JPH08322575A - プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 完全栄養培地で使用可能で、ＰＤＲ１遺伝子
産物により転写調節可能な酵母由来のプロモーターの塩
基配列を提供する。 【構成】 配列表の配列番号１で表される塩基配列（配
列の長さ１３６６）に含有されているプロモーター。Ｐ
ＤＲ１遺伝子産物により転写調節可能な前記プロモータ
ー。前記塩基配列にハイブリダイズ可能で、かつ、プロ
モーター活性を有するプロモーター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子組換え技術を用
いた有用なタンパク質や、代謝産物の製造等の分子生物
工学に有用な酵母由来の転写調節可能なプロモーターの
塩基配列に関する。

【０００２】

【従来の技術】医薬品や食品などの有用タンパク質を遺
伝子工学的に生産するために、酵母を宿主として、酵母
内で生産することが広く行われている。異種タンパク質
を生産するため、それに対応する異種遺伝子をサッカロ
ミセス属の酵母、特にサッカロミセス セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae、以下、Ｓ．セレビシエと略記
する）に導入する技術は知られている。Ｓ．セレビシエ
細胞内で異種遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む）
を発現させる時、その上流に酵母内で発現可能なプロモ
ーターをつけることが必要である。報告されているＳ．
セレビシエのプロモーターとして、強い発現量を示すこ
とが知られているアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤ
Ｈ１）遺伝子のプロモーターや３−ホスホグリセレート
キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーター、又はガラク
トース培地で転写が誘導されるＧＡＬ１やＧＡＬ１０プ
ロモーター、更に無機リン酸濃度の低い培地で転写が誘
導されるＰＨＯ５プロモーターなどが知られている。プ
ロモーターとしては転写調節が可能であり、更に高発現
となるプロモーターが望まれる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】異種タンパク質を酵母
により多量生産するためにはプロモーターが強い発現量
を示すだけでなく、転写調節可能なものが更に好まし
い。また、異種タンパク質を生産させる時の酵母の培養
条件として、栄養が豊かな完全栄養培地が、細胞の増殖
速度を速くし、高い細胞密度を維持できる点で更に好ま
しい。現在知られている転写誘導可能なプロモーターは
ガラクトースを炭素源とする培地を用いたり、リン酸濃
度の低い培地を用いたりするため、異種タンパク質を大
量生産する目的において、細胞増殖の点で好ましくな
い。本発明の目的は、上記の課題を解決するために、完
全栄養培地で使用可能で、ＰＤＲ１遺伝子産物により転
写調節可能な酵母由来のプロモーターの塩基配列を提供
することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はプロモーターに関する発明であっ
て、配列表の配列番号１で表される塩基配列に含有され
ていることを特徴とする。第２の発明は、ＰＤＲ１遺伝
子産物により転写調節可能な第１の発明のプロモーター
に関する。第３の発明は、第１の発明における塩基配列
にハイブリダイズ可能で、かつ、プロモーター活性を有
することを特徴とするプロモーターに関する。

【０００５】本発明者らは、オーレオバシジン（aureob
asidin) 感受性細胞（野生株）より得られるオーレオバ
シジン感受性関連遺伝子が、オーレオバシジン感受性細
胞を変異等で処理し、オーレオバシジン耐性株とした際
に、該遺伝子の発現量が増大するということを見出し、
該遺伝子発現に関与するプロモーターを提供できないか
と考えた。そこで、本発明者らは、鋭意研究を行った結
果、オーレオバシジン耐性となった変異株のゲノムＤＮ
Ａより上記遺伝子発現に関与するプロモーターをクロー
ニングし、塩基配列を決定した。更に、検討を行った結
果、驚くべきことに該プロモーターは多剤薬剤耐性遺伝
子（pleiotropic drug resistance gene) のＰＤＲ１遺
伝子の遺伝子産物により、転写プロモーター活性が制御
されていることをつきとめ、本発明を完成させた。

【０００６】本明細書でいう「プロモーター」とは、転
写開始点（＋１）から上流にあって、正確な位置からＲ
ＮＡポリメラーゼに転写を開始させる機能を担っている
ＴＡＴＡボックス又はＴＡＴＡボックス類似の領域が含
まれ、上流活性化配列（ＵＡＳ）や発現調整のためにＲ
ＮＡポリメラーゼ以外のタンパク質が会合するために必
要な領域を含んでいてもよい。

【０００７】また、本明細書でいう「ＰＤＲ１遺伝子産
物」とは、ＰＤＲ１遺伝子より直接得られる遺伝子産
物、若しくは自然変異誘発又は部位特異的変異誘発等に
より一部のヌクレオチドの置換、挿入及び欠失の少なく
とも１つによって修飾されたＰＤＲ１遺伝子より得られ
る遺伝子産物を含む。また、本明細書でいう「異種遺伝
子」とは、宿主真菌細胞に異種、すなわち外来の遺伝子
であり、例えば、非真菌遺伝子、修飾された遺伝子、異
なる真菌種の遺伝子、セルフクローニングされた遺伝子
等をいう。更に、上記の異種遺伝子により生産されるタ
ンパク質を総称して異種タンパク質とする。

【０００８】オーレオバシジン〔特開平２−１３８２９
６号、同３−２２９９５号、同３−２２０１９９号、同
５−２７９３８４号、特願平４−３０３１７７号、ジャ
ーナル オブ アンチバイオチクス（Ｊ．Antibiotic
s)、第４４巻、第９号、第９１９〜９２４頁、同第４４
巻、第９号、第９２５〜９３３頁、同第４４巻、第１１
号、第１１８７〜１１９８頁（１９９１）〕とは、オー
レオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulan
s) No.Ｒ１０６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９３８）の発酵
生産物として得られる、環状のデプシペプチドであり、
他の抗真菌剤とは構造的に全く異なる。更に、オーレオ
バシジンの中で代表的な化合物であるオーレオバシジン
Ａは、下記表１及び表２に示したように、Ｃ．アルビカ
ンスを始めとする種々のカンジダ属酵母、クリプトコッ
カス ネオホルマンス（Cryptococcus neoformans)、ヒ
ストプラズマ カプスラタム（Histoplasma capsulatu
m) 、ブラストマイセス デルマチチジス（Blastomyces
dermatitidis) 、アスペルギルス（Aspergillus)属真
菌に対して、強い抗真菌活性を有する（特開平２−１３
８２９６号）が、毒性が非常に弱く、優れた選択毒性を
有する抗真菌剤である。

【０００９】以下、本明細書において、カンジダを
Ｃ．、クリプトコッカスをＣｒ．、アスペルギルスを
Ａ．と略記する。下記表１及び表２中、ＭＩＣはオーレ
オバシジンＡの各種真菌類に対する最小生育阻止濃度
（μｇ／ｍｌ）である。

【００１０】

【表１】 表 １ ─────────────────────────────────── 試 験 菌 ＴＩＭＭ番号 ＭＩＣ（μｇ／ml） ─────────────────────────────────── Ｃ．アルビカンス ０１３６ ≦０．０４ Ｃ．アルビカンス バリアント ステラトイデア １３０８ ≦０．０４ Ｃ．トロピカリス ０３１２ ０．０８ Ｃ．ケフィール ０２９８ ０．１６ Ｃ．パラプシロシス ０２８７ ０．１６ Ｃ．クルセイ ０２７０ ≦０．０４ Ｃ．ギリエルモンジ ０２５７ ０．０８ Ｃ．グラブラータ １０６２ ≦０．０４ Ｃｒ．ネオホルマンス ０３５４ ０．６３ Ｃｒ．テレウス ０４２４ ０．３１ ロドトルラ ルブラ ０９２３ ０．６３ Ａ．フミガタス ００６３ ２０ Ａ．クラバタス ００５６ ０．１６ ───────────────────────────────────

【００１１】

【表２】 表 ２ ─────────────────────────────────── 試 験 菌 ＴＩＭＭ番号 ＭＩＣ（μｇ／ml） ─────────────────────────────────── Ａ．ニドランス ０１１２ ０．１６ Ａ．テレウス ０１２０ ５ ペニシリウム コムュン １３３１ １．２５ トリコフィトン メンタグロフィテス １１８９ １０ エピデルモフィトン フロコッサム ０４３１ ２．５ フォンセカエア ペドロソイ ０４８２ ０．３１ エキソフィアラ ベルネッキ １３３４ １．２５ クラドスポリウム バンチアヌム ０３４３ ０．６３ ヒストプラズマ カプスラタム ０７１３ ０．１６ パラコクシディオイデス ブラジリ エンシス ０８８０ ０．３１ ジオトリカム カンディダム ０６９４ ０．６３ ブラストマイセス デルマチチジス ０１２６ ０．３１ ───────────────────────────────────

【００１２】上記表１及び表２中、未記載の菌の原語を
以下にまとめて示す。Ｃ．アルビカンス バリアント
ステラトイデア（Ｃ．albicans var. stellatoidea) 、
Ｃ．ケフィール（Ｃ．kefyr)、Ｃ．パラプシロシス
（Ｃ．parapsilosis) 、Ｃ．クルセイ（Ｃ．krusei) 、
Ｃ．ギリエルモンジ（Ｃ．guilliermondii) 、Ｃ．グラ
ブラータ（Ｃ．glabrata) 、Ｃｒ．テレウス（Cr.terre
us) 、ロドトルラ ルブラ（Rhodotorula rubra)、Ａ．
フミガタス（Ａ．fumigatus)、Ａ．クラバタス（Ａ．cl
avatus) 、Ａ．ニドランス（Ａ．nidulans) 、Ａ．テレ
ウス（Ａ．terreus)、ペニシリウム コムュン（Penici
llium commune)、トリコフィトン メンタグロフィテス
（Trichophyton mentagrophytes)、エピデルモフィトン
フロコッサム（Epidermophyton floccosum) 、フォン
セカエア ペドロソイ（Fonsecaea pedrosoi) 、エキソ
フィアラ ベルネッキ（Exophiala werneckii)、クラド
スポリウム バンチアヌム（Cladosporium bantianum)
、パラコクシディオイデス ブラジリエンシス（Parac
occidioides brasiliensis)、ジオトリカム カンディ
ダム（Geotrichum candidum)。

【００１３】本発明者らは、先の特願平６−１０６１５
８号明細書に記載のようにシゾサッカロミセス ポンベ
（Schizosaccharomyces pombe 、以下、Schizo. ポンベ
と略記する）、Ｓ．セレビシエ等の真菌がオーレオバシ
ジンに感受性を示すことを見出している。

【００１４】

【表３】 表 ３ ─────────────────────────────── 試 験 菌 ＭＩＣ（μｇ／ml） ─────────────────────────────── Schizo. ポンベ ０．０８ Ｓ．セレビシエ ０．３１ ───────────────────────────────

【００１５】そして、Schizo. ポンベ、Ｓ．セレビシエ
等の感受性細胞（野生株）に変異処理を施すことにより
耐性細胞（耐性株）にかえ、その耐性株よりオーレオバ
シジン耐性を付与する遺伝子（耐性遺伝子）、更に野生
株より対応するオーレオバシジン感受性を付与する遺伝
子（感受性遺伝子）の単離に成功した。更に、本発明者
らは、該遺伝子のコードするタンパク質の存在を明らか
にしている。また、該遺伝子を含有させた複製ベクター
を作製し、該ベクターを用いて形質転換した細胞を培養
し、上記遺伝子を発現させることに成功している。更
に、上記遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとして用いるこ
とによって、オーレオバシジンに感受性の他の真菌よ
り、新たにオーレオバシジン感受性に関連する遺伝子を
発見することに成功している。

【００１６】オーレオバシジン感受性関連遺伝子（ａｕ
ｒ）とは、オーレオバシジン感受性に関連するタンパク
質をコードする遺伝子であり、感受性遺伝子及び耐性遺
伝子が含まれる。

【００１７】オーレオバシジン感受性関連遺伝子を単離
するためには、まずオーレオバシジンに感受性の細胞
（野生株）より変異処理により耐性株を誘導し、この耐
性株の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡライブラリ
ーを作製し、このライブラリーの中から耐性を付与する
遺伝子（耐性遺伝子）をクローニングする。また、野生
株のＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーの
中から、耐性遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡ分子を
単離、クローニングすれば、感受性遺伝子を単離するこ
とができる。

【００１８】変異処理の方法としては、エチルメタンス
ルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の薬剤処理による方
法、紫外線又は放射線により処理する方法等がある。耐
性を獲得した変異株を選択するためには、変異処理した
細胞を適当な濃度のオーレオバシジンを含有する栄養培
地で、適当な条件で培養すれば、耐性を獲得した株を選
択することができる。変異処理の方法、条件により、得
られる耐性株は異なる可能性がある。

【００１９】以下、野生株の例としてＳ．セレビシエＤ
ＫＤ８Ｄ株（接合型ａ、遺伝子型ｌｅｕ２−３・１１
２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ４）を用いて、
本発明を具体的に説明する。

【００２０】オーレオバシジンに感受性であるＳ．セレ
ビシエＤＫＤ８Ｄ株をＥＭＳにより変異処理し、得られ
る変異株のうち、多剤耐性変異ではなくオーレオバシジ
ンに特異的な耐性であるＳ．セレビシエＡＬ３３−１８
Ｃ株を単離する。該菌株は Saccharomyces cerevisiae
ＡＬ３３−１８Ｃと命名、表示され工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４９２０として寄託
されている。

【００２１】次に、Ｓ．セレビシエＤＫＤ８Ｄ株とＳ．
セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株とのオーレオバシジン感
受性関連遺伝子の発現量を確認する。発現量の確認をす
るためには、上記両株よりそれぞれの全ＲＮＡを抽出す
る。この全ＲＮＡと、例えば特願平６−１０６１５８号
明細書に記載の scaur２遺伝子をプローブとしたノーザ
ンハイブリダイゼーションを行うことでオーレオバシジ
ン感受性関連遺伝子である scaur２遺伝子の発現量を確
認することができる。その結果を図１に示す。図１に示
すように、オーレオバシジン耐性株であるＳ．セレビシ
エＡＬ３３−１８Ｃ株において scaur２遺伝子の発現量
が非常に高くなっていた。なお、プローブとして用いた
scaur２遺伝子は、プラスミド pSCAR２に含有されてお
り、該プラスミド pSCAR２を保有する大腸菌ＨＢ１０１
はEscherichia coli HB101/pSCAR２と命名、表示され通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
ＢＰ−４４８４として寄託されている。

【００２２】次に、発現量が非常に高くなっていた sca
ur２遺伝子の上流にあると考えられるプロモーターのク
ローニングを試みる。プロモーターをクローニングする
ために、まず、Ｓ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株から
オーレオバシジン感受性関連遺伝子 scaur２遺伝子のク
ローニングを行う。 scaur２遺伝子をクローニングする
には、特願平６−１０６１５８号明細書に記載の方法を
用いることができる。例えば、Ｓ．セレビシエＡＬ３３
−１８Ｃ株よりゲノムＤＮＡを調製し、ゲノムライブラ
リーを作製する。その後、上述した特願平６−１０６１
５８号明細書に記載の scaur２遺伝子をプローブとし、
該ゲノムライブラリーをハイブリダイゼーション法によ
るスクリーニングによってＳ．セレビシエＡＬ３３−１
８Ｃ株のscaur２遺伝子を取得することができる。該 sc
aur２遺伝子を含有するＤＮＡ断片の制限酵素地図を図
２に示す。該 scaur２遺伝子が本当にオーレオバシジン
感受性関連遺伝子 scaur２遺伝子であるかどうかを確認
するためには、Ｓ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株の s
caur２遺伝子の塩基配列を決定し、特願平６−１０６１
５８号明細書に記載の scaur２遺伝子の塩基配列、及
び、この塩基配列より予想される scaur２遺伝子のコー
ドするタンパク質のアミノ酸配列と比較することにより
確認できる。Ｓ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株の sca
ur２遺伝子のタンパク質をコードしている部分を含む領
域の塩基配列は配列表の配列番号２に、この塩基配列に
より予想される該遺伝子のコードするタンパク質のアミ
ノ酸配列は配列表の配列番号３に示す。

【００２３】この結果、Ｓ．セレビシエＡＬ３３−１８
Ｃ株の scaur２遺伝子が、オーレオバシジン感受性関連
遺伝子であることが確認できた。次に、該 scaur２遺伝
子の上流にあると考えられるプロモーターをクローニン
グする。例えば、該 scaur２遺伝子を含有するＤＮＡ断
片を適当な制限酵素で消化し、 scaur２遺伝子の上流部
分を含むＤＮＡ断片をサブクローニングし、塩基配列を
決定する。該塩基配列のうち scaur２遺伝子より上流の
塩基配列を配列表の配列番号４に示す。また更に、 sca
ur２遺伝子より上流だけをＰＣＲ等により得ることがで
きる。例えば、配列表の配列番号４より上述のＤＮＡ断
片の上流の方に相当するプライマー（配列表の配列番号
５）を、配列表の配列番号２より、 scaur２遺伝子の上
流に相当するプライマー（配列表の配列番号６）を設計
し、これらプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより
プロモーターを含むＤＮＡ断片を得ることができる。該
ＤＮＡ断片の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。

【００２４】次に、該ＤＮＡ断片がプロモーターとして
機能しているかどうかを確認するために、適当なベクタ
ーに該ＤＮＡ断片を組込み、その下流に該ＤＮＡ断片が
プロモーターとして機能するであろう方向と同一方向に
なるように異種遺伝子をつなぎ、更にその下流にターミ
ネーターを同一方向につなげた組換えベクターを作製す
る。ターミネーターとしては、公知のもの、若しくは s
caur２遺伝子より下流に存在するであろうものを使用す
ることができる。 scaur２遺伝子より下流のターミネー
ターを得るためには scaur２遺伝子より下流に相当する
プライマー（配列表の配列番号７）と、 scaur２遺伝子
を含むＤＮＡ断片を組込んだ組換えベクターの scaur２
遺伝子より下流に存在するベクター配列由来のプライマ
ー〔例えば、ベクターがｐＵＣ１１９の場合、Ｍ１３プ
ライマーＭ３（宝酒造社製）を用いることができる〕を
用いてＰＣＲを行うことによりターミネーターを含むＤ
ＮＡ断片を得ることができる。該ＤＮＡ断片の塩基配列
を配列表の配列番号８に示す。こうして得られた組換え
ベクターを酵母等に形質転換し、異種遺伝子若しくは、
異種タンパク質の発現を見ることによりプロモーターと
して機能しているかどうかを確認することができる。例
えば、異種遺伝子として、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
〔メソッズ イン エンザイモロジー（Methods in Enz
ymology)、第１００巻、第２９３〜３０８頁（１９８
３）〕を、上述のＤＮＡ断片の下流に同一方向でつな
ぎ、組換えベクターを作製する。該組換えベクターを酵
母に形質転換し、得られた組換え細胞を５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ
−ｇａｌ）を含む培地上において培養を行い、発現して
いるガラクトシダーゼにより青色のコロニーを形成する
かどうかを確認することで該ＤＮＡ断片がプロモーター
活性を有するかどうかを確認することができる。その結
果、本発明のプロモーターを含むＤＮＡ断片は、プロモ
ーター活性を有していることが明らかとなった。

【００２５】次に、前述のＳ．セレビシエＤＫＤ８Ｄ株
とＳ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株との scaur２遺伝
子の発現量の大きな違いが上記のＤＮＡ断片中に含まれ
るプロモーターによるものかどうかを確認するために、
野生株とオーレオバシジン耐性株へ上述のプロモーター
活性の確認に用いた組換えベクターをそれぞれに形質転
換する。野生株としては、例えば、Ｓ．セレビシエＤＫ
Ｄ８Ｄ株、Ｓ．セレビシエＳＨ３３２８株（接合型α、
遺伝子型ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ４、ｔｈｒ４、ｌｅｕ
２−３・１１２）等を用いることができ、オーレオバシ
ジン耐性株としては、Ｓ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ
株を用いることができる。得られる組換え細胞を培養
し、該培養物から細胞破砕液を調製する。該破砕液を用
い、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｏ−
nitrophenyl −β−Ｄ−galactoside 、ＯＮＰＧ）を基
質として、ガラクトシダーゼ活性を測定〔エクスペリメ
ンツイン モレキュラー バイオロジー（Experiments
in Molecular Biology) 、コールド スプリングハーバ
ー ラボラトリー発行、第３５２〜３５５頁（１９７
２）〕を行うことにより、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
の発現量を、β−ガラクトシダーゼ酵素活性として測定
することができる。その結果、 scaur２遺伝子の発現量
を比較した結果と同様に、Ｓ．セレビシエＡＬ３３−１
８Ｃ株に組換えベクターを形質転換した組換え細胞の方
が非常に高い活性を示した。このことより、本発明のプ
ロモーターは、高発現を誘導するような転写調節因子が
存在することが明らかとなった。

【００２６】更に、この転写調節因子が何であるかを確
認するために、Ｓ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株の遺
伝学的解析を行う。その結果、従来より転写調節因子と
して知られている多剤薬剤耐性遺伝子のＰＤＲ１遺伝子
〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Journal of Biological Chemistry)、第２６２巻、第
３５号、第１６８７１〜１６８７９頁（１９８７）〕に
変異が起こっていることが明らかとなり、該ＰＤＲ１遺
伝子産物により本発明のプロモーターが転写の調節を制
御されていることが明らかとなり、本発明のプロモータ
ーは、ＰＤＲ１遺伝子産物により転写調節可能であるこ
とが明らかとなった。

【００２７】本発明により、本発明のプロモーターを用
いて、該プロモーターの下流の発現可能な位置に接続さ
れた遺伝子の発現量をＰＤＲ１遺伝子産物により調節可
能であり、これは有用な組換えタンパク質等の製造にお
いて有用である。更には、形質転換に用いる宿主として
酵母を用いることにより、細胞の増殖速度が速く、高い
細胞密度が維持できる、栄養が豊かな完全栄養培地を使
うことができ、有用な組換えタンパク質を大量生産する
のに有用である。本発明のプロモーターは、Ｓ．セレビ
シエＡＬ３３−１８Ｃ株より取得が可能であり、また、
本発明のプロモーターを含む塩基配列を用いることによ
り、該塩基配列にハイブリダイズ可能で、本発明のプロ
モーターと同様の性質を有する、組換えタンパク質等の
製造において有用なプロモーターを取得することができ
る。該プロモーターも、本発明に含まれる。

【００２８】目的のプロモーターをハイブリダイゼーシ
ョンにより得る方法としては、例えば、以下の方法が適
用できる。まず、目的の遺伝子源から得た染色体ＤＮＡ
を定法に従い、プラスミドやファージベクターに接続し
て宿主に導入し、ライブラリーを作製する。そのライブ
ラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー又はプ
ラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取り、
変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜をあらか
じめ³²Ｐ等で標識したプローブ（使用するプローブとし
ては、配列表の配列番号１、４に記載した塩基配列、又
はその一部の遺伝子を使用することができる）を含む溶
液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブ
リッドを形成させる。例えばＤＮＡを固定化した膜を、
６×ＳＳＣ、１％ラウリル硫酸ナトリウム、１００μｇ
／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ウシ血清ア
ルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞ
れ０．１％の濃度で含む）を含む溶液中で６５℃で２０
時間、プローブとハイブリダイゼーションを行う。ハイ
ブリダイゼーション後、非特異的吸着を洗い流し、オー
トラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形
成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形
成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得
られたクローンの中には、目的のプロモーターが挿入さ
れている。得られた遺伝子は、例えば、次のように塩基
配列を決定し、得られた遺伝子が目的のプロモーターで
あるかを確認する。

【００２９】塩基配列の決定は、ハイブリダイゼーショ
ンにより得られたクローンの場合、組換体が大腸菌であ
れば試験管等で培養を行い、プラスミドを定法に従い抽
出する。これを制限酵素により切断し挿入断片を取り出
し、Ｍ１３ファージベクター等にサブクローニングし、
ジデオキシ法により塩基配列を決定する。組換体がファ
ージの場合も基本的に同様のステップにより塩基配列を
決定することができる。これら培養から塩基配列決定ま
での基本的な実験法については、例えば、モレキュラー
・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル〔Mole
cular Cloning,A Laboratory Manual 、１９８２年、コ
ールドスプリングハーバーラボラトリー発行、ティ．マ
ニアティス（T.Maniatis) ら著〕等に記載されている。

【００３０】得られた遺伝子が目的のプロモーターであ
るかどうかを確認するには、決定された塩基配列を本発
明のプロモーター及び配列表の配列番号１に記載した塩
基配列と比較してその遺伝子構造を知ることができる。
得られた遺伝子がプロモーター領域のすべてを含まない
場合には、得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡプライ
マーを作製し、ＰＣＲにより足りない領域を増幅した
り、得られた遺伝子の断片をプローブとして、更にＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングすることにより、本発
明のプロモーターにハイブリダイズするプロモーターの
全領域の塩基配列を決定することができる。例えば、特
願平６−１０６１５８号明細書に記載のオーレオバシジ
ン耐性株Ｓ．セレビシエＬ２２−８Ｂ株を遺伝子源とし
て目的のプロモーターを得ることが可能である。

【００３１】また、本発明のプロモーターの塩基配列を
基にして、該塩基配列を含む遺伝子の部位特異的変異誘
発により、該塩基配列の一部を置換、挿入及び欠失の少
なくとも一つによって修飾することで、本発明のプロモ
ーターの機能を改変させ本発明のプロモーター類似のプ
ロモーターを得ることができる。この部位特異的変異誘
発は、ギャプト デュプレックス（gapped duplex)法
〔メソッズ イン エンザイモロジー、第１５４巻、第
３５０〜３６７頁（１９８７）〕、ウラシルＤＮＡ法
〔メソッズ・イン・エンザイモロジー、第１５４巻、第
３６７〜３８２頁（１９８７）〕、亜硝酸法〔プロシー
ディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Proceedings of
the National Academy of Sciences of the USA) 、第
７９巻、第７２５８〜７２６２頁（１９８２）〕、更に
カセット変異法〔ジーン（Gene) 、第３４巻、第３１５
〜３２３頁（１９８５）〕が知られている。また、本発
明のプロモーターの塩基配列を基にして、該塩基配列を
含む遺伝子、又はその一部を既知のプロモーター等の遺
伝子、若しくはその一部と結合、あるいは置換し、キメ
ラのプロモーター〔プロシーディングズ オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ ＵＳＡ、第８８巻、第７２６６〜７２７０頁（１９
９１）〕を作製することで、本発明のプロモーターと同
様に、ＰＤＲ１遺伝子産物により転写調節可能なプロモ
ーターを得ることができる。

【００３２】このようにして得られるプロモーターは、
その下流に各種リポーター遺伝子を発現できる位置に接
続し、本発明のプロモーターと同様の方法でプロモータ
ー活性を測定することにより、該プロモーターが細胞内
で機能するかどうか確認することができる。

【００３３】本発明のプロモーターや、該プロモーター
にハイブリダイズ可能で、本発明のプロモーターと同様
の性質を有するプロモーターは、適当なベクターに単
独、若しくはターミネーターと同時に組込み組換えベク
ターとして使用することができる。使用可能なベクター
としては、例えば、酵母用ベクターとしてはｐＹＲ型、
ｐＹＣ型、ｐＹＥ型、ｐＹＩ型が使用できる。該組換え
ベクターに、１個又はそれ以上の構造遺伝子を、発現で
きる位置に発現できる向きで組込むことが可能である。
更に該構造遺伝子を組込んだ組換えベクターは該構造遺
伝子の発現産物を菌体外へ分泌させるシグナルを含むこ
とが好ましい。該組換えベクターや、構造遺伝子等を組
込んだ組換えベクターの形質転換に使用される細胞は、
本発明のプロモーターや、該プロモーターにハイブリダ
イズ可能で、本発明のプロモーターと同様の性質を有す
るプロモーターが、その細胞中でプロモーター活性を有
する細胞であればいかなるものでもよく、例えば酵母が
好ましい。これらの細胞に、該組換えベクターや構造遺
伝子等を組込んだ組換えベクターを形質転換する方法と
しては、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、エレクト
ロポレーション法等のように、従来知られている方法で
あれば、いかなる方法でも可能である。

【００３４】また、該組換えベクターや構造遺伝子等を
組込んだ組換えベクターと、ＰＤＲ１遺伝子を適当なベ
クターに発現できるように組込んだ組換えベクターとを
共に同一の細胞内へ形質転換することで、本発明のプロ
モーターや、該プロモーターにハイブリダイズ可能で、
本発明のプロモーターと同様の性質を有するプロモータ
ーの転写の調節を行うことができる。

【００３５】また更に、該組換えベクターや構造遺伝子
等を組込んだ組換えベクターを、無細胞系のタンパク質
合成に使用することで、外部よりＰＤＲ１遺伝子産物を
添加、若しくは初めから入れておくことにより、本発明
のプロモーターや、該プロモーターにハイブリダイズ可
能で、本発明のプロモーターと同様の性質を有するプロ
モーターの転写を調節することができ、通常の場合のタ
ンパク質合成よりもより良いタンパク質合成を行うこと
が可能となる。

【００３６】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

【００３７】実施例１ Ｓ．セレビシエのオーレオバ
シジン耐性変異株の分離 オーレオバシジンＡに対して０．３１μｇ／ｍｌで感受
性を示すＳ．セレビシエＤＫＤ８Ｄ株（接合型ａ、遺伝
子型ｌｅｕ２−３・１１２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３−５
２、ｈｉｓ４）の約１×１０⁸ 個の細胞を１ｍｌの０．
９％塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液に懸濁した。最
終濃度３％のＥＭＳ、３０℃、９０分間という条件で変
異処理をした。５％チオ硫酸ナトリウム８ｍｌを加え
て、ＥＭＳを失活した後、処理細胞を遠心（２５００r.
p.m.、５分間）により回収し、６ｍｌの生理食塩水で２
回洗浄後、２ｍｌのＹＰＤ培地（２％グルコース、１％
酵母エキス、２％ポリペプトン）に懸濁した。懸濁液を
３０℃、５時間、かくはんしながら保温した後、１．５
μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡを含むＹＰＤプレート
（１．５％寒天を含むＹＰＤ培地）へ蒔き、３０℃、３
〜４日間培養した。このようにして得られた耐性変異株
Ｓ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株は２５μｇ／ｍｌの
オーレオバシジンＡに対しても耐性を示し、多剤耐性変
異ではなく、オーレオバシジンに特異的な耐性であると
推定される。該菌株は、 Saccharomyces cerevisiae Ａ
Ｌ３３−１８Ｃと命名、表示され、工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４９２０として寄託
されている。

【００３８】実施例２ Ｓ．セレビシエＤＫＤ８Ｄ株
とＳ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株における scaur２
遺伝子の発現 Ｓ．セレビシエの野生株であるＳ．セレビシエＤＫＤ８
Ｄ株と、実施例１で得られたオーレオバシジン耐性株で
あるＳ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株からＲ．ジェン
センらの方法〔プロシーディングズ オブ ザ ナショ
ナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ
ＵＳＡ、第８０巻、第３０３５〜３０３９頁（１９８
３）〕により全ＲＮＡを抽出、精製した。更にオリゴテ
ックス−ｄＴ３０（宝酒造社製）によりポリ（Ａ）ＲＮ
Ａのみを精製した。精製ポリ（Ａ）ＲＮＡ（２．５μ
ｇ）をホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲル
での電気泳動により分離後、ナイロンメンブレン（Hybo
nd−Ｎ、アマシャム社製）へ移し、固定化した。 scaur
２遺伝子の発現を確認するためのプローブとして、特願
平６−１０６１５８号明細書に記載のオーレオバシジン
耐性株Ｓ．セレビシエＬ２２−８Ｂ株由来の scaur２遺
伝子を含有するプラスミド pSCAR２を保有する大腸菌、
Escherichia coli HB101/pSCAR２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４
４８４）よりプラスミド pSCAR２を調製し、Ｈｉｎｄ I
II（宝酒造社製）及びＰｓｔＩ（宝酒造社製）で二重消
化し、アガロースゲル電気泳動を行い、 scaur２遺伝子
のＨｉｎｄIII −ＰｓｔＩ断片（１．２ｋｂ）を回収、
精製した。該ＤＮＡ断片を〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰで標識
したものをプローブとして用いて、上記の固定化したポ
リ（Ａ）ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行った。そ
の結果を図１に示す。すなわち図１は、野生株、及び耐
性株より得られたｍＲＮＡをホルムアルデヒドを含む
１．２％アガロースゲル電気泳動を行い、ノーザンハイ
ブリダイゼーションを行った結果のオートラジオグラフ
である。図中、レーン１は野生株より、レーン２は耐性
株より得られたｍＲＮＡを示す。この結果から、Ｓ．セ
レビシエＤＫＤ８Ｄ株に比べてＳ．セレビシエＡＬ３３
−１８Ｃ株は scaur２遺伝子のｍＲＮＡが５０倍以上の
高発現となっていた。

【００３９】実施例３ scaur２遺伝子のプロモータ
ーのクローニング （１） scaur２遺伝子のクローニング scaur２遺伝子のプロモーターをクローニングするため
に、Ｓ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株より scaur２遺
伝子のクローニングを行った。実施例１で得たオーレオ
バシジン耐性株Ｓ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株から
ゲノムＤＮＡをＰ．フィリップセン（P.philippsen) ら
の方法〔メソッズ イン エンザイモロジー、第１９４
巻、第１６９〜１７５頁（１９９１）〕により抽出、精
製した。精製したゲノムＤＮＡ（８μｇ）をＨｉｎｄII
I ５ユニットで３７℃、１０分間処理による部分分解
後、フェノール／クロロホルムにより除タンパクし、エ
タノール沈殿し、部分分解ＤＮＡを得た。このＤＮＡを
０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ、３〜１５ｋｂ
ｐ領域のＤＮＡを抽出、精製した。このＤＮＡとＨｉｎ
ｄIII で完全分解した酵母−大腸菌シャトルベクターｐ
ＷＨ５〔２μｇ、プラスミド（Plasmid)、第１５巻、第
１５６〜１５８頁（１９８６）〕をＤＮＡライゲーショ
ンキット（ＤＮＡ Ligation Kit、宝酒造社製）により
連結させた後、大腸菌ＨＢ１０１へ形質転換し、ゲノム
ライブラリーを作製した。ゲノムライブラリーを含有さ
せた大腸菌をアンピシリンとテトラサイクリンを含むＬ
Ｂ寒天培地上へ蒔き、３７℃一夜培養した。生じたコロ
ニーをナイロンメンブレン（Hybond−Ｎ）へ移し、コロ
ニーハイブリダイゼーションを行った。プローブとし
て、実施例２で使用した特願平６−１０６１５８号明細
書に記載の scaur２遺伝子を含む８．５ｋｂのＤＮＡ断
片をランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（Rand
om Primer DNA Labeling Kit、宝酒造社製）を用い、
〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰで標識したものを用いた。２×１
０⁴ 個のコロニーのスクリーニングの結果、プローブと
ハイブリダイズする数クローンを得た。これらのクロー
ンは、４．６ｋｂと３．９ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断
片よりなる８．５ｋｂＤＮＡ断片を含むクローンであっ
た。それらのＤＮＡ断片の制限酵素地図より、これらは
特願平６−１０６１５８号明細書に記載の scaur２遺伝
子であることが明らかとなった。該８．５ｋｂＤＮＡ断
片を図２に示す。得られた８．５ｋｂＤＮＡ断片をｐＵ
Ｃ１１８（宝酒造社製）へサブクローニング後ＤＮＡ塩
基配列を決定した（配列表の配列番号２）。配列表の配
列番号２の塩基配列より配列表の配列番号３のアミノ酸
配列が推定された。なお、該８．５ｋｂＤＮＡ断片をｐ
ＵＣ１１９（宝酒造社製）のＨｉｎｄIIIサイトにサブ
クローニングし、このプラスミドをｐＵ scaur２と命名
し、該プラスミドｐＵ scaur２を保有する大腸菌ＨＢ１
０１Ｈ、Escherichia coli HB101/pＵ scaur２と命名し
た。

【００４０】（２） scaur２遺伝子のプロモーターのク
ローニング及び塩基配列の決定 実施例３−（１）で作製したプラスミドｐＵ scaur２を
ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、０．８％アガロー
スゲル電気泳動にかけ、プロモーターが含まれると考え
られる約２ｋｂのＤＮＡ断片を抽出、精製した。次に、
該ＤＮＡ断片をＤＮＡブランティング キット（ＤＮＡ
Blunting Kit、宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、
ｐＵＣ１１８のＳｍａＩサイトに挿入した。得られたプ
ラスミドを用いて、塩基配列を決定した。決定した塩基
配列のうち、 scaur２遺伝子より上流の塩基配列を配列
表の配列番号４に示す。更に、 scaur２遺伝子より上流
のプロモーターを含むＤＮＡ断片のみを得るために配列
表の配列番号４より、上記ＤＮＡ断片の上流領域に対応
する塩基配列の５′末端側にＨｉｎｄIII 認識配列を付
加したプライマーを設計した。該プライマーの塩基配列
を配列表の配列番号５に示す。次に、配列表の配列番号
２より、scaur２遺伝子の上流領域に対応する塩基配列
の５′末端側にＢａｍＨＩ認識配列を付加したプライマ
ーを設計した。該プライマーの塩基配列を配列表の配列
番号６に示す。プラスミドｐＵ scaur２を鋳型とし、両
プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＨｉ
ｎｄIII とＢａｍＨＩで消化後、０．８％アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、ＰＣＲにより得られた約１．４ｋｂ
ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を抽出、精製し
た。該ＤＮＡ断片をｐＵＣ１１９のＨｉｎｄIII −Ｂａ
ｍＨＩサイトにクローニングし、塩基配列を決定した。
該塩基配列のうち、プラスミドｐＵ scaur２に相当する
塩基配列を配列表の配列番号１に示す。

【００４１】（３） scaur２遺伝子のターミネーターの
クローニング及び塩基配列の決定 scaur２遺伝子より下流のターミネーターを含むＤＮＡ
断片をクローニングするために、配列表の配列番号２よ
り、 scaur２遺伝子の下流領域に対応する塩基配列の
５′末端側にＳｍａＩ認識配列を付加したプライマーを
設計した。該プライマーの塩基配列を配列表の配列番号
７に示す。プラスミドｐＵ scaur２を鋳型とし、該プラ
イマーとＭ１３プライマーとＭ３（宝酒造社製）とを用
いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＳｍａＩ（宝酒造
社製）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動にか
け、ＰＣＲにより得られた約１．１ｋｂＳｍａＩ ＤＮ
Ａ断片を抽出、精製した。該ＤＮＡ断片をｐＵＣ１１９
のＳｍａＩサイトにクローニングし、塩基配列を決定し
た。該塩基配列のうち、プラスミドｐＵ scaur２に相当
する塩基配列を配列表の配列番号８に示す。

【００４２】実施例４ プロモーター活性の測定 （１） scaur２遺伝子のプロモーター下流にβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子を導入したプラスミドの構築 実施例３−（２）で得られたプロモーターを含むＨｉｎ
ｄIII −ＢａｍＨＩＤＮＡ断片（約１．４ｋｂ）をｐＵ
Ｃ１１９のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩサイトに挿入し、
更に、実施例３−（３）で得られたターミネーターを含
むＳｍａＩＤＮＡ断片（約１．１ｋｂ）をプロモーター
を含むＤＮＡ断片と同一方向となるように挿入し、プラ
スミドｐＵ scaur２Ｐ−Ｔを作製した。次に、β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子をｐＵ scaur２Ｐ−Ｔに以下に示す
方法により挿入した。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ
Ｚ）遺伝子はプラスミドｐＭＣ１８７１〔メソッズ イ
ン エンザイモロジー、第１００巻、第２９３〜３０８
頁、（１９８３）〕をＢａｍＨＩで切断し、目的とする
約３．１ｋｂ ＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル電
気泳動により分離し、回収精製した。この３．１ｋｂ
ＤＮＡ断片をｐＵ scaur２Ｐ−ＴのＢａｍＨＩ部位に上
記で挿入したプロモーターを含むＤＮＡ断片と同一方向
となるように挿入し、プロモーターの下流にβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＵＡＲ２ＬＺが
得られた。

【００４３】（２） scaur２のプロモーター下流にβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した酵母複製ｐＹＣ系プ
ラスミドの構築 ｐＵＡＲ２ＬＺをＨｉｎｄIII で消化し、 scaur２遺伝
子のプロモーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子と sca
ur２遺伝子のターミネーターを含む約５．４ｋｂ ＤＮ
Ａ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動で分離し、回
収精製した。ＤＮＡブランティング キットにより平滑
化した５．４ｋｂ ＤＮＡ断片を、ｐＹＣ系ベクターで
あるｐＹＥＵｒａ３（クローンテック社製）のＢａｍＨ
ＩとＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化後、平滑化したサ
イトに連結した。このようにして得られたプラスミドを
ｐＹＣＡＲ２ＬＺと命名した。

【００４４】（３）野生株及びオーレオバシジン耐性株
での scaur２遺伝子のプロモーターからのβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子の発現 実施例４−（２）で得られたプラスミドｐＹＣＡＲ２Ｌ
Ｚを酢酸リチウム法により、野生株であるＳ．セレビシ
エＳＨ３３２８株（接合型α、遺伝子型ｕｒａ３−５
２、ｈｉｓ４、ｔｈｒ４、ｌｅｕ２−３・１１２）及び
オーレオバシジン耐性株Ｓ．セレビシエＡＬ３３−１８
Ｃ株に形質転換した。すなわち、０．１Ｍ酢酸リチウム
水溶液（ｐＨ７．５）に細胞を懸濁し、５μｇのプラス
ミドｐＹＣＡＲ２ＬＺと８５０μｌの４０％ポリエチレ
ングリコール（０．１Ｍ酢酸リチウムを含む）を添加
し、３０℃、３０分静置後、４２℃、１５分間処理した
後、遠心により集菌し、５ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％
酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）で１
時間、前培養を行った。この培養液をウラシルを含まな
い最小寒天培地ＳＤ培地（０．６７％アミノ酸不含酵母
ニトロゲンベース、２％グルコース、２％寒天）に接種
し、３０℃で培養した。３〜４日後ウラシル非要求性と
なった形質転換体を得た。次に、これらの形質転換体を
ｌａｃＺ発現検定用プレート（０．００４％Ｘ−ｇａｌ
と０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０を含むＹＰ
Ｄ寒天培地又はＳＤ寒天培地）に接種した。３０℃、２
〜３日培養後、青色の発色を比較した結果、Ｓ．セレビ
シエＳＨ３３２８株より得られた形質転換体はうすい水
色であったが、Ｓ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株より
得られた形質転換体は青〜濃青色のコロニーを形成し
た。すなわち、 scaur２遺伝子のプロモーターによるβ
−ガラクトシダーゼの発現が耐性株では著しく上昇する
ことが確認できた。更に、耐性株での発現の上昇をβ−
ガラクトシダーゼ活性を測定することにより確認した。
活性測定のため、それぞれの形質転換体をＹＰＤスラン
トで３０℃一晩培養した。菌体をかきとり、生理食塩水
にＯＤ₆₀₀ が約１５となるように懸濁した。この菌体懸
濁液１００μｌをガラスビーズ（シグマ社製、４２５−
６００ミクロン）と混合後、氷冷しながらボルテックス
（３０秒、３回）により、菌体を破砕した。破砕液にＺ
緩衝液〔０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）、０．０１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭＭｇＳＯ₄ 、０．０
５Ｍ ２−メルカプトエタノール〕を添加し、全量を１
ｍｌとした。０．５ｍｌの破砕液を用いて、ＯＮＰＧを
基質として、ガラクトシダーゼ活性を測定した〔エクス
ペリメンツ イン モレキュラー バイオロジー、コー
ルド スプリングハーバー ラボラトリー発行、第３５
２〜３５５頁（１９７２）〕。すなわち、菌体破砕液
０．５ｍｌとＺ緩衝液０．５ｍｌを混合し、２８℃で５
分間保温した後、０．２ｍｌのＯＮＰＧ溶液〔４ｍｇ／
ｍｌ ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）〕を添加し、酵
素反応を開始させた。２８℃、２０〜４０分間保温後、
０．５ｍｌの１Ｍ Ｎａ₂ ＣＯ₃ を加えて反応を停止さ
せた。１００００r.p.m.で１分間遠心後、上清のＯＤ
₄₂₀ 及びＯＤ₅₅₀ を測定した。活性は下記の式（数１）
から計算した。

【００４５】

【数１】活性（ユニット／ＯＤ₆₀₀ ）＝１０００×ＯＤ
₄₂₀ −１．７５×ＯＤ₅₅₀／ｔ×ｖ×ＯＤ₆₀₀

【００４６】 ＯＤ₄₂₀ 、ＯＤ₅₅₀ ： 反応液上清で測定 ＯＤ₆₀₀ ： 菌体懸濁液の細胞濃度 ｔ ： 反応時間 （分） ｖ ： 反応に用いた菌体懸濁液の量
（ｍｌ）

【００４７】その結果を表４に示す。表４に示すように
scaur２遺伝子のプロモーターによるβ−ガラクトシダ
ーゼの発現が、オーレオバシジン耐性株Ｓ．セレビシエ
ＡＬ３３−１８Ｃ株では、野生株Ｓ．セレビシエＳＨ３
３２８株の約２０倍に上昇していた。

【００４８】

【表４】 表 ４ ─────────────────────────────────── 活性（ユニット／ＯＤ₆₀₀ ） ─────────────────────────────────── ｐＹＣＡＲ２ＬＺをもつ クローン１ ２．１２ 野生株（Ｓ．セレビシエ クローン２ １．９９ ＳＨ３３２８） クローン３ ２．０９ クローン４ １．８６ クローン５ ２．２８ ─────────────────────────────────── ｐＹＣＡＲ２ＬＺをもつ クローン１ ３６．６ 耐性株（Ｓ．セレビシエ クローン２ ５４．４ ＡＬ３３−１８Ｃ） クローン３ ４８．６ クローン４ ５３．８ クローン５ ４５．７ ───────────────────────────────────

【００４９】実施例５ オーレオバシジン耐性株Ｓ．
セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株の耐性遺伝子の同定 Ｓ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株の遺伝学的解析を行
ったところ、耐性変異遺伝子は第７染色体のセントロメ
ア近傍に存在し、更に四分子分析の結果、ＬＥＵ１遺伝
子マーカーに隣接している〔＜４．１ｃＭ（センチモル
ガン）〕ことが明らかとなった。この位置には従来より
知られている多剤薬剤耐性遺伝子のＰＤＲ１遺伝子が存
在するため、このＳ．セレビシエＡＬ３３−１８Ｃ株は
ＰＤＲ１遺伝子に変異が起こっていることが明らかとな
った。ＰＤＲ１遺伝子と scaur２遺伝子は全く異なった
遺伝子であり、更に、ＰＤＲ１遺伝子産物は転写調節因
子であることが知られているため、ＰＤＲ１遺伝子産物
が scaur２遺伝子の転写を調節していることが明らかと
なった。

【００５０】

【発明の効果】本発明により、遺伝子組換え技術を用い
た有用タンパク質や代謝産物の製造等に有用な、転写調
節可能なプロモーターが提供された。該プロモーター
は、完全栄養培地で使用可能であり、また、ＰＤＲ１遺
伝子産物により転写調節が可能である。

【００５１】

【配列表】

【００５２】配列番号：1 配列の長さ：1366 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： TCCAACCCTG CGCATTCACC ATTATCAAAC TCGTCTTTTT TGTCTTTACG TTTTAATTTA 60 GCACCGAGCC CAACGTTGTC GTCCTTAATT GACACTTTGA TATGCGAAGT GTTCGAATTC 120 ATGGGGGATA ACCCCAGACC CATACCGGGT TTCCATCCAA ACTTTTCTAG AAATTGGTGC 180 CCGAATCTCG AGGTGTCGTT ACTCCATGCC GTATTTCTGG GGTCTAAACC AAACCGCTGT 240 TTGGTTCTTG TAGCTGCCAA ACCCATTCTG CTTCTTTGTT TAATGGTGTA AGCTGCCTAT 300 ATGTTACTAT TGAGTACTCA TCTCATCGCT TCTTTCAGAA CAAAATTTTT CATATTTTTT 360 TTTTTTCCTT TTCTTTTTTT TTTTTTCTTT GACTGTTACC CGGTTGTTTA TATTTGTAGG 420 AAAACAACAA CGACAGAGAA AATATCCTTG CAGTGGCGGC TAATTTGTTA GTTGACTGAT 480 TGATCACCTT CACTTATTAA AGTAAAATCA GCATACAAGA GATCAGAAGG GAGAAAGAGA 540 GTGGGCAAGG CTATAGTACT TTGAAGAAAG CATCTTTGAA CCGACTAGTT CTCTTCACAA 600 GCAAAATCTA TATGACTAAC CGCAAGGGGC AAAGGGTTGT GAGAGGGCCC GTCTTTCTCC 660 CGCTATAGCC GTCACTGGTA TCCCTCCTGG CTGCACAAAT CCGATAGAAA GGGGAAGAAG 720 GAAGTTTAGT GCCACCTTAT AGCACGCAGT TACTGTTTAC GCTAAGGAGA GGCATACTCA 780 ATTTTTATTA GTCGCCTTCT TTAGTTGCTG CGTTTTTATC CACGGTTCTC TACTAAATGC 840 TTGCGATAAG CGCTTCTATT TTCCTCCCCA CCGCGAGGCG GAAATGGCAC ATTTTTTTTC 900 TTTTGCTTCT GTGCTTTTGC TGTAATTTTT GGCATGTGCT ATTGTATGAA GATAACGCGT 960 GGTTCCGTGG AAATAGCCGG AAATTTTGCC GGGAATATGA CGGACATGAT TTAACACCCG 1020 TGGAAATGAA AAAAGCCAAG GTAAGAAAGT GGCAATATTT TTCCTACAAA TAGATCTGCT 1080 GTCCCTTAGA TGATTACCAT ACATATATAT ATTTATTACA CACATCTGTC AGAGGTAGCT 1140 AGCGAAGGTG TCACTGAAAT ATTTTTTGTT CCAGTTAGTA TAAATACGGA GGTAGAACAG 1200 CTCTCCGCGT GTATATCTTT TTTTGCGCTA TACAAGAACA GGAAGAACGC ATTTCCATAC 1260 CTTTTTCTCC TTACAGGTGC CCTCTGAGTA GTGTCACGAA CGAGGAAAAA GATTAATATT 1320 ACTGTTTTTA TATTCAAAAA GAGTAAAGCC GTTGCTATAT ACGAAT 1366

【００５３】配列番号：2 配列の長さ：5340 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： AGCGCTTCTA TTTTCCTCCC CACCGCGAGG CGGAAATGGC ACATTTTTTT TCTTTTGCTT 60 CTGTGCTTTT GCTGTAATTT TTGGCATGTG CTATTGTATG AAGATAACGC GTGGTTCCGT 120 GGAAATAGCC GGAAATTTTG CCGGGAATAT GACGGACATG ATTTAACACC CGTGGAAATG 180 AAAAAAGCCA AGGTAAGAAA GTGGCAATAT TTTTCCTACA AATAGATCTG CTGTCCCTTA 240 GATGATTACC ATACATATAT ATATTTATTA CACACATCTG TCAGAGGTAG CTAGCGAAGG 300 TGTCACTGAA ATATTTTTTG TTCCAGTTAG TATAAATACG GAGGTAGAAC AGCTCTCCGC 360 GTGTATATCT TTTTTTGCGC TATACAAGAA CAGGAAGAAC GCATTTCCAT ACCTTTTTCT 420 CCTTACAGGT GCCCTCTGAG TAGTGTCACG AACGAGGAAA AAGATTAATA TTACTGTTTT 480 TATATTCAAA AAGAGTAAAG CCGTTGCTAT ATACGAATAT GACGATTACC GTGGGGGATG 540 CAGTTTCGGA GACGGAGCTG GAAAACAAAA GTCAAAACGT GGTACTATCT CCCAAGGCAT 600 CTGCTTCTTC AGACATAAGC ACAGATGTTG ATAAAGACAC ATCGTCTTCT TGGGATGACA 660 AATCTTTGCT GCCTACAGGT GAATATATTG TGGACAGAAA TAAGCCCCAA ACCTACTTGA 720 ATAGCGATGA TATCGAAAAA GTGACAGAAT CTGATATTTT CCCTCAGAAA CGTCTGTTTT 780 CATTCTTGCA CTCTAAGAAA ATTCCAGAAG TACCACAAAC CGATGACGAG AGGAAGATAT 840 ATCCTCTGTT CCATACAAAT ATTATCTCTA ACATGTTTTT TTGGTGGGTT CTACCCATCC 900 TGCGAGTTGG TTATAAGAGA ACGATACAGC CGAACGATCT CTTCAAAATG GATCCGAGGA 960 TGTCTATAGA GACCCTTTAT GACGACTTTG AAAAAAACAT GATTTACTAT TTTGAGAAGA 1020 CGAGGAAAAA ATACCGTAAA AGACATCCAG AAGCGACAGA AGAAGAGGTT ATGGAAAATG 1080 CCAAACTACC TAAACATACA GTTCTGAGAG CTTTATTATT CACTTTTAAG AAACAGTACT 1140 TCATGTCGAT AGTGTTTGCA ATTCTCGCTA ATTGTACATC CGGTTTTAAC CCCATGATTA 1200 CCAAGAGGCT AATTGAGTTT GTCGAAGAAA AGGCTATTTT TCATAGCATG CATGTTAACA 1260 AAGGTATTGG TTACGCTATT GGTGCATGTT TGATGATGTT CGTTAACGGG TTGACGTTCA 1320 ATCATTTCTT TCATACATCC CAACTGACTG GTGTGCAAGC TAAGTCTATT CTTACTAAAG 1380 CTGCCATGAA GAAAATGTTT AATGCATCTA ATTATGCGAG ACATTGTTTT CCTAACGGTA 1440 AAGTGACTTC TTTTGTAACA ACAGATCTCG CTAGAATTGA ATTTGCCTTA TCTTTTCAGC 1500 CGTTTTTGGC TGGGTTCCCT GCAATTTTGG CTATTTGCAT TGTTTTATTG ATCGTTAACC 1560 TTGGACCCAT TGCCTTAGTT GGGATTGGTA TTTTTTTCGG TGGGTTTTTC ATATCCTTAT 1620 TTGCATTTAA GTTAATTCTG GGCTTTAGAA TTGCTGCGAA CATCTTCACT GATGCTAGAG 1680 TTACCATGAT GAGAGAAGTG CTGAATAATA TAAAAATGAT TAAATATTAT ACGTGGGAGG 1740 ATGCGTATGA AAAAAATATT CAAGATATTA GGACCAAAGA GATTTCTAAA GTTAGAAAAA 1800 TGCAACTATC AAGAAATTTC TTGATTGCTA TGGCCATGTC TTTGCCTAGT ATTGCTTCAT 1860 TGGTCACTTT CCTTGCAATG TACAAAGTTA ATAAAGGAGG CAGGCAACCT GGTAATATTT 1920 TTGCCTCTTT ATCTTTATTT CAGGTCTTGA GTTTGCAAAT GTTTTTCTTA CCTATTGCTA 1980 TTGGTACTGG AATTGACATG ATCATTGGAT TGGGCCGTTT GCAAAGCTTA TTGGAGGCTC 2040 CAGAAGATGA TCCAAATCAG ATGATTGAAA TGAAGCCCTC TCCTGGCTTT GATCCAAAAT 2100 TGGCTCTAAA AATGACACAT TGCTCATTTG AGTGGGAAGA TTATGAATTA AACGACGCTA 2160 TTGAAGAAGC AAAAGGAGAA GCTAAAGATG AAGGTAAAAA GAACAAAAAA AAGCGTAAGG 2220 ATACATGGGG TAAGCCATCT GCAAGTACTA ATAAGGCGAA AAGATTGGAC AATATGTTGA 2280 AAGACAGAGA CGGCCCGGAA GATTTAGAAA AAACTTCGTT TAGGGGTTTC AAGGACTTGA 2340 ACTTCGATAT TAAAAAGGGC GAATTTATTA TGATTACGGG ACCTATTGGT ACTGGTAAAT 2400 CTTCATTATT GAATGCGATG GCAGGATCAA TGAGAAAAAT TGATGGTAAG GTTGAAGTCA 2460 ACGGGGACTT ATTAATGTGT GGTTATCCAT GGATTCAAAA TGCATCTGTA AGAGATAACA 2520 TCATATTCGG TTCACCATTC AATAAAGAAA AGTATGATGA AGTAGTTCGT GTTTGCTCTT 2580 TGAAAGCTGA TCTGGATATT TTACCGGCAG GCGATATGAC CGAAATTGGG GAACGTGGTA 2640 TTACTTTATC TGGTGGTCAA AAGGCACGTA TCAATTTAGC CAGGTCTGTT TATAAGAAGA 2700 AGGATATTTA TGTATTCGAC GATGTCCTAA GTGCTGTCGA TTCTCGTGTT GGTAAACACA 2760 TCATGGATGA ATGTCTAACC GGAATGCTTG CTAATAAAAC CAGAATTTTA GCAACGCATC 2820 AGTTGTCACT GATTGAGAGA GCTTCTAGAG TCATCGTTTT AGGTACTGAT GGCCAAGTCG 2880 ATATTGGTAC TGTTGATGAG CTAAAAGCTC GTAATCAAAC TTTGATAAAT CTTTTACAAT 2940 TCTCTTCTCA AAATTCGGAG AAAGAGGATG AAGAACAGGA AGCGGTTGTT TCCGGTGAAT 3000 TGGGACAACT AAAATATGAA CCAGAGGTAA AGGAATTGAC TGAACTGAAG AAAAAGGCTA 3060 CAGAAATGTC ACAAACTGCA AATAGTGGTA AAATTGTAGC GGATGGTCAT ACTAGTAGTA 3120 AAGAAGAAAG AGCAGTCAAT AGTATCAGTC TGAAAATATA CCGTGAATAC ATTAAAGCTG 3180 CAGTAGGTAA GTGGGGTTTT ATCGCACTAC CGTTGTATGC AATTTTAGTC GTTGGAACCA 3240 CATTCTGCTC ACTTTTTTCT TCCGTTTGGT TATCTTACTG GACTGAGAAT AAATTCAAAA 3300 ACAGACCACC CAGTTTTTAT ATGGGTCTTT ACTCCTTCTT TGTGTTTGCT GCTTTCATAT 3360 TCATGAATGG CCAGTTCACC ATACTTTGCG CAATGGGTAT TATGGCATCG AAATGGTTAA 3420 ATTTGAGGGC TGTGAAAAGA ATTTTACACA CTCCAATGTC ATACATAGAT ACCACACCTT 3480 TGGGACGTAT TCTGAACAGA TTCACAAAAG ATACAGATAG CTTAGATAAT GAGTTAACCG 3540 AAAGTTTACG GTTGATGACA TCTCAATTTG CTAATATTGT AGGTGTTTGC GTCATGTGTA 3600 TTGTTTACTT GCCGTGGTTT GCTATCGCAA TTCCGTTTCT TTTGGTCATC TTTGTTCTGA 3660 TTGCTGATCA TTATCAGAGT TCTGGTAGAG AAATTAAAAG ACTTGAAGCT GTGCAACGGT 3720 CTTTTGTTTA CAATAATTTA AATGAAGTTT TGGGTGGGAT GGATACAATC AAAGCATACC 3780 GAAGTCAGGA ACGATTTTTG GCGAAATCAG ATTTTTTGAT CAACAAGATG AATGAGGCGG 3840 GATACCTTGT AGTTGTCCTG CAAAGATGGG TAGGTATTTT CCTTGATATG GTTGCTATCG 3900 CATTTGCACT AATTATTACG TTATTGTGTG TTACGAGAGC CTTTCCTATT TCCGCGGCTT 3960 CAGTTGGTGT TTTGTTGACT TATGTATTAC AATTGCCTGG TCTATTAAAT ACCATTTTAA 4020 GGGCAATGAC TCAAACAGAG AATGACATGA ATAGTGCCGA AAGATTGGTA ACATATGCAA 4080 CTGAACTACC ACTAGAGGCA TCCTATAGAA AGCCCGAAAT GACACCTCCA GAGTCATGGC 4140 CCTCAATGGG CGAAATAATT TTTGAAAATG TTGATTTTGC CTATAGACCT GGTTTACCTA 4200 TAGTTTTAAA AAATCTTAAC TTGAATATCA AGAGTGGGGA AAAAATTGGT ATCTGTGGTC 4260 GTACAGGTGC TGGTAAGTCC ACTATTATGA GTGCCCTTTA CAGGTTGAAT GAATTGACCG 4320 CAGGTAAAAT TTTAATTGAC AATGTTGATA TAAGTCAGCT GGGACTTTTC GATTTAAGAA 4380 GAAAATTAGC CATCATTCCA CAAGATCCAG TATTATTTAG GGGTACGATT CGCAAGAACT 4440 TAGATCCATT TAATGAGCGT ACAGATGACG AATTATGGGA TGCATTGGTG AGAGGTGGTG 4500 CTATCGCCAA GGATGACTTG CCGGAAGTGA AATTGCAAAA ACCTGATGAA AATGGTACTC 4560 ATGGTAAAAT GCATAAGTTC CATTTAGATC AAGCAGTGGA AGAAGAGGGC TCCAATTTCT 4620 CCTTAGGTGA GAGACAACTA TTAGCATTAA CAAGGGCATT GGTCCGCCAA TCAAAAATAT 4680 TGATTTTGGA TGAGGCTACA TCCTCAGTGG ACTACGAAAC GGATGGCAAA ATCCAAACAC 4740 GTATTGTTGA GGAATTTGGA GATTGTACAA TTTTGTGTAT TGCTCACAGA CTGAAGACCA 4800 TTGTAAATTA TGATCGTATT CTTGTTTTAG AGAAGGGTGA AGTCGCAGAA TTCGATACAC 4860 CATGGACGTT GTTTAGTCAA GAAGATAGTA TTTTCAGAAG CATGTGTTCT AGATCTGGTA 4920 TTGTGGAAAA TGATTTCGAG AACAGAAGTT AATTTATATT ATTTGTTGCA TGATTTTTCT 4980 CTTTTATTTA TTTATATGTT GCCGATGGTA CAAATTAGTA CTAGAAAAGA AAACCCACTA 5040 CTATGACTTG CAGAAAAAGT TATGTGTGCC ATAGATAGAT ATAATTGCAT ACCCACATCG 5100 TATACTCAAA ATTCCGAAAA GAACATTTCA TTTTTTATGA GGCAAACTGA ACAACGCTTC 5160 GGTCCTTTTT TCATTCTAGA AATATATATT TATACATCAT TTTCAGAAGA TATTCAAAGA 5220 ACTTATTGGG ATGTCTATTT ACTGAATAAA GTATACACAA AAAACGAATT TAAAATGGAA 5280 GGCATAAATA GAAAACTTAG AAGTGAAAAT CCTAAAACCG AAGGATATTT CAAATACGTA 5340

【００５４】配列番号：3 配列の長さ：1477 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Thr Ile Thr Val Gly Asp Ala Val Ser Glu Thr Glu Leu Glu 5 10 15 Asn Lys Ser Gln Asn Val Val Leu Ser Pro Lys Ala Ser Ala Ser 20 25 30 Ser Asp Ile Ser Thr Asp Val Asp Lys Asp Thr Ser Ser Ser Trp 35 40 45 Asp Asp Lys Ser Leu Leu Pro Thr Gly Glu Tyr Ile Val Asp Arg 50 55 60 Asn Lys Pro Gln Thr Tyr Leu Asn Ser Asp Asp Ile Glu Lys Val 65 70 75 Thr Glu Ser Asp Ile Phe Pro Gln Lys Arg Leu Phe Ser Phe Leu 80 85 90 His Ser Lys Lys Ile Pro Glu Val Pro Gln Thr Asp Asp Glu Arg 95 100 105 Lys Ile Tyr Pro Leu Phe His Thr Asn Ile Ile Ser Asn Met Phe 110 115 120 Phe Trp Trp Val Leu Pro Ile Leu Arg Val Gly Tyr Lys Arg Thr 125 130 135 Ile Gln Pro Asn Asp Leu Phe Lys Met Asp Pro Arg Met Ser Ile 140 145 150 Glu Thr Leu Tyr Asp Asp Phe Glu Lys Asn Met Ile Tyr Tyr Phe 155 160 165 Glu Lys Thr Arg Lys Lys Tyr Arg Lys Arg His Pro Glu Ala Thr 170 175 180 Glu Glu Glu Val Met Glu Asn Ala Lys Leu Pro Lys His Thr Val 185 190 195 Leu Arg Ala Leu Leu Phe Thr Phe Lys Lys Gln Tyr Phe Met Ser 200 205 210 Ile Val Phe Ala Ile Leu Ala Asn Cys Thr Ser Gly Phe Asn Pro 215 220 225 Met Ile Thr Lys Arg Leu Ile Glu Phe Val Glu Glu Lys Ala Ile 230 235 240 Phe His Ser Met His Val Asn Lys Gly Ile Gly Tyr Ala Ile Gly 245 250 255 Ala Cys Leu Met Met Phe Val Asn Gly Leu Thr Phe Asn His Phe 260 265 270 Phe His Thr Ser Gln Leu Thr Gly Val Gln Ala Lys Ser Ile Leu 275 280 285 Thr Lys Ala Ala Met Lys Lys Met Phe Asn Ala Ser Asn Tyr Ala 290 295 300 Arg His Cys Phe Pro Asn Gly Lys Val Thr Ser Phe Val Thr Thr 305 310 315 Asp Leu Ala Arg Ile Glu Phe Ala Leu Ser Phe Gln Pro Phe Leu 320 325 330 Ala Gly Phe Pro Ala Ile Leu Ala Ile Cys Ile Val Leu Leu Ile 335 340 345 Val Asn Leu Gly Pro Ile Ala Leu Val Gly Ile Gly Ile Phe Phe 350 355 360 Gly Gly Phe Phe Ile Ser Leu Phe Ala Phe Lys Leu Ile Leu Gly 365 370 375 Phe Arg Ile Ala Ala Asn Ile Phe Thr Asp Ala Arg Val Thr Met 380 385 390 Met Arg Glu Val Leu Asn Asn Ile Lys Met Ile Lys Tyr Tyr Thr 395 400 405 Trp Glu Asp Ala Tyr Glu Lys Asn Ile Gln Asp Ile Arg Thr Lys 410 415 420 Glu Ile Ser Lys Val Arg Lys Met Gln Leu Ser Arg Asn Phe Leu 425 430 435 Ile Ala Met Ala Met Ser Leu Pro Ser Ile Ala Ser Leu Val Thr 440 445 450 Phe Leu Ala Met Tyr Lys Val Asn Lys Gly Gly Arg Gln Pro Gly 455 460 465 Asn Ile Phe Ala Ser Leu Ser Leu Phe Gln Val Leu Ser Leu Gln 470 475 480 Met Phe Phe Leu Pro Ile Ala Ile Gly Thr Gly Ile Asp Met Ile 485 490 495 Ile Gly Leu Gly Arg Leu Gln Ser Leu Leu Glu Ala Pro Glu Asp 500 505 510 Asp Pro Asn Gln Met Ile Glu Met Lys Pro Ser Pro Gly Phe Asp 515 520 525 Pro Lys Leu Ala Leu Lys Met Thr His Cys Ser Phe Glu Trp Glu 530 535 540 Asp Tyr Glu Leu Asn Asp Ala Ile Glu Glu Ala Lys Gly Glu Ala 545 550 555 Lys Asp Glu Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys Arg Lys Asp Thr Trp 560 565 570 Gly Lys Pro Ser Ala Ser Thr Asn Lys Ala Lys Arg Leu Asp Asn 575 580 585 Met Leu Lys Asp Arg Asp Gly Pro Glu Asp Leu Glu Lys Thr Ser 590 595 600 Phe Arg Gly Phe Lys Asp Leu Asn Phe Asp Ile Lys Lys Gly Glu 605 610 615 Phe Ile Met Ile Thr Gly Pro Ile Gly Thr Gly Lys Ser Ser Leu 620 625 630 Leu Asn Ala Met Ala Gly Ser Met Arg Lys Ile Asp Gly Lys Val 635 640 645 Glu Val Asn Gly Asp Leu Leu Met Cys Gly Tyr Pro Trp Ile Gln 650 655 660 Asn Ala Ser Val Arg Asp Asn Ile Ile Phe Gly Ser Pro Phe Asn 665 670 675 Lys Glu Lys Tyr Asp Glu Val Val Arg Val Cys Ser Leu Lys Ala 680 685 690 Asp Leu Asp Ile Leu Pro Ala Gly Asp Met Thr Glu Ile Gly Glu 695 700 705 Arg Gly Ile Thr Leu Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Ile Asn Leu 710 715 720 Ala Arg Ser Val Tyr Lys Lys Lys Asp Ile Tyr Val Phe Asp Asp 725 730 735 Val Leu Ser Ala Val Asp Ser Arg Val Gly Lys His Ile Met Asp 740 745 750 Glu Cys Leu Thr Gly Met Leu Ala Asn Lys Thr Arg Ile Leu Ala 755 760 765 Thr His Gln Leu Ser Leu Ile Glu Arg Ala Ser Arg Val Ile Val 770 775 780 Leu Gly Thr Asp Gly Gln Val Asp Ile Gly Thr Val Asp Glu Leu 785 790 795 Lys Ala Arg Asn Gln Thr Leu Ile Asn Leu Leu Gln Phe Ser Ser 800 805 810 Gln Asn Ser Glu Lys Glu Asp Glu Glu Gln Glu Ala Val Val Ser 815 820 825 Gly Glu Leu Gly Gln Leu Lys Tyr Glu Pro Glu Val Lys Glu Leu 830 835 840 Thr Glu Leu Lys Lys Lys Ala Thr Glu Met Ser Gln Thr Ala Asn 845 850 855 Ser Gly Lys Ile Val Ala Asp Gly His Thr Ser Ser Lys Glu Glu 860 865 870 Arg Ala Val Asn Ser Ile Ser Leu Lys Ile Tyr Arg Glu Tyr Ile 875 880 885 Lys Ala Ala Val Gly Lys Trp Gly Phe Ile Ala Leu Pro Leu Tyr 890 895 900 Ala Ile Leu Val Val Gly Thr Thr Phe Cys Ser Leu Phe Ser Ser 905 910 915 Val Trp Leu Ser Tyr Trp Thr Glu Asn Lys Phe Lys Asn Arg Pro 920 925 930 Pro Ser Phe Tyr Met Gly Leu Tyr Ser Phe Phe Val Phe Ala Ala 935 940 945 Phe Ile Phe Met Asn Gly Gln Phe Thr Ile Leu Cys Ala Met Gly 950 955 960 Ile Met Ala Ser Lys Trp Leu Asn Leu Arg Ala Val Lys Arg Ile 965 970 975 Leu His Thr Pro Met Ser Tyr Ile Asp Thr Thr Pro Leu Gly Arg 980 985 990 Ile Leu Asn Arg Phe Thr Lys Asp Thr Asp Ser Leu Asp Asn Glu 995 1000 1005 Leu Thr Glu Ser Leu Arg Leu Met Thr Ser Gln Phe Ala Asn Ile 1010 1015 1020 Val Gly Val Cys Val Met Cys Ile Val Tyr Leu Pro Trp Phe Ala 1025 1030 1035 Ile Ala Ile Pro Phe Leu Leu Val Ile Phe Val Leu Ile Ala Asp 1040 1045 1050 His Tyr Gln Ser Ser Gly Arg Glu Ile Lys Arg Leu Glu Ala Val 1055 1060 1065 Gln Arg Ser Phe Val Tyr Asn Asn Leu Asn Glu Val Leu Gly Gly 1070 1075 1080 Met Asp Thr Ile Lys Ala Tyr Arg Ser Gln Glu Arg Phe Leu Ala 1085 1090 1095 Lys Ser Asp Phe Leu Ile Asn Lys Met Asn Glu Ala Gly Tyr Leu 1100 1105 1110 Val Val Val Leu Gln Arg Trp Val Gly Ile Phe Leu Asp Met Val 1115 1120 1125 Ala Ile Ala Phe Ala Leu Ile Ile Thr Leu Leu Cys Val Thr Arg 1130 1135 1140 Ala Phe Pro Ile Ser Ala Ala Ser Val Gly Val Leu Leu Thr Tyr 1145 1150 1155 Val Leu Gln Leu Pro Gly Leu Leu Asn Thr Ile Leu Arg Ala Met 1160 1165 1170 Thr Gln Thr Glu Asn Asp Met Asn Ser Ala Glu Arg Leu Val Thr 1175 1180 1185 Tyr Ala Thr Glu Leu Pro Leu Glu Ala Ser Tyr Arg Lys Pro Glu 1190 1195 1200 Met Thr Pro Pro Glu Ser Trp Pro Ser Met Gly Glu Ile Ile Phe 1205 1210 1215 Glu Asn Val Asp Phe Ala Tyr Arg Pro Gly Leu Pro Ile Val Leu 1220 1225 1230 Lys Asn Leu Asn Leu Asn Ile Lys Ser Gly Glu Lys Ile Gly Ile 1235 1240 1245 Cys Gly Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Ile Met Ser Ala Leu 1250 1255 1260 Tyr Arg Leu Asn Glu Leu Thr Ala Gly Lys Ile Leu Ile Asp Asn 1265 1270 1275 Val Asp Ile Ser Gln Leu Gly Leu Phe Asp Leu Arg Arg Lys Leu 1280 1285 1290 Ala Ile Ile Pro Gln Asp Pro Val Leu Phe Arg Gly Thr Ile Arg 1295 1300 1305 Lys Asn Leu Asp Pro Phe Asn Glu Arg Thr Asp Asp Glu Leu Trp 1310 1315 1320 Asp Ala Leu Val Arg Gly Gly Ala Ile Ala Lys Asp Asp Leu Pro 1325 1330 1335 Glu Val Lys Leu Gln Lys Pro Asp Glu Asn Gly Thr His Gly Lys 1340 1345 1350 Met His Lys Phe His Leu Asp Gln Ala Val Glu Glu Glu Gly Ser 1355 1360 1365 Asn Phe Ser Leu Gly Glu Arg Gln Leu Leu Ala Leu Thr Arg Ala 1370 1375 1380 Leu Val Arg Gln Ser Lys Ile Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser 1385 1390 1395 Ser Val Asp Tyr Glu Thr Asp Gly Lys Ile Gln Thr Arg Ile Val 1400 1405 1410 Glu Glu Phe Gly Asp Cys Thr Ile Leu Cys Ile Ala His Arg Leu 1415 1420 1425 Lys Thr Ile Val Asn Tyr Asp Arg Ile Leu Val Leu Glu Lys Gly 1430 1435 1440 Glu Val Ala Glu Phe Asp Thr Pro Trp Thr Leu Phe Ser Gln Glu 1445 1450 1455 Asp Ser Ile Phe Arg Ser Met Cys Ser Arg Ser Gly Ile Val Glu 1460 1465 1470 Asn Asp Phe Glu Asn Arg Ser 1475

【００５５】配列番号：4 配列の長さ：1512 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： GGATCCCACG TGCTTGCTAA ACTTCACCCT TCACAAAATG GATACCCCAT TTTCCGTCAA 60 TAATCTTCTG CTTTCTCTGC GTGTCCAATT CCTCTGATAT TTTGCTTTCC TTTCCGTTCA 120 GCCTACCAAG AATTCGCTGG AAGACATCCA ACCCTGCGCA TTCACCATTA TCAAACTCGT 180 CTTTTTTGTC TTTACGTTTT AATTTAGCAC CGAGCCCAAC GTTGTCGTCC TTAATTGACA 240 CTTTGATATG CGAAGTGTTC GAATTCATGG GGGATAACCC CAGACCCATA CCGGGTTTCC 300 ATCCAAACTT TTCTAGAAAT TGGTGCCCGA ATCTCGAGGT GTCGTTACTC CATGCCGTAT 360 TTCTGGGGTC TAAACCAAAC CGCTGTTTGG TTCTTGTAGC TGCCAAACCC ATTCTGCTTC 420 TTTGTTTAAT GGTGTAAGCT GCCTATATGT TACTATTGAG TACTCATCTC ATCGCTTCTT 480 TCAGAACAAA ATTTTTCATA TTTTTTTTTT TTCCTTTTCT TTTTTTTTTT TTCTTTGACT 540 GTTACCCGGT TGTTTATATT TGTAGGAAAA CAACAACGAC AGAGAAAATA TCCTTGCAGT 600 GGCGGCTAAT TTGTTAGTTG ACTGATTGAT CACCTTCACT TATTAAAGTA AAATCAGCAT 660 ACAAGAGATC AGAAGGGAGA AAGAGAGTGG GCAAGGCTAT AGTACTTTGA AGAAAGCATC 720 TTTGAACCGA CTAGTTCTCT TCACAAGCAA AATCTATATG ACTAACCGCA AGGGGCAAAG 780 GGTTGTGAGA GGGCCCGTCT TTCTCCCGCT ATAGCCGTCA CTGGTATCCC TCCTGGCTGC 840 ACAAATCCGA TAGAAAGGGG AAGAAGGAAG TTTAGTGCCA CCTTATAGCA CGCAGTTACT 900 GTTTACGCTA AGGAGAGGCA TACTCAATTT TTATTAGTCG CCTTCTTTAG TTGCTGCGTT 960 TTTATCCACG GTTCTCTACT AAATGCTTGC GATAAGCGCT TCTATTTTCC TCCCCACCGC 1020 GAGGCGGAAA TGGCACATTT TTTTTCTTTT GCTTCTGTGC TTTTGCTGTA ATTTTTGGCA 1080 TGTGCTATTG TATGAAGATA ACGCGTGGTT CCGTGGAAAT AGCCGGAAAT TTTGCCGGGA 1140 ATATGACGGA CATGATTTAA CACCCGTGGA AATGAAAAAA GCCAAGGTAA GAAAGTGGCA 1200 ATATTTTTCC TACAAATAGA TCTGCTGTCC CTTAGATGAT TACCATACAT ATATATATTT 1260 ATTACACACA TCTGTCAGAG GTAGCTAGCG AAGGTGTCAC TGAAATATTT TTTGTTCCAG 1320 TTAGTATAAA TACGGAGGTA GAACAGCTCT CCGCGTGTAT ATCTTTTTTT GCGCTATACA 1380 AGAACAGGAA GAACGCATTT CCATACCTTT TTCTCCTTAC AGGTGCCCTC TGAGTAGTGT 1440 CACGAACGAG GAAAAAGATT AATATTACTG TTTTTATATT CAAAAAGAGT AAAGCCGTTG 1500 CTATATACGA AT 1512

【００５６】配列番号：5 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTGGAAGCTT TCCAACCCTG CGCATTCAC 29

【００５７】配列番号：6 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AACTGGATCC CCCACGGTAA TCGTC 25

【００５８】配列番号：7 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGTACCCGGG AAAATGATTT CGAGAACAG 29

【００５９】配列番号：8 配列の長さ：926 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： TAATTTATAT TATTTGTTGC ATGATTTTTC TCTTTTATTT ATTTATATGT TGCCGATGGT 60 ACAAATTAGT ACTAGAAAAG AAAACCCACT ACTATGACTT GCAGAAAAAG TTATGTGTGC 120 CATAGATAGA TATAATTGCA TACCCACATC GTATACTCAA AATTCCGAAA AGAACATTTC 180 ATTTTTTATG AGGCAAACTG AACAACGCTT CGGTCCTTTT TTCATTCTAG AAATATATAT 240 TTATACATCA TTTTCAGAAG ATATTCAAAG AACTTATTGG GATGTCTATT TACTGAATAA 300 AGTATACACA AAAAACGAAT TTAAAATGGA AGGCATAAAT AGAAAACTTA GAAGTGAAAA 360 TCCTAAAACC GAAGGATATT TCAAATACGT AAAAGAAGTG AAAGATAAAA TAAAGCCCTA 420 AATAAGGAAG AAAAGAAGGG ATAACATTTT TTTTTGTTAC TTTTTGCTTA TTCCTCACCT 480 AAACAGAAGG AAAAAGCCAT TCTTGTTTAA AGAGTATTTT TAAAGCGTTC ATGAAAAGTC 540 ACAGTCCAAG GAGTATTTCA AATTGTCACT TGAAGTGAAA ACACCCCAGT GCTTCTCGAC 600 ATCAGAGGTA CCAGAGGTGT TTGGCTTCCA ATCTTCATCA AAGGCTTCAA AAACAATAAC 660 GTTAACACCC CAAGCTCTCA TGGAACAGAT ACCTTCTTTC CAGAATTGTT TGGCGTTGTC 720 AACAGATGGG TAAGAACTTT CAAAGTTGGT ACCATCAGTT GGCCAACCGG TCTCACCAAC 780 CCAGAAGGTA ATATCGGTAG AACCTTTAGT AGATTGGATA ACCTGTAGAG CTTGCATAAT 840 ATCATCAAAG AATGAGTAAG AGGCATTTTG CATGGTTTGA CCTTGCCAGT AGGAGAACGC 900 GTTAGCCATA ACAAAATCGG AAGCTT 926

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｓ．セレビシエの野生株とオーレオバシジン耐
性株のscaur2遺伝子のノーザンハイブリダイゼーション
の結果を示す図である。

【図２】scaur2遺伝子の制限酵素地図を示す図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１で表される塩基配列
   に含有されていることを特徴とするプロモーター。
2. 【請求項２】 ＰＤＲ１遺伝子産物により転写調節可能
   な請求項１記載のプロモーター。
3. 【請求項３】 請求項１記載の塩基配列にハイブリダイ
   ズ可能で、かつ、プロモーター活性を有することを特徴
   とするプロモーター。