本发明的方法进行调查的受试者应当是具有疑似感染的受试者。本文使用的术语“疑似感染”是指受试者应表现出感染的临床参数、体征和/或症状。因此，根据本发明的受试者通常是患有感染或疑似患有感染的受试者。通常，受试者为在急诊科就诊的受试者。有利地，样品已在就诊时获得。优选地，样品已在急诊科就诊时获得。然而，样品也可以在初级保健医生就诊时获得。
如本文所用的术语“样品”是指在生理条件下包括本文所述的第一生物标志物、第二生物标志物和/或第三生物标志物的任何样品。更通常地，样品是体液样品(例如血液样品或来源于其的样品)、尿液样品、唾液样品、淋巴液样品等。最通常地，所述样品为血液样品或来源于其的样品。在优选实施例中，样品是血液样品、血清样品或血浆样品。血液样品通常包括毛细血管样品、静脉样品或动脉血液样品。
在一些实施例中，样品为组织液样品。
术语“脓毒症”在本领域是众所周知的。如本文所用，该术语指由宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。例如，脓毒症的定义可以在Singer等人中找到(Sepsis-3 The Third International Consensus Definitions for Sepsis and SepticShock.JAMA 2016；315：801-819)，其全部公开内容通过引用并入本文。优选地，术语“脓毒症”是指根据如Singer等人公开的脓毒症-3定义的脓毒症(在之前引用的地方)。
通常，待测试的受试者应疑似患有感染。术语“感染”被技术人员很好地理解。如本文所用，术语“感染”优选地指由致病微生物侵对试者的身体组织的袭受、该微生物的增殖以及受试者的组织对该微生物的反应。在一个实施例中，感染是细菌感染。因此，受试者应疑似患有细菌感染。
如本文别处所述的，本发明允许对处于危险中的患者进行早期鉴定。在如本文所述的预测的实施例中，待测试的受试者因此在获得样品时未患有脓毒症。在特别优选的实施例中，待测试的受试者优选地在获得样品时未患有脓毒性休克。Singer等人对术语“脓毒性休克”进行了定义(在之前引用的地方)。因此，如果满足以下标准，则受试者患有脓毒性休克。
·脓毒症，即疑似/记录的感染以及总SOFA的变化
评分≥2分，结果为感染
·并且持续性低血压需要血管升压药来维持
MAP≥65mm Hg且血清乳酸水平＞2mmol/L
(18mg/dL)尽管有足够的容量复苏
此外，设想待测试的受试者可能感染也可能不感染SARS-CoV-2。
本文所用的术语“确定”是指对根据本发明提及的生物标志物的定性和定量的确定，即该术语涵盖对所述生物标志物的存在或不存在的确定或对所述生物标志物的绝对或相对量的确定。
如本文所用的术语“量”是指本文提及的化合物的绝对量、所述化合物的相对量或浓度以及与其相关或可从其得出的任何值或参数。此类值或参数包括来自通过直接测量从所述化合物获得的所有特定的物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR谱中的强度值。此外，所涵盖的是通过在本说明书别处指定的间接测量获得的所有值或参数，例如，响应于化合物或从特异性结合的配体获得的强度信号而从生物读出系统确定的响应水平。应理解的是，与上述量或参数相关的值也可以通过所有标准数学运算获得。在生物标志物是酶，诸如丙氨酸转氨酶(ALAT)或天冬氨酸转氨酶(AST或ASAT)的情况下，术语“量”还可以涵盖酶的活性。
在本发明的方法中确定量可以通过允许在所述第二分子从第一分子释放时检测所述第二分子的存在或不存在或量的任何技术来进行。合适的技术取决于生物标志物的分子性质和特性，并且在本文别处更详细地讨论。
通常，根据本发明提及的生物标志物的量可以通过使用三明治、竞争或其他测定形式的免疫测定来确定。所述测定将产生指示生物标志物的存在或不存在或量的信号。其他合适方法包括测量生物标志物特有的物理或化学性质，诸如其精确的分子质量或NMR谱。所述方法包括，优选地，生物传感器、耦合到免疫测定的光学装置、生物芯片、分析装置(诸如质谱仪、NMR分析仪、表面等离子共振测量设备或色谱装置)。此外，方法包括基于微板ELISA的方法、全自动或机器人免疫测定(例如可从Roche获得)。根据本发明的合适的测量方法还可以包括沉淀(特别是免疫沉淀)、电化学发光(电致化学发光)、RIA(放射免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、电化学发光三明治免疫测定(ECLIA)、解离增强镧系荧光免疫测定(DELFIA)、临近闪烁测定(SPA)、比浊法、散射测浊法、胶乳增强比浊法或比浊法或固相免疫测试。本领域已知的其他方法诸如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或蛋白质印迹。更通常地，特别设想用于确定本文提及的生物标志物的技术在下面所附实例中描述。
待根据本发明确定的生物标志物是本领域众所周知的。此外，用于确定生物标志物的量的方法是已知的。例如，可以如实例部分中所述测量生物标志物(参见实例1)。一些测试的生物标志物是酶(ALAT和ASAT)。这些生物标志物的量还可以通过确定样品中所述酶的活性来确定。
生物标志物NGAL(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白)，通常也称为“Lipocaline-2”，是本领域众所周知的。NGAL是可运输小型疏水性配体的脂质运载蛋白家族的成员。它由人类的LCN2基因编码。已知该生物标志物在中性粒细胞中高度表达。此外，该生物标志物被用作用于急性肾损伤和炎症性肠病的生物标志物。人类NGAL的序列是众所周知的，并且可以例如源自UniProt数据库(参见UniProtKB-P80188，NGAL_HUMAN)。
白细胞介素-6(Interleukin-6，缩写为IL-6)是一种由T细胞和巨噬细胞分泌的白细胞介素，用来刺激免疫反应，例如在感染期间和外伤后，特别是烧伤或其他导致炎症的组织损伤后。它既是促炎细胞因子又是抗炎细胞因子。在人类中，它是由IL6基因编码。人类IL-6的序列可以经由GenBank获得(多核苷酸序列参见NM_000600.3，且氨基酸序列参见NP_000591.1)。IL-6通过细胞表面I型细胞因子受体复合物发出信号，该复合物由配体结合IL-6Rα链(CD126)和信号转导成分gp130(也称为CD130)组成。CD130是包括白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子、抑瘤素M、IL-11和心肌营养素-1等几种细胞因子的常见的信号转导因子，并且在大多数组织中几乎普遍表达。相反，CD126的表达仅限于某些组织。当IL-6与其受体相互作用时，它会触发gp130和IL-6R蛋白以形成复合物，从而激活受体。这些复合物将gp130的细胞内区域聚集在一起，通过某些转录因子、两面神激酶(JAK)以及信号转导因子和转录激活因子启动信号转导级联。
生物标志物内皮细胞特异性分子1(缩写为ESM-1)是本领域众所周知的。生物标志物通常也被称为endocan。ESM-1是分泌蛋白，其主要在人肺和肾组织的内皮细胞中表达。公共领域数据表明，甲状腺、肺和肾中也表达，但在心脏组织中也表达，参见例如蛋白Atlas数据库中ESM-1的条目(Uhlén M.等人，Science 2015；347(6220)：1260419)。该基因的表达受细胞因子调节。ESM-1是由20kDa成熟多肽和30kDa O-连接的聚糖链构成的蛋白聚糖(Bechard D等人，J Biol Chem 2001；276(51)：48341-48349)。在本发明的一个优选实施例中，在来自主体的样品中测定人ESM-1多肽的量。人ESM-1多肽的序列是本领域众所周知的(例如参见Lassale P.等人，J.Biol.Chem.1996；271：20458-20464并且可以例如通过Uniprot数据库进行评定，参见条目Q9NQ30(ESM1_HUMAN)。通过选择性剪接产生ESM-1的两种同工型，即同工型1(具有Uniprot标识符Q9NQ30-1)和同工型2(具有Uniprot标识符Q9NQ30-2)。同工型1的长度为184个氨基酸。在同工型2中，缺少同工型1的氨基酸101至150。氨基酸1至19形成信号肽(可能会被裂解)。
在一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型1、即具有如UniProt登录号Q9NQ30-1所示的序列的同工型1的量。
在另一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型2、即具有如UniProt登录号Q9NQ30-2所示的序列的同工型2的量。
在另一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型1和同工型2、即总ESM-1的量。
生物标志物“胆红素”在本领域是众所周知的。胆红素是双二烯类的成员，是线性四吡咯，其二吡咯单元为外乙烯基和内乙烯基类型两者。它是血红素降解的产物，通过胆绿素的还原在网状内皮系统中产生，并作为与血清白蛋白的复合物转运到肝脏。它具有抗氧化剂的作用。胆红素测量在大多数医学实验室中常规进行并且可以通过多种方法测量(诸如通过实例部分中描述的方法)。
丙氨酸转氨酶(ALAT)催化L-丙氨酸转氨为α-酮戊二酸(g-KG)，形成L-谷氨酸和丙酮酸。形成的丙酮酸被乳酸脱氢酶(LDH)还原为乳酸，同时氧化还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。吸光度的变化与丙氨酸转氨酶活性成正比，并且可以例如使用双色(340nm、700nm)速率技术来测量。
天冬氨酸转氨酶(AST或ASAT)催化L-天冬氨酸转氨为α-酮戊二酸，形成L-谷氨酸和草乙酸。形成的草乙酸通过苹果酸脱氢酶(MDH)还原为苹果酸，同时氧化还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。由于NADH转化为NAD，吸光度随时间的变化与AST活性成正比，并且可以例如使用双色(340nm、700nm)速率技术来测量。
生物标志物“触珠蛋白”(缩写为HAPT)在本领域中是众所周知的。在人类中，该蛋白质由HP基因编码。触珠蛋白捕获并与游离血浆血红蛋白结合，以允许肝脏回收血红素铁并防止肾脏损伤。触珠蛋白还充当抗氧化剂，具有抗菌活性，并在调节急性期反应的许多方面发挥作用。关于人类触珠蛋白多肽的序列的信息可以经由Uniprot获得(参见UniProtKB-P00738(HPT_HUMAN))。
如本文所用，术语“BNP型肽”优选地包括pre-proBNP、proBNP、NT-proBNP和BNP。更优选地，BNP型肽为NT-proBNP或BNP。最优选地，BNP型肽为NT-proBNP。前体原肽(在pre-proBNP的情况下为134个氨基酸)包含短信号肽，其被酶裂解以释放前导肽(在proBNP的情况下为108个氨基酸)。将前导肽进一步裂解为N端前导肽(NT-pro肽，在NT-proBNP的情况下为76个氨基酸)和活性激素(在BNP的情况下为32个氨基酸)。优选地，根据本发明的BNP型肽为NT-proBNP、BNP及它们的变体。BNP(脑利尿钠肽)为活性激素，并且具有比其相应的非活性对比物NT-proBNP短的半衰期。
生物标志物肝素结合蛋白(缩写为HBP)也称为37kDa的阳离子抗菌蛋白(CAP37)或天青杀素。它是在中性粒细胞中合成的37kDa糖蛋白。此外，已知肝素是来源于中性粒细胞颗粒的抗菌剂以及单核细胞和成纤维细胞特异性趋化糖蛋白。HBP属于丝氨酸蛋白酶超家族。然而，它作为蛋白酶是无活性的。人类HBP的氨基酸序列可经由UniProt获得(参见UniProtKB-P20160(CAP7_HUMAN))。
在根据本发明的方法中，可以确定第三生物标志物。特别是，在本发明的方法的步骤(b)中
(i)如果确定作为第二生物标志物的HBP(肝素结合蛋白)的量，该方法将进一步包括确定作为第三生物标志物的胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)的量；或者
(ii)如果确定作为第二生物标志物的天冬氨酸转氨酶的量，该方法将进一步包括确定作为第三生物标志物的BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP的量。
因此，本发明涉及至少两种生物标志物(即，如本文所指的第一生物标志物和第二生物标志物)或至少三种生物标志物(即，如本文所指的第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物)的确定。
第一生物标志物为NGAL。第二生物标志物应选择HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶(ASAT)、胆红素、丙氨酸转氨酶(ALAT)、ESM-1和BNP型肽(诸如NT-proBNP或BNP)。
在替代实施例中，第二生物标志物为BNP型肽，诸如NT-proBNP或BNP，优选地NT-proBNP。
在替代实施例中，第二生物标志物为HBP。
在替代实施例中，第二生物标志物为ASAT。
在替代实施例中，第二生物标志物为胆红素。
在替代实施例中，第二生物标志物为ALAT。
在替代实施例中，第二生物标志物为ESM-1。
如果HBP是第二生物标志物，则该方法可进一步包括确定作为第三生物标志物的胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)的量。
在一个实施例中，确定NGAL、HBP和胆红素。
在替代实施例中，确定NGAL、HBP和天冬氨酸转氨酶。
在替代实施例中，确定NGAL、HBP和丙氨酸转氨酶。
在替代实施例中，确定NGAL、HBP和触珠蛋白。
在替代实施例中，确定NGAL、HBP和ESM1。
在替代实施例中，确定NGAL、HBP和IL-6。
如果确定作为第二生物标志物的天冬氨酸转氨酶的量，则该方法可进一步包括确定作为第三生物标志物的BNP型肽，诸如NT-proBNP或BNP，优选地NT-proBNP的量。
应当理解，本发明不限于上述标志物。相反，本发明可以涵盖对附加标志物的确定。
本文使用的术语“参考”是指允许将受试者分配至患有疾病或病症或处于发展该疾病或病症的风险的受试者组或未患有所述疾病或病症或未处于发展该疾病或病症的风险的受试者组的量或值。此类参考可以是将这些组彼此分开的阈值量。因此，参考应是允许将受试者分配至患有或不患有疾病或病症或处于或未处于发展该疾病或病症的风险的受试者组中的量或评分。例如，参考应是允许将受试者分配至处于发展脓毒症的风险或未处于发展序列的风险的受试者组中的量或评分(在如上所述的预测窗口内，诸如约48小时内)。
通过本文在别处提到的统计测试，基于来自已知患有疾病或病症或处于发展该疾病或病症的风险中的受试者或受试者组的生物标志物的量，或已知未患有疾病或病症或未处于发展该疾病或病症的风险中的受试者或受试者组的生物标记物的量，无需进一步计算分离两组的合适阈值量。适用于个体受试者的参考量可以根据各种生理参数(诸如年龄、性别或亚群)而变化。
通常地，所述参考为来源于至少一个已知处于发展脓毒症的风险的受试者的每种生物标志物的参考，优选地其中生物标志物中的每一者的量与对应参考基本相同或相似指示受试者处于发展脓毒症的风险，而生物标志物中的每一者的量与对应参考不同则指示受试者未处于发展脓毒症的风险。
还通常地，所述参考为来源于至少一个已知未处于发展脓毒症的风险的受试者的每种生物标志物的参考，优选地其中生物标志物中的每一者的量与对应参考基本相同或相似指示受试者未处于发展脓毒症的风险，而生物标志物中的每一者的量与对应参考不同则指示受试者处于发展脓毒症的风险。
术语“至少一名受试者”是指一名受试者或多于一名受试者，诸如至少10名、50名、100名、200名或1000名受试者。
在一个实施例中，生物标志物的量大于所述生物标志物的参考指示受试者处于风险(例如发展脓毒症)。此外，生物标志物的量低于所述生物标志物的参考指示受试者未处于风险(触珠蛋白除外：对于触珠蛋白，生物标志物的量低于所述生物标志物的参考指示受试者处于风险，而生物标志物的量大于所述生物标志物的参考指示受试者未处于风险)。
原则上可以通过应用标准统计方法，基于给定参数(诸如生物标志物量)的平均值或算术平均值来计算一组受试者的参考量。特别是，测试(诸如旨在诊断发生事件或未发生事件的方法)的准确性通过其接收器操作特性(ROC)而被最好地描述(特别地参见Zweig1993，Clin.Chem.39：561-577)。ROC曲线图是在观察到的整个数据范围内连续改变决策阈值所产生的所有灵敏性/特异性对的图。诊断方法的临床性能取决于它的准确性，即它正确地将受试者分配至某个预后或诊断的能力。ROC曲线图通过将适用于区分的整个阈值范围的敏感性对比1-特异性绘制成曲线而显示了两种分布之间的重叠。y轴上是敏感性，即真阳性分数，其被定义为真阳性测试结果数与真阳性测试结果数和假阴性测试结果数之积的比率。这也被称为存在疾病或病症时的阳性。其仅从受影响的子组计算。x轴上是假阳性分数，或1-特异性，其被定义为假阳性结果数与真阴性结果数和假阳性结果数之积的比率。这是一个特异性指数，并且完全由未受影响的子组计算得出。由于真阳性分数和假阳性分数是完全分开计算的，所以通过使用来自两个不同子组的测试结果，ROC曲线图与同期群中事件的患病率无关。ROC曲线图上的每个点代表对应于特定决策阈值的灵敏性/-特异性对。有完全区别(两种结果分布没有重叠)的测试具有穿过左上角的ROC曲线图，其中真阳性分数为1.0或100％(完全敏感性)，并且假阳性分数为0(完全特异性)。无区别(两个组的结果分布相同)的测试的理论曲线是从左下角到右上角的45°对角线。大多数曲线落在这两个极端之间。如果ROC曲线图完全落到低于45°对角线，则可以通过将“阳性”的标准从“大于”逆转为“小于”或反之亦然来轻松纠正。定性地，曲线越接近左上角，则测试的总体准确性就越高。根据期望的置信区间，可以从ROC曲线导出阈值，从而允许分别在灵敏性和特异性适当平衡下对给定事件进行诊断或预测。因此，通常地，通过建立如上描述的所述群组的ROC并由此导出阈值量，可以生成用于本发明的上述方法的参考，即允许区分处于风险的受试者与未处于风险的受试者的阈值。根据诊断方法所需的灵敏性和特异性，ROC曲线图允许得出合适的阈值。应当理解，对于排除处于风险增加或患有疾病的受试者(即排除)，需要最佳的灵敏性；而对于要被评定为处于风险增加或患有疾病的受试者(即确认)，设想了最佳的特异性。
本发明方法的步骤c)包括将生物标志物(即第一生物标志物、第二生物标志物和任选地第三生物标志物)的量与所述生物标志物的参考进行比较和/或基于生物标志物的量来计算用于评定具有疑似感染的受试者的评分。
因此，第一生物标志物、第二生物标志物和任选地第三生物标志物的量可以分别与第一生物标志物的参考、第二生物标志物的参考和任选地第三生物标志物的参考进行比较。
替代性地，可以基于生物标志物的量，即基于第一生物标志物的量、第二生物标志物的量和任选地第三生物标志物的量来计算评分。所述评分应允许评定具有疑似感染的受试者，诸如用于预测发展脓毒症的风险。任选地，可以将所述评分与合适的参考评分进行比较。
本文使用的术语“比较”涵盖将如本文提及的生物标志物的确定量与参考进行比较。应当理解，本文所用的比较是指在量的值与参考之间进行的任何类型的比较。然而，应当理解，优选地，相同类型的值彼此比较，例如，如果在本发明的方法中确定并要比较绝对量，则参考也应该是绝对量，如果在本发明的方法中确定并要比较相对量，则参考也应该是相对量，等等。替代性地，本文使用的术语“比较”涵盖将计算的评分与合适的参考核心进行比较。可手动或计算机辅助进行比较。例如，可以将量的值与参考彼此比较，并且所述比较可以由执行比较算法的计算机程序自动执行。执行所述评估的计算机程序将以合适的输出格式提供所需的评定。
如上所述，还设想基于第一生物标志物和第二生物标志物或者第一生物标志物、第二生物标志物或第三生物标志物的量(即单个评分)来计算评分(特别是单个评分)，并且将该评分与参考评分进行比较。优选地，评分基于来自测试受试者的样品中第一生物标志物和第二生物标志物的量，并且如果确定了第三生物标志物的量，则基于来自测试受试者的样品中第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物的量。
计算出的评分结合了至少两种或三种生物标志物的量的信息。此外，在评分中，优选地根据生物标志物对建立评定的贡献对生物标志物进行加权。因此，各个标志物的值通常被加权并且加权值用于计算评分。合适的系数(权重)可以由技术人员确定，不需要进一步的繁琐工作。还可以从已在至少两种生物标志物上训练过的决策树或决策树集(集合)来计算评分。基于在本发明的方法中应用的生物标志物的组合，单个生物标志物的权重以及决策树的结构可以是不同的。
该评分可以被视为用于评定本文所述的受试者的分类器参数。特别是，它使提供评定的人能够基于单一评分。参考评分优选地是一个值，特别是允许用于评定本文所述的具有疑似感染的受试者的截断值。优选地，参考是单个值。因此，人们不必解释有关各个生物标志物的量的全部信息。使用本文所述的评分系统，有利地，可以使用生物标志物的不同维度或单位的值，因为这些值将被数学地转换成评分。因此，例如绝对浓度值可以与峰面积比组合成评分。可以基于期望的灵敏性或期望的特异性来选择要应用的参考评分。如何选择合适的参考评分在本领域中是众所周知的。
有利地，在本发明的基础研究中已经发现，第一生物标志物与第二生物标志物和优选地第三生物标志物的组合允许对表现出感染的体征和症状的患者进行可靠且早期的评定。例如，对受试者的评定可以在获得测试样品后五小时内进行。在这些研究中，对在急诊科就诊的医疗(非手术)紧急情况的患者进行了调查。为此，将患者细分为高概率患有脓毒症的患者和疑似患有感染但未患脓毒症的患者。已确定了各种生物标志物的量，并经由逻辑回归分析对生物标志物进行了分析和数学组合。接受者操作特征下的面积(AUC)用于评估生物标志物的性能。AUC值是函数f(x)在区间[a][b]内的数学积分。还研究了生物标志物对和三联体的AUC。鉴定了与最佳单一生物标志物AUC相比，共同显示改善的AUC的生物标志物组合。结果描述于下面所附的实施例中。
特别是，如果这些患者在例如急诊室就诊，则对发展严重并发症(诸如脓毒症、SIRS或他们的整体健康状况普遍恶化)的风险进行早期评定对于开始疗法措施(包括药物施用、物理或其他治疗干预和/或住院治疗)具有决定性作用。这些治疗措施特别是可以包括，例如，快速管理广谱抗生素、液体复苏、血管活性药物疗法、机械通气、其他器官支持(例如，持续血液滤过、体外膜氧合)。作为治疗措施还涵盖分诊到更高水平的护理(例如重症监护病房、中级护理病房)。如果没有严重并发症的风险，患者可以出院回家并在门诊环境接受治疗或入院接受低水平护理(例如普通病房)。由于本发明，可以防止危及生命的发展，因为可以在早期阶段通过生物标志物确定来对患者进行评定。在支持本发明的研究中鉴定的生物标志物对和三联体是医疗决策的可靠基础，并且可以以时间和成本有效的方式进行评定。
因此，本发明的方法可进一步包括建议或启用合适的治疗措施。通常地，所述合适的治疗措施选自脓毒症管理的医学指南或推荐，诸如脓毒症和脓毒性休克管理国际指南(Intensive Care Med，2017)。例如，治疗措施可以为脓毒症的治疗或进一步的诊断调查或由医师认为必要的护理的其他方面。
在一个实施例中，如果患者已经被评定为有风险，则要建议或启用的治疗措施选自
·施用至少一种或多种广谱抗生素(诸如头孢菌素、β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂(例如哌拉西林)或碳青霉烯)进行经验性广谱疗法，通常地取决于可能被视为病原体和抗生素易感性的生物体
·液体复苏
·施用一种或多种血管升压药，诸如施用去甲肾上腺素，以及
·施用一种或多种皮质类固醇，例如施用氢化可的松
上文给出的定义比照适用于以下。
本发明还涉及一种用于评定具有疑似感染的受试者的计算机实现方法，该计算机实现方法包括以下步骤：
(a)接收在受试者的样品中第一生物标志物的量的值，所述第一生物标志物为NGAL；
(b)接收在受试者的样品中第二生物标志物的量的值，其中所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽(诸如NTproBNP或BNP)；
(c)将生物标志物的量的值与所述生物标志物的参考进行比较和/或基于生物标志物的量来计算用于评定具有疑似感染的受试者的评分；以及
(d)基于在步骤(c)中进行的比较和/或计算来评定所述受试者。
如本文所使用的术语“计算机实现”意味着该方法以自动方式在通常包括在计算机或类似数据处理装置中的数据处理单元上执行。数据处理单元应接收生物标志物的量的值。此类值可以是量、相对量或反映如本文别处详细描述的量的任何其他计算值。因此，应当理解，上述方法不需要确定生物标志物的量。而是使用已经预定的量的值。
通常，在所述方法的步骤(b)中
(i)如果接收作为第二生物标志物的HBP(肝素结合蛋白)的量的值，该方法将进一步包括接收作为第三生物标志物的胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)的量的值；或者
(ii)如果接收作为第二生物标志物的天冬氨酸转氨酶的量的值，该方法将进一步包括接收作为第三生物标志物的BNP型肽的量的值。
原则上，本发明还设想了一种计算机程序、计算机程序产品或具有有形嵌入所述计算机程序的计算机可读存储介质，其中该计算机程序包括指令，该指令当在数据处理装置或计算机上运行时执行如本发明上面所指定的方法。具体地。本公开还包括：
-一种计算机或计算机网络，该计算机或计算机网络包括至少一个处理器，其中该处理器适于进行根据本说明书中所描述的实施例之一的方法，
-一种计算机可加载数据结构，该计算机可加载数据结构适于当在计算机上执行该数据结构时，进行根据本说明书中所描述的实施例之一的方法。
-一种计算机脚本，其中该计算机程序适于当在计算机上执行该程序时，进行根据本说明书中所描述的实施例之一的方法，
-一种计算机程序，该计算机程序包括程序装置，该程序装置用于当在计算机上或在计算机网络上进行该计算机程序时，进行根据本说明书中所描述的实施例之一的方法，
-一种计算机程序，该计算机程序包括根据前述实施例的程序装置，其中这些程序装置存储在计算机可读的存储介质上，
-一种存储介质，其中数据结构存储在该存储介质上并且其中该数据结构适于在被加载到计算机或计算机网络的主存储装置和/或工作存储装置之后，进行根据本说明书中所述的实施例之一的方法，
-一种计算机程序产品，该计算机程序产品具有程序代码装置，其中该程序代码装置可以存储或被存储在存储介质上，以用于在计算机上或在计算机网络上执行这些程序代码装置的情况下，进行根据本说明书中所述的实施例之一的方法，
-一种数据流信号，通常是加密的，包括本文别处定义的参数的数据，以及
-一种数据流信号，通常是加密的，包括由本发明的方法提供的评定。
本发明涉及一种用于评定具有疑似感染的受试者的装置，该装置包括：
(a)测量单元，其用于确定在受试者的样品中第一生物标志物和第二生物标志物的量，第一生物标志物为NGAL，第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽，所述测量单元包括用于第一生物标志物和第二生物标志物的检测系统；和
(b)评估单元，其可操作地连接到测量单元，该评估单元包括具有第一生物标志物和第二生物标志物的存储的参考的数据库，优选地，如上文所指定，以及数据处理器，该数据处理器包括指令，该指令用于将第一生物标志物和第二生物标志物的量与参考进行比较和/或用于基于生物标志物的量对用于评定具有疑似感染的受试者的评分进行计算，优选地，如上文所指定，以及用于基于该比较来评定所述受试者，所述评估单元能够自动从测量单元接收生物标志物的量的值。
本文所用的术语“装置”涉及包括彼此可操作地连接的上述单元的系统，以便允许根据本发明的方法确定生物标志物的量并对其进行评估，从而可以提供评定。
分析单元通常包括至少一个反应区，该反应区具有用于第一生物标志物和第二生物标志物的检测剂，并且优选地还具有以固定形式固定在将与样品接触的固体支持物或载体上的第三生物标志物的检测剂。此外，在反应区中，可以应用允许检测剂与样品中包括的生物标志物特异性结合的条件。
反应区可以允许直接应用样品，或者可以连接至应用样品的装载区。在后一种情况下，样品可以经由装载区和反应区之间的连接主动地或被动地输送至反应区。此外，反应区还应连接至检测器。连接应使得检测器能够检测生物标志物与其检测剂的结合。合适的连接取决于用于测量生物标志物的存在或量的技术。例如，对于光学检测，在检测器和反应区之间可能需要光传输，而对于电化学确定，例如在反应区和电极之间可能需要流体连接。
检测器应当适于检测生物标志物的量的确定。随后可以将所确定的量传送至评估单元。所述评估单元包括数据处理元件，诸如计算机，其具有用于确定样品中存在的量的实现算法。
根据如本发明的方法所指的处理单元通常包括中央处理单元(CPU)和/或一个或多个图形处理单元(GPU)和/或一个或多个专用集成电路(ASIC)和/或一个或多个张量处理单元(TPU)和/或一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)等。例如，数据处理元件可以是通用计算机或便携式计算装置。还应当理解，多个计算装置可以一起使用，诸如通过网络或其他传输数据的方法，以进行本文公开的方法的一个或多个步骤。示例性计算装置包括台式计算机、膝上型计算机、个人数据助理(“PDA”)、蜂窝装置、智能或移动装置、平板计算机、服务器等。一般而言，数据处理元件包括能够执行多个指令(诸如软件程序)的处理器。
评估单元通常包括存储器或可以访问存储器。例如，存储器是计算机可读介质，并且可以包括单个存储装置或多个存储装置，该单个存储装置或多个存储装置与计算装置位于本地或可由计算装置通过网络访问。计算机可读介质可以是可由计算装置访问的任何可用介质，并且包括易失性和非易失性介质两者。进一步，计算机可读介质可以是可移动和不可移动介质中的一者或两者。作为示例而非限制，计算机可读介质可以包括计算机存储介质。示例性计算机存储介质包括但不限于RAM、ROM、EEPROM、闪存或任何其他存储技术、CD-ROM、数字通用光盘(DVD)或其他光盘存储、盒式磁带、磁带、磁盘存储器或其他磁存储装置，或者可以用于存储能够由计算装置访问并由计算装置的处理器执行的多个指令的任何其他介质。
根据本公开的实施例，软件可包括指令，该指令当由计算装置的处理器执行时可进行本文公开的方法的一个或多个步骤。一些指令可以适于产生控制其他机器的操作的信号，并且因此可以通过这些控制信号来操作以转换远离计算机本身的材料。这些描述和表示是数据处理领域的技术人员用来例如最有效地将其的工作内容传达给本领域的其他技术人员的手段。
多个指令还可以包括通常被认为是导致期望结果的自洽步骤序列的算法。这些步骤需要对物理量进行物理操作。通常，尽管不是必须的，这些量采用能够被存储、传输、转换、组合、比较和以其他方式操纵的电或磁脉冲或信号的形式。主要出于通用的原因，将这些信号称为值、字符、显示数据、数字等，作为对其中体现或表达此类信号的物理项目或表现形式的参考，被证明有时是方便的。然而，应该记住，所有这些和类似的术语都与适当的物理量相关联，并且在这里仅用作应用于这些量的方便标记。
评估单元还可以包括输出装置或者可以访问输出装置。例如，示例性输出装置包括传真机、显示器、打印机和文件。根据本公开的一些实施例，计算装置可以进行本文公开的方法的一个或多个步骤，并且此后经由输出装置提供与该方法的结果、指示、比率或其他因素相关的输出。
通常地，所述测量单元确定并包括用于第三生物标志物的检测系统，并且其中所述数据库包括第三生物标志物的存储的参考，所述第三生物标志物
(i)在HBP(肝素结合蛋白)为第二生物标志物的情况下，为胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)；或者
(ii)在天冬氨酸转氨酶为第二生物标志物的情况下，为BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP。
更通常地，所述检测系统包括至少一种能够特异性检测生物标志物中的每一者的检测剂。
本发明进一步设想了一种用于评定具有疑似感染的受试者的装置，该装置包括评估单元，该评估单元包括具有第一生物标志物和第二生物标志物的存储的参考的数据库，该第一生物标志物为NGAL，该第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽，以及数据处理器，该数据处理器包括指令，该指令用于将第一生物标志物和第二生物标志物的量与参考进行比较，优选地，如上文所指定，以及用于基于该比较来评定所述受试者，所述评估单元能够接收在受试者的样品中确定的生物标志物的量的值。
通常地，所述数据库包括第三生物标志物的存储的参考，所述第三生物标志物
(i)在HBP(肝素结合蛋白)为第二生物标志物的情况下，为胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)；
(ii)在天冬氨酸转氨酶为第二生物标志物的情况下，为BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP。
原则上，本发明还涉及第一生物标志物和第二生物标志物或者与所述第一生物标志物特异性结合的检测剂和与所述第二生物标志物特异性结合的检测剂用于评定具有疑似感染的受试者的用途，所述第一生物标志物为NGAL，所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽。
本文使用的术语“检测剂”通常是指与生物标志物特异性结合的任何试剂，即不与样品中存在的其他成分发生交叉反应的试剂。通常，如本文提及的特异性结合生物标志物的检测剂可以是抗体、抗体片段或衍生物、适体、生物标志物的配体、生物标志物的受体、已知结合和/或转化生物标志物的酶，或已知与生物标志物特异性结合的小分子。例如，如本文中称为检测剂的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体及其片段，诸如能够结合抗原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)2片段。本发明还包括单链抗体和人源化杂合抗体，其中表现出所需抗原特异性的非人类供体抗体的氨基酸序列与人类受体抗体的序列组合。供体序列通常至少包括供体的抗原结合氨基酸残基，但也可以包括供体抗体的其他结构和/或功能相关的氨基酸残基。此类杂合体可以通过本领域熟知的几种方法来制备。适体检测剂例如可以是核酸或肽适体。制备此类适体的方法在本领域中是众所周知的。例如，可以将随机突变引入作为适体基础的核酸或肽中。然后可以根据本领域已知的筛选程序，例如噬菌体展示，测试这些衍生物的结合。检测剂的特异性结合意味着它不应与待分析样品中存在的另一种肽、多肽或物质实质上结合，即交叉反应。优选地，特异性结合的生物标志物应当以比样品的任何其他成分高至少3倍、更优选地高至少10倍并且甚至更优选地高至少50倍的亲和力结合。非特异性结合可能是可以容忍的，如果它仍然可以明确地被区分和测量，例如根据其在蛋白质印迹上的大小，或通过其在样品中相对较高的丰度。
检测剂可以永久地或可逆地融合或连接至可检测标记。合适的标记是技术人员熟知的。合适的可检测标记是通过适当的检测方法检测的任何标记。典型的标记包括金颗粒、乳胶珠、吖啶酯、鲁米诺、钌、酶活性标记、放射性标记、磁性标记(“例如磁珠”，包括顺磁标记和超顺磁标记)和荧光标记。酶活性标记包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶，以及它们的衍生物。用于检测的合适底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3，3′-5，5′-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐，可作为现成储备溶液从RocheDiagnostics购得)、CDP-StarTM(Amersham Biosciences)、ECFTM(Amersham Biosciences)。合适的酶-底物组合可产生有色反应产物、荧光或化学发光，该有色反应产物、荧光或化学发光可根据本领域已知的方法(例如使用感光胶片或合适的摄像系统)来测量。对于酶反应的测量，上述给定的标准类似地适用。典型的荧光标记包括荧光蛋白(诸如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红、荧光素和Alexa染料(例如Alexa568)。进一步的荧光标记可从Molecular Probes(Oregon)购得。同样，还设想使用量子点作为荧光标记。典型的放射性标记包括35S、125I、32P、33P等。放射性标签可以通过任何已知且适当的方法检测，所述方法为例如感光胶片或磷光成像仪。合适的标记也可以是或包括标签，诸如生物素、地高辛、His标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。
例如，在实例中描述了用于生物标志物(诸如AST、ALT、白蛋白、胆红素和肌酐)的优选试剂。
如果生物标志物是酶，诸如AST或ALT，则检测剂可以是酶的底物，或用于检测的任何试剂(参见实例)
在一个实施例中，ALT(ALAT)的检测剂为例如L-丙氨酸。
在一个实施例中，AST(ASAT)的检测剂为例如L-天冬氨酸。
肌酐的检测剂为例如肌酐酶，或用于检测的任何试剂(参见实例)。
白蛋白的检测剂为例如溴甲酚紫。
胆红素a的检测剂为例如亚硝酸钠和对氨基苯磺酸，或用于检测的任何试剂(参见实例)。
本文所述的生物标志物的确定可以包括在分离步骤(例如通过LC或HPLC)之后进行的质谱法(MS)。如本文所使用的质谱法涵盖允许确定根据本发明与要确定的化合物(即生物标志物)对应的分子量(即质量)或质量变量的所有技术。优选地，如本文所使用的质谱法涉及GC-MS、LC-MS、直接输注质谱法、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四极杆质谱法、任何顺序耦合的质谱法，诸如MS-MS或MS-MS-MS、ICP-MS、Py-MS、TOF或使用上述技术的任何组合方法。怎样应用这些技术对于本领域的技术人员是众所周知的。此外，合适的装置是可商购的。更优选地，本文所使用的质谱法涉及LC-MS和/或HPLC-MS，即，质谱法可操作地链接到先前的液相色谱分离步骤。优选地，质谱法是串联质谱法(也称为MS/MS)。串联质谱法，也称为MS/MS，涉及两个或多个质谱法步骤，在两个阶段之间发生碎裂。在串联质谱法中，串联的两个质谱计由碰撞池连接。质谱计耦合到色谱装置。已经用色谱法分离的样品在第一质谱计中被分选和称重，然后在碰撞池中被惰性气体破碎，并且在第二质谱计中分选和称重一块或多块。片段在第二质谱计中被分类和称重。用MS/MS鉴定更准确。
在一个实施例中，本文所使用的质谱法涵盖四极杆MS。最优选地，所述四极杆MS按如下方式执行：a)在质谱计的第一分析四极杆中选择通过电离产生的离子的质量/电荷商(m/z)：b)通过在附加的随后四极杆中施加加速电压来对在步骤a)中选择的离子进行碎裂，所述附加的随后四极杆中填充有碰撞气体并且用作碰撞腔；c)选择在步骤b)中通过碎裂过程在另外的随后四极杆中产生的离子的质量/电荷商，由此至少执行一次该方法的步骤a)至c)，并分析作为电离过程的结果的存在于物质混合物中的所有离子的质量/电荷商，由此四极杆填充碰撞气体，但在分析期间不施加加速电压。根据本发明所使用的所述最优选的质谱法的细节可以在WO2003/073464中找到。
更优选地，所述质谱法是液相色谱(LC)MS，诸如高效液相色谱(HPLC)MS，特别是HPLC-MS/MS。本文所使用的液相色谱是指允许在液相或超临界相中分离化合物(即代谢物)的所有技术。
对于质谱法，样品中的分析物被电离以产生带电分子或分子片段。然后，测量电离分析物，特别是电离生物标志物或其片段的质荷比。在电离之前，样品可以经受蛋白酶的裂解，例如胰蛋白酶。蛋白酶将蛋白质生物标志物裂解成更小的片段。
因此，质谱法步骤优选地包括电离步骤，在该电离步骤中要被确定的生物标志物被电离。当然，样品/洗脱液中的其他化合物也被电离。生物标志物的电离可以通过任何被认为合适的方法来执行，特别是通过电子轰击电离、快速原子轰击、电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)。
在优选的实施例中，电离步骤(用于质谱法)通过电喷雾电离(ESI)来执行。因此，质谱法优选是ESI-MS(或者如果进行串联MS：ESI-MS/MS)。电喷雾是一种软电离方法，可在不破坏任何化学键的情况下形成离子。
更通常地，另外使用第三生物标志物或与所述第三生物标志物特异性结合的检测剂，所述第三生物标志物
(i)在HBP(肝素结合蛋白)为第二生物标志物的情况下，为胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)；或者
(ii)在天冬氨酸转氨酶为第二生物标志物的情况下，为BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP。
本发明还涉及用于评定具有疑似感染的受试者的试剂盒，该试剂盒包括与第一生物标志物特异性结合的检测剂和与第二生物标志物特异性结合的检测剂，该第一生物标志物为NGAL，该第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽。
如本文所用的术语“试剂盒”是指上述成分的集合，通常地，以单独的或单个容器内的形式提供。容器通常还包括用于执行本发明方法的指令。这些指令可以是手册的形式，或者可以由计算机程序代码提供，当在计算机或数据处理装置上实现时，该计算机程序代码能够执行或支持在本发明的方法中提及的生物标志物的确定。计算机程序代码可以在数据存储介质或装置(诸如光存储介质，例如，光盘)上提供，或者直接在计算机或数据处理装置上提供，或者可以以下载格式(诸如到可访问的服务器或云的链接)来提供。此外，试剂盒通常可以包括用于校准目的的生物标志物参考量的标准，如本文别处详细描述的。根据本发明的试剂盒还可以包括执行本发明的方法所必需的其他成分，诸如检测所释放的第二分子所需的溶剂、缓冲液、洗涤溶液和/或试剂。进一步，其可以部分地或全部地包括本发明的装置。
更典型地，所述试剂盒进一步包含特异性结合第三生物标志物的检测剂，所述第三生物标志物
(i)在HBP(肝素结合蛋白)为第二生物标志物的情况下，为胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)；或者
(ii)在天冬氨酸转氨酶为第二生物标志物的情况下，为BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP。
应当理解，上述术语的定义和解释相应地适用于本说明书和所附权利要求中描述的所有实施例。以下实施例是根据本发明设想的特定的实施例：
1.一种用于评定具有疑似感染的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)确定在受试者的样品中第一生物标志物的量，所述第一生物标志物为NGAL；
(b)确定在受试者的样品中第二生物标志物的量，其中所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽：
(c)将生物标志物的量与所述生物标志物的参考进行比较和/或基于生物标志物的量来计算用于评定具有疑似感染的受试者的评分：
以及
(d)基于在步骤(c)中进行的比较和/或计算来评定所述受试者。
2.根据实施例1所述的方法，其中在步骤(b)中
(i)如果确定作为第二生物标志物的HBP(肝素结合蛋白)的量，所述方法将进一步包括确定作为第三生物标志物的胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)的量；或者
(ii)如果确定作为第二生物标志物的天冬氨酸转氨酶的量，所述方法将进一步包括确定作为第三生物标志物的BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP的量。
3.根据实施例1或2所述的方法，其中受试者为在急诊科就诊的受试者。
4.根据实施例1至3中任一项所述的方法，其中评定为对发展脓毒症的风险的评定和/或对受试者的病况将恶化的风险的评定。
5.根据实施例1至4中任一项所述的方法，其中所述参考为来源于至少一个已知处于发展脓毒症的风险的受试者的每种生物标志物的参考，优选地其中生物标志物中的每一者的量与对应参考基本相同或相似指示受试者处于发展脓毒症的风险，而生物标志物中的每一者的量与对应参考不同则指示受试者未处于发展脓毒症的风险。
6.根据实施例1至4中任一项所述的方法，其中所述参考为来源于至少一个已知未处于发展脓毒症的风险的受试者的每种生物标志物的参考，优选地其中生物标志物中的每一者的量与对应参考基本相同或相似指示受试者未处于发展脓毒症的风险，而生物标志物中的每一者的量与对应参考不同则指示受试者处于发展脓毒症的风险。
7.根据实施例1至6中任一项所述的方法，其中所述受试者患有感染或疑似患有感染。
8.根据实施例1至7中任一项所述的方法，其中所述样品为血液样品或来源于其的样品。
9.根据实施例1至8中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。
10.一种用于评定具有疑似感染的受试者的计算机实现方法，其包括以下步骤：
(a)接收在受试者的样品中第一生物标志物的量的值，所述第一生物标志物为NGAL；
(b)接收在受试者的样品中第二生物标志物的量的值，其中所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽；
(c)将生物标志物的量的值与所述生物标志物的参考进行比较和/或基于生物标志物的量来计算用于评定具有疑似感染的受试者的评分；以及
(d)基于在步骤(c)中进行的比较和/或计算来评定所述受试者。
11.根据实施例10所述的方法，其中在步骤(b)中
(i)如果接收作为第二生物标志物的HBP(肝素结合蛋白)的量的值，该方法将进一步包括接收作为第三生物标志物的胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)的量的值；或者
(ii)如果接收作为第二生物标志物的天冬氨酸转氨酶的量的值，该方法将进一步包括接收作为第三生物标志物的BNP型肽的量的值。
12.一种用于评定具有疑似感染的受试者的装置，所述装置包括：
(a)测量单元，其用于确定在受试者的样品中第一生物标志物和第二生物标志物的量，第一生物标志物为NGAL，第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽，所述测量单元包括用于第一生物标志物和第二生物标志物的检测系统；和
(b)评估单元，其可操作地连接到测量单元，所述评估单元包括具有第一生物标志物和第二生物标志物的存储的参考的数据库，优选地，如实施例1至9中任一项所指定，以及数据处理器，所述数据处理器包括指令，所述指令用于将第一生物标志物和第二生物标志物的量与参考进行比较和/或用于基于生物标志物的量对用于评定具有疑似感染的受试者的评分进行计算，优选地，如实施例1至9中任一项所指定，以及用于基于所述比较来评定所述受试者，所述评估单元能够自动从测量单元接收生物标志物的量的值。
13.根据实施例12所述的装置，其中所述测量单元确定并包括用于第三生物标志物的检测系统，并且其中所述数据库包括第三生物标志物的存储的参考，所述第三生物标志物
(i)在HBP(肝素结合蛋白)为第二生物标志物的情况下，为胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)；或者
(ii)在天冬氨酸转氨酶为第二生物标志物的情况下，为BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP。
14.根据实施例12或13所述的装置，其中所述检测系统包括至少一种能够特异性检测生物标志物中的每一者的检测剂。
15.一种用于评定具有疑似感染的受试者的装置，所述装置包括评估单元，所述评估单元包括具有第一生物标志物和第二生物标志物的存储的参考的数据库，所述第一生物标志物为NGAL，所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽，以及数据处理器，所述数据处理器包括指令，所述指令用于将第一生物标志物和第二生物标志物的量与参考进行比较，优选地，如实施例1至11中任一项所指定，以及用于基于所述比较来评定所述受试者，所述评估单元能够接收在受试者的样品中确定的生物标志物的量的值。
16.根据实施例15所述的装置，其中所述数据库包括第三生物标志物的存储的参考，所述第三生物标志物
(i)在HBP(肝素结合蛋白)为第二生物标志物的情况下，为胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)；
(ii)在天冬氨酸转氨酶为第二生物标志物的情况下，为BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP。
17.i)第一生物标志物和第二生物标志物，或者ii)与所述第一生物标志物特异性结合的检测剂和与所述第二生物标志物特异性结合的检测剂用于评定具有疑似感染的受试者的用途，第一生物标志物为NGAL，第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽。
18.根据实施例17所述的用途，其中另外使用第三生物标志物或与所述第三生物标志物特异性结合的检测剂，所述第三生物标志物
(i)在HBP(肝素结合蛋白)为第二生物标志物的情况下，为胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)；或者
(ii)在天冬氨酸转氨酶为第二生物标志物的情况下，为BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP。
19.一种用于评定具有疑似感染的受试者的试剂盒，所述试剂盒包括与第一生物标志物特异性结合的检测剂和与第二生物标志物特异性结合的检测剂，所述第一生物标志物为NGAL，所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽。
20.根据实施例19所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括与第三生物标志物特异性结合的检测剂，所述第三生物标志物
(i)在HBP(肝素结合蛋白)为第二生物标志物的情况下，为胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)；或者
(ii)在天冬氨酸转氨酶为第二生物标志物的情况下，为BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP。
21根据前述实施例中任一项所述的方法、装置、用途或试剂盒，其中评定为对发展脓毒症的风险的评定。
22.根据前述实施例中任一项所述的方法、装置、用途或试剂盒，其中预测在48小时内发展脓毒症的风险。
本说明书通篇引用的所有参考文献均就上文具体提及的公开内容及其整体并入本文。
实例1：生物标志物的确定
下面简要介绍了用于确定GDF-15的电化学发光(ECL)技术和测定方法。GDF-15的浓度通过cobas e801分析仪确定。用cobas e801分析仪检测GDF-15是基于电化学发光(ECL)技术。简而言之，生物素标记和钌标记的抗体与相应量的未稀释样品结合，并在分析仪上温育。随后，在仪器上添加涂有链霉亲和素的磁性微粒并温育，以便促进生物素标记的免疫复合物的结合。在该温育步骤之后，将反应混合物转移到测量池中，在测量池中，磁珠被磁性捕获在电极的表面上。然后将含有用于后续ECL反应的三丙胺(TPA)的ProCell M缓冲液引入到测量池中，以便将结合的免疫测定复合物与游离的剩余颗粒分离。工作电极和对电极之间的电压感应然后引发反应，引致钌复合物以及TPA发射光子。所得的电化学发光信号由光电倍增管记录并转换为指示相应分析物的浓度水平的数值。
SFLT1或sFLT-1(可溶性fms样酪氨酸激酶-1)用sFLT-1的商用ECLIA测定法进行测量，sFLT-1是为cobasECLIA平台开发的三明治免疫测定法(ECLIA测定法来自德国的Roche Diagnostics)。该测定法包括与sFLT-1特异性结合的生物素化和钌化单克隆抗体。每个血清样品中使用12μL，并在cobas e801分析仪(Roche Diagnostics，德国)上不经稀释地测量。
PBNP或NTpBNP(脑利尿钠肽激素原的N端)用NTproBNP的商用ECLIA测定法进行测量，NTproBNP是为cobasECLIA平台开发的三明治免疫测定法(ECLIA测定法来自德国的Roche Diagnostics)。该测定法包括与NTproBNP特异性结合的生物素化和钌化单克隆抗体。每个血清样品中使用15μL，并在cobas e801分析仪(Roche Diagnostics，德国)上不经稀释地测量。
IL6(白细胞介素6)用白细胞介素-6的商用ECLIA测定法进行测量，该测定法是为cobasECLIA平台开发的三明治免疫测定法(ECLIA测定法来自德国的RocheDiagnostics)。该测定法包括与IL-6特异性结合的生物素化和钌化单克隆抗体。每个血清样品中使用30μL，并在cobas e801分析仪(Roche Diagnostics，德国)上不经稀释地测量。
ESM1(内皮细胞特异性分子1)用ESM-1的强大原型ECLIA测定法进行测量，该测定法是为cobasECLIA平台开发的三明治免疫测定法(ECLIA测定法来自德国的Roche Diagnostics)。该测定法包括特异性结合ESM-1的生物素化和钌化单克隆抗体。每个血清样品中使用20μL，并在cobas e601分析仪(Roche Diagnostics，德国)上不经稀释地测量。
STREM1或sTREM-1(在髓系细胞上表达的可溶性触发受体1)用sTREM-1的强大原型ECLIA测定法进行测量，该测定法是内部为cobasECLIA平台开发的三明治免疫测定法(ECLIA测定法来自德国的Roche Diagnostics)。该测定法包括与sTREM-1特异性结合的生物素化和钌化单克隆抗体。每个血清样品中使用50μL，并在cobas e601分析仪(Roche Diagnostics，德国)上不经稀释地测量。
NGAL(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白)测试是一种颗粒增强比浊免疫测定法，用于定量确定NGAL 3μL血浆与反应缓冲液R1混合。短暂孵育后，通过添加免疫颗粒悬浮液(涂有针对NGAL的小鼠单克隆抗体的聚苯乙烯微粒)开始反应。测定来自RocheDiagnostics(德国)。样品中的NGAL会导致免疫颗粒聚集。聚集的程度通过测量为光吸收的光散射量来量化。样品中的NGAL浓度通过在已建立的校准曲线上插值来确定。样品在cobasc 501分析仪(Roche Diagnostics，德国)上测量。
LDHI2(乳酸脱氢酶)：UV测定乳酸脱氢酶催化L-乳酸转化为丙酮酸；NAD在此过程中被还原为NADH。L-乳酸+NAD+LDH丙酮酸+NADH+H+NADH形成的初始速率与催化LDH活性成正比。它是通过光度法测量吸光度的增加来确定的。测定来自Roche Diagnostics(德国)。分析了2.2μL血浆。样品在cobas c 501分析仪(Roche Diagnostics，德国)上测量。
HAPT2(触珠蛋白)：一种针对人触珠蛋白的免疫比浊测定法，触珠蛋白与特定抗血清形成沉淀，并通过比浊法确定。分析了3.9μL血浆。样品在cobas c 501分析仪(RocheDiagnostics，德国)上测量。
HBP(肝素结合蛋白)：HBP的确定基于比浊反应，该反应发生在循环HBP和在聚乙二醇聚合物(PEG)存在的最佳pH条件下与氯甲基微粒结合的禽类单特异性多克隆抗体之间。变化的幅度与测试样品中HBP的量成正比。试剂来自Axis-Shield Diagnostics Ltd.(苏格兰)。分析了10μL血浆。样品在cobas c 501分析仪(Roche Diagnostics，德国)上测量。
BILI(胆红素)：重氮化磺胺酸是由亚硝酸钠和磺胺酸在低pH下结合形成的。样品中的胆红素(未结合)通过在咖啡因/苯甲酸盐/乙酸盐/EDTA的混合物中稀释而溶解。添加重氮化磺胺酸后，溶解的胆红素包括结合胆红素(单葡萄糖苷酸和二葡萄糖苷酸)和δ型2(胆蛋白-胆红素与白蛋白共价结合)转化为重氮胆红素，重氮胆红素是一种代表总胆红素的红色发色团，在540nm处吸收并使用双色(540nm、700nm)终点技术进行测量。使用样品空白校正。
CREAJ2(肌酐)：该动态比色测定基于Jaffé方法。在碱性溶液中，肌酐与苦味酸盐形成黄橙色复合物。染料形成的速率与样品中的肌酐浓度成正比。该测定使用“速率消隐”来最大限度地减少胆红素的干扰。测定来自Roche Diagnostics(德国)。使用7.5μL血浆进行确定。样品在cobas c 501分析仪(Roche Diagnostics，德国)上测量。
ALAT(丙氨酸转氨酶)：丙氨酸转氨酶催化L-丙氨酸转氨为α-酮戊二酸(α-KG)，形成L-谷氨酸和丙酮酸。形成的丙酮酸被乳酸脱氢酶(LDH)还原为乳酸，同时氧化还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。吸光度的变化与丙氨酸转氨酶活性成正比，并使用双色(340nm、700nm)速率技术进行测量。
ASAT(天冬氨酸转氨酶)：天冬氨酸转氨酶(AST)催化L-天冬氨酸转氨为α-酮戊二酸，形成L-谷氨酸和草乙酸。形成的草乙酸通过苹果酸脱氢酶(MDH)还原为苹果酸，同时氧化还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。由于NADH转化为NAD，吸光度随时间的变化与AST活性成正比，并且使用双色(340nm、700nm)速率技术来测量。
实例2：来自TRIAGE研究的患者分析
TRIAGE研究，瑞士坎通斯比特阿劳急诊科。(Schuetz 2013，BMC emergencymedicine，13(1)，12)。
所有连续因医疗紧急情况而寻求急诊科(ED)护理的患者均都包括在ED入院。从总共4000名患者中，选择了入院时具有疑似感染的患者子集，并根据以下条件分为极有可能脓毒症病例组或感染对照组：
·病例(N＝64)：如果已入住ICU或符合Rhee 2017年“Incidence and Trends ofSepsis in US Hospitals Using Clinical vs Claims Data，2009-2014.”JAMA 318(13)：1241-1249的标准，则极有可能在ED就诊后48h内脓毒症病例恶化/严重程度更高。
·对照(N＝207)：具有疑似感染但在ED就诊后48h内无脓毒症的患者。
经由逻辑回归对标志物进行数学组合，并使用“接受者操作特征下的面积”(AUC)作为标志物性能的一般测量。
表1显示了与单个标志物相比AUC提高至少一个百分点的标志物对组合(双变量标志物组合)。
表1：双变量标志物组合及其联合性能(AUC.bi)、第一标志物(AUC.1)和第二标志物(AUC.2)的单变量性能以及双变量标志物相对于最佳单个标志物的性能改进(Impr.AUC)。
表2显示了与双变量标志物对以及所有三个单个标志物相比AUC提高至少一个百分点的标志物三联体组合(三变量标志物组合)。
表2：三变量标志物组合及其联合性能(AUC.tri)；表1中列出的前两个标志物的双变量性能(AUC.bi)；第一标志物(AUC.1)、第二标志物(AUC.2)和第三标志物(AUC.3)的单变量性能以及三变量标志物相对于双变量标志物的性能改进(Impr.AUC)。
表3显示了与单个标志物相比没有提高的标志物双变量组合的实例。
表3：双变量标志物组合及其联合性能(AUC.bi)、第一标志物(AUC.1)和第二标志物(AUC.2)的单变量性能以及双变量标志物相对于最佳单个标志物的性能改进(Impr.AUC)。
标志物 AUC.bi AUC.1 AUC.2 Impr.AUC
NGAL+AT.pc 0.7311 0.7344 0.5692 -0.0033

Claims (22)

1.一种用于评定具有疑似感染的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)确定在所述受试者的样品中第一生物标志物的量，所述第一生物标志物为NGAL；
(b)确定在所述受试者的样品中第二生物标志物的量，其中所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽；
(c)将所述生物标志物的量与所述生物标志物的参考进行比较和/或基于所述生物标志物的量来计算用于评定具有疑似感染的所述受试者的评分；以及
(d)基于在步骤(c)中进行的所述比较和/或所述计算来评定所述受试者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中
(i)如果确定作为所述第二生物标志物的HBP(肝素结合蛋白)的量，所述方法将进一步包括确定作为第三生物标志物的胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)的量；或者
(ii)如果确定作为所述第二生物标志物的天冬氨酸转氨酶的量，所述方法将进一步包括确定作为第三生物标志物的BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP的量。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者为在急诊科就诊的受试者。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述评定为对发展脓毒症的风险的评定和/或对所述受试者的病况将恶化的风险的评定。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述参考为来源于至少一个已知处于发展脓毒症的风险中的受试者的每种生物标志物的参考，优选地其中所述生物标志物中的每一者的量与对应参考基本相同或相似指示受试者处于发展脓毒症的风险中，而所述生物标志物中的每一者的量与对应参考不同则指示受试者未处于发展脓毒症的风险中。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述参考为来源于至少一个已知未处于发展脓毒症的风险中的受试者的每种生物标志物的参考，优选地其中所述生物标志物中的每一者的量与对应参考基本相同或相似指示受试者未处于发展脓毒症的风险中，而所述生物标志物中的每一者的量与对应参考不同则指示受试者处于发展脓毒症的风险中。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述受试者患有感染或疑似患有感染。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述样品为血液样品或来源于其的样品。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。
10.一种用于评定具有疑似感染的受试者的计算机实现方法，其包括以下步骤：
(a)接收在所述受试者的样品中第一生物标志物的量的值，所述第一生物标志物为NGAL；
(b)接收在所述受试者的样品中第二生物标志物的量的值，其中所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽；
(c)将所述生物标志物的量的值与所述生物标志物的参考进行比较和/或基于所述生物标志物的量来计算用于评定具有疑似感染的所述受试者的评分；以及
(d)基于在步骤(c)中进行的所述比较和/或所述计算来评定所述受试者。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤(b)中
(i)如果接收作为所述第二生物标志物的HBP(肝素结合蛋白)的量的值，所述方法将进一步包括接收作为第三生物标志物的胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)的量的值；或者
(ii)如果接收作为所述第二生物标志物的天冬氨酸转氨酶的量的值，所述方法将进一步包括接收作为第三生物标志物的BNP型肽的量的值。
12.一种用于评定具有疑似感染的受试者的装置，所述装置包括：
(a)测量单元，其用于确定在所述受试者的样品中第一生物标志物和第二生物标志物的量，所述第一生物标志物为NGAL，所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽，所述测量单元包括用于所述第一生物标志物和所述第二生物标志物的检测系统；和
(b)评估单元，其可操作地连接到所述测量单元，所述评估单元包括具有所述第一生物标志物和所述第二生物标志物的存储的参考的数据库，优选地，如权利要求1至9中任一项所指定，以及数据处理器，所述数据处理器包括指令，所述指令用于将所述第一生物标志物和所述第二生物标志物的量与参考进行比较和/或用于基于所述生物标志物的量对用于评定具有疑似感染的所述受试者的评分进行计算，优选地，如权利要求1至9中任一项所指定，以及用于基于所述比较来评定所述受试者，所述评估单元能够自动从所述测量单元接收所述生物标志物的量的值。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述测量单元确定并包括用于第三生物标志物的检测系统，并且其中所述数据库包括第三生物标志物的存储的参考，所述第三生物标志物
(i)在HBP(肝素结合蛋白)为所述第二生物标志物的情况下，为胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)；或者
(ii)在天冬氨酸转氨酶为所述第二生物标志物的情况下，为BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP。
14.根据权利要求12或13所述的装置，其中所述检测系统包括至少一种能够特异性检测所述生物标志物中的每一者的检测剂。
15.一种用于评定具有疑似感染的受试者的装置，所述装置包括评估单元，所述评估单元包括具有第一生物标志物和第二生物标志物的存储的参考的数据库，所述第一生物标志物为NGAL，所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽，以及数据处理器，所述数据处理器包括指令，所述指令用于将所述第一生物标志物和所述第二生物标志物的量与参考进行比较，优选地，如权利要求1至11中任一项所指定，以及用于基于所述比较来评定所述受试者，所述评估单元能够接收在所述受试者的样品中确定的所述生物标志物的量的值。
16.根据权利要求15所述的装置，其中所述数据库包括第三生物标志物的存储的参考，所述第三生物标志物
(i)在HBP(肝素结合蛋白)为所述第二生物标志物的情况下，为胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)；
(ii)在天冬氨酸转氨酶为所述第二生物标志物的情况下，为BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP。
17.i)第一生物标志物和第二生物标志物，或者ii)与所述第一生物标志物特异性结合的检测剂和与所述第二生物标志物特异性结合的检测剂用于评定具有疑似感染的受试者的用途，所述第一生物标志物为NGAL，所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽。
18.根据权利要求17所述的用途，其中另外使用第三生物标志物或与所述第三生物标志物特异性结合的检测剂，所述第三生物标志物
(i)在HBP(肝素结合蛋白)为所述第二生物标志物的情况下，为胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)；或者
(ii)在天冬氨酸转氨酶为所述第二生物标志物的情况下，为BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP。
19.一种用于评定具有疑似感染的受试者的试剂盒，所述试剂盒包括与第一生物标志物特异性结合的检测剂和与第二生物标志物特异性结合的检测剂，所述第一生物标志物为NGAL，所述第二生物标志物选自由以下项组成的组：HBP(肝素结合蛋白)、天冬氨酸转氨酶、胆红素、丙氨酸转氨酶、ESM-1和BNP型肽。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括与第三生物标志物特异性结合的检测剂，所述第三生物标志物
(i)在HBP(肝素结合蛋白)为所述第二生物标志物的情况下，为胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、IL6、ESM-1或HAPT(触珠蛋白)；或者
(ii)在天冬氨酸转氨酶为所述第二生物标志物的情况下，为BNP型肽，诸如BNP或NT-proBNP。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法、装置、用途或试剂盒，其中所述评定为对发展脓毒症的风险的评定。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法、装置、用途或试剂盒，其中预测在48小时内发展脓毒症的风险。
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