JP3361418B2 - オーレオバシジン耐性付与蛋白質 - Google Patents
オーレオバシジン耐性付与蛋白質Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は抗真菌剤オーレオバ
シジンに対する感受性を付与する蛋白質の変異体に関
し、変異によりオーレオバシジン耐性付与蛋白質に変換
した変異体、及び該蛋白質をコードする遺伝子に関す
る。更に本発明は、真菌細胞の染色体に組込むことがで
き、かつ、特異的培地内に置かれた該細胞の中から、形
質転換体を容易に検出することができる、宿主に新規な
優性の遺伝的マーカーを付与しうるベクターを用いるマ
ーカー付与形質転換体の創製方法、及び該ベクターで形
質転換させた形質転換体に関する。
シジンに対する感受性を付与する蛋白質の変異体に関
し、変異によりオーレオバシジン耐性付与蛋白質に変換
した変異体、及び該蛋白質をコードする遺伝子に関す
る。更に本発明は、真菌細胞の染色体に組込むことがで
き、かつ、特異的培地内に置かれた該細胞の中から、形
質転換体を容易に検出することができる、宿主に新規な
優性の遺伝的マーカーを付与しうるベクターを用いるマ
ーカー付与形質転換体の創製方法、及び該ベクターで形
質転換させた形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】オーレオバシジン〔特開平２−１３８２
９６号、同３−２２９９５号、同３−２２０１９９号、
同５−２７９３８４号、同６−６５２９１号、ジャーナ
ル オブ アンチバイオチクス（Ｊ．Antibiotics)、第
４４巻、第９号、第９１９〜９２４頁、同第４４巻、第
９号、第９２５〜９３３頁、同第４４巻、第１１号、第
１１８７〜１１９８頁（１９９１）〕は、オーレオバシ
ジウム プルランス（Aureobasidium pullulans) No.Ｒ
１０６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９３８）の発酵生産物と
して得られる、環状のデプシペプチドである。更に、オ
ーレオバシジンの中で代表的な化合物であるオーレオバ
シジンＡは、カンジダ アルビカンス（Candida albica
ns、以下、Ｃ．アルビカンスと略記する）を始めとする
種々のカンジダ属酵母、クリプトコッカス ネオホルマ
ンス（Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ カ
プスラタム（Histoplasma capsulatum) 、ブラストマイ
セスデルマチチジス（Blastomyces dermatitidis) 、ア
スペルギルス（Aspergillus)属真菌に対して、強い抗真
菌活性を有する（特開平２−１３８２９６号）。本発明
者らは、更にカナダ国特許出願公開公報第２１２４０３
４号に記載のようにサッカロミセス セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae、以下、Ｓ．セレビシエと略記す
る）がオーレオバシジンに感受性を示すことを見出した
（表１）。
９６号、同３−２２９９５号、同３−２２０１９９号、
同５−２７９３８４号、同６−６５２９１号、ジャーナ
ル オブ アンチバイオチクス（Ｊ．Antibiotics)、第
４４巻、第９号、第９１９〜９２４頁、同第４４巻、第
９号、第９２５〜９３３頁、同第４４巻、第１１号、第
１１８７〜１１９８頁（１９９１）〕は、オーレオバシ
ジウム プルランス（Aureobasidium pullulans) No.Ｒ
１０６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９３８）の発酵生産物と
して得られる、環状のデプシペプチドである。更に、オ
ーレオバシジンの中で代表的な化合物であるオーレオバ
シジンＡは、カンジダ アルビカンス（Candida albica
ns、以下、Ｃ．アルビカンスと略記する）を始めとする
種々のカンジダ属酵母、クリプトコッカス ネオホルマ
ンス（Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ カ
プスラタム（Histoplasma capsulatum) 、ブラストマイ
セスデルマチチジス（Blastomyces dermatitidis) 、ア
スペルギルス（Aspergillus)属真菌に対して、強い抗真
菌活性を有する（特開平２−１３８２９６号）。本発明
者らは、更にカナダ国特許出願公開公報第２１２４０３
４号に記載のようにサッカロミセス セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae、以下、Ｓ．セレビシエと略記す
る）がオーレオバシジンに感受性を示すことを見出した
（表１）。
【０００３】
【表１】
表 １
───────────────────────────────
試験菌及び試験細胞 ＭＩＣ（μｇ／ｍｌ）
───────────────────────────────
Ｓ．セレビシエ ０．３１
───────────────────────────────
【０００４】そして、Ｓ．セレビシエの感受性細胞に変
異処理を施すことにより耐性細胞にかえ、その耐性細胞
よりオーレオバシジン耐性を付与する遺伝子（耐性遺伝
子）、更に感受性細胞より対応するオーレオバシジン感
受性を付与する遺伝子（感受性遺伝子）の単離に成功し
た。すなわち、オーレオバシジンに感受性であるＳ．セ
レビシエをＥＭＳにより変異処理し、得られた耐性菌に
ついてゲノムライブラリーを作製し、そのライブラリー
から優性変異である耐性遺伝子（ scaur１R ) を含有す
る図２の制限酵素地図で表されるＤＮＡ断片を単離し
た。scaur１R 遺伝子の蛋白質をコードしている部分を
含む領域の塩基配列は配列表の配列番号６の通りであ
り、本遺伝子のコードする蛋白質のアミノ酸配列は配列
表の配列番号７の通りである。この耐性遺伝子 scaur１
R を用いたハイブリダイゼーションにより感受性株より
感受性遺伝子（ scaur１S ）を含有する、図２の制限酵
素地図で表されるＤＮＡ断片を単離した。この感受性遺
伝子の蛋白質をコードしている部分を含む領域の塩基配
列は配列表の配列番号８の通りであり、本遺伝子のコー
ドする蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番号１の通
りである。配列番号８と配列番号６を比較すると８５２
番目の塩基のＴからＡへの突然変異が起こり、配列番号
１と配列番号７を比較するとアミノ酸レベルで１５８番
目のアミノ酸がフェニルアラニンからチロシンへ変化
し、これが耐性の原因となっていることが明らかにされ
た。
異処理を施すことにより耐性細胞にかえ、その耐性細胞
よりオーレオバシジン耐性を付与する遺伝子（耐性遺伝
子）、更に感受性細胞より対応するオーレオバシジン感
受性を付与する遺伝子（感受性遺伝子）の単離に成功し
た。すなわち、オーレオバシジンに感受性であるＳ．セ
レビシエをＥＭＳにより変異処理し、得られた耐性菌に
ついてゲノムライブラリーを作製し、そのライブラリー
から優性変異である耐性遺伝子（ scaur１R ) を含有す
る図２の制限酵素地図で表されるＤＮＡ断片を単離し
た。scaur１R 遺伝子の蛋白質をコードしている部分を
含む領域の塩基配列は配列表の配列番号６の通りであ
り、本遺伝子のコードする蛋白質のアミノ酸配列は配列
表の配列番号７の通りである。この耐性遺伝子 scaur１
R を用いたハイブリダイゼーションにより感受性株より
感受性遺伝子（ scaur１S ）を含有する、図２の制限酵
素地図で表されるＤＮＡ断片を単離した。この感受性遺
伝子の蛋白質をコードしている部分を含む領域の塩基配
列は配列表の配列番号８の通りであり、本遺伝子のコー
ドする蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番号１の通
りである。配列番号８と配列番号６を比較すると８５２
番目の塩基のＴからＡへの突然変異が起こり、配列番号
１と配列番号７を比較するとアミノ酸レベルで１５８番
目のアミノ酸がフェニルアラニンからチロシンへ変化
し、これが耐性の原因となっていることが明らかにされ
た。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】真菌は清酒、焼酎、ビ
ール、ワイン等の酒類、みそ、醤油等の発酵食品に広範
に利用されている。これらの工業用に使用される真菌の
育種において、望ましい形質を付与するために遺伝子工
学的手法は極めて有効であり、形質転換体を効率良く選
択するために使用可能な選択マーカーが必要である。本
発明の目的は真菌の遺伝子工学において使用可能な選択
マーカーとして機能するオーレオバシジン耐性付与蛋白
質及び該蛋白質をコードする遺伝子を提供することにあ
る。更に該遺伝子を含有するベクターで形質転換された
形質転換体を提供することを目的とする。
ール、ワイン等の酒類、みそ、醤油等の発酵食品に広範
に利用されている。これらの工業用に使用される真菌の
育種において、望ましい形質を付与するために遺伝子工
学的手法は極めて有効であり、形質転換体を効率良く選
択するために使用可能な選択マーカーが必要である。本
発明の目的は真菌の遺伝子工学において使用可能な選択
マーカーとして機能するオーレオバシジン耐性付与蛋白
質及び該蛋白質をコードする遺伝子を提供することにあ
る。更に該遺伝子を含有するベクターで形質転換された
形質転換体を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば本発
明の第１の発明は配列表の配列番号１で表されるオーレ
オバシジン感受性付与蛋白質の少なくとも２４０番目の
ＡｌａがＣｙｓに置換されたオーレオバシジン耐性付与
蛋白質、又は該蛋白質の２４０番目に相当する部位以外
のアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の置換、挿入
及び欠失の少なくとも一つを施すことにより得られるア
ミノ酸配列を有し、該蛋白質と同等の生物学的活性を示
すオーレオバシジン耐性付与蛋白質に関する。また、本
発明の第２の発明は本発明の第１の発明のオーレオバシ
ジン耐性付与蛋白質をコードする遺伝子に関する。本発
明の第３の発明は、オーレオバシジン耐性形質転換体の
創製方法に関し、下記工程を包含することを特徴とす
る。 （１）本発明の第２の発明のオーレオバシジン耐性付与
蛋白質をコードする遺伝子を含有する複製ベクターを得
る工程、 （２）上記工程で得られた複製ベクター中のオーレオバ
シジン耐性付与蛋白質をコードする遺伝子の１ヵ所で開
裂し、宿主真菌用染色体組込型ベクターを得る工程、 （３）上記工程で得られた宿主真菌用染色体組込型ベク
ターを宿主真菌の染色体に組込む工程、 （４）オーレオバシジン耐性に形質転換された宿主をオ
ーレオバシジン存在下で選択する工程。このオーレオバ
シジン耐性形質転換体の創製方法において複製ベクター
は異種の遺伝子を含有する場合がある。更に、本発明の
第４の発明は形質転換体に関し、本発明の第３の発明の
創製方法で得られるものであることを特徴とする。
明の第１の発明は配列表の配列番号１で表されるオーレ
オバシジン感受性付与蛋白質の少なくとも２４０番目の
ＡｌａがＣｙｓに置換されたオーレオバシジン耐性付与
蛋白質、又は該蛋白質の２４０番目に相当する部位以外
のアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の置換、挿入
及び欠失の少なくとも一つを施すことにより得られるア
ミノ酸配列を有し、該蛋白質と同等の生物学的活性を示
すオーレオバシジン耐性付与蛋白質に関する。また、本
発明の第２の発明は本発明の第１の発明のオーレオバシ
ジン耐性付与蛋白質をコードする遺伝子に関する。本発
明の第３の発明は、オーレオバシジン耐性形質転換体の
創製方法に関し、下記工程を包含することを特徴とす
る。 （１）本発明の第２の発明のオーレオバシジン耐性付与
蛋白質をコードする遺伝子を含有する複製ベクターを得
る工程、 （２）上記工程で得られた複製ベクター中のオーレオバ
シジン耐性付与蛋白質をコードする遺伝子の１ヵ所で開
裂し、宿主真菌用染色体組込型ベクターを得る工程、 （３）上記工程で得られた宿主真菌用染色体組込型ベク
ターを宿主真菌の染色体に組込む工程、 （４）オーレオバシジン耐性に形質転換された宿主をオ
ーレオバシジン存在下で選択する工程。このオーレオバ
シジン耐性形質転換体の創製方法において複製ベクター
は異種の遺伝子を含有する場合がある。更に、本発明の
第４の発明は形質転換体に関し、本発明の第３の発明の
創製方法で得られるものであることを特徴とする。
【０００７】本発明者らは配列表の配列番号１で表され
るオーレオバシジン感受性付与蛋白質（Ａｕｒ１S ｐ）
の２４０番目のＡｌａを他のアミノ酸で置換することに
より、該蛋白質がオーレオバシジン耐性付与蛋白質（Ａ
ｕｒ１R ｐ）に変換されることを見出し、本発明を完成
した。
るオーレオバシジン感受性付与蛋白質（Ａｕｒ１S ｐ）
の２４０番目のＡｌａを他のアミノ酸で置換することに
より、該蛋白質がオーレオバシジン耐性付与蛋白質（Ａ
ｕｒ１R ｐ）に変換されることを見出し、本発明を完成
した。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明のＡｕｒ１R ｐとは少なく
ともＡｕｒ１S ｐの２４０番目のＡｌａが他のアミノ酸
に置換されていれば良く、その他のアミノ酸残基が生物
活性を低下させることなく化学的、物理的、遺伝子工学
的に置換、挿入、及び欠失の少なくとも一つがなされて
いても良い。本発明のＡｕｒ１R ｐは好適には配列表の
配列番号９で表されるＡｕｒ１S ｐをコードするＤＮＡ
を用いることにより遺伝子工学的に作製することがで
き、オーレオバシジン感受性細胞を耐性細胞に変換させ
る活性を測定することにより、その生物活性を測定する
ことができる。本発明のＡｕｒ１R ｐとは、オーレオバ
シジン感受性細胞を耐性細胞に変換させる活性が、従来
公知の配列表の配列番号７で表されるＡｕｒ１R ｐより
増強されているものである。
ともＡｕｒ１S ｐの２４０番目のＡｌａが他のアミノ酸
に置換されていれば良く、その他のアミノ酸残基が生物
活性を低下させることなく化学的、物理的、遺伝子工学
的に置換、挿入、及び欠失の少なくとも一つがなされて
いても良い。本発明のＡｕｒ１R ｐは好適には配列表の
配列番号９で表されるＡｕｒ１S ｐをコードするＤＮＡ
を用いることにより遺伝子工学的に作製することがで
き、オーレオバシジン感受性細胞を耐性細胞に変換させ
る活性を測定することにより、その生物活性を測定する
ことができる。本発明のＡｕｒ１R ｐとは、オーレオバ
シジン感受性細胞を耐性細胞に変換させる活性が、従来
公知の配列表の配列番号７で表されるＡｕｒ１R ｐより
増強されているものである。
【０００９】配列表の配列番号１で表されるＡｕｒ１S
ｐの２４０番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された
Ａｕｒ１R ｐへのアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失は
遺伝子の部位特異的変異誘発により実施することができ
る。単離したＡｕｒ１S ｐ又はＡｕｒ１R ｐをコードす
るＤＮＡを、ヌクレオチドの置換、挿入及び欠失の少な
くとも一つによって修飾するのは容易であり、本発明の
Ａｕｒ１R ｐをコードしている新規なＤＮＡ配列を得る
ことができる。これらの変異を受けた配列は、変異体蛋
白質を生産するために用いられる。アミノ酸残基の置
換、挿入及び欠失に関し、１又は複数のアミノ酸残基の
変換は遺伝子工学的に作製可能な範囲のものであり、生
物活性を破壊することなく行われたものが選抜されう
る。更に、特定の位置の残基での突然変異を適切に行う
ためには標的コドンに無作為な変異誘発を行い、発現さ
れた変異体を所望の活性についてスクリーニングすれば
よい。挿入には、Ａｕｒ１R ｐ又はそのフラグメントと
他の蛋白質又はポリペプチドとがＡｕｒ１R ｐ又はその
フラグメントのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に
おいて、ペプチド結合を介して結合している融合蛋白質
を含む。更に、アミノ酸残基を欠失させる方法として、
ギャップド デュプレックス (gapped duplex)法により
アミノ酸配列の任意のアミノ酸コドンを終止コドンに置
換することにより、置換したアミノ酸残基よりカルボキ
シ末端側を欠失させることができる。
ｐの２４０番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された
Ａｕｒ１R ｐへのアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失は
遺伝子の部位特異的変異誘発により実施することができ
る。単離したＡｕｒ１S ｐ又はＡｕｒ１R ｐをコードす
るＤＮＡを、ヌクレオチドの置換、挿入及び欠失の少な
くとも一つによって修飾するのは容易であり、本発明の
Ａｕｒ１R ｐをコードしている新規なＤＮＡ配列を得る
ことができる。これらの変異を受けた配列は、変異体蛋
白質を生産するために用いられる。アミノ酸残基の置
換、挿入及び欠失に関し、１又は複数のアミノ酸残基の
変換は遺伝子工学的に作製可能な範囲のものであり、生
物活性を破壊することなく行われたものが選抜されう
る。更に、特定の位置の残基での突然変異を適切に行う
ためには標的コドンに無作為な変異誘発を行い、発現さ
れた変異体を所望の活性についてスクリーニングすれば
よい。挿入には、Ａｕｒ１R ｐ又はそのフラグメントと
他の蛋白質又はポリペプチドとがＡｕｒ１R ｐ又はその
フラグメントのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に
おいて、ペプチド結合を介して結合している融合蛋白質
を含む。更に、アミノ酸残基を欠失させる方法として、
ギャップド デュプレックス (gapped duplex)法により
アミノ酸配列の任意のアミノ酸コドンを終止コドンに置
換することにより、置換したアミノ酸残基よりカルボキ
シ末端側を欠失させることができる。
【００１０】別の方法としては、コードするＤＮＡをア
ミノ酸配列のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に対
応する部分より分解するディレーション法〔ジーン（Ge
ne)、第３３巻、第１０３〜１１９頁（１９８５）〕に
より欠失する方法や、開始コドン及び／又は終止コドン
を含むプライマーを用いたＰＣＲ法により任意の長さの
アミノ末端及び／又はカルボキシ末端を欠失させた蛋白
質をコードするＤＮＡを得ることができる。なお、部位
特異的変異誘発はオリゴヌクレオチドを用いたギャップ
ド デュプレックス法〔メソッズ イン エンザイモロ
ジー（Methodsin Enzymology)、第１５４巻、第３５０
〜３６７頁（１９８７）〕やオリゴヌクレオチドを用い
たウラシルＤＮＡ法〔メソッズ イン エンザイモロジ
ー、第１５４巻、第３６７〜３８２頁（１９８７）〕、
亜硝酸法〔プロシーディングズオブ ザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ
（Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ）、第７９巻、第７２
５８〜７２６２頁（１９８２）〕、更にカセット変異法
〔ジーン、第３４巻、第３１５〜３２３頁（１９８
５）〕が知られている。
ミノ酸配列のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に対
応する部分より分解するディレーション法〔ジーン（Ge
ne)、第３３巻、第１０３〜１１９頁（１９８５）〕に
より欠失する方法や、開始コドン及び／又は終止コドン
を含むプライマーを用いたＰＣＲ法により任意の長さの
アミノ末端及び／又はカルボキシ末端を欠失させた蛋白
質をコードするＤＮＡを得ることができる。なお、部位
特異的変異誘発はオリゴヌクレオチドを用いたギャップ
ド デュプレックス法〔メソッズ イン エンザイモロ
ジー（Methodsin Enzymology)、第１５４巻、第３５０
〜３６７頁（１９８７）〕やオリゴヌクレオチドを用い
たウラシルＤＮＡ法〔メソッズ イン エンザイモロジ
ー、第１５４巻、第３６７〜３８２頁（１９８７）〕、
亜硝酸法〔プロシーディングズオブ ザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ
（Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ）、第７９巻、第７２
５８〜７２６２頁（１９８２）〕、更にカセット変異法
〔ジーン、第３４巻、第３１５〜３２３頁（１９８
５）〕が知られている。
【００１１】本発明のＡｕｒ１R ｐの特に好適な実施態
様においてＡｕｒ１S ｐの２４０番目のＡｌａがＣｙｓ
に置換した変異体が得られる。その１例の変異体のアミ
ノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。また、この変異
体をＡｕｒ１R ｐ（Ａ２４０Ｃ）と称する。また、Ａｕ
ｒ１S ｐの１５８番目のＰｈｅがＴｙｒに、２４０番目
のＡｌａがＣｙｓに置換した変異体を得ることができ
る。この変異体のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に
示す。また、この変異体をＡｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、
Ａ２４０Ｃ）と称する。これらの変異体のオーレオバシ
ジン耐性付与能力はＡｕｒ１S ｐの１５８番目のＰｈｅ
がＴｙｒに置換した配列表の配列番号７で表される蛋白
質〔Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ）〕よりも強い。
様においてＡｕｒ１S ｐの２４０番目のＡｌａがＣｙｓ
に置換した変異体が得られる。その１例の変異体のアミ
ノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。また、この変異
体をＡｕｒ１R ｐ（Ａ２４０Ｃ）と称する。また、Ａｕ
ｒ１S ｐの１５８番目のＰｈｅがＴｙｒに、２４０番目
のＡｌａがＣｙｓに置換した変異体を得ることができ
る。この変異体のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に
示す。また、この変異体をＡｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、
Ａ２４０Ｃ）と称する。これらの変異体のオーレオバシ
ジン耐性付与能力はＡｕｒ１S ｐの１５８番目のＰｈｅ
がＴｙｒに置換した配列表の配列番号７で表される蛋白
質〔Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ）〕よりも強い。
【００１２】本発明のＡｕｒ１R ｐをコードするＤＮＡ
の例としては、配列表の配列番号４、５でそれぞれ表さ
れるＤＮＡがある。配列表の配列番号４で表されるＤＮ
ＡはＡｕｒ１R ｐ（Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡで
あり、配列表の配列番号５で表されるＤＮＡはＡｕｒ１
R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡで
ある。
の例としては、配列表の配列番号４、５でそれぞれ表さ
れるＤＮＡがある。配列表の配列番号４で表されるＤＮ
ＡはＡｕｒ１R ｐ（Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡで
あり、配列表の配列番号５で表されるＤＮＡはＡｕｒ１
R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡで
ある。
【００１３】本発明のＡｕｒ１R ｐをコードするＤＮＡ
を適当なベクターに組込み、複製ベクターを作製し、宿
主を形質転換すれば、宿主にオーレオバシジン耐性を選
択マーカーとして付与することができ、オーレオバシジ
ンを用いた薬剤耐性により容易に形質転換体を選択する
ことができる。この複製ベクターの酵母用ベクターとし
てはＹＲP 型、ＹＣP 型、ＹＥP 型、ＹＩP 型が使用で
きる。また、複製ベクターは大腸菌等に安定に保持させ
ることが可能であり、その際、ベクターとして使用可能
なものとして、ｐＵＣ系ベクター、ｐＴＶ系ベクター、
大腸菌−酵母シャトルベクター（例えば、ｐＷＨ５、ｐ
ＡＵ−ＰＳなど）等がある。
を適当なベクターに組込み、複製ベクターを作製し、宿
主を形質転換すれば、宿主にオーレオバシジン耐性を選
択マーカーとして付与することができ、オーレオバシジ
ンを用いた薬剤耐性により容易に形質転換体を選択する
ことができる。この複製ベクターの酵母用ベクターとし
てはＹＲP 型、ＹＣP 型、ＹＥP 型、ＹＩP 型が使用で
きる。また、複製ベクターは大腸菌等に安定に保持させ
ることが可能であり、その際、ベクターとして使用可能
なものとして、ｐＵＣ系ベクター、ｐＴＶ系ベクター、
大腸菌−酵母シャトルベクター（例えば、ｐＷＨ５、ｐ
ＡＵ−ＰＳなど）等がある。
【００１４】また、本発明のＡｕｒ１R ｐは適当な宿主
に発現させることも可能であり、上記複製ベクターを、
必要に応じて適当な制限酵素等で、蛋白質に翻訳される
領域（open reading frame, ＯＲＦ）にだけ切り縮めた
後、適当なベクターにつなぎ、発現用組換体プラスミド
とすることができる。発現用プラスミドとしては、宿主
が大腸菌の時は、ｐＴＶ系ベクター、宿主が酵母の時
は、ｐＹＥＳ２等のベクターＤＮＡを使用すれば良い。
に発現させることも可能であり、上記複製ベクターを、
必要に応じて適当な制限酵素等で、蛋白質に翻訳される
領域（open reading frame, ＯＲＦ）にだけ切り縮めた
後、適当なベクターにつなぎ、発現用組換体プラスミド
とすることができる。発現用プラスミドとしては、宿主
が大腸菌の時は、ｐＴＶ系ベクター、宿主が酵母の時
は、ｐＹＥＳ２等のベクターＤＮＡを使用すれば良い。
【００１５】また、本発明のＡｕｒ１R ｐをコードする
ＤＮＡを組込んだ複製プラスミドを切断し、線状化する
ことによって、線状の染色体組込型ベクターを作製する
ことができる。染色体組込型ベクター中のオーレオバシ
ジン耐性付与蛋白質をコードするＤＮＡが相同のＤＮ
Ａ、すなわちオーレオバシジン感受性付与蛋白質をコー
ドするＤＮＡと相同組換えを起こし、オーレオバシジン
感受性細胞が、オーレオバシジン耐性細胞に変換する。
ＤＮＡを組込んだ複製プラスミドを切断し、線状化する
ことによって、線状の染色体組込型ベクターを作製する
ことができる。染色体組込型ベクター中のオーレオバシ
ジン耐性付与蛋白質をコードするＤＮＡが相同のＤＮ
Ａ、すなわちオーレオバシジン感受性付与蛋白質をコー
ドするＤＮＡと相同組換えを起こし、オーレオバシジン
感受性細胞が、オーレオバシジン耐性細胞に変換する。
【００１６】本発明のＡｕｒ１R ｐは一倍体の酵母、二
倍体酵母、特に実用酵母にもオーレオバシジン耐性を付
与することができ、清酒、焼酎、ビール、ワイン等の酒
類、パン等の発酵食品に広範に利用されているＳ．セレ
ビシエの育種に極めて有用である。更に本発明のＡｕｒ
１R ｐはＳ．セレビシエ以外の真菌にも適用が可能であ
り、他の真菌の育種、遺伝子工学的利用等において有用
である。例えば、本発明のＡｕｒ１R ｐは、Ｃ．アルビ
カンスにオーレオバシジン耐性を付与することができ、
Ａｕｒ１R ｐをコードするＤＮＡを有するベクターは
Ｃ．アルビカンスの遺伝子工学用ベクターとして初めて
提供されるものである。
倍体酵母、特に実用酵母にもオーレオバシジン耐性を付
与することができ、清酒、焼酎、ビール、ワイン等の酒
類、パン等の発酵食品に広範に利用されているＳ．セレ
ビシエの育種に極めて有用である。更に本発明のＡｕｒ
１R ｐはＳ．セレビシエ以外の真菌にも適用が可能であ
り、他の真菌の育種、遺伝子工学的利用等において有用
である。例えば、本発明のＡｕｒ１R ｐは、Ｃ．アルビ
カンスにオーレオバシジン耐性を付与することができ、
Ａｕｒ１R ｐをコードするＤＮＡを有するベクターは
Ｃ．アルビカンスの遺伝子工学用ベクターとして初めて
提供されるものである。
【００１７】このＣ．アルビカンスは真菌症の病原菌と
して知られている。近年日和見感染症の増加と共に、そ
の病原性の原因究明のための研究が必要とされてきてお
り、本発明のＡｕｒ１R ｐ、前述ベクターはＣ．アルビ
カンスの遺伝子研究上、極めて有用である。
して知られている。近年日和見感染症の増加と共に、そ
の病原性の原因究明のための研究が必要とされてきてお
り、本発明のＡｕｒ１R ｐ、前述ベクターはＣ．アルビ
カンスの遺伝子研究上、極めて有用である。
【００１８】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
【００１９】実施例１ 変異オーレオバシジン耐性遺伝
子を含有する組換えプラスミドの構築 （１） scaur１R を含有するプラスミドの構築 scaur１S を含有するプラスミドｐＳＣＡＲ１を保有す
る大腸菌、Escherichia coli HB101/pSCAR1 (FERM BP-4
483)よりプラスミドｐＳＣＡＲ１を調製し、Hind IIIで
部分切断し、 scaur１S を含む３．５ｋｂのＤＮＡを単
離した。この３．５ｋｂＤＮＡをHind IIIで切断したｐ
ＵＣ１１９ベクターと連結し、プラスミドｐＵscaur1S
を作製した。プラスミドｐＵscaur1S を大腸菌ＣＪ２３
６に形質転換し、ｓｓＤＮＡを調製した。次に合成、精
製した配列表の配列番号１０で表される変異導入用合成
オリゴヌクレオチドと上記のｓｓＤＮＡを用いて、ミユ
ータン（Mutan)−Ｋキット（宝酒造社製）により部位特
異的ＤＮＡ変異を導入した。すなわち、配列表の配列番
号１０で表されるオリゴヌクレオチドを用いることによ
り、 scaur１S 遺伝子のＯＲＦ内のアミノ酸番号１５８
番目のＰｈｅのコドンＴＴＴがコドンＴＡＴのＴｙｒに
置換した scaur１R を得ることができた。このＡｕｒ１
R ｐ（Ｆ１５８Ｙ）をコードするＤＮＡを有するプラス
ミドをｐＵscaur1Ｒとした。
子を含有する組換えプラスミドの構築 （１） scaur１R を含有するプラスミドの構築 scaur１S を含有するプラスミドｐＳＣＡＲ１を保有す
る大腸菌、Escherichia coli HB101/pSCAR1 (FERM BP-4
483)よりプラスミドｐＳＣＡＲ１を調製し、Hind IIIで
部分切断し、 scaur１S を含む３．５ｋｂのＤＮＡを単
離した。この３．５ｋｂＤＮＡをHind IIIで切断したｐ
ＵＣ１１９ベクターと連結し、プラスミドｐＵscaur1S
を作製した。プラスミドｐＵscaur1S を大腸菌ＣＪ２３
６に形質転換し、ｓｓＤＮＡを調製した。次に合成、精
製した配列表の配列番号１０で表される変異導入用合成
オリゴヌクレオチドと上記のｓｓＤＮＡを用いて、ミユ
ータン（Mutan)−Ｋキット（宝酒造社製）により部位特
異的ＤＮＡ変異を導入した。すなわち、配列表の配列番
号１０で表されるオリゴヌクレオチドを用いることによ
り、 scaur１S 遺伝子のＯＲＦ内のアミノ酸番号１５８
番目のＰｈｅのコドンＴＴＴがコドンＴＡＴのＴｙｒに
置換した scaur１R を得ることができた。このＡｕｒ１
R ｐ（Ｆ１５８Ｙ）をコードするＤＮＡを有するプラス
ミドをｐＵscaur1Ｒとした。
【００２０】（２）ＰＣＲによる変異を導入して scaur
１R のＤＮＡ断片の増幅 Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ）の２４０番目のＡｌａをＣ
ｙｓに変換するためにＡｌａのコドンＧＣＴをＣｙｓの
コドンＴＧＴに変換した配列表の配列番号１１で表され
るプライマーを合成、精製した。 scaur１R を含む３．
５ｋｂHindIII断片をｐＵＣ１１９のHind III部位に保
持する実施例１−（１）記載のプラスミドｐＵscaur1Ｒ
を鋳型とし、配列番号１１で表されるプライマー及びＭ
１３Ｍ４プライマーを用いてＰＣＲ法によりＧＣＴがＴ
ＧＴに変換したＡｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０
Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸配列をコードする約５００ｂ
ｐを含むＤＮＡ断片（約１．４ｋｂ）を増幅した。ＰＣ
Ｒ反応は、最終濃度が１０ｍＭトリス（Tris) −ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 、０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、０．１ｍＭ ｄＣＴ
Ｐ、０．１ｍＭ ｄＴＴＰ、０．１ｍＭ ｄＧＴＰとな
るようなＰＣＲ反応緩衝液２８μｌに、２．５ユニット
のアムプリ タック（Ampli Taq)ＤＮＡポリメラーゼ
（パーキンエルマー社製）、各々１００ｐｍｏｌの配列
番号１１で表されるプライマー及びＭ１３Ｍ４プライマ
ー、１ｎｇのｐＵscaur1Ｒと蒸留水を加え、ＰＣＲ反応
液１００μｌとする。この反応液を９４℃１分間、５５
℃１．５分間、及び７２℃１．５分間の順序で加熱し、
このサイクルを３０回反復した。その後、ＰＣＲ産物を
ＳａｌＩとＳｎａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動
で分離させ、目的の約１．３ｋｂＤＮＡ断片をゲルより
回収、精製した。
１R のＤＮＡ断片の増幅 Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ）の２４０番目のＡｌａをＣ
ｙｓに変換するためにＡｌａのコドンＧＣＴをＣｙｓの
コドンＴＧＴに変換した配列表の配列番号１１で表され
るプライマーを合成、精製した。 scaur１R を含む３．
５ｋｂHindIII断片をｐＵＣ１１９のHind III部位に保
持する実施例１−（１）記載のプラスミドｐＵscaur1Ｒ
を鋳型とし、配列番号１１で表されるプライマー及びＭ
１３Ｍ４プライマーを用いてＰＣＲ法によりＧＣＴがＴ
ＧＴに変換したＡｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０
Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸配列をコードする約５００ｂ
ｐを含むＤＮＡ断片（約１．４ｋｂ）を増幅した。ＰＣ
Ｒ反応は、最終濃度が１０ｍＭトリス（Tris) −ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 、０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、０．１ｍＭ ｄＣＴ
Ｐ、０．１ｍＭ ｄＴＴＰ、０．１ｍＭ ｄＧＴＰとな
るようなＰＣＲ反応緩衝液２８μｌに、２．５ユニット
のアムプリ タック（Ampli Taq)ＤＮＡポリメラーゼ
（パーキンエルマー社製）、各々１００ｐｍｏｌの配列
番号１１で表されるプライマー及びＭ１３Ｍ４プライマ
ー、１ｎｇのｐＵscaur1Ｒと蒸留水を加え、ＰＣＲ反応
液１００μｌとする。この反応液を９４℃１分間、５５
℃１．５分間、及び７２℃１．５分間の順序で加熱し、
このサイクルを３０回反復した。その後、ＰＣＲ産物を
ＳａｌＩとＳｎａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動
で分離させ、目的の約１．３ｋｂＤＮＡ断片をゲルより
回収、精製した。
【００２１】（３）Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４
０Ｃ）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドの構築 ｐＵscaur1ＲをＳａｌＩ及びＳｎａＩで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動で分離させ、目的とする５．３ｋｂの
ＤＮＡ断片を回収し、精製した。このＤＮＡ断片に実施
例１−（２）で得た１．３ｋｂＤＮＡ断片を連結し、Ａ
ｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤ
ＮＡ（ scaur１R -C )を有するこのプラスミドをｐＵsc
aur1R −Ｃと命名した。清酒酵母の染色体への組込みに
よる形質転換のために、ｐＵscaur1R −ＣをＳｔｕＩで
切断し線状化した後、使用した。また対照としてｐＵsc
aur1ＲもＳｔｕＩで線状化した。
０Ｃ）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドの構築 ｐＵscaur1ＲをＳａｌＩ及びＳｎａＩで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動で分離させ、目的とする５．３ｋｂの
ＤＮＡ断片を回収し、精製した。このＤＮＡ断片に実施
例１−（２）で得た１．３ｋｂＤＮＡ断片を連結し、Ａ
ｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤ
ＮＡ（ scaur１R -C )を有するこのプラスミドをｐＵsc
aur1R −Ｃと命名した。清酒酵母の染色体への組込みに
よる形質転換のために、ｐＵscaur1R −ＣをＳｔｕＩで
切断し線状化した後、使用した。また対照としてｐＵsc
aur1ＲもＳｔｕＩで線状化した。
【００２２】（４）Ａｕｒ１R ｐ（Ａ２４０Ｃ）をコー
ドするＤＮＡを含有するプラスミドの構築 ｐＵｓｃａｕｒ１S をＳａｌＩ及びＳｎａＩで切断し、
アガロースゲル電気泳動で分離させ、目的とする５．３
ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、精製した。このＤＮＡ断片
に実施例１−（２）で得た１．３ｋｂＤＮＡ断片を連結
した。Ａｕｒ１S ｐの２４０番目のＡｌａがＣｙｓに変
換したＡｕｒ１R ｐ（Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡ
を有するこのプラスミドをｐＵscaur1Ａ２４０Ｃと命名
した。清酒酵母の染色体への組込みによる形質転換のた
めに、ｐＵscaur1Ａ２４０ＣをＳｔｕＩで切断し線状化
した後、使用した。
ドするＤＮＡを含有するプラスミドの構築 ｐＵｓｃａｕｒ１S をＳａｌＩ及びＳｎａＩで切断し、
アガロースゲル電気泳動で分離させ、目的とする５．３
ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、精製した。このＤＮＡ断片
に実施例１−（２）で得た１．３ｋｂＤＮＡ断片を連結
した。Ａｕｒ１S ｐの２４０番目のＡｌａがＣｙｓに変
換したＡｕｒ１R ｐ（Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡ
を有するこのプラスミドをｐＵscaur1Ａ２４０Ｃと命名
した。清酒酵母の染色体への組込みによる形質転換のた
めに、ｐＵscaur1Ａ２４０ＣをＳｔｕＩで切断し線状化
した後、使用した。
【００２３】（５）Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４
０Ｃ）をコードするＤＮＡを保持するｐＹＣ系ベクター
の構築 ｐＵscaur1R −Ｃを鋳型とし、配列表の配列番号１２と
１３でそれぞれ表されるプライマーを用いてＰＣＲを行
った。増幅したＡｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０
Ｃ）をコードするＤＮＡを含むＰＣＲ産物（約２．２ｋ
ｂ）をＸｈｏＩとＫｐｎＩで切断後、ブランチィングキ
ット（宝酒造社製）を用いて両末端を平滑化した。ｐＹ
Ｃ系ベクターであるｐＹＥＵｒａ３（クローンテック社
製）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断後、ブランチィン
グキットにより平滑末端にし、上記の平滑末端化したＰ
ＣＲ産物（約２．２ｋｂ）と連結した。こうして得られ
たプラスミドをｐＹＣscaur1R −Ｃと命名した。また、
同様にｐＵscaur1Ｒを鋳型とし、同様に配列表の配列番
号１２と１３でそれぞれ表されるプライマーを用いてＰ
ＣＲを行った。増幅したＡｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ）を
コードするＤＮＡを含むＰＣＲ産物（約２．２ｋｂ）を
ＸｈｏＩとＫｐｎＩで切断後、ブランチィングキット
（宝酒造社製）を用いて両末端を平滑化した。ｐＹＣ系
ベクターであるｐＹＥＵｒａ３（クローンテック社製）
をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断後、ブランチィングキ
ットにより平滑末端にし、上記の平滑末端化したＰＣＲ
産物（約２．２ｋｂ）と連結した。こうして得られたプ
ラスミドをｐＹＣscaur1Ｒと命名した。
０Ｃ）をコードするＤＮＡを保持するｐＹＣ系ベクター
の構築 ｐＵscaur1R −Ｃを鋳型とし、配列表の配列番号１２と
１３でそれぞれ表されるプライマーを用いてＰＣＲを行
った。増幅したＡｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０
Ｃ）をコードするＤＮＡを含むＰＣＲ産物（約２．２ｋ
ｂ）をＸｈｏＩとＫｐｎＩで切断後、ブランチィングキ
ット（宝酒造社製）を用いて両末端を平滑化した。ｐＹ
Ｃ系ベクターであるｐＹＥＵｒａ３（クローンテック社
製）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断後、ブランチィン
グキットにより平滑末端にし、上記の平滑末端化したＰ
ＣＲ産物（約２．２ｋｂ）と連結した。こうして得られ
たプラスミドをｐＹＣscaur1R −Ｃと命名した。また、
同様にｐＵscaur1Ｒを鋳型とし、同様に配列表の配列番
号１２と１３でそれぞれ表されるプライマーを用いてＰ
ＣＲを行った。増幅したＡｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ）を
コードするＤＮＡを含むＰＣＲ産物（約２．２ｋｂ）を
ＸｈｏＩとＫｐｎＩで切断後、ブランチィングキット
（宝酒造社製）を用いて両末端を平滑化した。ｐＹＣ系
ベクターであるｐＹＥＵｒａ３（クローンテック社製）
をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断後、ブランチィングキ
ットにより平滑末端にし、上記の平滑末端化したＰＣＲ
産物（約２．２ｋｂ）と連結した。こうして得られたプ
ラスミドをｐＹＣscaur1Ｒと命名した。
【００２４】（６）Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４
０Ｃ）をコードするＤＮＡを保持するｐＹＥ系ベクター
の構築 ｐＵscaur1R −Ｃを鋳型とし、配列番号１２で表される
プライマーとＭ１３Ｍ４プライマーを用いてＰＣＲ法に
よりＡｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコード
するＤＮＡを含むＤＮＡ断片（約２．２ｋｂ）を増幅し
た。ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動で分離し、目的とする約１．８ｋｂＤＮＡ断片
をゲルより回収精製した。プラスミドｐＳＣＡＲ１をＢ
ａｍＨＩで切断し、 scaur１S を含む２．８ｋｂＤＮＡ
断片を除いた１１．７ｋｂＤＮＡ断片を得た。この１
１．７ｋｂのＤＮＡ断片と上記のＡｕｒ１R ｐ（Ｆ１５
８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡを含む１．８ｋ
ｂＤＮＡ断片を連結し、目的とする方向で１．８ｋｂ断
片が挿入されたプラスミドを選別した。Ａｕｒ１R ｐ
（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡを含有
するこのプラスミドをｐＷscaur1R −Ｃと命名し、実験
室用酵母の形質転換に用いた。
０Ｃ）をコードするＤＮＡを保持するｐＹＥ系ベクター
の構築 ｐＵscaur1R −Ｃを鋳型とし、配列番号１２で表される
プライマーとＭ１３Ｍ４プライマーを用いてＰＣＲ法に
よりＡｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコード
するＤＮＡを含むＤＮＡ断片（約２．２ｋｂ）を増幅し
た。ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動で分離し、目的とする約１．８ｋｂＤＮＡ断片
をゲルより回収精製した。プラスミドｐＳＣＡＲ１をＢ
ａｍＨＩで切断し、 scaur１S を含む２．８ｋｂＤＮＡ
断片を除いた１１．７ｋｂＤＮＡ断片を得た。この１
１．７ｋｂのＤＮＡ断片と上記のＡｕｒ１R ｐ（Ｆ１５
８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡを含む１．８ｋ
ｂＤＮＡ断片を連結し、目的とする方向で１．８ｋｂ断
片が挿入されたプラスミドを選別した。Ａｕｒ１R ｐ
（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡを含有
するこのプラスミドをｐＷscaur1R −Ｃと命名し、実験
室用酵母の形質転換に用いた。
【００２５】実施例２ 酵母を宿主に用いた形質転換
（１）染色体組込型プラスミドを用いた清酒酵母の形質
転換 実施例１−（３）で作製したｐＵscaur1R −Ｃ、実施例
１−（４）で作製したｐＵscaur1Ａ２４０Ｃと実施例１
−（１）で作製したｐＵscaur1Ｒの活性を比較するため
ＳｔｕＩで線状化したプラスミド５μｇを清酒酵母協会
７０１号に酢酸リチウム法によって導入した。すなわ
ち、０．１Ｍ酢酸リチウム水溶液（ｐＨ７．５）に懸濁
しコンピテント化した清酒酵母（約６×１０7 ／１００
μｌの０．１Ｍ酢酸リチウム）に、ＳｔｕＩで１ヵ所切
断し直鎖状にしたプラスミド５μｇと８５０μｌの４０
％ポリエチレングリコール／０．１Ｍ酢酸リチウムを添
加し、３０℃、３０分間処理した。更に、４２℃、１５
分間保温した後、集菌し、５ｍｌのＹＰＤ液体培地で１
時間又は一晩、前培養し、各濃度のオーレオバシジンＡ
を含むＹＰＤ寒天培地に塗布した。３０℃、３〜４日の
培養後、オーレオバシジンＡに耐性を有する形質転換体
を得た。表２が示すようにＳｔｕＩ線状化ｐＵscaur1Ｒ
−Ｃによる形質転換体は５μｇ／ｍｌのオーレオバシジ
ンＡを含む培地でも生育可能である。これらの形質転換
体は数回の継代後も安定に親株の１０倍以上のオーレオ
バシジンＡ耐性を有していた。また線状化ｐＵscaur1R
−Ｃの形質転換により得られた形質転換体のオーレオバ
シジンＡに対するＭＩＣは１０μｇ／ｍｌ以上であっ
た。したがって、Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０
Ｃ）は清酒酵母に対する有効な選択マーカーとして利用
できることが確認された。表が示すようにＳｔｕＩ線状
化ｐＵscaur1Ａ２４０ＣもＳｔｕＩ線状化ｐＵscaur1Ｒ
よりも強い耐性付与活性を示した。すなわち、Ａｕｒ１
S ｐの２４０番目のＡｌａの変異により強い耐性付与活
性が発現した。ｐＵscaur1R −Ｃ中のＡｕｒ１R ｐ（Ｆ
１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡ（図１中、
scaur1R -Cと示す）が相同の宿主染色体、すなわちＡｕ
ｒ１S ｐをコードするＤＮＡ（図１中、scaur１S と示
す）と相同組換えを起こし、オーレオバシジン感受性細
胞をオーレオバシジン耐性細胞に変換する場合を図１に
示す。
転換 実施例１−（３）で作製したｐＵscaur1R −Ｃ、実施例
１−（４）で作製したｐＵscaur1Ａ２４０Ｃと実施例１
−（１）で作製したｐＵscaur1Ｒの活性を比較するため
ＳｔｕＩで線状化したプラスミド５μｇを清酒酵母協会
７０１号に酢酸リチウム法によって導入した。すなわ
ち、０．１Ｍ酢酸リチウム水溶液（ｐＨ７．５）に懸濁
しコンピテント化した清酒酵母（約６×１０7 ／１００
μｌの０．１Ｍ酢酸リチウム）に、ＳｔｕＩで１ヵ所切
断し直鎖状にしたプラスミド５μｇと８５０μｌの４０
％ポリエチレングリコール／０．１Ｍ酢酸リチウムを添
加し、３０℃、３０分間処理した。更に、４２℃、１５
分間保温した後、集菌し、５ｍｌのＹＰＤ液体培地で１
時間又は一晩、前培養し、各濃度のオーレオバシジンＡ
を含むＹＰＤ寒天培地に塗布した。３０℃、３〜４日の
培養後、オーレオバシジンＡに耐性を有する形質転換体
を得た。表２が示すようにＳｔｕＩ線状化ｐＵscaur1Ｒ
−Ｃによる形質転換体は５μｇ／ｍｌのオーレオバシジ
ンＡを含む培地でも生育可能である。これらの形質転換
体は数回の継代後も安定に親株の１０倍以上のオーレオ
バシジンＡ耐性を有していた。また線状化ｐＵscaur1R
−Ｃの形質転換により得られた形質転換体のオーレオバ
シジンＡに対するＭＩＣは１０μｇ／ｍｌ以上であっ
た。したがって、Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０
Ｃ）は清酒酵母に対する有効な選択マーカーとして利用
できることが確認された。表が示すようにＳｔｕＩ線状
化ｐＵscaur1Ａ２４０ＣもＳｔｕＩ線状化ｐＵscaur1Ｒ
よりも強い耐性付与活性を示した。すなわち、Ａｕｒ１
S ｐの２４０番目のＡｌａの変異により強い耐性付与活
性が発現した。ｐＵscaur1R −Ｃ中のＡｕｒ１R ｐ（Ｆ
１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）をコードするＤＮＡ（図１中、
scaur1R -Cと示す）が相同の宿主染色体、すなわちＡｕ
ｒ１S ｐをコードするＤＮＡ（図１中、scaur１S と示
す）と相同組換えを起こし、オーレオバシジン感受性細
胞をオーレオバシジン耐性細胞に変換する場合を図１に
示す。
【００２６】
【表２】
表 ２
────────────────────────────────────
プラスミド 前培養時間 形質転換体数／μｇＤＮＡ
───────────────────
オーレオバシジンＡ濃度
0.5μg/ml 1.0μg/ml 5.0μg/ml
────────────────────────────────────
StuI線状化pUscaur1R １時間 ０ ０ ０
一晩 ５ ４ ０
StuI線状化pUscaur1R -C １時間 １７０ ７３ ０
一晩 ２３６８ ２０２４ ６４
StuI線状化pUscaur1A240C １時間 １８ １ ０
一晩 １６０ １５２ ０
プラスミドなし １時間 ０ ０ ０
（コントロール） 一晩 ０ ０ ０
────────────────────────────────────
【００２７】（２）ｐＹＣscaur1R −Ｃによる清酒酵母
の形質転換 ｐＹＣ系プラスミドであるｐＹＣscaur1R −Ｃ ５μｇ
を用いて清酒酵母協会７０１号を実施例２−（１）で述
べた酢酸リチウム法によって形質転換した。表３が示す
ように線状化プラスミドと同様の結果を得た。これらの
形質転換体は数回の継代後も安定に親株の１０倍以上の
オーレオバシジンＡ耐性を有していた。したがって、Ａ
ｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）は複製ベクター
による形質転換においても清酒酵母に対する有効な選択
マーカーとして利用できることが確認された。
の形質転換 ｐＹＣ系プラスミドであるｐＹＣscaur1R −Ｃ ５μｇ
を用いて清酒酵母協会７０１号を実施例２−（１）で述
べた酢酸リチウム法によって形質転換した。表３が示す
ように線状化プラスミドと同様の結果を得た。これらの
形質転換体は数回の継代後も安定に親株の１０倍以上の
オーレオバシジンＡ耐性を有していた。したがって、Ａ
ｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）は複製ベクター
による形質転換においても清酒酵母に対する有効な選択
マーカーとして利用できることが確認された。
【００２８】
【表３】
表 ３
────────────────────────────────────
プラスミド 前培養時間 形質転換体数／μｇＤＮＡ
──────────────────────
オーレオバシジンＡ濃度
0.5μg/ml 1.0μg/ml 2.0μg/ml 5.0μg/ml
────────────────────────────────────
pYCscaur1R １時間 ０ ０ ０ ０
一晩 ２４ ２１ ０ ０
pYCscaur１R -C １時間 ３８６ １７２ １８ １
一晩 ４８２４ ４７９２ １６９２ １３６
────────────────────────────────────
【００２９】（３）ｐＹＣscaur1R −Ｃによる焼酎酵母
の形質転換 ｐＹＣ系プラスミドであるｐＹＣscaur1R −Ｃ ５μｇ
を用いて焼酎酵母協会２号を実施例２−（１）で述べた
酢酸リチウム法によって形質転換した。表４が示すよう
に清酒酵母を宿主とした場合と同様の結果を得た。これ
らの形質転換体は数回の継代後も安定に親株の１０倍以
上のオーレオバシジンＡ耐性を有していた。したがっ
て、Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）は焼酎酵
母に対しても有効な選択マーカーとして利用できること
が確認された。
の形質転換 ｐＹＣ系プラスミドであるｐＹＣscaur1R −Ｃ ５μｇ
を用いて焼酎酵母協会２号を実施例２−（１）で述べた
酢酸リチウム法によって形質転換した。表４が示すよう
に清酒酵母を宿主とした場合と同様の結果を得た。これ
らの形質転換体は数回の継代後も安定に親株の１０倍以
上のオーレオバシジンＡ耐性を有していた。したがっ
て、Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）は焼酎酵
母に対しても有効な選択マーカーとして利用できること
が確認された。
【００３０】
【表４】
表 ４
───────────────────────────────────
プラスミド 前培養時間 形質転換体数／μｇＤＮＡ
──────────────────────
オーレオバシジンＡ濃度
0.5μg/ml 1.0μg/ml 2.0μg/ml 5.0μg/ml
───────────────────────────────────
pYCscaurlR -C １時間 ５９７ ３００ ３５ ３０
一晩 2.1×104 8.36×103 1.59×103 ６２７
───────────────────────────────────
【００３１】（４）ｐＹＣscaur1R −Ｃによるパン酵母
の形質転換 ｐＹＣ系プラスミドであるｐＹＣscaur1R −Ｃ ５μｇ
を用いてパン酵母（オリエンタル社製ドライイースト）
を実施例２−（１）で述べた酢酸リチウム法によって形
質転換した。表５が示すように清酒酵母を宿主とした場
合と同様の結果を得た。これらの形質転換体は数回の継
代後も安定に親株の１０倍以上のオーレオバシジンＡ耐
性を有していた。したがって、Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８
Ｙ、Ａ２４０Ｃ）はパン酵母に対しても有効な選択マー
カーとして利用できることが確認された。
の形質転換 ｐＹＣ系プラスミドであるｐＹＣscaur1R −Ｃ ５μｇ
を用いてパン酵母（オリエンタル社製ドライイースト）
を実施例２−（１）で述べた酢酸リチウム法によって形
質転換した。表５が示すように清酒酵母を宿主とした場
合と同様の結果を得た。これらの形質転換体は数回の継
代後も安定に親株の１０倍以上のオーレオバシジンＡ耐
性を有していた。したがって、Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８
Ｙ、Ａ２４０Ｃ）はパン酵母に対しても有効な選択マー
カーとして利用できることが確認された。
【００３２】
【表５】
表 ５
───────────────────────────────────
プラスミド 前培養時間 形質転換体数／μｇＤＮＡ
──────────────────────
オーレオバシジンＡ濃度
0.5μg/ml 1.0μg/ml 2.0μg/ml 5.0μg/ml
───────────────────────────────────
pYCscaurlR -C １時間 ７４ ２９ １ ３
一晩 2.49×103 ８６８ ２３６ ６０
───────────────────────────────────
【００３３】（５）ｐＹＣscaur1R −Ｃによるビール酵
母の形質転換 ｐＹＣ系プラスミドであるｐＹＣscaur1R −Ｃ ５μｇ
を用いてビール酵母（ＡＴＣＣ ２８７）を実施例２−
（１）で述べた酢酸リチウム法によって形質転換した。
表６が示すように清酒酵母を宿主とした場合と同様の結
果を得た。これらの形質転換体は数回の継代後も安定に
親株の１０倍以上のオーレオバシジンＡ耐性を有してい
た。したがって、Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０
Ｃ）はビール酵母に対しても有効な選択マーカーとして
利用できることが確認された。
母の形質転換 ｐＹＣ系プラスミドであるｐＹＣscaur1R −Ｃ ５μｇ
を用いてビール酵母（ＡＴＣＣ ２８７）を実施例２−
（１）で述べた酢酸リチウム法によって形質転換した。
表６が示すように清酒酵母を宿主とした場合と同様の結
果を得た。これらの形質転換体は数回の継代後も安定に
親株の１０倍以上のオーレオバシジンＡ耐性を有してい
た。したがって、Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０
Ｃ）はビール酵母に対しても有効な選択マーカーとして
利用できることが確認された。
【００３４】
【表６】
表 ６
──────────────────────────────
プラスミド 前培養時間 形質転換体数／μｇＤＮＡ
─────────────────
オーレオバシジンＡ濃度
0.5μg/ml 1.0μg/ml 2.0μg/ml
──────────────────────────────
pYCscaurlR -C １時間 １５５ ３０ １５
一晩 1.95×103 1.25×103 ３５０
──────────────────────────────
【００３５】（６）ｐＹＣscaur1R −Ｃによるワイン酵
母の形質転換 ｐＹＣ系プラスミドであるｐＹＣscaur1R −Ｃ ５μｇ
を用いてワイン酵母（ＡＴＣＣ ４１０５）を実施例２
−（１）で述べた酢酸リチウム法によって形質転換し
た。表７が示すように清酒酵母を宿主とした場合と同様
の結果を得た。これらの形質転換体は数回の継代後も安
定に親株の１０倍以上のオーレオバシジンＡ耐性を有し
ていた。したがって、Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２
４０Ｃ）はワイン酵母に対しても有効な選択マーカーと
して利用できることが確認された。
母の形質転換 ｐＹＣ系プラスミドであるｐＹＣscaur1R −Ｃ ５μｇ
を用いてワイン酵母（ＡＴＣＣ ４１０５）を実施例２
−（１）で述べた酢酸リチウム法によって形質転換し
た。表７が示すように清酒酵母を宿主とした場合と同様
の結果を得た。これらの形質転換体は数回の継代後も安
定に親株の１０倍以上のオーレオバシジンＡ耐性を有し
ていた。したがって、Ａｕｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２
４０Ｃ）はワイン酵母に対しても有効な選択マーカーと
して利用できることが確認された。
【００３６】
【表７】
表 ７
──────────────────────────────
プラスミド 前培養時間 形質転換体数／μｇＤＮＡ
─────────────────
オーレオバシジンＡ濃度
0.5μg/ml 1.0μg/ml 2.0μg/ml
──────────────────────────────
pYCscaurlR -C １時間 １４１ ５４ ２１
一晩 1.57×103 ４３８ １２７
──────────────────────────────
【００３７】（７）ｐＷＣscaur1R −Ｃによる実験室用
酵母の形質転換 実験室用の一倍体酵母ＤＫＤ−５Ｄ（ａ，ｈｉｓ３，ｔ
ｒｐ１，ｌｅｕ２−３，１１２）を宿主として５μｇの
ｐＷscaur1R −Ｃを実施例２−（１）で述べられた酢酸
リチウム法によって形質転換した。比較のために、プラ
スミドに存在する栄養要求性マーカーを用いて形質転換
体を最小培地で選択した。表８に示されるように、Ａｕ
ｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）は一倍体酵母にお
いて従来の栄養要求性マーカーと同等な選択マーカーと
して利用可能であることが確認された。
酵母の形質転換 実験室用の一倍体酵母ＤＫＤ−５Ｄ（ａ，ｈｉｓ３，ｔ
ｒｐ１，ｌｅｕ２−３，１１２）を宿主として５μｇの
ｐＷscaur1R −Ｃを実施例２−（１）で述べられた酢酸
リチウム法によって形質転換した。比較のために、プラ
スミドに存在する栄養要求性マーカーを用いて形質転換
体を最小培地で選択した。表８に示されるように、Ａｕ
ｒ１R ｐ（Ｆ１５８Ｙ、Ａ２４０Ｃ）は一倍体酵母にお
いて従来の栄養要求性マーカーと同等な選択マーカーと
して利用可能であることが確認された。
【００３８】
【表８】
表 ８
───────────────────────────────────
プラスミド 前培養時間 形質転換体数／μｇＤＮＡ
──────────────────────
最小培地 オーレオバシジンＡ濃度
0.5μg/ml 1.0μg/ml 5.0μg/ml
───────────────────────────────────
pWscaur1R -C １時間 １９２ ２４８ １８１ ５８
一晩 ２５００ ２７８０ ２５２４ ２０４４
───────────────────────────────────
【００３９】実施例３ Ｃ．アルビカンスを宿主に用い
た形質転換 ｐＵscaur1R −ＣをｐＵＣ１１９の領域内で１ヵ所切断
するＳａｌＩで切断し、線状化したプラスミド５μｇを
Ｃ．アルビカンスＴＩＭＭ０１３６に酢酸リチウム法に
よって形質転換した。形質転換後、１時間又は一晩、Ｙ
ＰＤ培地で培養し、オーレオバシジンＡを含むＹＰＤ寒
天培地上に塗布した。表９が示すように、一晩、前培養
した時に、オーレオバシジンＡに耐性を有する形質転換
体を得た。これらの形質転換体はすべて、１０μｇ／ｍ
ｌ以上のＭＩＣを示した。
た形質転換 ｐＵscaur1R −ＣをｐＵＣ１１９の領域内で１ヵ所切断
するＳａｌＩで切断し、線状化したプラスミド５μｇを
Ｃ．アルビカンスＴＩＭＭ０１３６に酢酸リチウム法に
よって形質転換した。形質転換後、１時間又は一晩、Ｙ
ＰＤ培地で培養し、オーレオバシジンＡを含むＹＰＤ寒
天培地上に塗布した。表９が示すように、一晩、前培養
した時に、オーレオバシジンＡに耐性を有する形質転換
体を得た。これらの形質転換体はすべて、１０μｇ／ｍ
ｌ以上のＭＩＣを示した。
【００４０】
【表９】
表 ９
───────────────────────────────────
プラスミド 前培養時間 形質転換体数／μｇＤＮＡ
────────────────
オーレオバシジンＡ濃度
0.２５μg/ml 1.０μg/ml
───────────────────────────────────
SalI線状化pUscaur1R -C １時間 ０ ０
一晩 １８０ ０
───────────────────────────────────
【００４１】
【発明の効果】本発明により、オーレオバシジンに対す
る強い耐性を与えるオーレオバシジン耐性付与蛋白質、
及び該蛋白質をコードする遺伝子が提供された。これら
はオーレオバシジンに対して感受性を示す生物に耐性を
付与し、耐性となった生物を選択するための選択マーカ
ーとして有用であり、実用酵母の遺伝子工学的育種、
Ｃ．アルビカンスの遺伝情報解析等において特に有用で
ある。本発明により、真菌、特に工業用真菌の遺伝子組
換えにおいて有用なオーレオバシジン耐性を選択マーカ
ーとした染色体組込型用ベクターを導入された形質転換
体、その創製方法、及び該方法で得られる形質転換体が
提供された。これらは、有用蛋白質製造用形質転換体の
創製、育種等に有効に利用できる。特に、Ｓ．セレビシ
エは、工業用酵母として最も広く使用されているのみな
らず、遺伝子組換えにおいても安全性の高い酵母であ
る。したがって、Ｓ．セレビシエ由来のオーレオバシジ
ン耐性を遺伝子はＳ．セレビシエの育種、有用蛋白質の
製造のための形質転換体作製のために非常に有用であ
る。
る強い耐性を与えるオーレオバシジン耐性付与蛋白質、
及び該蛋白質をコードする遺伝子が提供された。これら
はオーレオバシジンに対して感受性を示す生物に耐性を
付与し、耐性となった生物を選択するための選択マーカ
ーとして有用であり、実用酵母の遺伝子工学的育種、
Ｃ．アルビカンスの遺伝情報解析等において特に有用で
ある。本発明により、真菌、特に工業用真菌の遺伝子組
換えにおいて有用なオーレオバシジン耐性を選択マーカ
ーとした染色体組込型用ベクターを導入された形質転換
体、その創製方法、及び該方法で得られる形質転換体が
提供された。これらは、有用蛋白質製造用形質転換体の
創製、育種等に有効に利用できる。特に、Ｓ．セレビシ
エは、工業用酵母として最も広く使用されているのみな
らず、遺伝子組換えにおいても安全性の高い酵母であ
る。したがって、Ｓ．セレビシエ由来のオーレオバシジ
ン耐性を遺伝子はＳ．セレビシエの育種、有用蛋白質の
製造のための形質転換体作製のために非常に有用であ
る。
【００４２】
【００４３】配列番号：1
配列の長さ：401
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Ala Asn Pro Phe Ser Arg Trp Phe Leu Ser Glu Arg Pro Pro
1 5 10 15
Asn Cys His Val Ala Asp Leu Glu Thr Ser Leu Asp Pro His Gln
20 25 30
Thr Leu Leu Lys Val Gln Lys Tyr Lys Pro Ala Leu Ser Asp Trp
35 40 45
Val His Tyr Ile Phe Leu Gly Ser Ile Met Leu Phe Val Phe Ile
50 55 60
Thr Asn Pro Ala Pro Trp Ile Phe Lys Ile Leu Phe Tyr Cys Phe
65 70 75
Leu Gly Thr Leu Phe Ile Ile Pro Ala Thr Ser Gln Phe Phe Phe
80 85 90
Asn Ala Leu Pro Ile Leu Thr Trp Val Ala Leu Tyr Phe Thr Ser
95 100 105
Ser Tyr Phe Pro Asp Asp Arg Arg Pro Pro Ile Thr Val Lys Val
110 115 120
Leu Pro Ala Val Glu Thr Ile Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asp
125 130 135
Ile Leu Ala Thr Ser Thr Asn Ser Phe Leu Asp Ile Leu Ala Trp
140 145 150
Leu Pro Tyr Gly Leu Phe His Phe Gly Ala Pro Phe Val Val Ala
155 160 165
Ala Ile Leu Phe Val Phe Gly Pro Pro Thr Val Leu Gln Gly Tyr
170 175 180
Ala Phe Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Ile Met Gln
185 190 195
Asn Val Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Ile Leu Tyr Gly
200 205 210
Leu Gln Ser Ala Asn Tyr Asp Met His Gly Ser Pro Gly Gly Leu
215 220 225
Ala Arg Ile Asp Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Tyr Thr Thr Ala
230 235 240
Phe Ser Asn Ser Ser Val Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His
245 250 255
Ser Gly Cys Ala Thr Met Glu Ala Leu Phe Phe Cys Tyr Cys Phe
260 265 270
Pro Lys Leu Lys Pro Leu Phe Ile Ala Tyr Val Cys Trp Leu Trp
275 280 285
Trp Ser Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Met
290 295 300
Ala Gly Ser Val Leu Ser Tyr Val Ile Phe Gln Tyr Thr Lys Tyr
305 310 315
Thr His Leu Pro Ile Val Asp Thr Ser Leu Phe Cys Arg Trp Ser
320 325 330
Tyr Thr Ser Ile Glu Lys Tyr Asp Ile Ser Lys Ser Asp Pro Leu
335 340 345
Ala Ala Asp Ser Asn Asp Ile Glu Ser Val Pro Leu Ser Asn Leu
350 355 360
Glu Leu Asp Phe Asp Leu Asn Met Thr Asp Glu Pro Ser Val Ser
365 370 375
Pro Ser Leu Phe Asp Gly Ser Thr Ser Val Ser Arg Ser Ser Ala
380 385 390
Thr Ser Ile Thr Ser Leu Gly Val Lys Arg Ala
395 400
【００４４】配列番号：2
配列の長さ：401
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Ala Asn Pro Phe Ser Arg Trp Phe Leu Ser Glu Arg Pro Pro
1 5 10 15
Asn Cys His Val Ala Asp Leu Glu Thr Ser Leu Asp Pro His Gln
20 25 30
Thr Leu Leu Lys Val Gln Lys Tyr Lys Pro Ala Leu Ser Asp Trp
35 40 45
Val His Tyr Ile Phe Leu Gly Ser Ile Met Leu Phe Val Phe Ile
50 55 60
Thr Asn Pro Ala Pro Trp Ile Phe Lys Ile Leu Phe Tyr Cys Phe
65 70 75
Leu Gly Thr Leu Phe Ile Ile Pro Ala Thr Ser Gln Phe Phe Phe
80 85 90
Asn Ala Leu Pro Ile Leu Thr Trp Val Ala Leu Tyr Phe Thr Ser
95 100 105
Ser Tyr Phe Pro Asp Asp Arg Arg Pro Pro Ile Thr Val Lys Val
110 115 120
Leu Pro Ala Val Glu Thr Ile Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asp
125 130 135
Ile Leu Ala Thr Ser Thr Asn Ser Phe Leu Asp Ile Leu Ala Trp
140 145 150
Leu Pro Tyr Gly Leu Phe His Phe Gly Ala Pro Phe Val Val Ala
155 160 165
Ala Ile Leu Phe Val Phe Gly Pro Pro Thr Val Leu Gln Gly Tyr
170 175 180
Ala Phe Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Ile Met Gln
185 190 195
Asn Val Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Ile Leu Tyr Gly
200 205 210
Leu Gln Ser Ala Asn Tyr Asp Met His Gly Ser Pro Gly Gly Leu
215 220 225
Ala Arg Ile Asp Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Tyr Thr Thr Cys
230 235 240
Phe Ser Asn Ser Ser Val Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His
245 250 255
Ser Gly Cys Ala Thr Met Glu Ala Leu Phe Phe Cys Tyr Cys Phe
260 265 270
Pro Lys Leu Lys Pro Leu Phe Ile Ala Tyr Val Cys Trp Leu Trp
275 280 285
Trp Ser Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Met
290 295 300
Ala Gly Ser Val Leu Ser Tyr Val Ile Phe Gln Tyr Thr Lys Tyr
305 310 315
Thr His Leu Pro Ile Val Asp Thr Ser Leu Phe Cys Arg Trp Ser
320 325 330
Tyr Thr Ser Ile Glu Lys Tyr Asp Ile Ser Lys Ser Asp Pro Leu
335 340 345
Ala Ala Asp Ser Asn Asp Ile Glu Ser Val Pro Leu Ser Asn Leu
350 355 360
Glu Leu Asp Phe Asp Leu Asn Met Thr Asp Glu Pro Ser Val Ser
365 370 375
Pro Ser Leu Phe Asp Gly Ser Thr Ser Val Ser Arg Ser Ser Ala
380 385 390
Thr Ser Ile Thr Ser Leu Gly Val Lys Arg Ala
395 400
【００４５】配列番号：3
配列の長さ：401
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Ala Asn Pro Phe Ser Arg Trp Phe Leu Ser Glu Arg Pro Pro
1 5 10 15
Asn Cys His Val Ala Asp Leu Glu Thr Ser Leu Asp Pro His Gln
20 25 30
Thr Leu Leu Lys Val Gln Lys Tyr Lys Pro Ala Leu Ser Asp Trp
35 40 45
Val His Tyr Ile Phe Leu Gly Ser Ile Met Leu Phe Val Phe Ile
50 55 60
Thr Asn Pro Ala Pro Trp Ile Phe Lys Ile Leu Phe Tyr Cys Phe
65 70 75
Leu Gly Thr Leu Phe Ile Ile Pro Ala Thr Ser Gln Phe Phe Phe
80 85 90
Asn Ala Leu Pro Ile Leu Thr Trp Val Ala Leu Tyr Phe Thr Ser
95 100 105
Ser Tyr Phe Pro Asp Asp Arg Arg Pro Pro Ile Thr Val Lys Val
110 115 120
Leu Pro Ala Val Glu Thr Ile Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asp
125 130 135
Ile Leu Ala Thr Ser Thr Asn Ser Phe Leu Asp Ile Leu Ala Trp
140 145 150
Leu Pro Tyr Gly Leu Phe His Tyr Gly Ala Pro Phe Val Val Ala
155 160 165
Ala Ile Leu Phe Val Phe Gly Pro Pro Thr Val Leu Gln Gly Tyr
170 175 180
Ala Phe Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Ile Met Gln
185 190 195
Asn Val Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Ile Leu Tyr Gly
200 205 210
Leu Gln Ser Ala Asn Tyr Asp Met His Gly Ser Pro Gly Gly Leu
215 220 225
Ala Arg Ile Asp Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Tyr Thr Thr Cys
230 235 240
Phe Ser Asn Ser Ser Val Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His
245 250 255
Ser Gly Cys Ala Thr Met Glu Ala Leu Phe Phe Cys Tyr Cys Phe
260 265 270
Pro Lys Leu Lys Pro Leu Phe Ile Ala Tyr Val Cys Trp Leu Trp
275 280 285
Trp Ser Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Met
290 295 300
Ala Gly Ser Val Leu Ser Tyr Val Ile Phe Gln Tyr Thr Lys Tyr
305 310 315
Thr His Leu Pro Ile Val Asp Thr Ser Leu Phe Cys Arg Trp Ser
320 325 330
Tyr Thr Ser Ile Glu Lys Tyr Asp Ile Ser Lys Ser Asp Pro Leu
335 340 345
Ala Ala Asp Ser Asn Asp Ile Glu Ser Val Pro Leu Ser Asn Leu
350 355 360
Glu Leu Asp Phe Asp Leu Asn Met Thr Asp Glu Pro Ser Val Ser
365 370 375
Pro Ser Leu Phe Asp Gly Ser Thr Ser Val Ser Arg Ser Ser Ala
380 385 390
Thr Ser Ile Thr Ser Leu Gly Val Lys Arg Ala
395 400
【００４６】配列番号：4
配列の長さ：1206
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
ATGGCAAACC CTTTTTCGAG ATGGTTTCTA TCAGAGAGAC CTCCAAACTG CCATGTAGCC 60
GATTTAGAAA CAAGTTTAGA TCCCCATCAA ACGTTGTTGA AGGTGCAAAA ATACAAACCC 120
GCTTTAAGCG ACTGGGTGCA TTACATCTTC TTGGGATCCA TCATGCTGTT TGTGTTCATT 180
ACTAATCCCG CACCTTGGAT CTTCAAGATC CTTTTTTATT GTTTCTTGGG CACTTTATTC 240
ATCATTCCAG CTACGTCACA GTTTTTCTTC AATGCCTTGC CCATCCTAAC ATGGGTGGCG 300
CTGTATTTCA CTTCATCGTA CTTTCCAGAT GACCGCAGGC CTCCTATTAC TGTCAAAGTG 360
TTACCAGCGG TGGAAACAAT TTTATACGGC GACAATTTAA GTGATATTCT TGCAACATCG 420
ACGAATTCCT TTTTGGACAT TTTAGCATGG TTACCGTACG GACTATTTCA TTTTGGGGCC 480
CCATTTGTCG TTGCTGCCAT CTTATTCGTA TTTGGTCCAC CAACTGTTTT GCAAGGTTAT 540
GCTTTTGCAT TTGGTTATAT GAACCTGTTT GGTGTTATCA TGCAAAATGT CTTTCCAGCC 600
GCTCCCCCAT GGTATAAAAT TCTCTATGGA TTGCAATCAG CCAACTATGA TATGCATGGC 660
TCGCCTGGTG GATTAGCTAG AATTGATAAG CTACTCGGTA TTAATATGTA TACTACATGT 720
TTTTCAAATT CCTCCGTCAT TTTCGGTGCT TTTCCTTCAC TGCATTCCGG GTGTGCTACT 780
ATGGAAGCCC TGTTTTTCTG TTATTGTTTT CCAAAATTGA AGCCCTTGTT TATTGCTTAT 840
GTTTGCTGGT TATGGTGGTC AACTATGTAT CTGACACACC ATTATTTTGT AGACCTTATG 900
GCAGGTTCTG TGCTGTCATA CGTTATTTTC CAGTACACAA AGTACACACA TTTACCAATT 960
GTAGATACAT CTCTTTTTTG CAGATGGTCA TACACTTCAA TTGAGAAATA CGATATATCA 1020
AAGAGTGATC CATTGGCTGC AGATTCAAAC GATATCGAAA GTGTCCCTTT GTCCAACTTG 1080
GAACTTGACT TTGATCTTAA TATGACTGAT GAACCCAGTG TAAGCCCTTC GTTATTTGAT 1140
GGATCTACTT CTGTTTCTCG TTCGTCCGCC ACGTCTATAA CGTCACTAGG TGTAAAGAGG 1200
GCTTAA 1206
【００４７】配列番号：5
配列の長さ：1206
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
ATGGCAAACC CTTTTTCGAG ATGGTTTCTA TCAGAGAGAC CTCCAAACTG CCATGTAGCC 60
GATTTAGAAA CAAGTTTAGA TCCCCATCAA ACGTTGTTGA AGGTGCAAAA ATACAAACCC 120
GCTTTAAGCG ACTGGGTGCA TTACATCTTC TTGGGATCCA TCATGCTGTT TGTGTTCATT 180
ACTAATCCCG CACCTTGGAT CTTCAAGATC CTTTTTTATT GTTTCTTGGG CACTTTATTC 240
ATCATTCCAG CTACGTCACA GTTTTTCTTC AATGCCTTGC CCATCCTAAC ATGGGTGGCG 300
CTGTATTTCA CTTCATCGTA CTTTCCAGAT GACCGCAGGC CTCCTATTAC TGTCAAAGTG 360
TTACCAGCGG TGGAAACAAT TTTATACGGC GACAATTTAA GTGATATTCT TGCAACATCG 420
ACGAATTCCT TTTTGGACAT TTTAGCATGG TTACCGTACG GACTATTTCA TTATGGGGCC 480
CCATTTGTCG TTGCTGCCAT CTTATTCGTA TTTGGTCCAC CAACTGTTTT GCAAGGTTAT 540
GCTTTTGCAT TTGGTTATAT GAACCTGTTT GGTGTTATCA TGCAAAATGT CTTTCCAGCC 600
GCTCCCCCAT GGTATAAAAT TCTCTATGGA TTGCAATCAG CCAACTATGA TATGCATGGC 660
TCGCCTGGTG GATTAGCTAG AATTGATAAG CTACTCGGTA TTAATATGTA TACTACATGT 720
TTTTCAAATT CCTCCGTCAT TTTCGGTGCT TTTCCTTCAC TGCATTCCGG GTGTGCTACT 780
ATGGAAGCCC TGTTTTTCTG TTATTGTTTT CCAAAATTGA AGCCCTTGTT TATTGCTTAT 840
GTTTGCTGGT TATGGTGGTC AACTATGTAT CTGACACACC ATTATTTTGT AGACCTTATG 900
GCAGGTTCTG TGCTGTCATA CGTTATTTTC CAGTACACAA AGTACACACA TTTACCAATT 960
GTAGATACAT CTCTTTTTTG CAGATGGTCA TACACTTCAA TTGAGAAATA CGATATATCA 1020
AAGAGTGATC CATTGGCTGC AGATTCAAAC GATATCGAAA GTGTCCCTTT GTCCAACTTG 1080
GAACTTGACT TTGATCTTAA TATGACTGAT GAACCCAGTG TAAGCCCTTC GTTATTTGAT 1140
GGATCTACTT CTGTTTCTCG TTCGTCCGCC ACGTCTATAA CGTCACTAGG TGTAAAGAGG 1200
GCTTAA 1206
【００４８】配列番号：6
配列の長さ：2340
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
TTTCTTTCTG TCAAAGAATA ATAAAGTGCC CATCAGTGTT CATATTTGTT ACAAAGTGGT 60
TTTCTGATTT GGTACTACTG CAGAGGCGTA TTTTTTGCTT CAGTTACCAT AGCGTAAGAA 120
CACTAGCGAC TTTTGTTCGT GAACCAACAG AGTAGGATTT CTACTGCTAC ATCTCTTAGG 180
TAGTTGGTTA GTCCGATCGC TCACTTTTGG TTGTTGTTAA GTACTTCATA AGTTTATCCT 240
TTTCCTTTTT CACACTGAGC TACTTTGGGT ATAGCTTTTG GCCCAAGGAT CTTTGAATTT 300
TCTCCAAAAG TACTTTATTT TATATCCTAC AGGTTGCGGT TTTCATATTT TAAAAAGCTT 360
TTTAATCATT CCTTTGCGTA TGGCAAACCC TTTTTCGAGA TGGTTTCTAT CAGAGAGACC 420
TCCAAACTGC CATGTAGCCG ATTTAGAAAC AAGTTTAGAT CCCCATCAAA CGTTGTTGAA 480
GGTGCAAAAA TACAAACCCG CTTTAAGCGA CTGGGTGCAT TACATCTTCT TGGGATCCAT 540
CATGCTGTTT GTGTTCATTA CTAATCCCGC ACCTTGGATC TTCAAGATCC TTTTTTATTG 600
TTTCTTGGGC ACTTTATTCA TCATTCCAGC TACGTCACAG TTTTTCTTCA ATGCCTTGCC 660
CATCCTAACA TGGGTGGCGC TGTATTTCAC TTCATCGTAC TTTCCAGATG ACCGCAGGCC 720
TCCTATTACT GTCAAAGTGT TACCAGCGGT GGAAACAATT TTATACGGCG ACAATTTAAG 780
TGATATTCTT GCAACATCGA CGAATTCCTT TTTGGACATT TTAGCATGGT TACCGTACGG 840
ACTATTTCAT TATGGGGCCC CATTTGTCGT TGCTGCCATC TTATTCGTAT TTGGTCCACC 900
AACTGTTTTG CAAGGTTATG CTTTTGCATT TGGTTATATG AACCTGTTTG GTGTTATCAT 960
GCAAAATGTC TTTCCAGCCG CTCCCCCATG GTATAAAATT CTCTATGGAT TGCAATCAGC 1020
CAACTATGAT ATGCATGGCT CGCCTGGTGG ATTAGCTAGA ATTGATAAGC TACTCGGTAT 1080
TAATATGTAT ACTACAGCTT TTTCAAATTC CTCCGTCATT TTCGGTGCTT TTCCTTCACT 1140
GCATTCCGGG TGTGCTACTA TGGAAGCCCT GTTTTTCTGT TATTGTTTTC CAAAATTGAA 1200
GCCCTTGTTT ATTGCTTATG TTTGCTGGTT ATGGTGGTCA ACTATGTATC TGACACACCA 1260
TTATTTTGTA GACCTTATGG CAGGTTCTGT GCTGTCATAC GTTATTTTCC AGTACACAAA 1320
GTACACACAT TTACCAATTG TAGATACATC TCTTTTTTGC AGATGGTCAT ACACTTCAAT 1380
TGAGAAATAC GATATATCAA AGAGTGATCC ATTGGCTGCA GATTCAAACG ATATCGAAAG 1440
TGTCCCTTTG TCCAACTTGG AACTTGACTT TGATCTTAAT ATGACTGATG AACCCAGTGT 1500
AAGCCCTTCG TTATTTGATG GATCTACTTC TGTTTCTCGT TCGTCCGCCA CGTCTATAAC 1560
GTCACTAGGT GTAAAGAGGG CTTAATGAGT ATTTTATCTG CAATTACGGA TACGGTTGGT 1620
CTTATGTAGA TACATATAAA TATATATCTT TTTCTTTCTT TTTCTTAGTC AGGATTGTCG 1680
TTTAGCATAA TATACATGTA GTTTATTTAA TCACATACCA CTGATTATCT TTAGAATTTT 1740
ATAAATTTTT GAAATAAATG GGTGGCTTTT AATGGTGTCT ATGTTAAGTG AGGCTTTTAG 1800
AATGCTCTTC CTGCTTTGTT TATTATATGT GTATGAAAGA TATGTATGTA TTTACATGTG 1860
TTTGTAGCGT CCCCAGTCAA AACCTGTGCG CTATACCTAA ATGGATTGAT AATCTTCATT 1920
CACTAATTCT AAAATAGACT TCTTCCCCAA AGAACGGTGT AACGATGAGG CTCTATCCAG 1980
CTGCTTATCT AAATCAACTT TAACGATGGA TGATCTTATG ACACGGGGAT CTTTCTTTAA 2040
AGTTCTTAGA ATTTCAGACT GTACCGCAGC TGATGAATCA AACAGCATTA AAAAGTGATA 2100
TGCTCGAAAA TGTTTTTCCT GGTCTTTCTT CATTATTTTA GGAAGATACC TTATGCCCAT 2160
GGGTACAATG TCCCTCACCA CACCTCTGTT TTGAATAATC AGTTTCCCGA TTGTGGAAGA 2220
CAATTCTTTT GCTTCCAACT TTGGCGCATT GGAGTTGGTT ATGCGAACAA GTCCGATCAG 2280
CTCATAAAGC ATCTTAGTGA AAAGGGTGGT TTTGCGTTAT TCTTTCCTCT GTTGAAGCTT 2340
【００４９】配列番号：7
配列の長さ：401
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Ala Asn Pro Phe Ser Arg Trp Phe Leu Ser Glu Arg Pro Pro
1 5 10 15
Asn Cys His Val Ala Asp Leu Glu Thr Ser Leu Asp Pro His Gln
20 25 30
Thr Leu Leu Lys Val Gln Lys Tyr Lys Pro Ala Leu Ser Asp Trp
35 40 45
Val His Tyr Ile Phe Leu Gly Ser Ile Met Leu Phe Val Phe Ile
50 55 60
Thr Asn Pro Ala Pro Trp Ile Phe Lys Ile Leu Phe Tyr Cys Phe
65 70 75
Leu Gly Thr Leu Phe Ile Ile Pro Ala Thr Ser Gln Phe Phe Phe
80 85 90
Asn Ala Leu Pro Ile Leu Thr Trp Val Ala Leu Tyr Phe Thr Ser
95 100 105
Ser Tyr Phe Pro Asp Asp Arg Arg Pro Pro Ile Thr Val Lys Val
110 115 120
Leu Pro Ala Val Glu Thr Ile Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asp
125 130 135
Ile Leu Ala Thr Ser Thr Asn Ser Phe Leu Asp Ile Leu Ala Trp
140 145 150
Leu Pro Tyr Gly Leu Phe His Tyr Gly Ala Pro Phe Val Val Ala
155 160 165
Ala Ile Leu Phe Val Phe Gly Pro Pro Thr Val Leu Gln Gly Tyr
170 175 180
Ala Phe Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Ile Met Gln
185 190 195
Asn Val Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Ile Leu Tyr Gly
200 205 210
Leu Gln Ser Ala Asn Tyr Asp Met His Gly Ser Pro Gly Gly Leu
215 220 225
Ala Arg Ile Asp Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Tyr Thr Thr Ala
230 235 240
Phe Ser Asn Ser Ser Val Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His
245 250 255
Ser Gly Cys Ala Thr Met Glu Ala Leu Phe Phe Cys Tyr Cys Phe
260 265 270
Pro Lys Leu Lys Pro Leu Phe Ile Ala Tyr Val Cys Trp Leu Trp
275 280 285
Trp Ser Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Met
290 295 300
Ala Gly Ser Val Leu Ser Tyr Val Ile Phe Gln Tyr Thr Lys Tyr
305 310 315
Thr His Leu Pro Ile Val Asp Thr Ser Leu Phe Cys Arg Trp Ser
320 325 330
Tyr Thr Ser Ile Glu Lys Tyr Asp Ile Ser Lys Ser Asp Pro Leu
335 340 345
Ala Ala Asp Ser Asn Asp Ile Glu Ser Val Pro Leu Ser Asn Leu
350 355 360
Glu Leu Asp Phe Asp Leu Asn Met Thr Asp Glu Pro Ser Val Ser
365 370 375
Pro Ser Leu Phe Asp Gly Ser Thr Ser Val Ser Arg Ser Ser Ala
380 385 390
Thr Ser Ile Thr Ser Leu Gly Val Lys Arg Ala
395 400
【００５０】配列番号：8
配列の長さ：2340
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
TTTCTTTCTG TCAAAGAATA ATAAAGTGCC CATCAGTGTT CATATTTGTT ACAAAGTGGT 60
TTTCTGATTT GGTACTACTG CAGAGGCGTA TTTTTTGCTT CAGTTACCAT AGCGTAAGAA 120
CACTAGCGAC TTTTGTTCGT GAACCAACAG AGTAGGATTT CTACTGCTAC ATCTCTTAGG 180
TAGTTGGTTA GTCCGATCGC TCACTTTTGG TTGTTGTTAA GTACTTCATA AGTTTATCCT 240
TTTCCTTTTT CACACTGAGC TACTTTGGGT ATAGCTTTTG GCCCAAGGAT CTTTGAATTT 300
TCTCCAAAAG TACTTTATTT TATATCCTAC AGGTTGCGGT TTTCATATTT TAAAAAGCTT 360
TTTAATCATT CCTTTGCGTA TGGCAAACCC TTTTTCGAGA TGGTTTCTAT CAGAGAGACC 420
TCCAAACTGC CATGTAGCCG ATTTAGAAAC AAGTTTAGAT CCCCATCAAA CGTTGTTGAA 480
GGTGCAAAAA TACAAACCCG CTTTAAGCGA CTGGGTGCAT TACATCTTCT TGGGATCCAT 540
CATGCTGTTT GTGTTCATTA CTAATCCCGC ACCTTGGATC TTCAAGATCC TTTTTTATTG 600
TTTCTTGGGC ACTTTATTCA TCATTCCAGC TACGTCACAG TTTTTCTTCA ATGCCTTGCC 660
CATCCTAACA TGGGTGGCGC TGTATTTCAC TTCATCGTAC TTTCCAGATG ACCGCAGGCC 720
TCCTATTACT GTCAAAGTGT TACCAGCGGT GGAAACAATT TTATACGGCG ACAATTTAAG 780
TGATATTCTT GCAACATCGA CGAATTCCTT TTTGGACATT TTAGCATGGT TACCGTACGG 840
ACTATTTCAT TTTGGGGCCC CATTTGTCGT TGCTGCCATC TTATTCGTAT TTGGTCCACC 900
AACTGTTTTG CAAGGTTATG CTTTTGCATT TGGTTATATG AACCTGTTTG GTGTTATCAT 960
GCAAAATGTC TTTCCAGCCG CTCCCCCATG GTATAAAATT CTCTATGGAT TGCAATCAGC 1020
CAACTATGAT ATGCATGGCT CGCCTGGTGG ATTAGCTAGA ATTGATAAGC TACTCGGTAT 1080
TAATATGTAT ACTACAGCTT TTTCAAATTC CTCCGTCATT TTCGGTGCTT TTCCTTCACT 1140
GCATTCCGGG TGTGCTACTA TGGAAGCCCT GTTTTTCTGT TATTGTTTTC CAAAATTGAA 1200
GCCCTTGTTT ATTGCTTATG TTTGCTGGTT ATGGTGGTCA ACTATGTATC TGACACACCA 1260
TTATTTTGTA GACCTTATGG CAGGTTCTGT GCTGTCATAC GTTATTTTCC AGTACACAAA 1320
GTACACACAT TTACCAATTG TAGATACATC TCTTTTTTGC AGATGGTCAT ACACTTCAAT 1380
TGAGAAATAC GATATATCAA AGAGTGATCC ATTGGCTGCA GATTCAAACG ATATCGAAAG 1440
TGTCCCTTTG TCCAACTTGG AACTTGACTT TGATCTTAAT ATGACTGATG AACCCAGTGT 1500
AAGCCCTTCG TTATTTGATG GATCTACTTC TGTTTCTCGT TCGTCCGCCA CGTCTATAAC 1560
GTCACTAGGT GTAAAGAGGG CTTAATGAGT ATTTTATCTG CAATTACGGA TACGGTTGGT 1620
CTTATGTAGA TACATATAAA TATATATCTT TTTCTTTCTT TTTCTTAGTC AGGATTGTCG 1680
TTTAGCATAA TATACATGTA GTTTATTTAA TCACATACCA CTGATTATCT TTAGAATTTT 1740
ATAAATTTTT GAAATAAATG GGTGGCTTTT AATGGTGTCT ATGTTAAGTG AGGCTTTTAG 1800
AATGCTCTTC CTGCTTTGTT TATTATATGT GTATGAAAGA TATGTATGTA TTTACATGTG 1860
TTTGTAGCGT CCCCAGTCAA AACCTGTGCG CTATACCTAA ATGGATTGAT AATCTTCATT 1920
CACTAATTCT AAAATAGACT TCTTCCCCAA AGAACGGTGT AACGATGAGG CTCTATCCAG 1980
CTGCTTATCT AAATCAACTT TAACGATGGA TGATCTTATG ACACGGGGAT CTTTCTTTAA 2040
AGTTCTTAGA ATTTCAGACT GTACCGCAGC TGATGAATCA AACAGCATTA AAAAGTGATA 2100
TGCTCGAAAA TGTTTTTCCT GGTCTTTCTT CATTATTTTA GGAAGATACC TTATGCCCAT 2160
GGGTACAATG TCCCTCACCA CACCTCTGTT TTGAATAATC AGTTTCCCGA TTGTGGAAGA 2220
CAATTCTTTT GCTTCCAACT TTGGCGCATT GGAGTTGGTT ATGCGAACAA GTCCGATCAG 2280
CTCATAAAGC ATCTTAGTGA AAAGGGTGGT TTTGCGTTAT TCTTTCCTCT GTTGAAGCTT 2340
【００５１】配列番号：9
配列の長さ：1206
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
ATGGCAAACC CTTTTTCGAG ATGGTTTCTA TCAGAGAGAC CTCCAAACTG CCATGTAGCC 60
GATTTAGAAA CAAGTTTAGA TCCCCATCAA ACGTTGTTGA AGGTGCAAAA ATACAAACCC 120
GCTTTAAGCG ACTGGGTGCA TTACATCTTC TTGGGATCCA TCATGCTGTT TGTGTTCATT 180
ACTAATCCCG CACCTTGGAT CTTCAAGATC CTTTTTTATT GTTTCTTGGG CACTTTATTC 240
ATCATTCCAG CTACGTCACA GTTTTTCTTC AATGCCTTGC CCATCCTAAC ATGGGTGGCG 300
CTGTATTTCA CTTCATCGTA CTTTCCAGAT GACCGCAGGC CTCCTATTAC TGTCAAAGTG 360
TTACCAGCGG TGGAAACAAT TTTATACGGC GACAATTTAA GTGATATTCT TGCAACATCG 420
ACGAATTCCT TTTTGGACAT TTTAGCATGG TTACCGTACG GACTATTTCA TTTTGGGGCC 480
CCATTTGTCG TTGCTGCCAT CTTATTCGTA TTTGGTCCAC CAACTGTTTT GCAAGGTTAT 540
GCTTTTGCAT TTGGTTATAT GAACCTGTTT GGTGTTATCA TGCAAAATGT CTTTCCAGCC 600
GCTCCCCCAT GGTATAAAAT TCTCTATGGA TTGCAATCAG CCAACTATGA TATGCATGGC 660
TCGCCTGGTG GATTAGCTAG AATTGATAAG CTACTCGGTA TTAATATGTA TACTACAGCT 720
TTTTCAAATT CCTCCGTCAT TTTCGGTGCT TTTCCTTCAC TGCATTCCGG GTGTGCTACT 780
ATGGAAGCCC TGTTTTTCTG TTATTGTTTT CCAAAATTGA AGCCCTTGTT TATTGCTTAT 840
GTTTGCTGGT TATGGTGGTC AACTATGTAT CTGACACACC ATTATTTTGT AGACCTTATG 900
GCAGGTTCTG TGCTGTCATA CGTTATTTTC CAGTACACAA AGTACACACA TTTACCAATT 960
GTAGATACAT CTCTTTTTTG CAGATGGTCA TACACTTCAA TTGAGAAATA CGATATATCA 1020
AAGAGTGATC CATTGGCTGC AGATTCAAAC GATATCGAAA GTGTCCCTTT GTCCAACTTG 1080
GAACTTGACT TTGATCTTAA TATGACTGAT GAACCCAGTG TAAGCCCTTC GTTATTTGAT 1140
GGATCTACTT CTGTTTCTCG TTCGTCCGCC ACGTCTATAA CGTCACTAGG TGTAAAGAGG 1200
GCTTAA 1206
【００５２】配列番号：10
配列の長さ：22
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GACTATTTCA TTATGGGGCC CC 22
【００５３】配列番号：11
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
AATATGTATA CTACATGTTT TTCAAATTCC 30
【００５４】配列番号：12
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GTTAACTCGA GAAAGTGCCC ATCAGTGTTC 30
【００５５】配列番号：13
配列の長さ：29
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GTTAACGGTA CCAGAGGAAA GAATAACGC 29
【図１】本発明の１例のＤＮＡの染色体への組込みを示
す図である。
す図である。
【図２】scaur1R を含有するＤＮＡ及びscaur1S を含有
するＤＮＡの制限酵素地図を示す図である。
するＤＮＡの制限酵素地図を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｐ 21/02
(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｒ 1:725）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:725）
(56)参考文献 特許3054026（ＪＰ，Ｂ２)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 14/31
C07K 14/39
C12N 1/19
C12P 21/02
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
Claims (7)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で表されるオーレオ
バシジン感受性付与蛋白質の少なくとも２４０番目のア
ミノ酸ＡｌａがＣｙｓに置換されたオーレオバシジン耐
性付与蛋白質、又は該蛋白質の２４０番目に相当する部
位以外のアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の置
換、挿入及び欠失の少なくとも一つを施すことにより得
られるアミノ酸配列を有し、該蛋白質と同等の生物学的
活性を示すオーレオバシジン耐性付与蛋白質。 - 【請求項２】 配列表の配列番号２又は３で表される請
求項１記載のオーレオバシジン耐性付与蛋白質。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のオーレオバシジン
耐性付与蛋白質をコードする遺伝子。 - 【請求項４】 下記工程を包含することを特徴とするオ
ーレオバシジン耐性形質転換体の創製方法。 （１）請求項３記載のオーレオバシジン耐性付与蛋白質
をコードする遺伝子を含有する複製ベクターを得る工
程、 （２）上記工程で得られた複製ベクター中のオーレオバ
シジン耐性付与蛋白質をコードする遺伝子の１ヵ所で開
裂し、宿主真菌用染色体組込型ベクターを得る工程、 （３）上記工程で得られた宿主真菌用染色体組込型ベク
ターを宿主真菌の染色体に組込む工程、 （４）オーレオバシジン耐性に形質転換された宿主をオ
ーレオバシジン存在下で選択する工程。 - 【請求項５】 請求項４記載の複製ベクターが異種の遺
伝子を含有する複製ベクターであることを特徴とする請
求項４記載の形質転換体の創製方法。 - 【請求項６】 請求項４又は５記載の方法で得られる形
質転換体。 - 【請求項７】 宿主真菌が清酒酵母、焼酎酵母、パン酵
母、ビール酵母、又はワイン酵母である請求項６記載の
形質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27823495A JP3361418B2 (ja) | 1995-03-30 | 1995-10-03 | オーレオバシジン耐性付与蛋白質 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9583195 | 1995-03-30 | ||
| JP7-95831 | 1995-03-30 | ||
| JP27823495A JP3361418B2 (ja) | 1995-03-30 | 1995-10-03 | オーレオバシジン耐性付与蛋白質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08322578A JPH08322578A (ja) | 1996-12-10 |
| JP3361418B2 true JP3361418B2 (ja) | 2003-01-07 |
Family
ID=26437004
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27823495A Expired - Fee Related JP3361418B2 (ja) | 1995-03-30 | 1995-10-03 | オーレオバシジン耐性付与蛋白質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3361418B2 (ja) |
-
1995
- 1995-10-03 JP JP27823495A patent/JP3361418B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08322578A (ja) | 1996-12-10 |
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