JP3369030B2 - 染色体組込型ベクター - Google Patents
染色体組込型ベクターInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、真菌細胞の染色体に組
込むことができ、かつ、特異的培地内に置かれた該細胞
の中から、形質転換体を容易に検出することができる、
宿主に新規な優性の遺伝的マーカーを付与しうるベクタ
ー、該ベクターを用いるマーカー付与形質転換体の創製
方法、及び該ベクターで形質転換させた形質転換体に関
する。
込むことができ、かつ、特異的培地内に置かれた該細胞
の中から、形質転換体を容易に検出することができる、
宿主に新規な優性の遺伝的マーカーを付与しうるベクタ
ー、該ベクターを用いるマーカー付与形質転換体の創製
方法、及び該ベクターで形質転換させた形質転換体に関
する。
【０００２】
【従来の技術】有用遺伝子をサッカロミセス セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae、以下、Ｓ．セレビシエ
と略記する）、シゾサッカロミセス ポンベ（Schizosa
ccharomyces pombe 、以下、Schizo. ポンベと略記す
る）、アスペルギルス ニドランス（Aspergillus nidu
lans、以下、Ａ．ニドランスと略記する）等の実験室内
で使用される一倍体の真菌細胞に導入する技術は知られ
ている。真菌細胞によるプラスミドＤＮＡの取込み及び
定着の成功は比較的まれにしか生じないため、形質転換
体の同定には選択マーカーが必要である。最も一般的に
は、選択は宿主細胞に栄養要求性突然変異を導入するこ
とによって達成される。一般に使用される突然変異は、
例えばＳ．セレビシエでは、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｔｒ
ｐ１及びｈｉｓ３である。プラスミドは、これらの遺伝
子の一つの野生型コピーを有する。プラスミド上の野生
型コピーは宿主の染色体対立遺伝子に対して優性である
から、プラスミドの導入された細胞の選択は、栄養要求
性宿主細胞が要求する栄養素を含有しない最小培地によ
って達成される。形質転換体を選択するために、薬剤耐
性を使用する報告もある。その数は少なく、ネオマイシ
ン同族体であるＧ４１８、ハイグロマイシンやセルレニ
ン等の抗生物質に対して耐性の遺伝子を含有する複製ベ
クター、染色体組込型ベクターが報告されている。複製
ベクターは細胞内で作用するＤＮＡ複製開始部位を有
し、このプラスミドは環状エピソームとして染色体外に
保持されるが、細胞の増殖に伴って数％の割合で消失し
続ける。組込型ベクターは、宿主細胞の染色体に挿入さ
れるため、安定して維持され、更に該配列を維持するた
めの選択機能を発揮させるための培地への薬剤の添加を
必要としない。工業用真菌の場合、付与された有用な形
質を安定に保持させる必要があり、このためには染色体
組込型ベクターが有用である。
エ（Saccharomyces cerevisiae、以下、Ｓ．セレビシエ
と略記する）、シゾサッカロミセス ポンベ（Schizosa
ccharomyces pombe 、以下、Schizo. ポンベと略記す
る）、アスペルギルス ニドランス（Aspergillus nidu
lans、以下、Ａ．ニドランスと略記する）等の実験室内
で使用される一倍体の真菌細胞に導入する技術は知られ
ている。真菌細胞によるプラスミドＤＮＡの取込み及び
定着の成功は比較的まれにしか生じないため、形質転換
体の同定には選択マーカーが必要である。最も一般的に
は、選択は宿主細胞に栄養要求性突然変異を導入するこ
とによって達成される。一般に使用される突然変異は、
例えばＳ．セレビシエでは、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｔｒ
ｐ１及びｈｉｓ３である。プラスミドは、これらの遺伝
子の一つの野生型コピーを有する。プラスミド上の野生
型コピーは宿主の染色体対立遺伝子に対して優性である
から、プラスミドの導入された細胞の選択は、栄養要求
性宿主細胞が要求する栄養素を含有しない最小培地によ
って達成される。形質転換体を選択するために、薬剤耐
性を使用する報告もある。その数は少なく、ネオマイシ
ン同族体であるＧ４１８、ハイグロマイシンやセルレニ
ン等の抗生物質に対して耐性の遺伝子を含有する複製ベ
クター、染色体組込型ベクターが報告されている。複製
ベクターは細胞内で作用するＤＮＡ複製開始部位を有
し、このプラスミドは環状エピソームとして染色体外に
保持されるが、細胞の増殖に伴って数％の割合で消失し
続ける。組込型ベクターは、宿主細胞の染色体に挿入さ
れるため、安定して維持され、更に該配列を維持するた
めの選択機能を発揮させるための培地への薬剤の添加を
必要としない。工業用真菌の場合、付与された有用な形
質を安定に保持させる必要があり、このためには染色体
組込型ベクターが有用である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】真菌は清酒、ビール、
ワイン等の酒類、みそ、醤油等の発酵食品に広範に利用
されている。これらの工業用に使用される真菌の育種に
おいても、望ましい形質を付与するために遺伝子工学的
手法は極めて有効であり、形質転換体を効率良く選択す
るために使用可能な選択マーカーが必要である。一倍体
の実験室酵母等で有効である栄養要求性マーカーについ
ては、工業用酵母は通常二倍体又は多倍数体であるた
め、これら酵母に栄養要求性突然変異を導入することは
困難であり、また変異処理を行うと他の遺伝子にも変異
が生じている可能性が極めて高く、目的の栄養要求性の
変異のみを導入した形質転換体の創製は極めて困難であ
る。薬剤耐性を使用することは、染色体数、特定突然変
異の存在、不在に関係なく任意の酵母種に安定な形質転
換体の選択を可能にするが、これらの工業用真菌は、Ｇ
４１８やハイグロマイシン等の抗生物質に対して、非感
受性のものが多く、これらの抗生物質の耐性遺伝子は使
用できない。また、これらの耐性遺伝子は、原核生物で
ある細菌に由来する遺伝子、蛋白質であり、酵母を始め
とする真菌には対応するものは存在せず、これら異種遺
伝子を組込んだ真菌細胞の利用には制限が多い。セルレ
ニン耐性遺伝子（ＰＤＲ４）は、Ｓ．セレビシエ由来の
ものであり、醸造用酵母を始めとするＳ．セレビシエの
形質転換には利用可能であるが、セルレニン以外の薬剤
に対しても耐性を付与するため、実用上問題となる可能
性がある。したがって、今後より優れた性質を有する
Ｓ．セレビシエを始めとする工業用真菌を育種するため
には、これだけでは不十分であり、真菌が本来持ってい
る遺伝子を利用した、薬剤耐性マーカーの開発が必要と
されている。本発明は、上記のような現状を考慮し、真
菌の形質転換体に新たな薬剤耐性の選択マーカーを付与
しうる、新たな染色体組込型ベクター、及び該ベクター
で形質転換された形質転換体を提供することを目的とす
る。
ワイン等の酒類、みそ、醤油等の発酵食品に広範に利用
されている。これらの工業用に使用される真菌の育種に
おいても、望ましい形質を付与するために遺伝子工学的
手法は極めて有効であり、形質転換体を効率良く選択す
るために使用可能な選択マーカーが必要である。一倍体
の実験室酵母等で有効である栄養要求性マーカーについ
ては、工業用酵母は通常二倍体又は多倍数体であるた
め、これら酵母に栄養要求性突然変異を導入することは
困難であり、また変異処理を行うと他の遺伝子にも変異
が生じている可能性が極めて高く、目的の栄養要求性の
変異のみを導入した形質転換体の創製は極めて困難であ
る。薬剤耐性を使用することは、染色体数、特定突然変
異の存在、不在に関係なく任意の酵母種に安定な形質転
換体の選択を可能にするが、これらの工業用真菌は、Ｇ
４１８やハイグロマイシン等の抗生物質に対して、非感
受性のものが多く、これらの抗生物質の耐性遺伝子は使
用できない。また、これらの耐性遺伝子は、原核生物で
ある細菌に由来する遺伝子、蛋白質であり、酵母を始め
とする真菌には対応するものは存在せず、これら異種遺
伝子を組込んだ真菌細胞の利用には制限が多い。セルレ
ニン耐性遺伝子（ＰＤＲ４）は、Ｓ．セレビシエ由来の
ものであり、醸造用酵母を始めとするＳ．セレビシエの
形質転換には利用可能であるが、セルレニン以外の薬剤
に対しても耐性を付与するため、実用上問題となる可能
性がある。したがって、今後より優れた性質を有する
Ｓ．セレビシエを始めとする工業用真菌を育種するため
には、これだけでは不十分であり、真菌が本来持ってい
る遺伝子を利用した、薬剤耐性マーカーの開発が必要と
されている。本発明は、上記のような現状を考慮し、真
菌の形質転換体に新たな薬剤耐性の選択マーカーを付与
しうる、新たな染色体組込型ベクター、及び該ベクター
で形質転換された形質転換体を提供することを目的とす
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、宿主真菌用染色体組込型ベクター
に関し、下記から選択されるオーレオバシジン耐性遺伝
子を含有することを特徴とする： （１）配列表の配列番号２若しくは配列番号６のアミノ
酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、 （２）配列表の配列番号２の２４０番目に相当する部位
以外のアミノ酸配列に１〜数個の置換、挿入及び欠失の
少なくとも一つを施すことにより得られるアミノ酸配列
を有し、かつオーレオバシジン耐性付与活性を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子、（３） 配列表の配列番号６の１５８番目に相当する部位
以外のアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の置換、
挿入及び欠失の少なくとも一つを施すことにより得られ
るアミノ酸配列を有し、かつオーレオバシジン耐性付与
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、 （４）配列表の配列番号１若しくは配列番号５の塩基配
列を有する遺伝子、 （５）配列表の配列番号１若しくは配列番号５の塩基配
列に厳密な条件においてハイブリダイズ可能であり、か
つオーレオバシジン耐性付与活性を有するタンパク質を
コードする遺伝子。かかる染色体組込型ベクターは異種
の遺伝子を含有する場合がある。本発明の第２の発明
は、オーレオバシジン耐性形質転換体の創製方法に関
し、下記工程を包含することを特徴とする。（Ａ） 下記から選択されるオーレオバシジン耐性遺伝
子を含有する複製ベクターを得る工程、（１） 配列表の配列番号２若しくは配列番号６のアミ
ノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、 （２） 配列表の配列番号２の２４０番目に相当する部
位以外のアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の置
換、挿入及び欠失の少なくとも一つを施すことにより得
られるアミノ酸配列を有し、かつオーレオバシジン耐性
付与活性を有するタ ンパク質をコードする遺伝子、 （３） 配列表の配列番号６の１５８番目に相当する部
位以外のアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の置
換、挿入及び欠失の少なくとも一つを施すことにより得
られるアミノ酸配列を有し、かつオーレオバシジン耐性
付与活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、 （４） 配列表の配列番号１若しくは５の塩基配列を有
する遺伝子、 （５） 配列表の配列番号１若しくは５の塩基配列に厳
密な条件においてハイブリダイズ可能であり、かつオー
レオバシジン耐性付与活性を有するタンパク質をコード
する遺伝子、 （Ｂ） 上記工程で得られた複製ベクター中のオーレオ
バシジン耐性遺伝子の１ヵ所で開裂し、宿主真菌用染色
体組込型ベクターを得る工程、（Ｃ） 上記工程で得られた宿主真菌用染色体組込型ベ
クターを宿主真菌の染色体に組込む工程、（Ｄ） オーレオバシジン耐性に形質転換された宿主を
オーレオバシジン存在下で選択する工程。このオーレオ
バシジン耐性形質転換体の創製方法において複製ベクタ
ーは異種の遺伝子を含有する場合がある。更に、本発明
の第３の発明は形質転換体に関し、本発明の第２の発明
の創製方法で得られるものであることを特徴とする。
発明の第１の発明は、宿主真菌用染色体組込型ベクター
に関し、下記から選択されるオーレオバシジン耐性遺伝
子を含有することを特徴とする： （１）配列表の配列番号２若しくは配列番号６のアミノ
酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、 （２）配列表の配列番号２の２４０番目に相当する部位
以外のアミノ酸配列に１〜数個の置換、挿入及び欠失の
少なくとも一つを施すことにより得られるアミノ酸配列
を有し、かつオーレオバシジン耐性付与活性を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子、（３） 配列表の配列番号６の１５８番目に相当する部位
以外のアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の置換、
挿入及び欠失の少なくとも一つを施すことにより得られ
るアミノ酸配列を有し、かつオーレオバシジン耐性付与
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、 （４）配列表の配列番号１若しくは配列番号５の塩基配
列を有する遺伝子、 （５）配列表の配列番号１若しくは配列番号５の塩基配
列に厳密な条件においてハイブリダイズ可能であり、か
つオーレオバシジン耐性付与活性を有するタンパク質を
コードする遺伝子。かかる染色体組込型ベクターは異種
の遺伝子を含有する場合がある。本発明の第２の発明
は、オーレオバシジン耐性形質転換体の創製方法に関
し、下記工程を包含することを特徴とする。（Ａ） 下記から選択されるオーレオバシジン耐性遺伝
子を含有する複製ベクターを得る工程、（１） 配列表の配列番号２若しくは配列番号６のアミ
ノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、 （２） 配列表の配列番号２の２４０番目に相当する部
位以外のアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の置
換、挿入及び欠失の少なくとも一つを施すことにより得
られるアミノ酸配列を有し、かつオーレオバシジン耐性
付与活性を有するタ ンパク質をコードする遺伝子、 （３） 配列表の配列番号６の１５８番目に相当する部
位以外のアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の置
換、挿入及び欠失の少なくとも一つを施すことにより得
られるアミノ酸配列を有し、かつオーレオバシジン耐性
付与活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、 （４） 配列表の配列番号１若しくは５の塩基配列を有
する遺伝子、 （５） 配列表の配列番号１若しくは５の塩基配列に厳
密な条件においてハイブリダイズ可能であり、かつオー
レオバシジン耐性付与活性を有するタンパク質をコード
する遺伝子、 （Ｂ） 上記工程で得られた複製ベクター中のオーレオ
バシジン耐性遺伝子の１ヵ所で開裂し、宿主真菌用染色
体組込型ベクターを得る工程、（Ｃ） 上記工程で得られた宿主真菌用染色体組込型ベ
クターを宿主真菌の染色体に組込む工程、（Ｄ） オーレオバシジン耐性に形質転換された宿主を
オーレオバシジン存在下で選択する工程。このオーレオ
バシジン耐性形質転換体の創製方法において複製ベクタ
ーは異種の遺伝子を含有する場合がある。更に、本発明
の第３の発明は形質転換体に関し、本発明の第２の発明
の創製方法で得られるものであることを特徴とする。
【０００５】オーレオバシジン〔特開平２−１３８２９
６号、同３−２２９９５号、同３−２２０１９９号、同
５−２７９３８４号、特願平４−３０３１７７号、ジャ
ーナル オブ アンチバイオチクス（Ｊ．Antibiotic
s)、第４４巻、第９号、第９１９〜９２４頁、同第４４
巻、第９号、第９２５〜９３３頁、同第４４巻、第１１
号、第１１８７〜１１９８頁（１９９１）〕は、オーレ
オバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans)
No.Ｒ１０６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９３８）の発酵生
産物として得られる、環状のデプシペプチドであり、他
の抗真菌剤とは構造的に全く異なる。更に、オーレオバ
シジンの中で代表的な化合物であるオーレオバシジンＡ
は、下記表１及び表２に示したように、カンジダ アル
ビカンス（Candida albicans、以下、Ｃ．アルビカンス
と略記する）を始めとする種々のカンジダ属酵母、クリ
プトコッカス ネオホルマンス（Cryptococcus neoform
ans)、ヒストプラズマ カプスラタム（Histoplasma ca
psulatum) 、ブラストマイセス デルマチチジス（Blas
tomyces dermatitidis) 、アスペルギルス（Aspergillu
s)属真菌に対して、強い抗真菌活性を有する（特開平２
−１３８２９６号）が、毒性が非常に弱く、優れた選択
毒性を有する抗真菌剤である。
６号、同３−２２９９５号、同３−２２０１９９号、同
５−２７９３８４号、特願平４−３０３１７７号、ジャ
ーナル オブ アンチバイオチクス（Ｊ．Antibiotic
s)、第４４巻、第９号、第９１９〜９２４頁、同第４４
巻、第９号、第９２５〜９３３頁、同第４４巻、第１１
号、第１１８７〜１１９８頁（１９９１）〕は、オーレ
オバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans)
No.Ｒ１０６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９３８）の発酵生
産物として得られる、環状のデプシペプチドであり、他
の抗真菌剤とは構造的に全く異なる。更に、オーレオバ
シジンの中で代表的な化合物であるオーレオバシジンＡ
は、下記表１及び表２に示したように、カンジダ アル
ビカンス（Candida albicans、以下、Ｃ．アルビカンス
と略記する）を始めとする種々のカンジダ属酵母、クリ
プトコッカス ネオホルマンス（Cryptococcus neoform
ans)、ヒストプラズマ カプスラタム（Histoplasma ca
psulatum) 、ブラストマイセス デルマチチジス（Blas
tomyces dermatitidis) 、アスペルギルス（Aspergillu
s)属真菌に対して、強い抗真菌活性を有する（特開平２
−１３８２９６号）が、毒性が非常に弱く、優れた選択
毒性を有する抗真菌剤である。
【０００６】以下、本明細書において、カンジダを
Ｃ．、クリプトコッカスをＣｒ．、アスペルギルスを
Ａ．と略記する。
Ｃ．、クリプトコッカスをＣｒ．、アスペルギルスを
Ａ．と略記する。
【０００７】
【表１】
表 １
───────────────────────────────────
試 験 菌 ＴＩＭＭ番号 ＭＩＣ（μｇ／ml）
───────────────────────────────────
Ｃ．アルビカンス ０１３６ ≦０．０４
Ｃ．アルビカンス バリアント
ステラトイデア １３０８ ≦０．０４
Ｃ．トロピカリス ０３１２ ０．０８
Ｃ．ケフィール ０２９８ ０．１６
Ｃ．パラプシロシス ０２８７ ０．１６
Ｃ．クルセイ ０２７０ ≦０．０４
Ｃ．ギリエルモンジ ０２５７ ０．０８
Ｃ．グラブラータ １０６２ ≦０．０４
Ｃｒ．ネオホルマンス ０３５４ ０．６３
Ｃｒ．テレウス ０４２４ ０．３１
ロドトルラ ルブラ ０９２３ ０．６３
Ａ．フミガタス ００６３ ２０
Ａ．クラバタス ００５６ ０．１６
───────────────────────────────────
【０００８】
【表２】
表 ２
────────────────────────────────────
試 験 菌 ＴＩＭＭ番号 ＭＩＣ（μｇ／ml）
────────────────────────────────────
Ａ．ニドランス ０１１２ ０．１６
Ａ．テレウス ０１２０ ５
ペニシリウム コムュン １３３１ １．２５
トリコフィトン メンタグロフィテス １１８９ １０
エピデルモフィトン フロコッサム ０４３１ ２．５
フォンセカエア ペドロソイ ０４８２ ０．３１
エキソフィアラ ベルネッキ １３３４ １．２５
クラドスポリウム バンチアヌム ０３４３ ０．６３
ヒストプラズマ カプスラタム ０７１３ ０．１６
パラコクシディオイデス ブラジリ
エンシス ０８８０ ０．３１
ジオトリカム カンディダム ０６９４ ０．６３
ブラストマイセス デルマチチジス ０１２６ ０．３１
────────────────────────────────────
【０００９】上記表１及び表２中、未記載の菌の原語を
以下にまとめて示す。Ｃ．アルビカンス バリアント
ステラトイデア（Ｃ．albicans var. stellatoidea) 、
Ｃ．ケフィール（Ｃ．kefyr)、Ｃ．パラプシロシス
（Ｃ．parapsilosis) 、Ｃ．クルセイ（Ｃ．krusei) 、
Ｃ．ギリエルモンジ（Ｃ．guilliermondii) 、Ｃ．グラ
ブラータ（Ｃ．glabrata) 、Ｃｒ．テレウス（Cr.terre
us) 、ロドトルラ ルブラ（Rhodotorula rubra)、Ａ．
フミガタス（Ａ．fumigatus)、Ａ．クラバタス（Ａ．cl
avatus) 、Ａ．ニドランス（Ａ．nidulans) 、Ａ．テレ
ウス（Ａ．terreus)、ペニシリウム コムュン（Penici
llium commune)、トリコフィトン メンタグロフィテス
（Trichophyton mentagrophytes)、エピデルモフィトン
フロコッサム（Epidermophyton floccosum) 、フォン
セカエア ペドロソイ（Fonsecaea pedrosoi) 、エキソ
フィアラ ベルネッキ（Exophiala werneckii)、クラド
スポリウム バンチアヌム（Cladosporium bantianum)
、パラコクシディオイデス ブラジリエンシス（Parac
occidioides brasiliensis)、ジオトリカム カンディ
ダム（Geotrichum candidum)。
以下にまとめて示す。Ｃ．アルビカンス バリアント
ステラトイデア（Ｃ．albicans var. stellatoidea) 、
Ｃ．ケフィール（Ｃ．kefyr)、Ｃ．パラプシロシス
（Ｃ．parapsilosis) 、Ｃ．クルセイ（Ｃ．krusei) 、
Ｃ．ギリエルモンジ（Ｃ．guilliermondii) 、Ｃ．グラ
ブラータ（Ｃ．glabrata) 、Ｃｒ．テレウス（Cr.terre
us) 、ロドトルラ ルブラ（Rhodotorula rubra)、Ａ．
フミガタス（Ａ．fumigatus)、Ａ．クラバタス（Ａ．cl
avatus) 、Ａ．ニドランス（Ａ．nidulans) 、Ａ．テレ
ウス（Ａ．terreus)、ペニシリウム コムュン（Penici
llium commune)、トリコフィトン メンタグロフィテス
（Trichophyton mentagrophytes)、エピデルモフィトン
フロコッサム（Epidermophyton floccosum) 、フォン
セカエア ペドロソイ（Fonsecaea pedrosoi) 、エキソ
フィアラ ベルネッキ（Exophiala werneckii)、クラド
スポリウム バンチアヌム（Cladosporium bantianum)
、パラコクシディオイデス ブラジリエンシス（Parac
occidioides brasiliensis)、ジオトリカム カンディ
ダム（Geotrichum candidum)。
【００１０】本発明者らは、先に特願平６−１０６１５
８号明細書に記載のようにSchizo．ポンベ、Ｓ．セレビ
シエ等の真菌がオーレオバシジンに感受性を示すことを
見出した。
８号明細書に記載のようにSchizo．ポンベ、Ｓ．セレビ
シエ等の真菌がオーレオバシジンに感受性を示すことを
見出した。
【００１１】
【表３】
表 ３
───────────────────────────────
試験菌及び試験細胞 ＭＩＣ（μｇ／ml）
───────────────────────────────
Schizo. ポンベ ０．０８
Ｓ．セレビシエ ０．３１
───────────────────────────────
【００１２】そして、Schizo. ポンベ、Ｓ．セレビシエ
等の感受性細胞に変異処理を施すことにより耐性細胞に
かえ、その耐性細胞よりオーレオバシジン耐性を付与す
る遺伝子（耐性遺伝子）、更に感受性細胞より対応する
オーレオバシジン感受性を付与する遺伝子（感受性遺伝
子）の単離に成功した。更に、本発明者らは、本遺伝子
のコードする蛋白質の存在を明らかにした。また、本遺
伝子を含有させた複製ベクターを作製し、該ベクターを
用いて形質転換した細胞を培養し、本遺伝子を発現させ
ることに成功した。更に、本遺伝子のＤＮＡ断片をプロ
ーブとして用いることによって、オーレオバシジンに感
受性の他の真菌より、新たにオーレオバシジン感受性に
関連する遺伝子を発見することに成功した。
等の感受性細胞に変異処理を施すことにより耐性細胞に
かえ、その耐性細胞よりオーレオバシジン耐性を付与す
る遺伝子（耐性遺伝子）、更に感受性細胞より対応する
オーレオバシジン感受性を付与する遺伝子（感受性遺伝
子）の単離に成功した。更に、本発明者らは、本遺伝子
のコードする蛋白質の存在を明らかにした。また、本遺
伝子を含有させた複製ベクターを作製し、該ベクターを
用いて形質転換した細胞を培養し、本遺伝子を発現させ
ることに成功した。更に、本遺伝子のＤＮＡ断片をプロ
ーブとして用いることによって、オーレオバシジンに感
受性の他の真菌より、新たにオーレオバシジン感受性に
関連する遺伝子を発見することに成功した。
【００１３】ここで、オーレオバシジンに感受性を有す
る表１及び表２に示した真菌、及び表３の真菌はオーレ
オバシジン感受性に関連する蛋白質及びその蛋白質をコ
ードする遺伝子を保有している。本発明におけるオーレ
オバシジン感受性に関連する蛋白質とは、オーレオバシ
ジンに対して感受性を示す真菌に含有される蛋白質であ
り、その蛋白質はオーレオバシジンに対して感受性又は
耐性を示すために必要とされる。当然、この蛋白質と３
５％以上のホモロジーを有する、同様の機能を有する蛋
白質も、オーレオバシジン感受性に関連する蛋白質に含
まれる。更に、これらの蛋白質を遺伝子工学的に変化さ
せた蛋白質もオーレオバシジン感受性に関連する蛋白質
に含まれる。オーレオバシジン感受性関連遺伝子とは、
これらのオーレオバシジン感受性に関連する蛋白質をコ
ードする遺伝子であり、感受性遺伝子及び耐性遺伝子が
含まれる。
る表１及び表２に示した真菌、及び表３の真菌はオーレ
オバシジン感受性に関連する蛋白質及びその蛋白質をコ
ードする遺伝子を保有している。本発明におけるオーレ
オバシジン感受性に関連する蛋白質とは、オーレオバシ
ジンに対して感受性を示す真菌に含有される蛋白質であ
り、その蛋白質はオーレオバシジンに対して感受性又は
耐性を示すために必要とされる。当然、この蛋白質と３
５％以上のホモロジーを有する、同様の機能を有する蛋
白質も、オーレオバシジン感受性に関連する蛋白質に含
まれる。更に、これらの蛋白質を遺伝子工学的に変化さ
せた蛋白質もオーレオバシジン感受性に関連する蛋白質
に含まれる。オーレオバシジン感受性関連遺伝子とは、
これらのオーレオバシジン感受性に関連する蛋白質をコ
ードする遺伝子であり、感受性遺伝子及び耐性遺伝子が
含まれる。
【００１４】オーレオバシジン感受性関連遺伝子を単離
するためには、まずオーレオバシジンに感受性の細胞
（野生株）より変異処理により耐性株を誘導し、この耐
性株の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡライブラリ
ーを作製し、このライブラリーの中から耐性を付与する
遺伝子（耐性遺伝子）をクローニングする。また、野生
株のＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーの
中に、耐性遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡ分子を単
離、クローニングすれば、感受性遺伝子を単離すること
ができる。
するためには、まずオーレオバシジンに感受性の細胞
（野生株）より変異処理により耐性株を誘導し、この耐
性株の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡライブラリ
ーを作製し、このライブラリーの中から耐性を付与する
遺伝子（耐性遺伝子）をクローニングする。また、野生
株のＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーの
中に、耐性遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡ分子を単
離、クローニングすれば、感受性遺伝子を単離すること
ができる。
【００１５】変異処理の方法としては、エチルメタンス
ルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の薬剤処理による方
法、紫外線又は放射線により処理する方法等がある。耐
性を獲得した変異株を選択するためには、変異処理した
細胞を適当な濃度のオーレオバシジンを含有する栄養培
地で、適当な条件で培養すれば、耐性を獲得した株を選
択することができる。変異処理の方法、条件により、得
られる耐性株は異なる可能性がある。
ルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の薬剤処理による方
法、紫外線又は放射線により処理する方法等がある。耐
性を獲得した変異株を選択するためには、変異処理した
細胞を適当な濃度のオーレオバシジンを含有する栄養培
地で、適当な条件で培養すれば、耐性を獲得した株を選
択することができる。変異処理の方法、条件により、得
られる耐性株は異なる可能性がある。
【００１６】オーレオバシジン（aureobasidin) 感受性
関連遺伝子（aur)の代表例として、aur１遺伝子があ
る。 aur１遺伝子の代表例としては、Schizo. ポンベよ
り単離した spaur１遺伝子、及びＳ．セレビシエより単
離した scaur１遺伝子がある。以下、本発明者らが耐性
の変異株より単離した耐性遺伝子（ spaur１R 、 scaur
１R ）、及び感受性の野生株より単離した感受性遺伝子
（ spaur１S 、 scaur１S ) について説明する。
関連遺伝子（aur)の代表例として、aur１遺伝子があ
る。 aur１遺伝子の代表例としては、Schizo. ポンベよ
り単離した spaur１遺伝子、及びＳ．セレビシエより単
離した scaur１遺伝子がある。以下、本発明者らが耐性
の変異株より単離した耐性遺伝子（ spaur１R 、 scaur
１R ）、及び感受性の野生株より単離した感受性遺伝子
（ spaur１S 、 scaur１S ) について説明する。
【００１７】なお、添付図面の図３にオーレオバシジン
感受性関連遺伝子の spaur１R 及びspaur１S の制限酵
素地図を、図４に scaur１R 及び scaur１S の制限酵素
地図をそれぞれ示す。
感受性関連遺伝子の spaur１R 及びspaur１S の制限酵
素地図を、図４に scaur１R 及び scaur１S の制限酵素
地図をそれぞれ示す。
【００１８】オーレオバシジンに感受性であるSchizo.
ポンベをＥＭＳにより変異処理し、得られた耐性菌のゲ
ノムライブラリーを作製し、その中から耐性遺伝子（sp
aur１R ）を含有する、図３の制限酵素地図を有するＤ
ＮＡ断片を単離した。本遺伝子の塩基配列は配列表の配
列番号１の通りであり、この塩基配列より予想される本
遺伝子のコードする蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配
列番号２の通りである。この耐性遺伝子を用いたハイブ
リダイゼーションにより、感受性株より感受性遺伝子
（ spaur１S ）を含有する、図３の制限酵素地図を有す
るＤＮＡ断片を単離した。この感受性遺伝子の塩基配列
は配列表の配列番号３の通りであり、この塩基配列より
予想される本遺伝子のコードする蛋白質のアミノ酸配列
は配列表の配列番号４の通りである。配列番号３と配列
番号１の比較により１０５３番目の塩基のＧからＴへの
突然変異が起こり、配列番号４と配列番号２の比較によ
りアミノ酸レベルで２４０番目のアミノ酸がグリシンか
らシステインへ変化し、これが耐性の原因となっている
ことが明らかとなった。
ポンベをＥＭＳにより変異処理し、得られた耐性菌のゲ
ノムライブラリーを作製し、その中から耐性遺伝子（sp
aur１R ）を含有する、図３の制限酵素地図を有するＤ
ＮＡ断片を単離した。本遺伝子の塩基配列は配列表の配
列番号１の通りであり、この塩基配列より予想される本
遺伝子のコードする蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配
列番号２の通りである。この耐性遺伝子を用いたハイブ
リダイゼーションにより、感受性株より感受性遺伝子
（ spaur１S ）を含有する、図３の制限酵素地図を有す
るＤＮＡ断片を単離した。この感受性遺伝子の塩基配列
は配列表の配列番号３の通りであり、この塩基配列より
予想される本遺伝子のコードする蛋白質のアミノ酸配列
は配列表の配列番号４の通りである。配列番号３と配列
番号１の比較により１０５３番目の塩基のＧからＴへの
突然変異が起こり、配列番号４と配列番号２の比較によ
りアミノ酸レベルで２４０番目のアミノ酸がグリシンか
らシステインへ変化し、これが耐性の原因となっている
ことが明らかとなった。
【００１９】更に、オーレオバシジンに感受性である
Ｓ．セレビシエをＥＭＳにより変異処理し、得られた耐
性菌についてゲノムライブラリーを作製し、優性変異で
ある耐性遺伝子（ scaur１R ）を含有する図４の制限酵
素地図を有するＤＮＡ断片を単離した。scaur１R 遺伝
子の蛋白質をコードしている部分を含む領域の塩基配列
は配列表の配列番号５の通りであり、この塩基配列より
予想される本遺伝子のコードする蛋白質のアミノ酸配列
は配列表の配列番号６の通りである。この耐性遺伝子 s
caur１R を用いたハイブリダイゼーションにより感受性
株より感受性遺伝子（ scaur１S ）を含有する、図４の
制限酵素地図を有するＤＮＡ断片を単離した。この感受
性遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号７の通りであ
り、この塩基配列より予想される本遺伝子のコードする
蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番号８の通りであ
る。配列番号７と配列番号５を比較すると８５２番目の
塩基のＴからＡへの突然変異が起こり、配列番号８と配
列番号６を比較するとアミノ酸レベルで１５８番目のア
ミノ酸がフェニルアラニンからチロシンへ変化し、これ
が耐性の原因となっていることが明らかとなった。 spa
ur１遺伝子と scaur１遺伝子を比較するとアミノ酸レベ
ルで５８％のホモロジーがあり、両遺伝子が同様の機能
を有する蛋白質をコードする遺伝子であることが明らか
である。 spaur１、 scaur１遺伝子及びそのコードする
蛋白質のアミノ酸配列とホモロジーを有する遺伝子及び
蛋白質をデータベースにより探索したところ、３５％以
上のホモロジーを有するものはなかった。すなわち、本
遺伝子及びそのコードする蛋白質は従来全く知られてい
ない分子であることが明らかである。次に、配列番号１
に示した spaur１R 遺伝子のＤＮＡ塩基配列から配列表
の配列番号９と配列番号１０のプライマー対を合成し、
病原性真菌であるＣ．アルビカンスのｃＤＮＡを鋳型と
して、上記プライマーを用いてＰＣＲを行う。そのＰＣ
Ｒ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、臭化エ
チジウム染色し、ＤＮＡ断片の特異的な増幅を確認す
る。得られたＤＮＡ断片をプローブとして、Ｃ．アルビ
カンスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることにより、 spaur１、 scaur１遺伝子と同様の機能
を有する遺伝子（ caaur１）を含有する図５の制限酵素
地図を有するＤＮＡ分子が得られた。この caaur１遺伝
子の塩基配列は配列表の配列番号１１の通りであり、こ
の塩基配列より推定される本遺伝子がコードする蛋白質
のアミノ酸配列は配列表の配列番号１２の通りであり、
spaur１、 scaur１遺伝子のコードする蛋白質と高いホ
モロジーを有している。
Ｓ．セレビシエをＥＭＳにより変異処理し、得られた耐
性菌についてゲノムライブラリーを作製し、優性変異で
ある耐性遺伝子（ scaur１R ）を含有する図４の制限酵
素地図を有するＤＮＡ断片を単離した。scaur１R 遺伝
子の蛋白質をコードしている部分を含む領域の塩基配列
は配列表の配列番号５の通りであり、この塩基配列より
予想される本遺伝子のコードする蛋白質のアミノ酸配列
は配列表の配列番号６の通りである。この耐性遺伝子 s
caur１R を用いたハイブリダイゼーションにより感受性
株より感受性遺伝子（ scaur１S ）を含有する、図４の
制限酵素地図を有するＤＮＡ断片を単離した。この感受
性遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号７の通りであ
り、この塩基配列より予想される本遺伝子のコードする
蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番号８の通りであ
る。配列番号７と配列番号５を比較すると８５２番目の
塩基のＴからＡへの突然変異が起こり、配列番号８と配
列番号６を比較するとアミノ酸レベルで１５８番目のア
ミノ酸がフェニルアラニンからチロシンへ変化し、これ
が耐性の原因となっていることが明らかとなった。 spa
ur１遺伝子と scaur１遺伝子を比較するとアミノ酸レベ
ルで５８％のホモロジーがあり、両遺伝子が同様の機能
を有する蛋白質をコードする遺伝子であることが明らか
である。 spaur１、 scaur１遺伝子及びそのコードする
蛋白質のアミノ酸配列とホモロジーを有する遺伝子及び
蛋白質をデータベースにより探索したところ、３５％以
上のホモロジーを有するものはなかった。すなわち、本
遺伝子及びそのコードする蛋白質は従来全く知られてい
ない分子であることが明らかである。次に、配列番号１
に示した spaur１R 遺伝子のＤＮＡ塩基配列から配列表
の配列番号９と配列番号１０のプライマー対を合成し、
病原性真菌であるＣ．アルビカンスのｃＤＮＡを鋳型と
して、上記プライマーを用いてＰＣＲを行う。そのＰＣ
Ｒ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、臭化エ
チジウム染色し、ＤＮＡ断片の特異的な増幅を確認す
る。得られたＤＮＡ断片をプローブとして、Ｃ．アルビ
カンスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることにより、 spaur１、 scaur１遺伝子と同様の機能
を有する遺伝子（ caaur１）を含有する図５の制限酵素
地図を有するＤＮＡ分子が得られた。この caaur１遺伝
子の塩基配列は配列表の配列番号１１の通りであり、こ
の塩基配列より推定される本遺伝子がコードする蛋白質
のアミノ酸配列は配列表の配列番号１２の通りであり、
spaur１、 scaur１遺伝子のコードする蛋白質と高いホ
モロジーを有している。
【００２０】上記の例から明らかなように、オーレオバ
シジンに感受性を示す生物を出発材料として、種々の変
異処理方法、及び／又は選択方法を用い、上記と同様の
方法でクローニングを行えば、それぞれの生物又は方法
に対応したオーレオバシジン感受性関連遺伝子を単離す
ることができる。更に、これらの遺伝子にハイブリダイ
ズ可能な遺伝子も単離できる。また、当然、上記のよう
にして得られたオーレオバシジン感受性関連遺伝子の一
部を化学的、物理的、遺伝子工学的方法により変化させ
た遺伝子も作成できる。
シジンに感受性を示す生物を出発材料として、種々の変
異処理方法、及び／又は選択方法を用い、上記と同様の
方法でクローニングを行えば、それぞれの生物又は方法
に対応したオーレオバシジン感受性関連遺伝子を単離す
ることができる。更に、これらの遺伝子にハイブリダイ
ズ可能な遺伝子も単離できる。また、当然、上記のよう
にして得られたオーレオバシジン感受性関連遺伝子の一
部を化学的、物理的、遺伝子工学的方法により変化させ
た遺伝子も作成できる。
【００２１】本発明におけるオーレオバシジン耐性遺伝
子とは、宿主真菌に組込まれた場合に抗真菌剤オーレオ
バシジンに対して耐性を付与する遺伝子であり、この遺
伝子はオーレオバシジンに対して耐性を付与する蛋白質
をコードしている。代表的なオーレオバシジン耐性遺伝
子として、前出の spaur１R 、 scaur１Rがある。これ
らの遺伝子は優性に働き、またこれらの耐性遺伝子によ
る耐性は、オーレオバシジンに対して選択的なものであ
り、他の薬剤に対する感受性は実質上変化しない。な
お、 spaur１R 、 scaur１R にハイブリダイズ可能で、
宿主真菌にオーレオバシジン耐性を付与する遺伝子、例
えば spaur１R 、 scaur１R の一部を化学的、酵素的、
物理的、遺伝子工学的に変化させた遺伝子もオーレオバ
シジン耐性遺伝子に含まれる。
子とは、宿主真菌に組込まれた場合に抗真菌剤オーレオ
バシジンに対して耐性を付与する遺伝子であり、この遺
伝子はオーレオバシジンに対して耐性を付与する蛋白質
をコードしている。代表的なオーレオバシジン耐性遺伝
子として、前出の spaur１R 、 scaur１Rがある。これ
らの遺伝子は優性に働き、またこれらの耐性遺伝子によ
る耐性は、オーレオバシジンに対して選択的なものであ
り、他の薬剤に対する感受性は実質上変化しない。な
お、 spaur１R 、 scaur１R にハイブリダイズ可能で、
宿主真菌にオーレオバシジン耐性を付与する遺伝子、例
えば spaur１R 、 scaur１R の一部を化学的、酵素的、
物理的、遺伝子工学的に変化させた遺伝子もオーレオバ
シジン耐性遺伝子に含まれる。
【００２２】オーレオバシジンに対して耐性を付与する
蛋白質（ Aur１R p ）にアミノ酸残基の置換、挿入、及
び欠失の少なくとも一つを施すことにより得られるアミ
ノ酸配列を有し、オーレオバシジン耐性付与活性を有す
る蛋白質をコードする遺伝子もオーレオバシジン耐性遺
伝子に含まれる。
蛋白質（ Aur１R p ）にアミノ酸残基の置換、挿入、及
び欠失の少なくとも一つを施すことにより得られるアミ
ノ酸配列を有し、オーレオバシジン耐性付与活性を有す
る蛋白質をコードする遺伝子もオーレオバシジン耐性遺
伝子に含まれる。
【００２３】Aur１R p へのアミノ酸残基の置換、挿
入、及び欠失は遺伝子の部位特異的変異誘発により実施
することができる。単離した Aur１R p 又はオーレオバ
シジンに対して感受性を付与する蛋白質（ Aur１S p ）
をコードするＤＮＡを、ヌクレオチドの置換、挿入、及
び欠失の少なくとも一つによって修飾するのは容易であ
り、 Aur１R p の変異体をコードしている新規なＤＮＡ
を得ることができる。アミノ酸残基の置換、挿入、及び
欠失に関し、１又は複数のアミノ酸残基の変換は遺伝子
工学的に作製可能な範囲のものであり、生物活性を破壊
することなく行われたものが選抜されうる。更に、特定
の位置の残基での突然変異を適切に行うためには標的コ
ドンに無作為な変異誘発を行い、発現された変異体を所
望の活性についてスクリーニングすればよい。挿入に
は、 Aur１R p 又はそのフラグメントと他の蛋白質又は
ポリペプチドとが Aur１R p 又はそのフラグメントのア
ミノ末端及び／又はカルボキシ末端において、ペプチド
結合を介して結合している融合蛋白質を含む。更に、ア
ミノ酸残基を欠失させる方法として、ギャップド デュ
プレックス（gapped duplex)法によりアミノ酸配列の任
意のアミノ酸コドンを終止コドンに置換することによ
り、置換したアミノ酸残基よりカルボキシ末端側を欠失
させることができる。別の方法としては、コードするＤ
ＮＡをアミノ酸配列のアミノ末端及び／又はカルボキシ
末端に対応する部分より分解するディレーション法〔ジ
ーン（Gene) 、第３３巻、第１０３〜１１９頁、（１９
８５）〕により欠失する方法や、開始コドン及び／又は
終止コドンを含むプライマーを用いたＰＣＲ法により任
意の長さのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端を欠失
させた蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。
なお、部位特異的変異誘発はオリゴヌクレオチドを用い
たギャップド デュプレックス法〔メソッズ イン エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology)、第１５４
巻、第３５０〜３６７頁（１９８７）〕や、オリゴヌク
レオチドを用いたウラシルＤＮＡ法〔メソッズ イン
エンザイモロジー、第１５４巻、第３６７〜３８２頁
（１９８７）〕、亜硝酸法〔プロシーディングズ オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サンエンシーズ
オブ ザ ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、
第７９巻、第７２５８〜７２６２頁（１９８２）〕、更
にカセット変異法〔ジーン、第３４巻、第３１５〜３２
３頁、（１９８５）〕が知られている。
入、及び欠失は遺伝子の部位特異的変異誘発により実施
することができる。単離した Aur１R p 又はオーレオバ
シジンに対して感受性を付与する蛋白質（ Aur１S p ）
をコードするＤＮＡを、ヌクレオチドの置換、挿入、及
び欠失の少なくとも一つによって修飾するのは容易であ
り、 Aur１R p の変異体をコードしている新規なＤＮＡ
を得ることができる。アミノ酸残基の置換、挿入、及び
欠失に関し、１又は複数のアミノ酸残基の変換は遺伝子
工学的に作製可能な範囲のものであり、生物活性を破壊
することなく行われたものが選抜されうる。更に、特定
の位置の残基での突然変異を適切に行うためには標的コ
ドンに無作為な変異誘発を行い、発現された変異体を所
望の活性についてスクリーニングすればよい。挿入に
は、 Aur１R p 又はそのフラグメントと他の蛋白質又は
ポリペプチドとが Aur１R p 又はそのフラグメントのア
ミノ末端及び／又はカルボキシ末端において、ペプチド
結合を介して結合している融合蛋白質を含む。更に、ア
ミノ酸残基を欠失させる方法として、ギャップド デュ
プレックス（gapped duplex)法によりアミノ酸配列の任
意のアミノ酸コドンを終止コドンに置換することによ
り、置換したアミノ酸残基よりカルボキシ末端側を欠失
させることができる。別の方法としては、コードするＤ
ＮＡをアミノ酸配列のアミノ末端及び／又はカルボキシ
末端に対応する部分より分解するディレーション法〔ジ
ーン（Gene) 、第３３巻、第１０３〜１１９頁、（１９
８５）〕により欠失する方法や、開始コドン及び／又は
終止コドンを含むプライマーを用いたＰＣＲ法により任
意の長さのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端を欠失
させた蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。
なお、部位特異的変異誘発はオリゴヌクレオチドを用い
たギャップド デュプレックス法〔メソッズ イン エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology)、第１５４
巻、第３５０〜３６７頁（１９８７）〕や、オリゴヌク
レオチドを用いたウラシルＤＮＡ法〔メソッズ イン
エンザイモロジー、第１５４巻、第３６７〜３８２頁
（１９８７）〕、亜硝酸法〔プロシーディングズ オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サンエンシーズ
オブ ザ ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、
第７９巻、第７２５８〜７２６２頁（１９８２）〕、更
にカセット変異法〔ジーン、第３４巻、第３１５〜３２
３頁、（１９８５）〕が知られている。
【００２４】本発明者らは配列表の配列番号８で表され
る Aur１S p の２４０番目のAla を他のアミノ酸で置換
することにより、該蛋白質が Aur１R p に変換されるこ
とを見出している。この蛋白質においては、２４０番目
のAla が他のアミノ酸で置換されていれば良く、その他
のアミノ酸残基が化学的、物理的、遺伝子工学的に置
換、挿入、又は欠失されていても良い。この Aur１R p
変異体は好適には配列表の配列番号２３で表される Aur
１S p をコードするＤＮＡを用いることにより遺伝子工
学的に作製することができ、オーレオバシジン感受性細
胞を耐性細胞に変換させる活性を測定することにより、
その生物活性を測定することができる。この Aur１R p
変異体としては、オーレオバシジン感受性細胞を耐性細
胞に変換させる活性が配列表の配列番号６で表される A
ur１R p より増強されているものが好ましく、該 Aur１
R p をコードするＤＮＡが本発明においても好適に使用
できる。
る Aur１S p の２４０番目のAla を他のアミノ酸で置換
することにより、該蛋白質が Aur１R p に変換されるこ
とを見出している。この蛋白質においては、２４０番目
のAla が他のアミノ酸で置換されていれば良く、その他
のアミノ酸残基が化学的、物理的、遺伝子工学的に置
換、挿入、又は欠失されていても良い。この Aur１R p
変異体は好適には配列表の配列番号２３で表される Aur
１S p をコードするＤＮＡを用いることにより遺伝子工
学的に作製することができ、オーレオバシジン感受性細
胞を耐性細胞に変換させる活性を測定することにより、
その生物活性を測定することができる。この Aur１R p
変異体としては、オーレオバシジン感受性細胞を耐性細
胞に変換させる活性が配列表の配列番号６で表される A
ur１R p より増強されているものが好ましく、該 Aur１
R p をコードするＤＮＡが本発明においても好適に使用
できる。
【００２５】Aur１R p の特に好適な実施態様におい
て、 Aur１S p の２４０番目のAla がCys に置換した変
異体が得られる。その１例の変異体のアミノ酸配列を配
列表の配列番号の１８に示す。また、この変異体を Aur
１R p （Ａ２４０Ｃ）と称する。また、 Aur１S p の１
５８番目のPhe がTyr に、２４０番目のAla がCys に置
換した変異体を得ることができる。この変異体のアミノ
酸配列を配列表の配列番号１９に示す。また、この変異
体を Aur１R p （Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）と称する。
これらの変異体のオーレオバシジン耐性付与能力は Aur
１S p の１５８番目のPhe がTyr に置換した配列表の配
列番号６で表される蛋白質〔 Aur１R p （Ｆ１５８
Ｙ）〕よりも強い。
て、 Aur１S p の２４０番目のAla がCys に置換した変
異体が得られる。その１例の変異体のアミノ酸配列を配
列表の配列番号の１８に示す。また、この変異体を Aur
１R p （Ａ２４０Ｃ）と称する。また、 Aur１S p の１
５８番目のPhe がTyr に、２４０番目のAla がCys に置
換した変異体を得ることができる。この変異体のアミノ
酸配列を配列表の配列番号１９に示す。また、この変異
体を Aur１R p （Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）と称する。
これらの変異体のオーレオバシジン耐性付与能力は Aur
１S p の１５８番目のPhe がTyr に置換した配列表の配
列番号６で表される蛋白質〔 Aur１R p （Ｆ１５８
Ｙ）〕よりも強い。
【００２６】本発明で使用するオーレオバシジン耐性遺
伝子の例としては配列表の配列番号２０〜２２でそれぞ
れ表されるＤＮＡがある。配列表の配列番号２２で表さ
れるＤＮＡは Aur１R p （Ｆ１５８Ｙ）をコードするＤ
ＮＡであり、配列表の配列番号２０で表されるＤＮＡは
Aur１R p （Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡであり、
配列表の配列番号２１で表されるＤＮＡは Aur１R p
（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡであ
る。
伝子の例としては配列表の配列番号２０〜２２でそれぞ
れ表されるＤＮＡがある。配列表の配列番号２２で表さ
れるＤＮＡは Aur１R p （Ｆ１５８Ｙ）をコードするＤ
ＮＡであり、配列表の配列番号２０で表されるＤＮＡは
Aur１R p （Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡであり、
配列表の配列番号２１で表されるＤＮＡは Aur１R p
（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡであ
る。
【００２７】オーレオバシジンの感受性に関連する蛋白
質をコードする遺伝子を適当なベクターに組込み、複製
プラスミドを作成できる。例えば、酵母の適当なベクタ
ーにオーレオバシジン耐性遺伝子を組込んだプラスミド
は、オーレオバシジンを用いた薬剤耐性により容易に形
質転換体を選択できるため、選択マーカー遺伝子として
有用性が高い。酵母用ベクターとしてはＹＲP 型、ＹＣ
P 型、ＹＥP 型、ＹＩP 型が使用できる。
質をコードする遺伝子を適当なベクターに組込み、複製
プラスミドを作成できる。例えば、酵母の適当なベクタ
ーにオーレオバシジン耐性遺伝子を組込んだプラスミド
は、オーレオバシジンを用いた薬剤耐性により容易に形
質転換体を選択できるため、選択マーカー遺伝子として
有用性が高い。酵母用ベクターとしてはＹＲP 型、ＹＣ
P 型、ＹＥP 型、ＹＩP 型が使用できる。
【００２８】また、複製プラスミドは大腸菌等に安定に
保持させることが可能であり、その際、ベクターとして
使用可能なものとして、ｐＵＣ１１８、ｐＷＨ５、ｐＡ
Ｕ−ＰＳ、Ｔｒａｐｌｅｘ１１９、ｐＴＶ１１８等があ
る。 spaur１S 遺伝子を組込んだｐＡＵ−ＰＳは、ｐＳ
ＰＡＲ１と命名し、 scaur１S 遺伝子を組込んだｐＷＨ
５は、ｐＳＣＡＲ１と命名し、 caaur１遺伝子を組込ん
だＴｒａｐｌｅｘ１１９ベクターはｐＣＡＡＲ１と命名
し、それぞれ大腸菌に形質転換された。また、適当な宿
主に発現させることも可能であり、上記プラスミドを、
必要に応じて適当な制限酵素等で、蛋白質に翻訳される
領域（open reading frame、ＯＲＦ）にだけ切り縮めた
後、適当なベクターにつなぎ、発現用組換体プラスミド
とすることができる。発現用プラスミドとしては、宿主
が大腸菌の時は、ｐＴＶ１１８等のプラスミド、宿主が
酵母の時は、ｐＹＥＳ２等のプラスミドをベクターとし
て使用すれば良い。 spaur１S 遺伝子を組込んだｐＳＰ
ＡＲ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Escheric
hia coli JM109/pSPAR１と命名、表示され、工業技術院
生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４４８５と
して寄託されている。 scaur１S 遺伝子を組込んだｐＳ
ＣＡＲ１で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１は、Escher
ichia coli HB101/pSCAR１と命名、表示され、工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４４８３
として寄託されている。 caaur１遺伝子を組込んだｐＣ
ＡＡＲ１で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１は、Escher
ichiacoli HB101/pCAAR１と命名、表示され、工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４４８２
として寄託されている。
保持させることが可能であり、その際、ベクターとして
使用可能なものとして、ｐＵＣ１１８、ｐＷＨ５、ｐＡ
Ｕ−ＰＳ、Ｔｒａｐｌｅｘ１１９、ｐＴＶ１１８等があ
る。 spaur１S 遺伝子を組込んだｐＡＵ−ＰＳは、ｐＳ
ＰＡＲ１と命名し、 scaur１S 遺伝子を組込んだｐＷＨ
５は、ｐＳＣＡＲ１と命名し、 caaur１遺伝子を組込ん
だＴｒａｐｌｅｘ１１９ベクターはｐＣＡＡＲ１と命名
し、それぞれ大腸菌に形質転換された。また、適当な宿
主に発現させることも可能であり、上記プラスミドを、
必要に応じて適当な制限酵素等で、蛋白質に翻訳される
領域（open reading frame、ＯＲＦ）にだけ切り縮めた
後、適当なベクターにつなぎ、発現用組換体プラスミド
とすることができる。発現用プラスミドとしては、宿主
が大腸菌の時は、ｐＴＶ１１８等のプラスミド、宿主が
酵母の時は、ｐＹＥＳ２等のプラスミドをベクターとし
て使用すれば良い。 spaur１S 遺伝子を組込んだｐＳＰ
ＡＲ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Escheric
hia coli JM109/pSPAR１と命名、表示され、工業技術院
生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４４８５と
して寄託されている。 scaur１S 遺伝子を組込んだｐＳ
ＣＡＲ１で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１は、Escher
ichia coli HB101/pSCAR１と命名、表示され、工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４４８３
として寄託されている。 caaur１遺伝子を組込んだｐＣ
ＡＡＲ１で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１は、Escher
ichiacoli HB101/pCAAR１と命名、表示され、工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４４８２
として寄託されている。
【００２９】本発明のオーレオバシジン耐性遺伝子を含
有する組込型ベクターは線状ベクターであり、通常オー
レオバシジン耐性遺伝子を含有する複製プラスミドを切
断、線状化することにより調製することができる。この
複製プラスミドの切断点について以下説明する。
有する組込型ベクターは線状ベクターであり、通常オー
レオバシジン耐性遺伝子を含有する複製プラスミドを切
断、線状化することにより調製することができる。この
複製プラスミドの切断点について以下説明する。
【００３０】染色体組込型ベクター中のオーレオバシジ
ン耐性遺伝子が相同の宿主染色体、すなわちオーレオバ
シジン感受性遺伝子と相同組換えを起こし、オーレオバ
シジン感受性細胞をオーレオバシジン耐性細胞に変換す
る場合を図１に示す。オーレオバシジン耐性遺伝子を含
有する複製プラスミド中のオーレオバシジン耐性遺伝子
配列を適当な制限酵素で一ヵ所切断し、線状化する。こ
の直線化ベクターは、宿主染色体中の相同なオーレオバ
シジン感受性遺伝子と相同組換えを起こし、宿主細胞に
耐性が付与される。この時、複製プラスミド中に異種の
遺伝子を含有させれば、オーレオバシジン耐性及び異種
の遺伝子が宿主に付与される。一例として、 scaur１R
と、特開平３−２５４６８０号公報に記載のヒトアシル
アミノ酸遊離酵素（ＡＡＲＥ）遺伝子を含有する直線化
ベクター調製用の複製ベクターpAUR1aare を調製した。
本ベクターを導入した大腸菌ＪＭ１０９株は、Escheric
hia coli JM109／pAUR1aare と命名、表示され、工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４３６
６として寄託されている。複製ベクターの直線化のため
には、オーレオバシジン耐性遺伝子に存在するが、目的
の異種遺伝子部分に存在しない制限酵素切断部位が有効
に利用可能である。例えば、Ｓ．セレビシエ由来の sca
ur１R の場合、ＳｔｕＩ等、Ｓ．ポンベ由来の spaur１
R の場合、ＢａｌＩ等の制限酵素サイトが利用可能であ
る。
ン耐性遺伝子が相同の宿主染色体、すなわちオーレオバ
シジン感受性遺伝子と相同組換えを起こし、オーレオバ
シジン感受性細胞をオーレオバシジン耐性細胞に変換す
る場合を図１に示す。オーレオバシジン耐性遺伝子を含
有する複製プラスミド中のオーレオバシジン耐性遺伝子
配列を適当な制限酵素で一ヵ所切断し、線状化する。こ
の直線化ベクターは、宿主染色体中の相同なオーレオバ
シジン感受性遺伝子と相同組換えを起こし、宿主細胞に
耐性が付与される。この時、複製プラスミド中に異種の
遺伝子を含有させれば、オーレオバシジン耐性及び異種
の遺伝子が宿主に付与される。一例として、 scaur１R
と、特開平３−２５４６８０号公報に記載のヒトアシル
アミノ酸遊離酵素（ＡＡＲＥ）遺伝子を含有する直線化
ベクター調製用の複製ベクターpAUR1aare を調製した。
本ベクターを導入した大腸菌ＪＭ１０９株は、Escheric
hia coli JM109／pAUR1aare と命名、表示され、工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４３６
６として寄託されている。複製ベクターの直線化のため
には、オーレオバシジン耐性遺伝子に存在するが、目的
の異種遺伝子部分に存在しない制限酵素切断部位が有効
に利用可能である。例えば、Ｓ．セレビシエ由来の sca
ur１R の場合、ＳｔｕＩ等、Ｓ．ポンベ由来の spaur１
R の場合、ＢａｌＩ等の制限酵素サイトが利用可能であ
る。
【００３１】本発明のベクターの好ましい形態として
は、オーレオバシジン耐性遺伝子及び異種遺伝子を含有
すればよく、他の複製プラスミド由来遺伝子は除去すれ
ばよい。また、オーレオバシジン耐性遺伝子発現用、異
種遺伝子発現用のプロモーター、ターミネーター等は宿
主の性質に応じて選択することができる。当然、オーレ
オバシジン耐性遺伝子の機能発現のために使用されるプ
ロモーターは、配列表の配列番号１、５でそれぞれ表さ
れるＤＮＡ中のプロモーター部分も使用可能である。
Ｓ．セレビシエの場合、アルコール脱水素酵素遺伝子
（ＡＤＨ１）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素
遺伝子（ＧＰＤ）のプロモーター、チトクロームＣ１遺
伝子（ＣＹＣ１）のターミネーター等が使用できる。こ
のプロモーター、ターミネーターはオーレオバシジン耐
性遺伝子発現用のものと異ってもよい。
は、オーレオバシジン耐性遺伝子及び異種遺伝子を含有
すればよく、他の複製プラスミド由来遺伝子は除去すれ
ばよい。また、オーレオバシジン耐性遺伝子発現用、異
種遺伝子発現用のプロモーター、ターミネーター等は宿
主の性質に応じて選択することができる。当然、オーレ
オバシジン耐性遺伝子の機能発現のために使用されるプ
ロモーターは、配列表の配列番号１、５でそれぞれ表さ
れるＤＮＡ中のプロモーター部分も使用可能である。
Ｓ．セレビシエの場合、アルコール脱水素酵素遺伝子
（ＡＤＨ１）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素
遺伝子（ＧＰＤ）のプロモーター、チトクロームＣ１遺
伝子（ＣＹＣ１）のターミネーター等が使用できる。こ
のプロモーター、ターミネーターはオーレオバシジン耐
性遺伝子発現用のものと異ってもよい。
【００３２】なお本発明において異種遺伝子とは、宿主
真菌細胞に異種、すなわち外来の遺伝子であり、例え
ば、非真菌遺伝子、修飾された遺伝子、異なる真菌種の
遺伝子、セルフクローニングされた遺伝子等をいう。具
体的には、発酵、アルコール耐性、糖化、呈味成分、香
気成分の生成に関係する遺伝子等がある。
真菌細胞に異種、すなわち外来の遺伝子であり、例え
ば、非真菌遺伝子、修飾された遺伝子、異なる真菌種の
遺伝子、セルフクローニングされた遺伝子等をいう。具
体的には、発酵、アルコール耐性、糖化、呈味成分、香
気成分の生成に関係する遺伝子等がある。
【００３３】本発明の第２の発明はオーレオバシジン耐
性形質転換体の創製方法であり、例えば上記のオーレオ
バシジン耐性遺伝子を含有する複製ベクターを調製し、
複製ベクター中のオーレオバシジン耐性遺伝子の１ヵ所
で切断し、線状の宿主真菌用染色体組込型ベクターを調
製し、次に真菌細胞を形質転換せしめる条件下で該ベク
ターをオーレオバシジン感受性の宿主真菌細胞と混合
し、該ベクターを宿主染色体に組込み、続いて抗生物質
オーレオバシジンを含有する宿主細胞の増殖に適した培
地中で増殖させ、増殖してくるオーレオバシジン耐性細
胞を選択することにより、オーレオバシジン耐性形質転
換体を創製することができる。形質転換方法としては公
知の方法に準じればよく、プロトプラスト化法、酢酸リ
チウム法、エレクトロポレーション法等がある。使用さ
れる培地としては、真菌を増殖させるために使用可能な
ものであれば、特に制限はなく、通常サブローデキスト
ロース培地、ＹＰＤ培地、ツアペック培地、ＹＮＢＧ培
地等が用いられる。添加されるオーレオバシジンの濃度
は、感受性の宿主真菌細胞により異なるが、通常０．０
５〜８０μｇ／mlで使用される。
性形質転換体の創製方法であり、例えば上記のオーレオ
バシジン耐性遺伝子を含有する複製ベクターを調製し、
複製ベクター中のオーレオバシジン耐性遺伝子の１ヵ所
で切断し、線状の宿主真菌用染色体組込型ベクターを調
製し、次に真菌細胞を形質転換せしめる条件下で該ベク
ターをオーレオバシジン感受性の宿主真菌細胞と混合
し、該ベクターを宿主染色体に組込み、続いて抗生物質
オーレオバシジンを含有する宿主細胞の増殖に適した培
地中で増殖させ、増殖してくるオーレオバシジン耐性細
胞を選択することにより、オーレオバシジン耐性形質転
換体を創製することができる。形質転換方法としては公
知の方法に準じればよく、プロトプラスト化法、酢酸リ
チウム法、エレクトロポレーション法等がある。使用さ
れる培地としては、真菌を増殖させるために使用可能な
ものであれば、特に制限はなく、通常サブローデキスト
ロース培地、ＹＰＤ培地、ツアペック培地、ＹＮＢＧ培
地等が用いられる。添加されるオーレオバシジンの濃度
は、感受性の宿主真菌細胞により異なるが、通常０．０
５〜８０μｇ／mlで使用される。
【００３４】本発明の第３の発明の形質転換体は本発明
の第２の方法で得ることができる。本発明の形質転換体
の一例として、 scaur１R とＡＡＲＥ遺伝子が染色体に
組込まれた清酒酵母協会７０１号は、Saccharomyces ce
revisiae K701/pAUR1aareと命名表示され、工業技術院
生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４３７９と
して寄託されている。このようにして本発明の染色体組
込型ベクターによって得られた形質転換体は、オーレオ
バシジン耐性が付与され、かつ組込まれた異種遺伝子も
染色体上で安定に保持されるために、工業用等の目的に
利用価値が大きい。
の第２の方法で得ることができる。本発明の形質転換体
の一例として、 scaur１R とＡＡＲＥ遺伝子が染色体に
組込まれた清酒酵母協会７０１号は、Saccharomyces ce
revisiae K701/pAUR1aareと命名表示され、工業技術院
生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４３７９と
して寄託されている。このようにして本発明の染色体組
込型ベクターによって得られた形質転換体は、オーレオ
バシジン耐性が付与され、かつ組込まれた異種遺伝子も
染色体上で安定に保持されるために、工業用等の目的に
利用価値が大きい。
【００３５】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
【００３６】実施例１ オーレオバシジン耐性遺伝子
を含有する染色体組込型ベクターの構築 （１） scaur１R を含有する複製ベクターの構築 scaur１S を含有するプラスミドｐＳＣＡＲ１を保有す
る大腸菌、Escherichia coli HB101/pSCAR1 (FERM BP-4
483)よりプラスミドｐＳＣＡＲ１を調製し、Ｈｉｎｄ I
IIで部分切断し、 scaur１S を含む３．５kbのＤＮＡを
単離した。この３．５kbＤＮＡをＨｉｎｄ IIIで切断し
たｐＵＣ１１８ベクターと連結し、プラスミドｐＵ sca
ur１S を作製した。プラスミドｐＵ scaur１S を大腸菌
ＣＪ２３６に形質転換し、ｓｓＤＮＡを調製した。次に
合成、精製した配列表の配列番号１３で表される変異導
入用合成オリゴヌクレオチドと上記のｓｓＤＮＡを用い
て、ミュータン（Mutan)−Ｋキット（宝酒造社製）によ
り部位特異的ＤＮＡ変異を導入した。すなわち、配列表
の配列番号１３で表されるオリゴヌクレオチドを用いる
ことにより、 scaur１S 遺伝子のＯＲＦ内のアミノ酸番
号１５８番目のＰｈｅのコドンＴＴＴがコドンＴＡＴの
Ｔｙｒに置換した scaur１R を得ることができた。この
Aur１R p （Ｆ１５８Ｙ）をコードするＤＮＡを有する
プラスミドをｐＵ scaur１Ｒとした。
を含有する染色体組込型ベクターの構築 （１） scaur１R を含有する複製ベクターの構築 scaur１S を含有するプラスミドｐＳＣＡＲ１を保有す
る大腸菌、Escherichia coli HB101/pSCAR1 (FERM BP-4
483)よりプラスミドｐＳＣＡＲ１を調製し、Ｈｉｎｄ I
IIで部分切断し、 scaur１S を含む３．５kbのＤＮＡを
単離した。この３．５kbＤＮＡをＨｉｎｄ IIIで切断し
たｐＵＣ１１８ベクターと連結し、プラスミドｐＵ sca
ur１S を作製した。プラスミドｐＵ scaur１S を大腸菌
ＣＪ２３６に形質転換し、ｓｓＤＮＡを調製した。次に
合成、精製した配列表の配列番号１３で表される変異導
入用合成オリゴヌクレオチドと上記のｓｓＤＮＡを用い
て、ミュータン（Mutan)−Ｋキット（宝酒造社製）によ
り部位特異的ＤＮＡ変異を導入した。すなわち、配列表
の配列番号１３で表されるオリゴヌクレオチドを用いる
ことにより、 scaur１S 遺伝子のＯＲＦ内のアミノ酸番
号１５８番目のＰｈｅのコドンＴＴＴがコドンＴＡＴの
Ｔｙｒに置換した scaur１R を得ることができた。この
Aur１R p （Ｆ１５８Ｙ）をコードするＤＮＡを有する
プラスミドをｐＵ scaur１Ｒとした。
【００３７】（２） scaur1R のＰＣＲ法による増幅
scaur１R を含む３．５kbのＨｉｎｄ III断片を保持す
るプラスミドｐＵ scaur１Ｒを用い、ＰＣＲ法にて、 s
caur１R （約１．９kb）を増幅した。使用したプライマ
ーについては、増幅した scaur１R をプラスミドベクタ
ーｐＹＥＳ２（インビトロジェン社製）にクローニング
するために、あらかじめＸｈｏＩサイト及びＫｐｎＩサ
イトをプライマーに設計し、配列表の配列番号１４、１
５でそれぞれ表されるプライマーを合成した。反応につ
いては、最終濃度が、１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、５０mMＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ2 、０．１mM
ｄＡＴＰ、０．１mM ｄＣＴＰ、０．１mM ｄＴＴ
Ｐ、０．１mM ｄＧＴＰとなるようなＰＣＲ反応緩衝液
２８μｌ、２．５ユニットの、アムプリ タック（Ampl
i Taq)ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社製）１
μｌ、２０pmolの配列表の配列番号１４、１５でそれぞ
れ表されるプライマー各０．５μｌ、ベクター１μｌ及
びＨ2 Ｏ ６９μｌを含有するＰＣＲ溶液１００μｌを
９４℃の初期温度にて１分間保持し、次に９４℃にて１
分間、５０℃にて２分間、及び７２℃にて３分間の順序
で加熱し、この温度サイクルを３５回反復した。その
後、反応混合物を更に７２℃にて１０分間保温し、ＰＣ
Ｒによる増幅を行った。更に、ＰＣＲ増幅産物を、Ｋｐ
ｎＩとＸｈｏＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動
で分離させ、目的の約１．９kbのＤＮＡ断片をゲルより
スプレック（Suprec) TM−０１（宝酒造社製）にて回収
精製した。
るプラスミドｐＵ scaur１Ｒを用い、ＰＣＲ法にて、 s
caur１R （約１．９kb）を増幅した。使用したプライマ
ーについては、増幅した scaur１R をプラスミドベクタ
ーｐＹＥＳ２（インビトロジェン社製）にクローニング
するために、あらかじめＸｈｏＩサイト及びＫｐｎＩサ
イトをプライマーに設計し、配列表の配列番号１４、１
５でそれぞれ表されるプライマーを合成した。反応につ
いては、最終濃度が、１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、５０mMＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ2 、０．１mM
ｄＡＴＰ、０．１mM ｄＣＴＰ、０．１mM ｄＴＴ
Ｐ、０．１mM ｄＧＴＰとなるようなＰＣＲ反応緩衝液
２８μｌ、２．５ユニットの、アムプリ タック（Ampl
i Taq)ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社製）１
μｌ、２０pmolの配列表の配列番号１４、１５でそれぞ
れ表されるプライマー各０．５μｌ、ベクター１μｌ及
びＨ2 Ｏ ６９μｌを含有するＰＣＲ溶液１００μｌを
９４℃の初期温度にて１分間保持し、次に９４℃にて１
分間、５０℃にて２分間、及び７２℃にて３分間の順序
で加熱し、この温度サイクルを３５回反復した。その
後、反応混合物を更に７２℃にて１０分間保温し、ＰＣ
Ｒによる増幅を行った。更に、ＰＣＲ増幅産物を、Ｋｐ
ｎＩとＸｈｏＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動
で分離させ、目的の約１．９kbのＤＮＡ断片をゲルより
スプレック（Suprec) TM−０１（宝酒造社製）にて回収
精製した。
【００３８】（３） ＤＮＡの連結及び形質転換
上記工程のようにして精製した約１．９kbのＤＮＡ断片
約０．３μｇを、あらかじめＸｈｏＩとＫｐｎＩで消化
しておいたｐＹＥＳ２約０．１μｇと、ＤＮＡライゲー
ション キット（Ligation Kit) （宝酒造社製）を用い
て連結した。次に７μｌの上記連結混合物を大腸菌ＨＢ
１０１のコンピテント細胞２００μｌに加え、この細胞
を氷上で３０分間、４２℃にて１分間、そして再び氷上
で１分間静置した。次いで８００μｌのＳＯＣ培地〔１
９８９年、コールド スプリング ハーバー ラボラト
リー プレス発行、サムブルック（Sambrook) ら、モレ
キュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュア
ル（Molecular Cloning, Ａ Laboratory Manual) 〕を
加え、３７℃にて１時間インキュベートした後、５０μ
ｇ／mlのアンピシリンを含有するＬ−ブロス寒天培地上
にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートす
ることで、形質転換体を得た。この形質転換体を５０μ
ｇ／mlのアンピシリンを含有するＬ−ブロス培地５ml中
で３７℃にて一夜培養し、この培養物からアルカリ法
（前記モレキュラー クローニング）に従ってプラスミ
ドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドをプ
ラスミドｐＹＥＳ２ａｕｒ１と命名した。
約０．３μｇを、あらかじめＸｈｏＩとＫｐｎＩで消化
しておいたｐＹＥＳ２約０．１μｇと、ＤＮＡライゲー
ション キット（Ligation Kit) （宝酒造社製）を用い
て連結した。次に７μｌの上記連結混合物を大腸菌ＨＢ
１０１のコンピテント細胞２００μｌに加え、この細胞
を氷上で３０分間、４２℃にて１分間、そして再び氷上
で１分間静置した。次いで８００μｌのＳＯＣ培地〔１
９８９年、コールド スプリング ハーバー ラボラト
リー プレス発行、サムブルック（Sambrook) ら、モレ
キュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュア
ル（Molecular Cloning, Ａ Laboratory Manual) 〕を
加え、３７℃にて１時間インキュベートした後、５０μ
ｇ／mlのアンピシリンを含有するＬ−ブロス寒天培地上
にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートす
ることで、形質転換体を得た。この形質転換体を５０μ
ｇ／mlのアンピシリンを含有するＬ−ブロス培地５ml中
で３７℃にて一夜培養し、この培養物からアルカリ法
（前記モレキュラー クローニング）に従ってプラスミ
ドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドをプ
ラスミドｐＹＥＳ２ａｕｒ１と命名した。
【００３９】（４） 染色体組込型ベクターの構築
上記プラスミドｐＹＥＳ２ａｕｒ１約０．４μｇをＸｂ
ａＩとＫｐｎＩで消化させた後、アガロースゲル電気泳
動で分離させ、 scaur１R を含む約１．９kbのＤＮＡ断
片をゲルよりスプレック−０１にて回収精製を行った。
同様に、プラスミドベクターｐＵＣ１９約０．４μｇを
ＳｓｐＩとＰｖｕIIで消化させた後、アガロースゲル電
気泳動で分離させ、アンピシリン耐性遺伝子及びＣｏｌ
Ｅ１オリジンを含むＤＮＡ断片（約１．８kb）をゲルよ
り回収精製を行った。精製した上記の両ＤＮＡ断片それ
ぞれ約０．１μｇについて、ＤＮＡブランティング キ
ット（Blunting Kit) （宝酒造社製）を用いて末端を平
滑化させた。更にその平滑化両ＤＮＡ断片を、それぞれ
約０．１μｇずつ用いて、ライゲーション反応を行っ
た。反応については、ＤＮＡライゲーション キット
（宝酒造社製）を用いて連結した。続いて、プラスミド
を大腸菌ＪＭ１０９に組込み、培養後、形質転換体及び
プラスミドＤＮＡを調製し、こうして得られたプラスミ
ドをプラスミドｐＡＵＲ１と命名した。次に該プラスミ
ドをＳｔｕ１で切断し、染色体組込型ベクターを作製し
た。
ａＩとＫｐｎＩで消化させた後、アガロースゲル電気泳
動で分離させ、 scaur１R を含む約１．９kbのＤＮＡ断
片をゲルよりスプレック−０１にて回収精製を行った。
同様に、プラスミドベクターｐＵＣ１９約０．４μｇを
ＳｓｐＩとＰｖｕIIで消化させた後、アガロースゲル電
気泳動で分離させ、アンピシリン耐性遺伝子及びＣｏｌ
Ｅ１オリジンを含むＤＮＡ断片（約１．８kb）をゲルよ
り回収精製を行った。精製した上記の両ＤＮＡ断片それ
ぞれ約０．１μｇについて、ＤＮＡブランティング キ
ット（Blunting Kit) （宝酒造社製）を用いて末端を平
滑化させた。更にその平滑化両ＤＮＡ断片を、それぞれ
約０．１μｇずつ用いて、ライゲーション反応を行っ
た。反応については、ＤＮＡライゲーション キット
（宝酒造社製）を用いて連結した。続いて、プラスミド
を大腸菌ＪＭ１０９に組込み、培養後、形質転換体及び
プラスミドＤＮＡを調製し、こうして得られたプラスミ
ドをプラスミドｐＡＵＲ１と命名した。次に該プラスミ
ドをＳｔｕ１で切断し、染色体組込型ベクターを作製し
た。
【００４０】実施例２ オーレオバシジン耐性遺伝子
を含有する染色体組込型ベクターの構築 （１） ＰＣＲによる変異を導入した scaur１R のＤＮ
Ａ断片の増幅 Aur１R p （Ｆ１５８Ｙ）の２４０番目のＡｌａをＣｙ
ｓに変換するためにＡｌａのコドンＧＣＴをＣｙｓのコ
ドンＴＧＴに変換した配列表の配列番号２４で表される
プライマーを合成、精製した。 scaur１R を含む３．５
kbＨｉｎｄ III断片をｐＵＣ１１９のＨｉｎｄ III部位
に保持する実施例１−（１）記載のプラスミドｐＵ sca
ur１Ｒを鋳型とし、配列番号２４で表されるプライマー
及びＭ１３Ｍ４プライマーを用いてＰＣＲ法によりＧＣ
ＴがＴＧＴに変換した Aur１R p（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４
０Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸配列をコードする約５００
bpを含むＤＮＡ断片( 約１．４kb）を増幅した。ＰＣＲ
反応は、最終濃度が１０mMトリス（Tris) −ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．３）、５０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ2 、
０．１mM ｄＡＴＰ、０．１mM ｄＣＴＰ、０．１mM
ｄＴＴＰ、０．１mMｄＧＴＰとなるようなＰＣＲ反応緩
衝液２８μｌに、２．５ユニットのアムプリ タックＤ
ＮＡポリメラーゼ、各々１００pmolの配列番号２４で表
されるプライマー及びＭ１３Ｍ４プライマー、１ngのｐ
Ｕ scaur１Ｒと蒸留水を加え、ＰＣＲ反応液１００μｌ
とする。この反応液を９４℃１分間、５５℃１．５分
間、及び７２℃１．５分間の順序で加熱し、このサイク
ルを３０回反復した。その後、ＰＣＲ産物をＳａｌＩと
ＳｎａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で分離さ
せ、目的の約１．３kbＤＮＡ断片をゲルより回収、精製
した。
を含有する染色体組込型ベクターの構築 （１） ＰＣＲによる変異を導入した scaur１R のＤＮ
Ａ断片の増幅 Aur１R p （Ｆ１５８Ｙ）の２４０番目のＡｌａをＣｙ
ｓに変換するためにＡｌａのコドンＧＣＴをＣｙｓのコ
ドンＴＧＴに変換した配列表の配列番号２４で表される
プライマーを合成、精製した。 scaur１R を含む３．５
kbＨｉｎｄ III断片をｐＵＣ１１９のＨｉｎｄ III部位
に保持する実施例１−（１）記載のプラスミドｐＵ sca
ur１Ｒを鋳型とし、配列番号２４で表されるプライマー
及びＭ１３Ｍ４プライマーを用いてＰＣＲ法によりＧＣ
ＴがＴＧＴに変換した Aur１R p（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４
０Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸配列をコードする約５００
bpを含むＤＮＡ断片( 約１．４kb）を増幅した。ＰＣＲ
反応は、最終濃度が１０mMトリス（Tris) −ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．３）、５０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ2 、
０．１mM ｄＡＴＰ、０．１mM ｄＣＴＰ、０．１mM
ｄＴＴＰ、０．１mMｄＧＴＰとなるようなＰＣＲ反応緩
衝液２８μｌに、２．５ユニットのアムプリ タックＤ
ＮＡポリメラーゼ、各々１００pmolの配列番号２４で表
されるプライマー及びＭ１３Ｍ４プライマー、１ngのｐ
Ｕ scaur１Ｒと蒸留水を加え、ＰＣＲ反応液１００μｌ
とする。この反応液を９４℃１分間、５５℃１．５分
間、及び７２℃１．５分間の順序で加熱し、このサイク
ルを３０回反復した。その後、ＰＣＲ産物をＳａｌＩと
ＳｎａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で分離さ
せ、目的の約１．３kbＤＮＡ断片をゲルより回収、精製
した。
【００４１】（２） Aur１R p （Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４
０Ｃ）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドの構築 ｐＵ scaur１ＲをＳａｌＩ及びＳｎａＩで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動で分離させ、目的とする５．３kbの
ＤＮＡ断片を回収し、精製した。このＤＮＡ断片に実施
例２−（１）で得た１．３kbＤＮＡ断片を連結し、 Aur
１R p （Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡ
（ scaur１R −Ｃ）を有するこのプラスミドをｐＵ sca
ur１R −Ｃと命名した。清酒酵母の染色体への組込みに
よる形質転換のために、ｐＵ scaur１R −ＣをＳｔｕＩ
で切断し線状化した後、使用した。また対照としてｐＵ
scaur１ＲもＳｔｕＩで線状化した。
０Ｃ）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドの構築 ｐＵ scaur１ＲをＳａｌＩ及びＳｎａＩで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動で分離させ、目的とする５．３kbの
ＤＮＡ断片を回収し、精製した。このＤＮＡ断片に実施
例２−（１）で得た１．３kbＤＮＡ断片を連結し、 Aur
１R p （Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡ
（ scaur１R −Ｃ）を有するこのプラスミドをｐＵ sca
ur１R −Ｃと命名した。清酒酵母の染色体への組込みに
よる形質転換のために、ｐＵ scaur１R −ＣをＳｔｕＩ
で切断し線状化した後、使用した。また対照としてｐＵ
scaur１ＲもＳｔｕＩで線状化した。
【００４２】（３） Aur１R p （Ａ２４０Ｃ）をコー
ドするＤＮＡを含有するプラスミドの構築 ｐＵ scaur１S をＳａｌＩ及びＳｎａＩで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動で分離させ、目的とする５．３kbの
ＤＮＡ断片を回収し、精製した。このＤＮＡ断片に実施
例２−（１）で得た１．３kbＤＮＡ断片を連結した。 A
ur１S p の２４０番目のＡｌａがＣｙｓに変換した Aur
１R p （Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡを有するこの
プラスミドをｐＵ scaur１Ａ２４０Ｃと命名した。清酒
酵母の染色体への組込みによる形質転換のために、ｐＵ
scaur１Ａ２４０ＣをＳｔｕＩで切断し線状化した後、
使用した。
ドするＤＮＡを含有するプラスミドの構築 ｐＵ scaur１S をＳａｌＩ及びＳｎａＩで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動で分離させ、目的とする５．３kbの
ＤＮＡ断片を回収し、精製した。このＤＮＡ断片に実施
例２−（１）で得た１．３kbＤＮＡ断片を連結した。 A
ur１S p の２４０番目のＡｌａがＣｙｓに変換した Aur
１R p （Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡを有するこの
プラスミドをｐＵ scaur１Ａ２４０Ｃと命名した。清酒
酵母の染色体への組込みによる形質転換のために、ｐＵ
scaur１Ａ２４０ＣをＳｔｕＩで切断し線状化した後、
使用した。
【００４３】実施例３ 清酒酵母を宿主に用いた形質
転換 （１） 実施例１記載のプラスミドｐＡＵＲ１の線状化
ベクター約１０μｇを清酒酵母協会７０１号に酢酸リチ
ウム法〔ジャーナル オブ バクテリオロジー（Journa
l of Bacteriology)、第１５３巻、第１６３頁（１９８
３）〕によって導入した。すなわち、０．１Ｍ酢酸リチ
ウム水溶液に懸濁し処理しておいた清酒酵母協会７０１
号（約１．３×１０8 細胞／１００μｌの０．１Ｍ酢酸
リチウム）に、あらかじめＳｔｕＩを用いて、 scaur１
R を１ヵ所切断し直鎖状にしておいたベクター１０μｇ
を添加し、３０℃にて３０分間処理した。続いて、４２
℃１５分間処理後、遠心して集菌し、５mlのＹＥＰＤ液
体培地で前々培養を行い、更にオーレオバシジンＡ
（０．４μｇ／ml）を含むＹＥＰＤ−液体培地で前培養
後、オーレオバシジンＡ ０．８μｇ／mlを含むＹＥＰ
Ｄ寒天培地にて、形質転換体を得、該形質転換体を清酒
酵母協会７０１号／ｐＡＵＲ１と命名した。この形質転
換体は、オーレオバシジンＡ非存在下で３代継代後、オ
ーレオバシジンＡに対する感受性を測定したところ、親
株の清酒酵母協会７０１号の８倍の耐性（ＭＩＣ １．
５６μｇ／ml）を示し、オーレオバシジン耐性を保持し
ていた。したがって、宿主染色体上で形成されたオーレ
オバシジン耐性は、選択マーカーとして、利用できるこ
とが確認された。
転換 （１） 実施例１記載のプラスミドｐＡＵＲ１の線状化
ベクター約１０μｇを清酒酵母協会７０１号に酢酸リチ
ウム法〔ジャーナル オブ バクテリオロジー（Journa
l of Bacteriology)、第１５３巻、第１６３頁（１９８
３）〕によって導入した。すなわち、０．１Ｍ酢酸リチ
ウム水溶液に懸濁し処理しておいた清酒酵母協会７０１
号（約１．３×１０8 細胞／１００μｌの０．１Ｍ酢酸
リチウム）に、あらかじめＳｔｕＩを用いて、 scaur１
R を１ヵ所切断し直鎖状にしておいたベクター１０μｇ
を添加し、３０℃にて３０分間処理した。続いて、４２
℃１５分間処理後、遠心して集菌し、５mlのＹＥＰＤ液
体培地で前々培養を行い、更にオーレオバシジンＡ
（０．４μｇ／ml）を含むＹＥＰＤ−液体培地で前培養
後、オーレオバシジンＡ ０．８μｇ／mlを含むＹＥＰ
Ｄ寒天培地にて、形質転換体を得、該形質転換体を清酒
酵母協会７０１号／ｐＡＵＲ１と命名した。この形質転
換体は、オーレオバシジンＡ非存在下で３代継代後、オ
ーレオバシジンＡに対する感受性を測定したところ、親
株の清酒酵母協会７０１号の８倍の耐性（ＭＩＣ １．
５６μｇ／ml）を示し、オーレオバシジン耐性を保持し
ていた。したがって、宿主染色体上で形成されたオーレ
オバシジン耐性は、選択マーカーとして、利用できるこ
とが確認された。
【００４４】（２） 実施例２−（２）で作製したｐＵ
scaur１R −Ｃ、実施例２−（３）で作製したｐＵ sca
ur１Ａ２４０Ｃ、実施例１−（１）で作製したｐＵ sca
ur１Ｒの活性を比較するためＳｔｕＩで線状化したプラ
スミド５μｇを清酒酵母協会７０１号に酢酸リチウム法
によって導入した。すなわち、０．１Ｍ酢酸リチウム水
溶液（ｐＨ７．５）に懸濁しコンピテント化した清酒酵
母（約６×１０7 ／１００μｌの０．１Ｍ酢酸リチウ
ム）に、ＳｔｕＩで１ヵ所切断し直鎖状にしたプラスミ
ド５μｇと８５０μｌの４０％ポリエチレングリコール
／０．１Ｍ酢酸リチウムを添加し、３０℃、３０分間処
理した。更に、４２℃、１５分間保温した後、集菌し、
５mlのＹＥＰＤ液体培地で１時間又は一晩、前培養し、
各濃度のオーレオバシジンＡを含むＹＥＰＤ寒天培地に
塗布した。３０℃、３〜４日の培養後、オーレオバシジ
ンＡに耐性を有する形質転換体を得た。表４が示すよう
にＳｔｕＩ線状化ｐＵ scaur１R −Ｃによる形質転換体
は５μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡを含む培地でも生
育可能である。これらの形質転換体は数回の継代後も安
定に親株の１０倍以上のオーレオバシジンＡ耐性を有し
ていた。また線状化ｐＵscaur１R −Ｃの形質転換によ
り得られた形質転換体のオーレオバシジンＡに対するＭ
ＩＣは２０μｇ／ｍｌ以上であった。したがって、 Aur
１R p （Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）は清酒酵母に対する
有効な選択マーカーとして利用できることが確認され
た。表が示すようにＳｔｕＩ線状化ｐＵ scaur１Ａ２４
０ＣをＳｔｕＩ線状化ｐＵ scaur１Ｒよりも強い耐性付
与活性を示した。すなわち、 Aur１Sp の２４０番目の
Ａｌａの変異により強い耐性付与活性が発現した。
scaur１R −Ｃ、実施例２−（３）で作製したｐＵ sca
ur１Ａ２４０Ｃ、実施例１−（１）で作製したｐＵ sca
ur１Ｒの活性を比較するためＳｔｕＩで線状化したプラ
スミド５μｇを清酒酵母協会７０１号に酢酸リチウム法
によって導入した。すなわち、０．１Ｍ酢酸リチウム水
溶液（ｐＨ７．５）に懸濁しコンピテント化した清酒酵
母（約６×１０7 ／１００μｌの０．１Ｍ酢酸リチウ
ム）に、ＳｔｕＩで１ヵ所切断し直鎖状にしたプラスミ
ド５μｇと８５０μｌの４０％ポリエチレングリコール
／０．１Ｍ酢酸リチウムを添加し、３０℃、３０分間処
理した。更に、４２℃、１５分間保温した後、集菌し、
５mlのＹＥＰＤ液体培地で１時間又は一晩、前培養し、
各濃度のオーレオバシジンＡを含むＹＥＰＤ寒天培地に
塗布した。３０℃、３〜４日の培養後、オーレオバシジ
ンＡに耐性を有する形質転換体を得た。表４が示すよう
にＳｔｕＩ線状化ｐＵ scaur１R −Ｃによる形質転換体
は５μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡを含む培地でも生
育可能である。これらの形質転換体は数回の継代後も安
定に親株の１０倍以上のオーレオバシジンＡ耐性を有し
ていた。また線状化ｐＵscaur１R −Ｃの形質転換によ
り得られた形質転換体のオーレオバシジンＡに対するＭ
ＩＣは２０μｇ／ｍｌ以上であった。したがって、 Aur
１R p （Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）は清酒酵母に対する
有効な選択マーカーとして利用できることが確認され
た。表が示すようにＳｔｕＩ線状化ｐＵ scaur１Ａ２４
０ＣをＳｔｕＩ線状化ｐＵ scaur１Ｒよりも強い耐性付
与活性を示した。すなわち、 Aur１Sp の２４０番目の
Ａｌａの変異により強い耐性付与活性が発現した。
【００４５】
【表４】
表 ４
───────────────────────────────────
形質転換体数／μｇＤＮＡ
プラスミド 前培養 ─────────────────
時間 オーレオバシジンＡ濃度
0.5μg/ml 1.0μg/ml 5.0μg/ml
───────────────────────────────────
StuI線状化pUscaur1R １時間 0 0 0
一 晩 5 4 0
StuI線状化pUscaur1R -C １時間 170 73 0
一 晩 2368 2024 64
StuI線状化pUscaur1A240C １時間 18 1 0
一 晩 160 152 0
プラスミドなし １時間 0 0 0
（コントロール） 一 晩 0 0 0
───────────────────────────────────
【００４６】実施例４ オーレオバシジン耐性遺伝子
及びＡＡＲＥ遺伝子を含有する染色体組込型ベクターに
よる形質転換 （１） ＡＡＲＥ遺伝子を含有するプラスミドの構築 プラスミドｐＡＵＲ１の０．５μｇをＳｐｈＩで切断し
た後、アガロースゲル電気泳動で分離させ、直鎖状にな
ったプラスミドｐＡＵＲ１をゲルより回収精製した。次
に特開平３−２５４６８０号公報に記載のＡＡＲＥ遺伝
子を含有するプラスミドｐＹＨＡ２０１を保有する酵母
ＢＪ２１６８、Saccharomyces cerevisiae BJ2168/pYHA
201 〔微工研菌寄第１１５７０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１
５７０）〕よりプラスミドｐＹＨＡ２０１を調製し、プ
ラスミドｐＹＨＡ２０１の０．５μｇをＳｐｈＩで消化
して遊離する約３．２kbのＤＮＡ断片を分離精製した。
この３．２kbのＤＮＡ断片には、ＡＤＨ１プロモーター
下流につないだＡＡＲＥ遺伝子が含まれている。精製し
た両ＳｐｈＩ切断ＤＮＡ断片各０．２μｇずつを用い
て、ライゲーション反応を行った。反応については、Ｄ
ＮＡライゲーション キット（宝酒造社製）を用いて連
結した。続いてプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に組込
み、培養後、形質転換体及びプラスミドＤＮＡを調製
し、こうして得られたプラスミドをプラスミドｐＡＵＲ
１ａａｒｅと命名した。また形質転換体は Escherichia
coli JM109/pAUR1aare と命名、表示し、工業技術院生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１４３６６として
寄託した。
及びＡＡＲＥ遺伝子を含有する染色体組込型ベクターに
よる形質転換 （１） ＡＡＲＥ遺伝子を含有するプラスミドの構築 プラスミドｐＡＵＲ１の０．５μｇをＳｐｈＩで切断し
た後、アガロースゲル電気泳動で分離させ、直鎖状にな
ったプラスミドｐＡＵＲ１をゲルより回収精製した。次
に特開平３−２５４６８０号公報に記載のＡＡＲＥ遺伝
子を含有するプラスミドｐＹＨＡ２０１を保有する酵母
ＢＪ２１６８、Saccharomyces cerevisiae BJ2168/pYHA
201 〔微工研菌寄第１１５７０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１
５７０）〕よりプラスミドｐＹＨＡ２０１を調製し、プ
ラスミドｐＹＨＡ２０１の０．５μｇをＳｐｈＩで消化
して遊離する約３．２kbのＤＮＡ断片を分離精製した。
この３．２kbのＤＮＡ断片には、ＡＤＨ１プロモーター
下流につないだＡＡＲＥ遺伝子が含まれている。精製し
た両ＳｐｈＩ切断ＤＮＡ断片各０．２μｇずつを用い
て、ライゲーション反応を行った。反応については、Ｄ
ＮＡライゲーション キット（宝酒造社製）を用いて連
結した。続いてプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に組込
み、培養後、形質転換体及びプラスミドＤＮＡを調製
し、こうして得られたプラスミドをプラスミドｐＡＵＲ
１ａａｒｅと命名した。また形質転換体は Escherichia
coli JM109/pAUR1aare と命名、表示し、工業技術院生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１４３６６として
寄託した。
【００４７】（２） ＡＡＲＥの清酒酵母における発現
上記に示したプラスミドｐＡＵＲ１ａａｒｅ約１０μｇ
と清酒酵母協会７０１号を用いて、実施例３に示した方
法と同様に、プラスミドｐＡＵＲ１ａａｒｅを直鎖状に
して形質転換を行い、オーレオバシジンＡを０．４μｇ
／ml含むＹＥＰＤ寒天培地上にて、オーレオバシジン耐
性の形質転換体を得た。該形質転換体は Saccharomyces
cerevisiae K701/pAUR1aareと命名、表示され工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４３７９
として寄託されている。次にこの形質転換体を５mlの最
小培地〔０．６７％ バクト イーストニトロジェンベ
ース ｗ／ｏアミノ酸（ディフコ社製）、２％グルコー
ス〕に接種し、３０℃で二晩培養後、遠心分離にて集菌
した。上清を捨てた後、菌体を２mlの水で洗浄し、再び
遠心集菌を行った。続いて、０．２Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．２）７００μｌに懸濁した。これに、
４００μｌ相当のガラスビーズ（直径０．４０〜０．６
０mm）を加え氷冷しながら激しくかくはんして菌体を破
砕した。遠心分離後、上清を回収し、酵母抽出液とし
た。同様に清酒酵母協会７０１号、及び実施例３におい
て得られた清酒酵母協会７０１号／ｐＡＵＲ１について
も抽出液を用意した。
と清酒酵母協会７０１号を用いて、実施例３に示した方
法と同様に、プラスミドｐＡＵＲ１ａａｒｅを直鎖状に
して形質転換を行い、オーレオバシジンＡを０．４μｇ
／ml含むＹＥＰＤ寒天培地上にて、オーレオバシジン耐
性の形質転換体を得た。該形質転換体は Saccharomyces
cerevisiae K701/pAUR1aareと命名、表示され工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４３７９
として寄託されている。次にこの形質転換体を５mlの最
小培地〔０．６７％ バクト イーストニトロジェンベ
ース ｗ／ｏアミノ酸（ディフコ社製）、２％グルコー
ス〕に接種し、３０℃で二晩培養後、遠心分離にて集菌
した。上清を捨てた後、菌体を２mlの水で洗浄し、再び
遠心集菌を行った。続いて、０．２Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．２）７００μｌに懸濁した。これに、
４００μｌ相当のガラスビーズ（直径０．４０〜０．６
０mm）を加え氷冷しながら激しくかくはんして菌体を破
砕した。遠心分離後、上清を回収し、酵母抽出液とし
た。同様に清酒酵母協会７０１号、及び実施例３におい
て得られた清酒酵母協会７０１号／ｐＡＵＲ１について
も抽出液を用意した。
【００４８】このようにして得た抽出液のアシルアミノ
酸遊離酵素活性を以下のように測定した。０．０２０mM
Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンと７−アミノ−４−メ
チル−クマリン（ＡＭＣ）とのアミドを含む、０．５％
ジメチルホルムアミド−０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７．２）０．８９mlを、３７℃で約５分間予熱
した後、１００μｌの上記抽出液を加えて混合し、３７
℃で１５分間保温した。反応後１０μｌの１０％ＳＤＳ
を加えて反応を停止させ、これを蛍光光度計で蛍光強度
を測定した。すわなち励起波長３８０nm、測定波長を４
４０nmとし、遊離したＡＭＣの量は、濃度既知のＡＭＣ
にてあらかじめ標準曲線を作成しておき、それと比較す
ることにより定量した。先に調製した抽出液１００μｌ
は、上記反応液中で１５分間で約２５pmolのＡＭＣを遊
離させる活性を持っていた。なお、プラスミドを保持し
ない清酒酵母協会７０１号、及び実施例３において得ら
れた清酒酵母協会７０１号／ｐＡＵＲ１より調製した抽
出液を用いた活性測定においては、ＡＡＲＥ活性は認め
られなかった。
酸遊離酵素活性を以下のように測定した。０．０２０mM
Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンと７−アミノ−４−メ
チル−クマリン（ＡＭＣ）とのアミドを含む、０．５％
ジメチルホルムアミド−０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７．２）０．８９mlを、３７℃で約５分間予熱
した後、１００μｌの上記抽出液を加えて混合し、３７
℃で１５分間保温した。反応後１０μｌの１０％ＳＤＳ
を加えて反応を停止させ、これを蛍光光度計で蛍光強度
を測定した。すわなち励起波長３８０nm、測定波長を４
４０nmとし、遊離したＡＭＣの量は、濃度既知のＡＭＣ
にてあらかじめ標準曲線を作成しておき、それと比較す
ることにより定量した。先に調製した抽出液１００μｌ
は、上記反応液中で１５分間で約２５pmolのＡＭＣを遊
離させる活性を持っていた。なお、プラスミドを保持し
ない清酒酵母協会７０１号、及び実施例３において得ら
れた清酒酵母協会７０１号／ｐＡＵＲ１より調製した抽
出液を用いた活性測定においては、ＡＡＲＥ活性は認め
られなかった。
【００４９】更に、オーレオバシジン耐性遺伝子をプロ
ーブに用いたサザンハイブリダイゼーションによる解析
を行った。すなわちハイブリダイゼーションのプローブ
としては、プラスミドｐＡＵＲ１を鋳型に、配列番号１
６、１７でそれぞれ表されるプライマーを用い、ＰＣＲ
法にて増幅したscaur1R フラグメント約１．６kbを用い
た。その得られた断片１００ngを BcaBESTTM ラベリン
グ キット（LabelingKit) を用いて、32Ｐで標識し
た。またハイブリダイゼーション用フィルターには、各
種制限酵素（ＨｐａＩ：これはpAUR1aare 上にその切断
部位をもたない。ＢａｍＨＩ：pAUR1aare 上で２ヵ所切
断部位をもつ）で、清酒酵母協会７０１号、及び Sacch
aromyces cerevisiae K701/pAUR1aareのそれぞれのゲノ
ムＤＮＡを切断後、アガロースゲル電気泳動にて泳動し
たものをトランスファーした。
ーブに用いたサザンハイブリダイゼーションによる解析
を行った。すなわちハイブリダイゼーションのプローブ
としては、プラスミドｐＡＵＲ１を鋳型に、配列番号１
６、１７でそれぞれ表されるプライマーを用い、ＰＣＲ
法にて増幅したscaur1R フラグメント約１．６kbを用い
た。その得られた断片１００ngを BcaBESTTM ラベリン
グ キット（LabelingKit) を用いて、32Ｐで標識し
た。またハイブリダイゼーション用フィルターには、各
種制限酵素（ＨｐａＩ：これはpAUR1aare 上にその切断
部位をもたない。ＢａｍＨＩ：pAUR1aare 上で２ヵ所切
断部位をもつ）で、清酒酵母協会７０１号、及び Sacch
aromyces cerevisiae K701/pAUR1aareのそれぞれのゲノ
ムＤＮＡを切断後、アガロースゲル電気泳動にて泳動し
たものをトランスファーした。
【００５０】図２において、レーン１と３は清酒酵母協
会７０１号、レーン２と４は Saccharomyces cerevisia
e K701/pAUR1aareより得られたゲノムＤＮＡをレーン１
と２はＨｐａＩでレーン３と４はＢａｍＨＩで切断した
後、サザンハイブリダイゼーションしたものである。Ｈ
ｐａＩの切断部位はプラスミドｐＡＵＲ１ａａｒｅ上に
はなく、ゲノムＤＮＡ上のみを切断するため、レーン１
と２より、オーレオバシジン耐性遺伝子は１対の染色体
のうち一方の染色体上に組込まれていることが明らかと
なった。レーン３と４より、オーレオバシジン耐性遺伝
子は、清酒酵母の染色体のオーレオバシジン感受性遺伝
子に相同的に組込まれていることを確認した。このこと
は、清酒酵母の遺伝子群が、オーレオバシジン耐性遺伝
子のランダムな組込みによって破壊されなかったことを
示している。以上、本発明の染色体組込型ベクターを用
いてオーレオバシジン感受性真菌に耐性を付与し、更
に、異種遺伝子を発現することができた。
会７０１号、レーン２と４は Saccharomyces cerevisia
e K701/pAUR1aareより得られたゲノムＤＮＡをレーン１
と２はＨｐａＩでレーン３と４はＢａｍＨＩで切断した
後、サザンハイブリダイゼーションしたものである。Ｈ
ｐａＩの切断部位はプラスミドｐＡＵＲ１ａａｒｅ上に
はなく、ゲノムＤＮＡ上のみを切断するため、レーン１
と２より、オーレオバシジン耐性遺伝子は１対の染色体
のうち一方の染色体上に組込まれていることが明らかと
なった。レーン３と４より、オーレオバシジン耐性遺伝
子は、清酒酵母の染色体のオーレオバシジン感受性遺伝
子に相同的に組込まれていることを確認した。このこと
は、清酒酵母の遺伝子群が、オーレオバシジン耐性遺伝
子のランダムな組込みによって破壊されなかったことを
示している。以上、本発明の染色体組込型ベクターを用
いてオーレオバシジン感受性真菌に耐性を付与し、更
に、異種遺伝子を発現することができた。
【００５１】
【発明の効果】本発明により、真菌、特に工業用真菌の
遺伝子組換えにおいて有用なオーレオバシジン耐性を選
択マーカーとした染色体組込型用ベクター、該ベクター
を導入された形質転換体、その創製方法、及び該方法で
得られる形質転換体が提供された。これらは、有用蛋白
質製造用形質転換体の創製、育種等に有効に利用でき
る。特に、Ｓ．セレビシエは、工業用酵母として最も広
く使用されているのみならず、遺伝子組換えにおいても
安全性の高い酵母である。したがって、Ｓ．セレビシエ
由来のオーレオバシジン耐性遺伝子はＳ．セレビシエの
育種、有用蛋白質の製造のための形質転換体作製のため
に非常に有用である。
遺伝子組換えにおいて有用なオーレオバシジン耐性を選
択マーカーとした染色体組込型用ベクター、該ベクター
を導入された形質転換体、その創製方法、及び該方法で
得られる形質転換体が提供された。これらは、有用蛋白
質製造用形質転換体の創製、育種等に有効に利用でき
る。特に、Ｓ．セレビシエは、工業用酵母として最も広
く使用されているのみならず、遺伝子組換えにおいても
安全性の高い酵母である。したがって、Ｓ．セレビシエ
由来のオーレオバシジン耐性遺伝子はＳ．セレビシエの
育種、有用蛋白質の製造のための形質転換体作製のため
に非常に有用である。
【００５２】
【００５３】配列番号：1
配列の長さ：2385
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
AAGCTTTTTT GCCTCTGCAA AAGTTCCTTT CTCGAATTGG TTTTTTGAGG AAAAGCAAGT 60
TAATAAACTA ATTATATTAT ATATAATTAG CAATTTTATA AAAAAAATAA AAAAATAGCC 120
CTGATTGCTG GCAACTGTGA GCTGAACATT GGTTAATCGG TCCATCTTTT TTTAAATATT 180
TTACATCGCT ACTTTTAAGT GCTTGACACT TGCATTTAAT AGCTACTTTC TTTCCTTCAT 240
AAAAATTCCT TTTTTTTCCT TTAGTTTTCC GGTTAATTCC TTACGAAATT TTTTTCGTAC 300
GCTTCCCTTT TTTACTCTGA TAATTCTTTG AAGCAATGTC TGCTCTTTCG ACCTTAAAAA 360
AGCGCCTTGC TGCGTGTAAC CGAGCATCCC AATACAAGTT GGAAACAAGC TTAAACCCTA 420
TGCCTACATT TCGTTTGCTA CGCAATACGA AATGGTCATG GACACATTTG CAATATGTGT 480
TTCTAGCAGG TAATTTGATT TTTGCTTGTA TTGTCATTGA ATCTCCTGGA TTCTGGGGGA 540
AATTTGGCAT TGCCTGTCTT TTGGCCATTG CGTTGACCGT TCCTTTAACA CGCCAAATTT 600
TTTTTCCTGC CATTGTTATC ATCACCTGGG CAATTTTATT TTACTCTTGT AGGTTTATTC 660
CAGAACGCTG GCGTCCACCC ATATGGGTTC GTGTTTTACC CACACTTGAA AATATTCTTT 720
ATGGCTCTAA TCTTTCTAGT CTTCTCTCGA AAACCACGCA TAGCATCCTT GATATTTTGG 780
CCTGGGTTCC ATATGGAGTC ATGCATTATT CGGCTCCTTT TATCATTTCA TTTATTCTTT 840
TCATCTTTGC ACCTCCTGGA ACTCTTCCAG TTTGGGCTCG AACTTTTGGT TATATGAATT 900
TATTTGGTGT TCTTATCCAA ATGGCTTTCC CCTGTTCTCC TCCTTGGTAT GAAAATATGT 960
ATGGTTTAGA ACCTGCCACG TATGCAGTAC GTGGCTCTCC TGGTGGATTG GCCCGTATTG 1020
ATGCTCTCTT CGGCACTAGC ATTTACACTG ATTGTTTTTC TAACTCTCCG GTTGTTTTTG 1080
GTGCCTTTCC ATCTCTTCAC GCTGGATGGG CCATGCTGGA AGCACTTTTC CTTTCGCATG 1140
TGTTTCCTCG ATACCGCTTC TGCTTTTATG GATATGTTCT ATGGCTTTGC TGGTGTACTA 1200
TGTACCTTAC CCACCACTAC TTTGTAGATT TGGTCGGCGG TATGTGTTTA GCTATTATAT 1260
GCTTCGTTTT TGCTCAAAAG CTACGCCTCC CACAGTTGCA AACTGGTAAA ATCCTTCGTT 1320
GGGAATACGA GTTTGTTATC CACGGTCATG GTCTTTCCGA AAAAACCAGC AACTCCTTGG 1380
CTCGTACCGG CAGCCCATAC TTACTTGGAA GGGATTCTTT TACTCAAAAC CCTAATGCAG 1440
TAGCCTTCAT GAGTGGTCTT AACAATATGG AACTTGCTAA CACCGATCAT GAATGGTCCG 1500
TGGGTTCATC ATCACCTGAG CCGTTACCTA GTCCTGCTGC TGATTTGATT GATCGTCCTG 1560
CCAGTACCAC TTCCTCCATC TTTGATGCAA GTCATCTTCC TTAAATCAAC GTGCTTTAAG 1620
AATATATTTC CAAAAGCTAC ATGATACATT GACTAGAATC GGTTTGATTC ATAGTGGTAT 1680
TGGAATGATG TTGTTCATTG TGTTTTTTAA CTGTTAATCT GACATCCATT GAGTCATTCT 1740
TTACAATTTG TAAAATTAAT TTGTATCACT AATTTTGAAG GAAGCTATTT TGGTATTAAT 1800
ACCGCTTTTG GTCTCCACTT CCTTTTCGAA ACTCTTAACA GCGATTAGGC CGGGTATCTT 1860
CCAGTGTGAT GTATAGGTAT TTGTCGTTTT TTTATCATTT CCGTTAATAA AGAACTCTTT 1920
TATCCAGCTT CTTACACTGT CAACTGTTGT GAAAGGAACA CATTTAGAAT TTCATTTTCC 1980
TTATTTGTTG TGATTTAAAT CGTTTGACAT AATTTTAAAT TTGGTTTGAA ATGTGTGTGA 2040
GAAGGCTTGT TTTATTCATT TAGTTTATTG CTTGTTTGCA CGAAAATCCA GAACGGAGCA 2100
TTAATGTAAT CCTTTTTTAT TCTGTAAAGC GTTTTTATAC AAATGTTGGT TATACGTTTC 2160
TAAAATAAGA ATATTGTTAT AATAATATAG TTTTTTCTAT CATTTGTTAC ACACACTAAA 2220
GAGACATTAA GGATAAGCAA ATGTGTTAAA ATGATAATAT ATTTTGGAAA CATTTATAAA 2280
GAAATTAAGC AGCTTTGACT AACTACATTT TTGTTTTTTT CCTAAGCAAA ACTGTATAGT 2340
TATACACGCG AGCTGTATTC ACTTCCATTG TAGTGACTTG AGCTC 2385
【００５４】配列番号：2
配列の長さ：422
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Ser Ala Leu Ser Thr Leu Lys Lys Arg Leu Ala Ala Cys Asn
1 5 10 15
Arg Ala Ser Gln Tyr Lys Leu Glu Thr Ser Leu Asn Pro Met Pro
20 25 30
Thr Phe Arg Leu Leu Arg Asn Thr Lys Trp Ser Trp Thr His Leu
35 40 45
Gln Tyr Val Phe Leu Ala Gly Asn Leu Ile Phe Ala Cys Ile Val
50 55 60
Ile Glu Ser Pro Gly Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile Ala Cys Leu
65 70 75
Leu Ala Ile Ala Leu Thr Val Pro Leu Thr Arg Gln Ile Phe Phe
80 85 90
Pro Ala Ile Val Ile Ile Thr Trp Ala Ile Leu Phe Tyr Ser Cys
95 100 105
Arg Phe Ile Pro Glu Arg Trp Arg Pro Pro Ile Trp Val Arg Val
110 115 120
Leu Pro Thr Leu Glu Asn Ile Leu Tyr Gly Ser Asn Leu Ser Ser
125 130 135
Leu Leu Ser Lys Thr Thr His Ser Ile Leu Asp Ile Leu Ala Trp
140 145 150
Val Pro Tyr Gly Val Met His Tyr Ser Ala Pro Phe Ile Ile Ser
155 160 165
Phe Ile Leu Phe Ile Phe Ala Pro Pro Gly Thr Leu Pro Val Trp
170 175 180
Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Leu Ile Gln
185 190 195
Met Ala Phe Pro Cys Ser Pro Pro Trp Tyr Glu Asn Met Tyr Gly
200 205 210
Leu Glu Pro Ala Thr Tyr Ala Val Arg Gly Ser Pro Gly Gly Leu
215 220 225
Ala Arg Ile Asp Ala Leu Phe Gly Thr Ser Ile Tyr Thr Asp Cys
230 235 240
Phe Ser Asn Ser Pro Val Val Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His
245 250 255
Ala Gly Trp Ala Met Leu Glu Ala Leu Phe Leu Ser His Val Phe
260 265 270
Pro Arg Tyr Arg Phe Cys Phe Tyr Gly Tyr Val Leu Trp Leu Cys
275 280 285
Trp Cys Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Val
290 295 300
Gly Gly Met Cys Leu Ala Ile Ile Cys Phe Val Phe Ala Gln Lys
305 310 315
Leu Arg Leu Pro Gln Leu Gln Thr Gly Lys Ile Leu Arg Trp Glu
320 325 330
Tyr Glu Phe Val Ile His Gly His Gly Leu Ser Glu Lys Thr Ser
335 340 345
Asn Ser Leu Ala Arg Thr Gly Ser Pro Tyr Leu Leu Gly Arg Asp
350 355 360
Ser Phe Thr Gln Asn Pro Asn Ala Val Ala Phe Met Ser Gly Leu
365 370 375
Asn Asn Met Glu Leu Ala Asn Thr Asp His Glu Trp Ser Val Gly
380 385 390
Ser Ser Ser Pro Glu Pro Leu Pro Ser Pro Ala Ala Asp Leu Ile
395 400 405
Asp Arg Pro Ala Ser Thr Thr Ser Ser Ile Phe Asp Ala Ser His
410 415 420
Leu Pro
【００５５】配列番号：3
配列の長さ：2385
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
AAGCTTTTTT GCCTCTGCAA AAGTTCCTTT CTCGAATTGG TTTTTTGAGG AAAAGCAAGT 60
TAATAAACTA ATTATATTAT ATATAATTAG CAATTTTATA AAAAAAATAA AAAAATAGCC 120
CTGATTGCTG GCAACTGTGA GCTGAACATT GGTTAATCGG TCCATCTTTT TTTAAATATT 180
TTACATCGCT ACTTTTAAGT GCTTGACACT TGCATTTAAT AGCTACTTTC TTTCCTTCAT 240
AAAAATTCCT TTTTTTTCCT TTAGTTTTCC GGTTAATTCC TTACGAAATT TTTTTCGTAC 300
GCTTCCCTTT TTTACTCTGA TAATTCTTTG AAGCAATGTC TGCTCTTTCG ACCTTAAAAA 360
AGCGCCTTGC TGCGTGTAAC CGAGCATCCC AATACAAGTT GGAAACAAGC TTAAACCCTA 420
TGCCTACATT TCGTTTGCTA CGCAATACGA AATGGTCATG GACACATTTG CAATATGTGT 480
TTCTAGCAGG TAATTTGATT TTTGCTTGTA TTGTCATTGA ATCTCCTGGA TTCTGGGGGA 540
AATTTGGCAT TGCCTGTCTT TTGGCCATTG CGTTGACCGT TCCTTTAACA CGCCAAATTT 600
TTTTTCCTGC CATTGTTATC ATCACCTGGG CAATTTTATT TTACTCTTGT AGGTTTATTC 660
CAGAACGCTG GCGTCCACCC ATATGGGTTC GTGTTTTACC CACACTTGAA AATATTCTTT 720
ATGGCTCTAA TCTTTCTAGT CTTCTCTCGA AAACCACGCA TAGCATCCTT GATATTTTGG 780
CCTGGGTTCC ATATGGAGTC ATGCATTATT CGGCTCCTTT TATCATTTCA TTTATTCTTT 840
TCATCTTTGC ACCTCCTGGA ACTCTTCCAG TTTGGGCTCG AACTTTTGGT TATATGAATT 900
TATTTGGTGT TCTTATCCAA ATGGCTTTCC CCTGTTCTCC TCCTTGGTAT GAAAATATGT 960
ATGGTTTAGA ACCTGCCACG TATGCAGTAC GTGGCTCTCC TGGTGGATTG GCCCGTATTG 1020
ATGCTCTCTT CGGCACTAGC ATTTACACTG ATGGTTTTTC TAACTCTCCG GTTGTTTTTG 1080
GTGCCTTTCC ATCTCTTCAC GCTGGATGGG CCATGCTGGA AGCACTTTTC CTTTCGCATG 1140
TGTTTCCTCG ATACCGCTTC TGCTTTTATG GATATGTTCT ATGGCTTTGC TGGTGTACTA 1200
TGTACCTTAC CCACCACTAC TTTGTAGATT TGGTCGGCGG TATGTGTTTA GCTATTATAT 1260
GCTTCGTTTT TGCTCAAAAG CTACGCCTCC CACAGTTGCA AACTGGTAAA ATCCTTCGTT 1320
GGGAATACGA GTTTGTTATC CACGGTCATG GTCTTTCCGA AAAAACCAGC AACTCCTTGG 1380
CTCGTACCGG CAGCCCATAC TTACTTGGAA GGGATTCTTT TACTCAAAAC CCTAATGCAG 1440
TAGCCTTCAT GAGTGGTCTT AACAATATGG AACTTGCTAA CACCGATCAT GAATGGTCCG 1500
TGGGTTCATC ATCACCTGAG CCGTTACCTA GTCCTGCTGC TGATTTGATT GATCGTCCTG 1560
CCAGTACCAC TTCCTCCATC TTTGATGCAA GTCATCTTCC TTAAATCAAC GTGCTTTAAG 1620
AATATATTTC CAAAAGCTAC ATGATACATT GACTAGAATC GGTTTGATTC ATAGTGGTAT 1680
TGGAATGATG TTGTTCATTG TGTTTTTTAA CTGTTAATCT GACATCCATT GAGTCATTCT 1740
TTACAATTTG TAAAATTAAT TTGTATCACT AATTTTGAAG GAAGCTATTT TGGTATTAAT 1800
ACCGCTTTTG GTCTCCACTT CCTTTTCGAA ACTCTTAACA GCGATTAGGC CGGGTATCTT 1860
CCAGTGTGAT GTATAGGTAT TTGTCGTTTT TTTATCATTT CCGTTAATAA AGAACTCTTT 1920
TATCCAGCTT CTTACACTGT CAACTGTTGT GAAAGGAACA CATTTAGAAT TTCATTTTCC 1980
TTATTTGTTG TGATTTAAAT CGTTTGACAT AATTTTAAAT TTGGTTTGAA ATGTGTGTGA 2040
GAAGGCTTGT TTTATTCATT TAGTTTATTG CTTGTTTGCA CGAAAATCCA GAACGGAGCA 2100
TTAATGTAAT CCTTTTTTAT TCTGTAAAGC GTTTTTATAC AAATGTTGGT TATACGTTTC 2160
TAAAATAAGA ATATTGTTAT AATAATATAG TTTTTTCTAT CATTTGTTAC ACACACTAAA 2220
GAGACATTAA GGATAAGCAA ATGTGTTAAA ATGATAATAT ATTTTGGAAA CATTTATAAA 2280
GAAATTAAGC AGCTTTGACT AACTACATTT TTGTTTTTTT CCTAAGCAAA ACTGTATAGT 2340
TATACACGCG AGCTGTATTC ACTTCCATTG TAGTGACTTG AGCTC 2385
【００５６】配列番号：4
配列の長さ：422
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Ser Ala Leu Ser Thr Leu Lys Lys Arg Leu Ala Ala Cys Asn
1 5 10 15
Arg Ala Ser Gln Tyr Lys Leu Glu Thr Ser Leu Asn Pro Met Pro
20 25 30
Thr Phe Arg Leu Leu Arg Asn Thr Lys Trp Ser Trp Thr His Leu
35 40 45
Gln Tyr Val Phe Leu Ala Gly Asn Leu Ile Phe Ala Cys Ile Val
50 55 60
Ile Glu Ser Pro Gly Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile Ala Cys Leu
65 70 75
Leu Ala Ile Ala Leu Thr Val Pro Leu Thr Arg Gln Ile Phe Phe
80 85 90
Pro Ala Ile Val Ile Ile Thr Trp Ala Ile Leu Phe Tyr Ser Cys
95 100 105
Arg Phe Ile Pro Glu Arg Trp Arg Pro Pro Ile Trp Val Arg Val
110 115 120
Leu Pro Thr Leu Glu Asn Ile Leu Tyr Gly Ser Asn Leu Ser Ser
125 130 135
Leu Leu Ser Lys Thr Thr His Ser Ile Leu Asp Ile Leu Ala Trp
140 145 150
Val Pro Tyr Gly Val Met His Tyr Ser Ala Pro Phe Ile Ile Ser
155 160 165
Phe Ile Leu Phe Ile Phe Ala Pro Pro Gly Thr Leu Pro Val Trp
170 175 180
Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Leu Ile Gln
185 190 195
Met Ala Phe Pro Cys Ser Pro Pro Trp Tyr Glu Asn Met Tyr Gly
200 205 210
Leu Glu Pro Ala Thr Tyr Ala Val Arg Gly Ser Pro Gly Gly Leu
215 220 225
Ala Arg Ile Asp Ala Leu Phe Gly Thr Ser Ile Tyr Thr Asp Gly
230 235 240
Phe Ser Asn Ser Pro Val Val Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His
245 250 255
Ala Gly Trp Ala Met Leu Glu Ala Leu Phe Leu Ser His Val Phe
260 265 270
Pro Arg Tyr Arg Phe Cys Phe Tyr Gly Tyr Val Leu Trp Leu Cys
275 280 285
Trp Cys Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Val
290 295 300
Gly Gly Met Cys Leu Ala Ile Ile Cys Phe Val Phe Ala Gln Lys
305 310 315
Leu Arg Leu Pro Gln Leu Gln Thr Gly Lys Ile Leu Arg Trp Glu
320 325 330
Tyr Glu Phe Val Ile His Gly His Gly Leu Ser Glu Lys Thr Ser
335 340 345
Asn Ser Leu Ala Arg Thr Gly Ser Pro Tyr Leu Leu Gly Arg Asp
350 355 360
Ser Phe Thr Gln Asn Pro Asn Ala Val Ala Phe Met Ser Gly Leu
365 370 375
Asn Asn Met Glu Leu Ala Asn Thr Asp His Glu Trp Ser Val Gly
380 385 390
Ser Ser Ser Pro Glu Pro Leu Pro Ser Pro Ala Ala Asp Leu Ile
395 400 405
Asp Arg Pro Ala Ser Thr Thr Ser Ser Ile Phe Asp Ala Ser His
410 415 420
Leu Pro
【００５７】配列番号：5
配列の長さ：2340
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
TTTCTTTCTG TCAAAGAATA ATAAAGTGCC CATCAGTGTT CATATTTGTT ACAAAGTGGT 60
TTTCTGATTT GGTACTACTG CAGAGGCGTA TTTTTTGCTT CAGTTACCAT AGCGTAAGAA 120
CACTAGCGAC TTTTGTTCGT GAACCAACAG AGTAGGATTT CTACTGCTAC ATCTCTTAGG 180
TAGTTGGTTA GTCCGATCGC TCACTTTTGG TTGTTGTTAA GTACTTCATA AGTTTATCCT 240
TTTCCTTTTT CACACTGAGC TACTTTGGGT ATAGCTTTTG GCCCAAGGAT CTTTGAATTT 300
TCTCCAAAAG TACTTTATTT TATATCCTAC AGGTTGCGGT TTTCATATTT TAAAAAGCTT 360
TTTAATCATT CCTTTGCGTA TGGCAAACCC TTTTTCGAGA TGGTTTCTAT CAGAGAGACC 420
TCCAAACTGC CATGTAGCCG ATTTAGAAAC AAGTTTAGAT CCCCATCAAA CGTTGTTGAA 480
GGTGCAAAAA TACAAACCCG CTTTAAGCGA CTGGGTGCAT TACATCTTCT TGGGATCCAT 540
CATGCTGTTT GTGTTCATTA CTAATCCCGC ACCTTGGATC TTCAAGATCC TTTTTTATTG 600
TTTCTTGGGC ACTTTATTCA TCATTCCAGC TACGTCACAG TTTTTCTTCA ATGCCTTGCC 660
CATCCTAACA TGGGTGGCGC TGTATTTCAC TTCATCGTAC TTTCCAGATG ACCGCAGGCC 720
TCCTATTACT GTCAAAGTGT TACCAGCGGT GGAAACAATT TTATACGGCG ACAATTTAAG 780
TGATATTCTT GCAACATCGA CGAATTCCTT TTTGGACATT TTAGCATGGT TACCGTACGG 840
ACTATTTCAT TATGGGGCCC CATTTGTCGT TGCTGCCATC TTATTCGTAT TTGGTCCACC 900
AACTGTTTTG CAAGGTTATG CTTTTGCATT TGGTTATATG AACCTGTTTG GTGTTATCAT 960
GCAAAATGTC TTTCCAGCCG CTCCCCCATG GTATAAAATT CTCTATGGAT TGCAATCAGC 1020
CAACTATGAT ATGCATGGCT CGCCTGGTGG ATTAGCTAGA ATTGATAAGC TACTCGGTAT 1080
TAATATGTAT ACTACAGCTT TTTCAAATTC CTCCGTCATT TTCGGTGCTT TTCCTTCACT 1140
GCATTCCGGG TGTGCTACTA TGGAAGCCCT GTTTTTCTGT TATTGTTTTC CAAAATTGAA 1200
GCCCTTGTTT ATTGCTTATG TTTGCTGGTT ATGGTGGTCA ACTATGTATC TGACACACCA 1260
TTATTTTGTA GACCTTATGG CAGGTTCTGT GCTGTCATAC GTTATTTTCC AGTACACAAA 1320
GTACACACAT TTACCAATTG TAGATACATC TCTTTTTTGC AGATGGTCAT ACACTTCAAT 1380
TGAGAAATAC GATATATCAA AGAGTGATCC ATTGGCTGCA GATTCAAACG ATATCGAAAG 1440
TGTCCCTTTG TCCAACTTGG AACTTGACTT TGATCTTAAT ATGACTGATG AACCCAGTGT 1500
AAGCCCTTCG TTATTTGATG GATCTACTTC TGTTTCTCGT TCGTCCGCCA CGTCTATAAC 1560
GTCACTAGGT GTAAAGAGGG CTTAATGAGT ATTTTATCTG CAATTACGGA TACGGTTGGT 1620
CTTATGTAGA TACATATAAA TATATATCTT TTTCTTTCTT TTTCTTAGTC AGGATTGTCG 1680
TTTAGCATAA TATACATGTA GTTTATTTAA TCACATACCA CTGATTATCT TTAGAATTTT 1740
ATAAATTTTT GAAATAAATG GGTGGCTTTT AATGGTGTCT ATGTTAAGTG AGGCTTTTAG 1800
AATGCTCTTC CTGCTTTGTT TATTATATGT GTATGAAAGA TATGTATGTA TTTACATGTG 1860
TTTGTAGCGT CCCCAGTCAA AACCTGTGCG CTATACCTAA ATGGATTGAT AATCTTCATT 1920
CACTAATTCT AAAATAGACT TCTTCCCCAA AGAACGGTGT AACGATGAGG CTCTATCCAG 1980
CTGCTTATCT AAATCAACTT TAACGATGGA TGATCTTATG ACACGGGGAT CTTTCTTTAA 2040
AGTTCTTAGA ATTTCAGACT GTACCGCAGC TGATGAATCA AACAGCATTA AAAAGTGATA 2100
TGCTCGAAAA TGTTTTTCCT GGTCTTTCTT CATTATTTTA GGAAGATACC TTATGCCCAT 2160
GGGTACAATG TCCCTCACCA CACCTCTGTT TTGAATAATC AGTTTCCCGA TTGTGGAAGA 2220
CAATTCTTTT GCTTCCAACT TTGGCGCATT GGAGTTGGTT ATGCGAACAA GTCCGATCAG 2280
CTCATAAAGC ATCTTAGTGA AAAGGGTGGT TTTGCGTTAT TCTTTCCTCT GTTGAAGCTT 2340
【００５８】配列番号：6
配列の長さ：401
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Ala Asn Pro Phe Ser Arg Trp Phe Leu Ser Glu Arg Pro Pro
1 5 10 15
Asn Cys His Val Ala Asp Leu Glu Thr Ser Leu Asp Pro His Gln
20 25 30
Thr Leu Leu Lys Val Gln Lys Tyr Lys Pro Ala Leu Ser Asp Trp
35 40 45
Val His Tyr Ile Phe Leu Gly Ser Ile Met Leu Phe Val Phe Ile
50 55 60
Thr Asn Pro Ala Pro Trp Ile Phe Lys Ile Leu Phe Tyr Cys Phe
65 70 75
Leu Gly Thr Leu Phe Ile Ile Pro Ala Thr Ser Gln Phe Phe Phe
80 85 90
Asn Ala Leu Pro Ile Leu Thr Trp Val Ala Leu Tyr Phe Thr Ser
95 100 105
Ser Tyr Phe Pro Asp Asp Arg Arg Pro Pro Ile Thr Val Lys Val
110 115 120
Leu Pro Ala Val Glu Thr Ile Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asp
125 130 135
Ile Leu Ala Thr Ser Thr Asn Ser Phe Leu Asp Ile Leu Ala Trp
140 145 150
Leu Pro Tyr Gly Leu Phe His Tyr Gly Ala Pro Phe Val Val Ala
155 160 165
Ala Ile Leu Phe Val Phe Gly Pro Pro Thr Val Leu Gln Gly Tyr
170 175 180
Ala Phe Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Ile Met Gln
185 190 195
Asn Val Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Ile Leu Tyr Gly
200 205 210
Leu Gln Ser Ala Asn Tyr Asp Met His Gly Ser Pro Gly Gly Leu
215 220 225
Ala Arg Ile Asp Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Tyr Thr Thr Ala
230 235 240
Phe Ser Asn Ser Ser Val Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His
245 250 255
Ser Gly Cys Ala Thr Met Glu Ala Leu Phe Phe Cys Tyr Cys Phe
260 265 270
Pro Lys Leu Lys Pro Leu Phe Ile Ala Tyr Val Cys Trp Leu Trp
275 280 285
Trp Ser Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Met
290 295 300
Ala Gly Ser Val Leu Ser Tyr Val Ile Phe Gln Tyr Thr Lys Tyr
305 310 315
Thr His Leu Pro Ile Val Asp Thr Ser Leu Phe Cys Arg Trp Ser
320 325 330
Tyr Thr Ser Ile Glu Lys Tyr Asp Ile Ser Lys Ser Asp Pro Leu
335 340 345
Ala Ala Asp Ser Asn Asp Ile Glu Ser Val Pro Leu Ser Asn Leu
350 355 360
Glu Leu Asp Phe Asp Leu Asn Met Thr Asp Glu Pro Ser Val Ser
365 370 375
Pro Ser Leu Phe Asp Gly Ser Thr Ser Val Ser Arg Ser Ser Ala
380 385 390
Thr Ser Ile Thr Ser Leu Gly Val Lys Arg Ala
395 400
【００５９】配列番号：7
配列の長さ：2340
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
TTTCTTTCTG TCAAAGAATA ATAAAGTGCC CATCAGTGTT CATATTTGTT ACAAAGTGGT 60
TTTCTGATTT GGTACTACTG CAGAGGCGTA TTTTTTGCTT CAGTTACCAT AGCGTAAGAA 120
CACTAGCGAC TTTTGTTCGT GAACCAACAG AGTAGGATTT CTACTGCTAC ATCTCTTAGG 180
TAGTTGGTTA GTCCGATCGC TCACTTTTGG TTGTTGTTAA GTACTTCATA AGTTTATCCT 240
TTTCCTTTTT CACACTGAGC TACTTTGGGT ATAGCTTTTG GCCCAAGGAT CTTTGAATTT 300
TCTCCAAAAG TACTTTATTT TATATCCTAC AGGTTGCGGT TTTCATATTT TAAAAAGCTT 360
TTTAATCATT CCTTTGCGTA TGGCAAACCC TTTTTCGAGA TGGTTTCTAT CAGAGAGACC 420
TCCAAACTGC CATGTAGCCG ATTTAGAAAC AAGTTTAGAT CCCCATCAAA CGTTGTTGAA 480
GGTGCAAAAA TACAAACCCG CTTTAAGCGA CTGGGTGCAT TACATCTTCT TGGGATCCAT 540
CATGCTGTTT GTGTTCATTA CTAATCCCGC ACCTTGGATC TTCAAGATCC TTTTTTATTG 600
TTTCTTGGGC ACTTTATTCA TCATTCCAGC TACGTCACAG TTTTTCTTCA ATGCCTTGCC 660
CATCCTAACA TGGGTGGCGC TGTATTTCAC TTCATCGTAC TTTCCAGATG ACCGCAGGCC 720
TCCTATTACT GTCAAAGTGT TACCAGCGGT GGAAACAATT TTATACGGCG ACAATTTAAG 780
TGATATTCTT GCAACATCGA CGAATTCCTT TTTGGACATT TTAGCATGGT TACCGTACGG 840
ACTATTTCAT TTTGGGGCCC CATTTGTCGT TGCTGCCATC TTATTCGTAT TTGGTCCACC 900
AACTGTTTTG CAAGGTTATG CTTTTGCATT TGGTTATATG AACCTGTTTG GTGTTATCAT 960
GCAAAATGTC TTTCCAGCCG CTCCCCCATG GTATAAAATT CTCTATGGAT TGCAATCAGC 1020
CAACTATGAT ATGCATGGCT CGCCTGGTGG ATTAGCTAGA ATTGATAAGC TACTCGGTAT 1080
TAATATGTAT ACTACAGCTT TTTCAAATTC CTCCGTCATT TTCGGTGCTT TTCCTTCACT 1140
GCATTCCGGG TGTGCTACTA TGGAAGCCCT GTTTTTCTGT TATTGTTTTC CAAAATTGAA 1200
GCCCTTGTTT ATTGCTTATG TTTGCTGGTT ATGGTGGTCA ACTATGTATC TGACACACCA 1260
TTATTTTGTA GACCTTATGG CAGGTTCTGT GCTGTCATAC GTTATTTTCC AGTACACAAA 1320
GTACACACAT TTACCAATTG TAGATACATC TCTTTTTTGC AGATGGTCAT ACACTTCAAT 1380
TGAGAAATAC GATATATCAA AGAGTGATCC ATTGGCTGCA GATTCAAACG ATATCGAAAG 1440
TGTCCCTTTG TCCAACTTGG AACTTGACTT TGATCTTAAT ATGACTGATG AACCCAGTGT 1500
AAGCCCTTCG TTATTTGATG GATCTACTTC TGTTTCTCGT TCGTCCGCCA CGTCTATAAC 1560
GTCACTAGGT GTAAAGAGGG CTTAATGAGT ATTTTATCTG CAATTACGGA TACGGTTGGT 1620
CTTATGTAGA TACATATAAA TATATATCTT TTTCTTTCTT TTTCTTAGTC AGGATTGTCG 1680
TTTAGCATAA TATACATGTA GTTTATTTAA TCACATACCA CTGATTATCT TTAGAATTTT 1740
ATAAATTTTT GAAATAAATG GGTGGCTTTT AATGGTGTCT ATGTTAAGTG AGGCTTTTAG 1800
AATGCTCTTC CTGCTTTGTT TATTATATGT GTATGAAAGA TATGTATGTA TTTACATGTG 1860
TTTGTAGCGT CCCCAGTCAA AACCTGTGCG CTATACCTAA ATGGATTGAT AATCTTCATT 1920
CACTAATTCT AAAATAGACT TCTTCCCCAA AGAACGGTGT AACGATGAGG CTCTATCCAG 1980
CTGCTTATCT AAATCAACTT TAACGATGGA TGATCTTATG ACACGGGGAT CTTTCTTTAA 2040
AGTTCTTAGA ATTTCAGACT GTACCGCAGC TGATGAATCA AACAGCATTA AAAAGTGATA 2100
TGCTCGAAAA TGTTTTTCCT GGTCTTTCTT CATTATTTTA GGAAGATACC TTATGCCCAT 2160
GGGTACAATG TCCCTCACCA CACCTCTGTT TTGAATAATC AGTTTCCCGA TTGTGGAAGA 2220
CAATTCTTTT GCTTCCAACT TTGGCGCATT GGAGTTGGTT ATGCGAACAA GTCCGATCAG 2280
CTCATAAAGC ATCTTAGTGA AAAGGGTGGT TTTGCGTTAT TCTTTCCTCT GTTGAAGCTT 2340
【００６０】配列番号：8
配列の長さ：401
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Ala Asn Pro Phe Ser Arg Trp Phe Leu Ser Glu Arg Pro Pro
1 5 10 15
Asn Cys His Val Ala Asp Leu Glu Thr Ser Leu Asp Pro His Gln
20 25 30
Thr Leu Leu Lys Val Gln Lys Tyr Lys Pro Ala Leu Ser Asp Trp
35 40 45
Val His Tyr Ile Phe Leu Gly Ser Ile Met Leu Phe Val Phe Ile
50 55 60
Thr Asn Pro Ala Pro Trp Ile Phe Lys Ile Leu Phe Tyr Cys Phe
65 70 75
Leu Gly Thr Leu Phe Ile Ile Pro Ala Thr Ser Gln Phe Phe Phe
80 85 90
Asn Ala Leu Pro Ile Leu Thr Trp Val Ala Leu Tyr Phe Thr Ser
95 100 105
Ser Tyr Phe Pro Asp Asp Arg Arg Pro Pro Ile Thr Val Lys Val
110 115 120
Leu Pro Ala Val Glu Thr Ile Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asp
125 130 135
Ile Leu Ala Thr Ser Thr Asn Ser Phe Leu Asp Ile Leu Ala Trp
140 145 150
Leu Pro Tyr Gly Leu Phe His Phe Gly Ala Pro Phe Val Val Ala
155 160 165
Ala Ile Leu Phe Val Phe Gly Pro Pro Thr Val Leu Gln Gly Tyr
170 175 180
Ala Phe Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Ile Met Gln
185 190 195
Asn Val Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Ile Leu Tyr Gly
200 205 210
Leu Gln Ser Ala Asn Tyr Asp Met His Gly Ser Pro Gly Gly Leu
215 220 225
Ala Arg Ile Asp Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Tyr Thr Thr Ala
230 235 240
Phe Ser Asn Ser Ser Val Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His
245 250 255
Ser Gly Cys Ala Thr Met Glu Ala Leu Phe Phe Cys Tyr Cys Phe
260 265 270
Pro Lys Leu Lys Pro Leu Phe Ile Ala Tyr Val Cys Trp Leu Trp
275 280 285
Trp Ser Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Met
290 295 300
Ala Gly Ser Val Leu Ser Tyr Val Ile Phe Gln Tyr Thr Lys Tyr
305 310 315
Thr His Leu Pro Ile Val Asp Thr Ser Leu Phe Cys Arg Trp Ser
320 325 330
Tyr Thr Ser Ile Glu Lys Tyr Asp Ile Ser Lys Ser Asp Pro Leu
335 340 345
Ala Ala Asp Ser Asn Asp Ile Glu Ser Val Pro Leu Ser Asn Leu
350 355 360
Glu Leu Asp Phe Asp Leu Asn Met Thr Asp Glu Pro Ser Val Ser
365 370 375
Pro Ser Leu Phe Asp Gly Ser Thr Ser Val Ser Arg Ser Ser Ala
380 385 390
Thr Ser Ile Thr Ser Leu Gly Val Lys Arg Ala
395 400
【００６１】配列番号：9
配列の長さ：26
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TTTGGTTAYA TGAAYYTNTT YGGNGT 26
【００６２】配列番号：10
配列の長さ：29
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TCTACAAART ARTGGTGNGT NARRTACAT 29
【００６３】配列番号：11
配列の長さ：2274
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
TTATATATAT TATTGATTTG TTCCTGTTGT TATTTAGTTT AGAATCAGAC GACTACACCA 60
GAACCACAAT TCAACCAACA CTTATATAGA ACCTGGCTTG GAAAAAAGTA ACATTTATCA 120
TTCCTATACT TTTTTAGCAA ACATAATCCG TGTTTTACAT ATATTATTCA CCCAATATCA 180
TAACAAAAAC AAACTGAATA ATGGCGTCTT CTATTTTGCG TTCCAAAATA ATACAAAAAC 240
CGTACCAATT ATTCCACTAC TATTTTCTTC TGGAGAAGGC TCCTGGTTCT ACAGTTAGTG 300
ATTTGAATTT TGATACAAAC ATACAAACGA GTTTACGTAA ATTAAAGCAT CATCATTGGA 360
CGGTGGGAGA AATATTCCAT TATGGGTTTT TGGTTTCCAT ACTTTTTTTC GTGTTTGTGG 420
TTTTCCCAGC TTCATTTTTT ATAAAATTAC CAATAATCTT AGCATTTGCT ACTTGTTTTT 480
TAATACCCTT AACATCACAA TTTTTTCTTC CTGCCTTGCC CGTTTTCACT TGGTTGGCAT 540
TATATTTTAC GTGTGCTAAA ATACCTCAAG AATGGAAACC AGCTATCACA GTTAAAGTTT 600
TACCAGCTAT GGAAACAATT TTGTACGGCG ATAATTTATC AAATGTTTTG GCAACCATCA 660
CTACCGGAGT GTTAGATATA TTGGCATGGT TACCATATGG GATTATTCAT TTCAGTTTCC 720
CATTTGTACT TGCTGCTATT ATATTTTTAT TTGGGCCACC GACGGCATTA AGATCATTTG 780
GATTTGCCTT TGGTTATATG AACTTGCTTG GAGTCTTGAT TCAAATGGCA TTCCCAGCTG 840
CTCCTCCATG GTACAAAAAC TTGCACGGAT TAGAACCAGC TAATTATTCA ATGCACGGGT 900
CTCCTGGTGG ACTTGGAAGG ATAGATAAAT TGTTAGGTGT TGATATGTAT ACCACAGGGT 960
TTTCCAATTC ATCAATCATT TTTGGGGCAT TCCCATCGTT ACATTCAGGA TGTTGTATCA 1020
TGGAAGTGTT ATTTTTGTGT TGGTTGTTTC CACGATTCAA GTTTGTGTGG GTTACATACG 1080
CATCTTGGCT TTGGTGGAGC ACGATGTATT TGACCCATCA CTACTTTGTC GATTTGATTG 1140
GTGGAGCCAT GCTATCTTTG ACTGTTTTTG AGTTCACCAA ATATAAATAT TTGCCAAAAA 1200
ACAAAGAAGG CCTTTTCTGT CGTTGGTCAT ACACTGAAAT TGAAAAAATC GATATCCAAG 1260
AGATTGACCC TTTATCATAC AATTATATCC CTGTCAACAG CAATGATAAT GAAAGCAGAT 1320
TGTATACGAG AGTGTACCAA GAGTCTCAGG TTAGTCCCCC ACAGAGAGCT GAAACACCTG 1380
AAGCATTTGA GATGTCAAAT TTTTCTAGGT CTAGACAAAG CTCAAAGACT CAGGTTCCAT 1440
TGAGTAATCT TACTAACAAT GATCAAGTGT CTGGAATTAA CGAAGAGGAT GAAGAAGAAG 1500
AAGGCGATGA AATTTCATCG AGTACTCCTT CGGTGTTTGA AGACGAACCA CAGGGTAGCA 1560
CATATGCTGC ATCCTCAGCT ACATCAGTAG ATGATTTGGA TTCCAAAAGA AATTAGTAAA 1620
ATAACAGTTT CTATTAATTT CTTTATTTCC TCCTAATTAA TGATTTTATG CTCAATACCT 1680
ACACTATCTG TTTTTAATTT CCTACTTTTT TTTTATTATT GTTGAGTTCA TTTGCTGTTC 1740
ATTGAATATT TACAATTTTG CATTAATTAC CATCAATATA GAATGGGCAC AGTTTTTTTA 1800
AGTTTTTTTG TTTTTGTGTT TGTCTTTCTT TTTTTACATT AATGTGTTTG GATTGTTTTA 1860
GGTTCCTTTA TCCCTTAGCC CCCTCAGAAT ACTATTTTAT CTAATTAATT TGTTTTTATT 1920
TTCTGATATT TACCAATTGC TTTTTCTTTT GGATATTTAT AATAGCATCC CCTAATAATT 1980
AATATACAAC TGTTTCATAT ATATACGTGT ATGTCCTGTA GTGGTGGAAA CTGGAGTCAA 2040
CATTTGTATT AATGTGTACA AGAAAGCAGT GTTAATGCTA CTATTATAAT TTTTGAGGTG 2100
CAAATCAAGA GGTTGGCAGC TTTCTTATGG CTATGACCGT GAATGAAGGC TTGTAAACCA 2160
CGTAATAAAC AAAAGCCAAC AAGTTTTTTT AGAGCCTTTA ACAACATACG CAATGAGAGT 2220
GATTGCAATA CTACAAGATA TAGCCCAAAA AATTGAATGC ATTTCAACAA CAAC 2274
【００６４】配列番号：12
配列の長さ：471
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Ala Ser Ser Ile Leu Arg Ser Lys Ile Ile Gln Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Phe His Tyr Tyr Phe Leu Ser Glu Lys Ala Pro Gly Ser
20 25 30
Thr Val Ser Asp Leu Asn Phe Asp Thr Asn Ile Gln Thr Ser Leu
35 40 45
Arg Lys Leu Lys His His His Trp Thr Val Gly Glu Ile Phe His
50 55 60
Tyr Gly Phe Leu Val Ser Ile Leu Phe Phe Val Phe Val Val Phe
65 70 75
Pro Ala Ser Phe Phe Ile Lys Leu Pro Ile Ile Leu Ala Phe Ala
80 85 90
Thr Cys Phe Leu Ile Pro Leu Thr Ser Gln Phe Phe Leu Pro Ala
95 100 105
Leu Pro Val Phe Thr Trp Leu Ala Leu Tyr Phe Thr Cys Ala Lys
110 115 120
Ile Pro Gln Glu Trp Lys Pro Ala Ile Thr Val Lys Val Leu Pro
125 130 135
Ala Met Glu Thr Ile Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asn Val Leu
140 145 150
Ala Thr Ile Thr Thr Gly Val Leu Asp Ile Leu Ala Trp Leu Pro
155 160 165
Tyr Gly Ile Ile His Phe Ser Phe Pro Phe Val Leu Ala Ala Ile
170 175 180
Ile Phe Leu Phe Gly Pro Pro Thr Ala Leu Arg Ser Phe Gly Phe
185 190 195
Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Leu Gly Val Leu Ile Gln Met Ala
200 205 210
Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Asn Leu His Gly Leu Glu
215 220 225
Pro Ala Asn Tyr Ser Met His Gly Ser Pro Gly Gly Leu Gly Arg
230 235 240
Ile Asp Lys Leu Leu Gly Val Asp Met Tyr Thr Thr Gly Phe Ser
245 250 255
Asn Ser Ser Ile Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His Ser Gly
260 265 270
Cys Cys Ile Met Glu Val Leu Phe Leu Cys Trp Leu Phe Pro Arg
275 280 285
Phe Lys Phe Val Trp Val Thr Tyr Ala Ser Trp Leu Trp Trp Ser
290 295 300
Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Ile Gly Gly
305 310 315
Ala Met Leu Ser Leu Thr Val Phe Glu Phe Thr Lys Tyr Lys Tyr
320 325 330
Leu Pro Lys Asn Lys Glu Gly Leu Phe Cys Arg Trp Ser Tyr Thr
335 340 345
Glu Ile Glu Lys Ile Asp Ile Gln Glu Ile Asp Pro Leu Ser Tyr
350 355 360
Asn Tyr Ile Pro Val Asn Ser Asn Asp Asn Glu Ser Arg Leu Tyr
365 370 375
Thr Arg Val Tyr Gln Glu Ser Gln Val Ser Pro Pro Gln Arg Ala
380 385 390
Glu Thr Pro Glu Ala Phe Glu Met Ser Asn Phe Ser Arg Ser Arg
395 400 405
Gln Ser Ser Lys Thr Gln Val Pro Leu Ser Asn Leu Thr Asn Asn
410 415 420
Asp Gln Val Ser Gly Ile Asn Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Gly
425 430 435
Asp Glu Ile Ser Ser Ser Thr Pro Ser Val Phe Glu Asp Glu Pro
440 445 450
Gln Gly Ser Thr Tyr Ala Ala Ser Ser Ala Thr Ser Val Asp Asp
455 460 465
Leu Asp Ser Lys Arg Asn
470
【００６５】配列番号：13
配列の長さ：22
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GACTATTTCA TTATGGGGCC CC 22
【００６６】配列番号：14
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GTTAACTCGA GAAAGTGCCC ATCAGTGTTC 30
【００６７】配列番号：15
配列の長さ：29
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GTTAACGGTA CCTCATCGTT ACACCGTTC 29
【００６８】配列番号：16
配列の長さ：19
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GCTAAACGAC AATCCTGAC 19
【００６９】配列番号：17
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CGTTGGCCGA TTCATTAATG C 21
【００７０】配列番号：18
配列の長さ：401
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Ala Asn Pro Phe Ser Arg Trp Phe Leu Ser Glu Arg Pro Pro
1 5 10 15
Asn Cys His Val Ala Asp Leu Glu Thr Ser Leu Asp Pro His Gln
20 25 30
Thr Leu Leu Lys Val Gln Lys Tyr Lys Pro Ala Leu Ser Asp Trp
35 40 45
Val His Tyr Ile Phe Leu Gly Ser Ile Met Leu Phe Val Phe Ile
50 55 60
Thr Asn Pro Ala Pro Trp Ile Phe Lys Ile Leu Phe Tyr Cys Phe
65 70 75
Leu Gly Thr Leu Phe Ile Ile Pro Ala Thr Ser Gln Phe Phe Phe
80 85 90
Asn Ala Leu Pro Ile Leu Thr Trp Val Ala Leu Tyr Phe Thr Ser
95 100 105
Ser Tyr Phe Pro Asp Asp Arg Arg Pro Pro Ile Thr Val Lys Val
110 115 120
Leu Pro Ala Val Glu Thr Ile Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asp
125 130 135
Ile Leu Ala Thr Ser Thr Asn Ser Phe Leu Asp Ile Leu Ala Trp
140 145 150
Leu Pro Tyr Gly Leu Phe His Phe Gly Ala Pro Phe Val Val Ala
155 160 165
Ala Ile Leu Phe Val Phe Gly Pro Pro Thr Val Leu Gln Gly Tyr
170 175 180
Ala Phe Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Ile Met Gln
185 190 195
Asn Val Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Ile Leu Tyr Gly
200 205 210
Leu Gln Ser Ala Asn Tyr Asp Met His Gly Ser Pro Gly Gly Leu
215 220 225
Ala Arg Ile Asp Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Tyr Thr Thr Cys
230 235 240
Phe Ser Asn Ser Ser Val Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His
245 250 255
Ser Gly Cys Ala Thr Met Glu Ala Leu Phe Phe Cys Tyr Cys Phe
260 265 270
Pro Lys Leu Lys Pro Leu Phe Ile Ala Tyr Val Cys Trp Leu Trp
275 280 285
Trp Ser Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Met
290 295 300
Ala Gly Ser Val Leu Ser Tyr Val Ile Phe Gln Tyr Thr Lys Tyr
305 310 315
Thr His Leu Pro Ile Val Asp Thr Ser Leu Phe Cys Arg Trp Ser
320 325 330
Tyr Thr Ser Ile Glu Lys Tyr Asp Ile Ser Lys Ser Asp Pro Leu
335 340 345
Ala Ala Asp Ser Asn Asp Ile Glu Ser Val Pro Leu Ser Asn Leu
350 355 360
Glu Leu Asp Phe Asp Leu Asn Met Thr Asp Glu Pro Ser Val Ser
365 370 375
Pro Ser Leu Phe Asp Gly Ser Thr Ser Val Ser Arg Ser Ser Ala
380 385 390
Thr Ser Ile Thr Ser Leu Gly Val Lys Arg Ala
395 400
【００７１】配列番号：19
配列の長さ：401
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Ala Asn Pro Phe Ser Arg Trp Phe Leu Ser Glu Arg Pro Pro
1 5 10 15
Asn Cys His Val Ala Asp Leu Glu Thr Ser Leu Asp Pro His Gln
20 25 30
Thr Leu Leu Lys Val Gln Lys Tyr Lys Pro Ala Leu Ser Asp Trp
35 40 45
Val His Tyr Ile Phe Leu Gly Ser Ile Met Leu Phe Val Phe Ile
50 55 60
Thr Asn Pro Ala Pro Trp Ile Phe Lys Ile Leu Phe Tyr Cys Phe
65 70 75
Leu Gly Thr Leu Phe Ile Ile Pro Ala Thr Ser Gln Phe Phe Phe
80 85 90
Asn Ala Leu Pro Ile Leu Thr Trp Val Ala Leu Tyr Phe Thr Ser
95 100 105
Ser Tyr Phe Pro Asp Asp Arg Arg Pro Pro Ile Thr Val Lys Val
110 115 120
Leu Pro Ala Val Glu Thr Ile Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asp
125 130 135
Ile Leu Ala Thr Ser Thr Asn Ser Phe Leu Asp Ile Leu Ala Trp
140 145 150
Leu Pro Tyr Gly Leu Phe His Tyr Gly Ala Pro Phe Val Val Ala
155 160 165
Ala Ile Leu Phe Val Phe Gly Pro Pro Thr Val Leu Gln Gly Tyr
170 175 180
Ala Phe Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Ile Met Gln
185 190 195
Asn Val Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Ile Leu Tyr Gly
200 205 210
Leu Gln Ser Ala Asn Tyr Asp Met His Gly Ser Pro Gly Gly Leu
215 220 225
Ala Arg Ile Asp Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Tyr Thr Thr Cys
230 235 240
Phe Ser Asn Ser Ser Val Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His
245 250 255
Ser Gly Cys Ala Thr Met Glu Ala Leu Phe Phe Cys Tyr Cys Phe
260 265 270
Pro Lys Leu Lys Pro Leu Phe Ile Ala Tyr Val Cys Trp Leu Trp
275 280 285
Trp Ser Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Met
290 295 300
Ala Gly Ser Val Leu Ser Tyr Val Ile Phe Gln Tyr Thr Lys Tyr
305 310 315
Thr His Leu Pro Ile Val Asp Thr Ser Leu Phe Cys Arg Trp Ser
320 325 330
Tyr Thr Ser Ile Glu Lys Tyr Asp Ile Ser Lys Ser Asp Pro Leu
335 340 345
Ala Ala Asp Ser Asn Asp Ile Glu Ser Val Pro Leu Ser Asn Leu
350 355 360
Glu Leu Asp Phe Asp Leu Asn Met Thr Asp Glu Pro Ser Val Ser
365 370 375
Pro Ser Leu Phe Asp Gly Ser Thr Ser Val Ser Arg Ser Ser Ala
380 385 390
Thr Ser Ile Thr Ser Leu Gly Val Lys Arg Ala
395 400
【００７２】配列番号：20
配列の長さ：1206
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
ATGGCAAACC CTTTTTCGAG ATGGTTTCTA TCAGAGAGAC CTCCAAACTG CCATGTAGCC 60
GATTTAGAAA CAAGTTTAGA TCCCCATCAA ACGTTGTTGA AGGTGCAAAA ATACAAACCC 120
GCTTTAAGCG ACTGGGTGCA TTACATCTTC TTGGGATCCA TCATGCTGTT TGTGTTCATT 180
ACTAATCCCG CACCTTGGAT CTTCAAGATC CTTTTTTATT GTTTCTTGGG CACTTTATTC 240
ATCATTCCAG CTACGTCACA GTTTTTCTTC AATGCCTTGC CCATCCTAAC ATGGGTGGCG 300
CTGTATTTCA CTTCATCGTA CTTTCCAGAT GACCGCAGGC CTCCTATTAC TGTCAAAGTG 360
TTACCAGCGG TGGAAACAAT TTTATACGGC GACAATTTAA GTGATATTCT TGCAACATCG 420
ACGAATTCCT TTTTGGACAT TTTAGCATGG TTACCGTACG GACTATTTCA TTTTGGGGCC 480
CCATTTGTCG TTGCTGCCAT CTTATTCGTA TTTGGTCCAC CAACTGTTTT GCAAGGTTAT 540
GCTTTTGCAT TTGGTTATAT GAACCTGTTT GGTGTTATCA TGCAAAATGT CTTTCCAGCC 600
GCTCCCCCAT GGTATAAAAT TCTCTATGGA TTGCAATCAG CCAACTATGA TATGCATGGC 660
TCGCCTGGTG GATTAGCTAG AATTGATAAG CTACTCGGTA TTAATATGTA TACTACATGT 720
TTTTCAAATT CCTCCGTCAT TTTCGGTGCT TTTCCTTCAC TGCATTCCGG GTGTGCTACT 780
ATGGAAGCCC TGTTTTTCTG TTATTGTTTT CCAAAATTGA AGCCCTTGTT TATTGCTTAT 840
GTTTGCTGGT TATGGTGGTC AACTATGTAT CTGACACACC ATTATTTTGT AGACCTTATG 900
GCAGGTTCTG TGCTGTCATA CGTTATTTTC CAGTACACAA AGTACACACA TTTACCAATT 960
GTAGATACAT CTCTTTTTTG CAGATGGTCA TACACTTCAA TTGAGAAATA CGATATATCA 1020
AAGAGTGATC CATTGGCTGC AGATTCAAAC GATATCGAAA GTGTCCCTTT GTCCAACTTG 1080
GAACTTGACT TTGATCTTAA TATGACTGAT GAACCCAGTG TAAGCCCTTC GTTATTTGAT 1140
GGATCTACTT CTGTTTCTCG TTCGTCCGCC ACGTCTATAA CGTCACTAGG TGTAAAGAGG 1200
GCTTAA 1206
【００７３】配列番号：21
配列の長さ：1206
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
ATGGCAAACC CTTTTTCGAG ATGGTTTCTA TCAGAGAGAC CTCCAAACTG CCATGTAGCC 60
GATTTAGAAA CAAGTTTAGA TCCCCATCAA ACGTTGTTGA AGGTGCAAAA ATACAAACCC 120
GCTTTAAGCG ACTGGGTGCA TTACATCTTC TTGGGATCCA TCATGCTGTT TGTGTTCATT 180
ACTAATCCCG CACCTTGGAT CTTCAAGATC CTTTTTTATT GTTTCTTGGG CACTTTATTC 240
ATCATTCCAG CTACGTCACA GTTTTTCTTC AATGCCTTGC CCATCCTAAC ATGGGTGGCG 300
CTGTATTTCA CTTCATCGTA CTTTCCAGAT GACCGCAGGC CTCCTATTAC TGTCAAAGTG 360
TTACCAGCGG TGGAAACAAT TTTATACGGC GACAATTTAA GTGATATTCT TGCAACATCG 420
ACGAATTCCT TTTTGGACAT TTTAGCATGG TTACCGTACG GACTATTTCA TTATGGGGCC 480
CCATTTGTCG TTGCTGCCAT CTTATTCGTA TTTGGTCCAC CAACTGTTTT GCAAGGTTAT 540
GCTTTTGCAT TTGGTTATAT GAACCTGTTT GGTGTTATCA TGCAAAATGT CTTTCCAGCC 600
GCTCCCCCAT GGTATAAAAT TCTCTATGGA TTGCAATCAG CCAACTATGA TATGCATGGC 660
TCGCCTGGTG GATTAGCTAG AATTGATAAG CTACTCGGTA TTAATATGTA TACTACATGT 720
TTTTCAAATT CCTCCGTCAT TTTCGGTGCT TTTCCTTCAC TGCATTCCGG GTGTGCTACT 780
ATGGAAGCCC TGTTTTTCTG TTATTGTTTT CCAAAATTGA AGCCCTTGTT TATTGCTTAT 840
GTTTGCTGGT TATGGTGGTC AACTATGTAT CTGACACACC ATTATTTTGT AGACCTTATG 900
GCAGGTTCTG TGCTGTCATA CGTTATTTTC CAGTACACAA AGTACACACA TTTACCAATT 960
GTAGATACAT CTCTTTTTTG CAGATGGTCA TACACTTCAA TTGAGAAATA CGATATATCA 1020
AAGAGTGATC CATTGGCTGC AGATTCAAAC GATATCGAAA GTGTCCCTTT GTCCAACTTG 1080
GAACTTGACT TTGATCTTAA TATGACTGAT GAACCCAGTG TAAGCCCTTC GTTATTTGAT 1140
GGATCTACTT CTGTTTCTCG TTCGTCCGCC ACGTCTATAA CGTCACTAGG TGTAAAGAGG 1200
GCTTAA 1206
【００７４】配列番号：22
配列の長さ：1206
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
ATGGCAAACC CTTTTTCGAG ATGGTTTCTA TCAGAGAGAC CTCCAAACTG CCATGTAGCC 60
GATTTAGAAA CAAGTTTAGA TCCCCATCAA ACGTTGTTGA AGGTGCAAAA ATACAAACCC 120
GCTTTAAGCG ACTGGGTGCA TTACATCTTC TTGGGATCCA TCATGCTGTT TGTGTTCATT 180
ACTAATCCCG CACCTTGGAT CTTCAAGATC CTTTTTTATT GTTTCTTGGG CACTTTATTC 240
ATCATTCCAG CTACGTCACA GTTTTTCTTC AATGCCTTGC CCATCCTAAC ATGGGTGGCG 300
CTGTATTTCA CTTCATCGTA CTTTCCAGAT GACCGCAGGC CTCCTATTAC TGTCAAAGTG 360
TTACCAGCGG TGGAAACAAT TTTATACGGC GACAATTTAA GTGATATTCT TGCAACATCG 420
ACGAATTCCT TTTTGGACAT TTTAGCATGG TTACCGTACG GACTATTTCA TTATGGGGCC 480
CCATTTGTCG TTGCTGCCAT CTTATTCGTA TTTGGTCCAC CAACTGTTTT GCAAGGTTAT 540
GCTTTTGCAT TTGGTTATAT GAACCTGTTT GGTGTTATCA TGCAAAATGT CTTTCCAGCC 600
GCTCCCCCAT GGTATAAAAT TCTCTATGGA TTGCAATCAG CCAACTATGA TATGCATGGC 660
TCGCCTGGTG GATTAGCTAG AATTGATAAG CTACTCGGTA TTAATATGTA TACTACAGCT 720
TTTTCAAATT CCTCCGTCAT TTTCGGTGCT TTTCCTTCAC TGCATTCCGG GTGTGCTACT 780
ATGGAAGCCC TGTTTTTCTG TTATTGTTTT CCAAAATTGA AGCCCTTGTT TATTGCTTAT 840
GTTTGCTGGT TATGGTGGTC AACTATGTAT CTGACACACC ATTATTTTGT AGACCTTATG 900
GCAGGTTCTG TGCTGTCATA CGTTATTTTC CAGTACACAA AGTACACACA TTTACCAATT 960
GTAGATACAT CTCTTTTTTG CAGATGGTCA TACACTTCAA TTGAGAAATA CGATATATCA 1020
AAGAGTGATC CATTGGCTGC AGATTCAAAC GATATCGAAA GTGTCCCTTT GTCCAACTTG 1080
GAACTTGACT TTGATCTTAA TATGACTGAT GAACCCAGTG TAAGCCCTTC GTTATTTGAT 1140
GGATCTACTT CTGTTTCTCG TTCGTCCGCC ACGTCTATAA CGTCACTAGG TGTAAAGAGG 1200
GCTTAA 1206
【００７５】配列番号：23
配列の長さ：1206
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
ATGGCAAACC CTTTTTCGAG ATGGTTTCTA TCAGAGAGAC CTCCAAACTG CCATGTAGCC 60
GATTTAGAAA CAAGTTTAGA TCCCCATCAA ACGTTGTTGA AGGTGCAAAA ATACAAACCC 120
GCTTTAAGCG ACTGGGTGCA TTACATCTTC TTGGGATCCA TCATGCTGTT TGTGTTCATT 180
ACTAATCCCG CACCTTGGAT CTTCAAGATC CTTTTTTATT GTTTCTTGGG CACTTTATTC 240
ATCATTCCAG CTACGTCACA GTTTTTCTTC AATGCCTTGC CCATCCTAAC ATGGGTGGCG 300
CTGTATTTCA CTTCATCGTA CTTTCCAGAT GACCGCAGGC CTCCTATTAC TGTCAAAGTG 360
TTACCAGCGG TGGAAACAAT TTTATACGGC GACAATTTAA GTGATATTCT TGCAACATCG 420
ACGAATTCCT TTTTGGACAT TTTAGCATGG TTACCGTACG GACTATTTCA TTTTGGGGCC 480
CCATTTGTCG TTGCTGCCAT CTTATTCGTA TTTGGTCCAC CAACTGTTTT GCAAGGTTAT 540
GCTTTTGCAT TTGGTTATAT GAACCTGTTT GGTGTTATCA TGCAAAATGT CTTTCCAGCC 600
GCTCCCCCAT GGTATAAAAT TCTCTATGGA TTGCAATCAG CCAACTATGA TATGCATGGC 660
TCGCCTGGTG GATTAGCTAG AATTGATAAG CTACTCGGTA TTAATATGTA TACTACAGCT 720
TTTTCAAATT CCTCCGTCAT TTTCGGTGCT TTTCCTTCAC TGCATTCCGG GTGTGCTACT 780
ATGGAAGCCC TGTTTTTCTG TTATTGTTTT CCAAAATTGA AGCCCTTGTT TATTGCTTAT 840
GTTTGCTGGT TATGGTGGTC AACTATGTAT CTGACACACC ATTATTTTGT AGACCTTATG 900
GCAGGTTCTG TGCTGTCATA CGTTATTTTC CAGTACACAA AGTACACACA TTTACCAATT 960
GTAGATACAT CTCTTTTTTG CAGATGGTCA TACACTTCAA TTGAGAAATA CGATATATCA 1020
AAGAGTGATC CATTGGCTGC AGATTCAAAC GATATCGAAA GTGTCCCTTT GTCCAACTTG 1080
GAACTTGACT TTGATCTTAA TATGACTGAT GAACCCAGTG TAAGCCCTTC GTTATTTGAT 1140
GGATCTACTT CTGTTTCTCG TTCGTCCGCC ACGTCTATAA CGTCACTAGG TGTAAAGAGG 1200
GCTTAA 1206
【００７６】配列番号：24
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
AATATGTATA CTACATGTTT TTCAAATTCC 30
【図１】本発明の１例のベクターの構築、及び染色体へ
の組込みを示す図である。
の組込みを示す図である。
【図２】ゲノムＤＮＡの制限酵素分解物の電気泳動後の
サザンハイブリダイゼーションパターンを示す図であ
る。
サザンハイブリダイゼーションパターンを示す図であ
る。
【図３】spaur 1 R 及びspaur 1 S の制限酵素地図を示
す図である。
す図である。
【図４】scaur 1 R 及びscaur 1 S の制限酵素地図を示
す図である。
す図である。
【図５】caaur 1 の制限酵素地図を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(72)発明者 大門 尚志
滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒
造株式会社中央研究所内
(72)発明者 竹迫 一任
滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒
造株式会社中央研究所内
(72)発明者 加藤 郁之進
滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒
造株式会社中央研究所内
(56)参考文献 特開 平７−313132（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
Claims (6)
- 【請求項１】 下記から選択されるオーレオバシジン耐
性遺伝子を含有することを特徴とする宿主真菌用染色体
組込型ベクター。 （１） 配列表の配列番号２若しくは配列番号６のアミ
ノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、（２） 配列表の配列番号２の２４０番目に相当する部
位以外のアミノ酸配列に１〜数個の置換、挿入及び欠失
の少なくとも一つを施すことにより得られるアミノ酸配
列を有し、かつオーレオバシジン耐性付与活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子、（３） 配列表の配列番号６の１５８番目に相当する部
位以外のアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の置
換、挿入及び欠失の少なくとも一つを施すことにより得
られるアミノ酸配列を有し、かつオーレオバシジン耐性
付与活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、 （４） 配列表の配列番号１若しくは配列番号５の塩基
配列を有する遺伝子、 （５） 配列表の配列番号１若しくは配列番号５の塩基
配列に厳密な条件においてハイブリダイズ可能であり、
かつオーレオバシジン耐性付与活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子。 - 【請求項２】 異種の遺伝子を含有する請求項１記載の
ベクター。 - 【請求項３】下記工程を包含することを特徴とするオー
レオバシジン耐性形質転換体の創製方法。（Ａ） 下記から選択されるオーレオバシジン耐性遺伝
子を含有する複製ベクターを得る工程、（１） 配列表の配列番号２若しくは配列番号６のアミ
ノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、 （２） 配列表の配列番号２の２４０番目に相当する部
位以外のアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の置
換、挿入及び欠失の少なくとも一つを施すことにより得
られるアミノ酸配列を有し、かつオーレオバシジン耐性
付与活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、 （３） 配列表の配列番号６の１５８番目に相当する部
位以外のアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の置
換、挿入及び欠失の少なくとも一つを施すことにより得
られるアミノ酸配列を有し、かつオーレオバシジン耐性
付与活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、 （４） 配列表の配列番号１若しくは５の塩基配列を有
する遺伝子、 （５） 配列表の配列番号１若しくは５の塩基配列に厳
密な条件においてハイブリダイズ可能であり、かつオー
レオバシジン耐性付与活性を有するタンパク質をコード
する遺伝子、 （Ｂ） 上記工程で得られた複製ベクター中のオーレオ
バシジン耐性遺伝子の１ヵ所で開裂し、宿主真菌用染色
体組込型ベクターを得る工程、（Ｃ） 上記工程で得られた宿主真菌用染色体組込型ベ
クターを宿主真菌の染色体に組込む工程、（Ｄ） オーレオバシジン耐性に形質転換された宿主を
オーレオバシジン存在下で選択する工程。 - 【請求項４】請求項３記載の複製ベクターが異種の遺伝
子を含有する複製ベクターであることを特徴とする請求
項３記載の形質転換体の創製方法。 - 【請求項５】請求項３又は４記載の方法で得られる形質
転換体。 - 【請求項６】宿主真菌が清酒酵母である請求項５記載の
形質転換体。
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14139395A JP3369030B2 (ja) | 1994-06-29 | 1995-05-17 | 染色体組込型ベクター |
| DE69504596T DE69504596T2 (de) | 1994-06-29 | 1995-06-15 | Chromosomaler Integrationsvektor |
| EP95304165A EP0692534B1 (en) | 1994-06-29 | 1995-06-15 | A chromosome integration vector |
| KR1019950019321A KR100391221B1 (ko) | 1994-06-29 | 1995-06-28 | 염색체 통합 벡터 |
| CNB951081136A CN1295335C (zh) | 1994-06-29 | 1995-06-28 | 编码调控金黄担子菌素敏感性的蛋白质的基因 |
| US08/492,459 US6015689A (en) | 1993-05-24 | 1995-06-29 | Regulation of aureobasidin sensitivity |
| US08/716,873 US6194166B1 (en) | 1993-05-24 | 1996-09-20 | Gene regulating aureobasidin sensitivity |
| US09/368,431 US6294651B1 (en) | 1993-05-24 | 1999-08-05 | Gene regulating aubeobasidin sensitivity |
| US09/414,006 US6348577B1 (en) | 1993-05-24 | 1999-10-07 | Regulation of aureobasidin sensitivity in fungus |
| US09/951,217 US6693174B2 (en) | 1993-05-24 | 2001-09-12 | Gene regulating aureobasidin sensitivity |
| US10/777,195 US20040265857A1 (en) | 1993-05-24 | 2004-02-13 | Gene regulating aureobasidin sensitivity |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16861194 | 1994-06-29 | ||
| JP6-168611 | 1994-06-29 | ||
| JP9595595 | 1995-03-30 | ||
| JP7-95955 | 1995-03-30 | ||
| JP14139395A JP3369030B2 (ja) | 1994-06-29 | 1995-05-17 | 染色体組込型ベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08322574A JPH08322574A (ja) | 1996-12-10 |
| JP3369030B2 true JP3369030B2 (ja) | 2003-01-20 |
Family
ID=27307959
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14139395A Expired - Fee Related JP3369030B2 (ja) | 1993-05-24 | 1995-05-17 | 染色体組込型ベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3369030B2 (ja) |
-
1995
- 1995-05-17 JP JP14139395A patent/JP3369030B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08322574A (ja) | 1996-12-10 |
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| JPH08322575A (ja) | プロモーター |
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