FI63062C - Foerfarande foer framstaellning av de farmaceutiskt aktiva aminosockerderivaten trestatin a trestatin b och trestatin c - Google Patents

Description

U.W71 rBl Μ1ν ICUULUTUSJULKAISU

VgrV LBJ (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 6 0U62 c (45) ?r: Icr. t ti r.ySnnctty 11 C4 1733 / (51) K*.ik.3/Int.a.3 C 12 P 19/26, C 07 H. 15/20 SUOM I — Fl N LAN D (21) P»t*nttlt»lc*mu» — P*««MMw»ng 79θί+86 (22) HtkemltptWI — AMöknlnpdag li.02.79

(F O

(23) Alkupthri—Giltighetadag li.02.79 (11) Tullut JulklMkti — Wlvtt offmtlig 15.08.79

Patentti- ja rekisterihallitut /44) Nihtivikslpanen |s kuul)ullulMn pvm. — 31.12.82

Patent- och registerstyrelsen Ansttkan utlagd odi utLikrtfun public·rad (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird prloritet li .02.78

Englanti-England(GB) 5831/78 (71) F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Grenzacherstrasse 121-181, CH-1002 Basel, Sveitsi-Schveiz(CH) (72) Yasuji Suhara, Yokohama-shi, Kanagava-ken, Kiyoshi Ogava, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Kazuteru Yokose, Katsushika-gun, Chiha-ken, Kimihiro Watanabe, Koza-gun, Kanagava-ken, Japani-Japan(JP) (7*0 Oy Kolster Ab

(5l) Menetelmä farmaseuttisesti aktiivisten aminosokerijohdannaisten trestatiini A, trestatiini B ja trestatiini C valmistamiseksi -Förfarande för framställning av de farmaceutiskt aktiva amino-sockerderivaten trestatin A, trestatin B och trestatin C

Keksinnön kohteena on menetelmä farmaseuttisesti aktiivisten kaavan I mukaisten aminosokerijohdannaisten trestatiini A, trestatiini B ja trestatiini C, sekä niiden suolojen ja seosten valmistamiseksi , CH2OH H CH3 CH20H CH2CH CH-OH h oh H/~r~V ϊ/η-0^ H/S~ Iyir1^ ,

_H OH H H OH HÖH _Jn HÖH H OH H

jossa kaavassa n on 1, 2 tai 3, jolloin trestatiini A:11a n = 2, trestatiini B:llä n = 1 ja trestatiini C:llä n = 3, ja jotka yhteisenä rakennetunnusmerkkinä sisältävät trehaloosia.

Trestatiini A, trestatiini B ja trestatiini C ovat emäksisiä valkoisia jauheita, joilla on seuraavat fysikokemialliset ominaisuudet: a) Alkuaineanalyysi: 2 63062 C, % H, % N, % O, % trestatiini A: 46,72 7,13 2,08 43,28 trestatiini B: 46,27 7,04 1,65 44,69 trestatiini C: 47,55 7,15 2,29 42,66 b) Molekyylipaino (osmometria): trestatiini A: 1470 trestatiini B: 975 trestatiini C: 1890 c) Sulamispiste: trestatiini A: 221-232°C (hajoaa) trestatiini B: 209-219°C (hajoaa) trestatiini C: 230-237°C (hajoaa) d) Ominaiskiertyminen: 24 o trestatiini A: / = +177 (c = 1,0,1^0) trestatiini B: /<x/ ® = (c = 1/0,HjO) trestatiini C: /ct/D^ = +169,5° (c = 1,0, H2O) e) Ultravioletti-absorptiospektri (vedessä):

Trestatiini A, trestatiini B ja trestatiini C antavat pääte-absorption.

f) Infrapuna-absorptiokirjo (KBr:ssa): trestatiini A: ks. kuvio 1 trestatiini B: ks. kuvio 2 trestatiini C: ks. kuvio 3 g) 1H NMR-kirjo (ydinmagneettinen resonanssikirjo) (D20:ssa 100 MHz:ssa): trestatiini A: ks. kuvio 4 trestatiini B: ks. kuvio 5 trestatiini C: ks. kuvio 6 h) Liukoisuus liuottimiin:

Trestatiini A, trestatiini B ja trestatiini C sekä niiden hydrokloridit ovat helppoliukoisia veteen; liukoisia dimetyylisulf-oksidiin; heikosti liukoisia etanoliin ja asetoniin; ja liukenemattomia etyyliasetaattiin ja kloroformiin; i) Värireaktio:

Trestatiini A, trestatiini B ja trestatiini C antavat positiivisen permanganaatti- ja antroni-reaktion ja negatiivisen

Sakaouchi-reaktion.

3 63062

Uusia trestatiineja, ts. trestatiinia A, trestatiinia B ja trestatiinia C valmistetaan keksinnön mukaisesti siten, että viljellään trestatiinia tuottavaa mikro-organismia Streptomyces dimorpho-genes NR-320-OM7HB (ATCC 31 484) tai NR-320-OM7HBS (ATCC 31 485) aerobisissa olosuhteissa vesipitoisessa väliaineessa, erotetaan tres-tatiinit käymisliemestä sinänsä tunnetulla tavalla, esimerkiksi sentrifugoimalla tai suodattamalla, adsorptio- tai saostusmenetel-millä tai kromatografiamenetelmillä, ja haluttaessa erotetaan tres- tätiini A, trestatiini B ja trestatiini C toisistaan, ja haluttaessa eristetään ne suoloinaan.

Agency of Industrial Science and Technology, Fermentations Research Institute, Japani, on tallettanut kannat Streptomyces di-morphogenes NR-320-OM7HB ja Streptomyces dimorphogenes ΝΚ-320-ΟΜ·ΛΒΧ5 tunnuksilla "FERM-P no. 3 664" ja "FERM-P no. 3 665". American Type Culture Collection (ATCC) Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 (USA) on edelleen tallettanut kannat seuraavasti: ATCC-no. Talletettu, ovm: FEM-P no 3 664 31 484 30.01.1979 FERM-Pno. 3 665 31 485 30.01.1979 ja niillä on seuraavat mykologiset tuntomerkit: I. Morfologia

Mikroskooppisesti kehittää FERM-P no. 3 664 vallitsevasti suoran ja harvoin kierteenmuotoisen ilmahuovaston, jossa on 10-50 itiötä ketjua kohti, hyvin haarautuneesta huovastosta erilaisilla ISP-väliaineilla. Itiöillä on sileä pinta ja ne ovat kooltaan 0,6- 1,0 x 0,8-1,4 /ά. Haarautumia kierremäisessä huovastossa tai itiöpe-säkkeiden muodostumista ei havaittu. Lisäksi havaittiin tarkasteltaessa ilmahuovaston morfologiaa pieni populaatio (pienempi kuin 1 %), jossa oli kierremäinen ilmahuovasto, joka esiintyi kasautumana hallitsevan populaation sisällä, jolla on suora itiöketju. Eristettäessä kierukkamainen pesäke kävi ilmi, että klooni säilyttää kierremäisen ilmahuovaston morfologian sukupolvien yli, jolloin pysyvästi syntyi pieni osa (0,7-2 %) suoraa ilmahuovastoa ryhminä tai pesäkkeinä. Tätä kannan FERM-P 3 664 kierremäisestä pesäkkeestä eristettyä alalajia nimitetään FERM-P 3 665:ksi. FERM-P 3 664:n ja FERM-P 3 665:n tunnusmerkeissä ei todettu selvää eroa, lukuunottamatta ilmahuovaston morfologiaa.

II. Viljely-tunnusmerkkejä

Kannoilla FERM-P 3 664 ja FERM-P 3 665 on samat, taulukossa I esitetyt viljely-tunnusmerkit. Kaikki testit suoritettiin 4 63062 27°C:ssa kasvatetuilla viljelmillä, lukuunottamatta testiä kuoritulla maidolla, joka suoritettiin 37°C:ssa. Värimääritykset suoritettiin 14-21 päivän ikäisillä viljelmillä Color Harmony Namual’in, 4. painos 1958 mukaisesti (Container Cooperation of America, Chicago).

5 xj 6 30 6 2

P

c § § · s

Cl ^ ^ 53 (0 -H -H ra

G -P p .p ra p -P -P

0 15 3 φ φ 8 <0 -P 8¾ -¾ ! a i 1 3¾ 3 3¾ d(S & κ k ax fi κί 1 1 B ί Id -«—. '—> hi—i 0) φ c I Ό 110)(0 C ^ Φ rH ^ rH AJQo

Si rH W MO 5 φ 0(0 H J) (0 I—I W £ (0 (3 CO S+JO^IgO) Ή Jh M (1) p ra 0)

p ra ra c C :roC5 H h H W ra X φ o X h G X

w φ > ra :ra > _c 2 ου 3 « gl x ·> -p s Ξ eg ra χ ra > κοκ ra rH Μ φ 5 p οιχ ίο !3·η p > w ς χ s ·ρή> hh c χΡ fi I ci at huh o 35335) ·η φ -h ra «5 u c m ra r-ι rH 2 p Η βΐ φ -P φ X d X p ·Μ (0 '— ί> (0 Φ-·Η

JB -HE- rH-Η ί 5 *H φ · Λ « Λ tTH

Η ·Η Sq-Hf-j ΗΦΦ 2 Blj) X (0 -P

•P rH -P p a. φ rH rH (0 £ ·Η W H £ Μ Φ H X B ΓΟ S

-P Q >H>^r χ cm «η > E (0 Φ > n ra p X φ l Η 2 w “ ra 3 :(0 Φ ~ ~ ~ o ie 9 φ 2 5« 3 ra x 2& - fi « - S3- i6:|S- L· 4 £3« -Sijii § f'3S,3.Sj§ g|g Άξ 1« s

Jj id 'φί^φρρ^ορΒΜ ra φ :ra μ "ο p μ ,<c :ra ra’ ¢3 -ra ra S m CO X K'' -PH H > H E O BA >03 W fi ffl > -P S > -P K I «

rt? C i w i-h i rH 'SL iC| in w L

S I S3 iT«2 pö-5 rowä , lp.

ra h g (ΟΦΓΡΒΦ-Ρδ-Φ χ ra h φ *-c > H E (0 (0 X O ra rH > X :W tr G ra φ φ a :ra 53 * Q Φ H Φ >lc >rHCnT3>rH(3 3 X X Έ ra > e tr 2 X <0 χ pO β (ΟΦΒίΡκΟ'ΌΑ! MW row &·ΗΗ . x g χ ra * m -h :ra -p χ m > -p ·— S3' φ ^ ä dra ra ^ i ra i p e o > x ^- · S - ra m φ ι-ημι-Ρ'-'-φ „ -h oras 53cö:rarai -p o ra c φ 2h 2 p ch ^ ex

O -P rH φ 2 r-s e :ra ·Ρ E ra h ιη φ 5 h :ra cu ra h 53 Φ (0 3 W

3 S S -M S S 3£sS |S^S«!|B sp» = e -S-gÄ SE

= 2 > 3¾¾ ·3£°3 ·=3Ρ-*2“« »£*8 o?3sp“.g

(-n -P *2 e s p φ - φ -pino * ci »<u o -p XKoraraMgrH

s | tieUfills ?33·§ 3£g|ils

f S Ässä IS f f |,äS§ SÄSl^SJS

§ o J! » φ ^ aj u-ij o ta /h *ra •h Ό C o ϋ ' ή ® ? Ό o ra ή ra ra ra

O ra ra 3(00 n > | h i cm m p cm > x M E

"rara i3 ^3 ^ «n 1 ^w| ™ i ^ ra 1 > in x m £§§ "S ell's 1¾¾^¾ liS o | lp 1 ipIppMäi 3 O jj CH M -ΡΈι-Η qtfiXCrH > 2whhx 3 iso q B S Of S4) 3 S S Of (3-Ppm Ά ΦΦ6 v£3 SWSWqwHg^ OCp * omC"-* Q Αί H S βΗδφ H(DCe H 2 fl) 4-^ ·ΗφΞ ^ I in ii Ilii jillsijjiiι i i§ln § i fa i§ rw , I i -ase |sa ,qt § is -il l|s» l? m «-s· ias l 11¾ Sl s l-äa^s 3 |aä f 4 11¾¾ ä? tsll !&1 s S 11 s s a > Igi? as a s 11 tfSJrf ss&d g i g1 sirs s 6 63062 ? S S S § ro +j -μ 4-> S 3 3 3 s s s 2 ro h "H ro 15 JS 3 &i 2 > p -p ro Έ :P» i ϋ|ΰ § ® uf 1 c h ro e ro ro (n > ro :o c ro ~ κ ro 4J ro

ro s ro c "ro in -H

ro ro ro ro p m ro

>Ha;^ & > -P I I

I I

'-v I I ' I H H

ro -h w ro ro ro ro i o roro -nro-— ,ν λ; χ 4-1 rH s f\j > ro Έ q ro Ϊ3 -hihu roro ro ro ro ro ro en i ro ro e ^ g cj ™ ,3 J§ § ^ "ro roro (3 3 ro ^ S ro ro .ero -h Φ ro ro E _c > > .h m ro ro ts -h roro

0 ro ro ja y a i i > P

λ; rororororo row 2 t> i> p ► -M e e G 4) e -w 'iSBjro 'SS SS "S ro 1 IsflSs S! 31 Is K C P ffl P H > 4-> >44 S > kiii s ro ^ro ro ro g

w S S "§ ^ "§ S

g & ί B ί §· p p 1 §0~·8^ s s 'ro ro ST^ ro ίτΓ'ίΒ 3 3 3 gSÖSSÖg S S 6 sa h s — sl ST Ä *3 3 l a, ^ eroa-h e

S3 O P 6 -H S P

-wipe 4-> -P M ro -p S 5 S 5 8 ro Su 3¾¾ gfc 3Γ §£

Sv ö-a-, 7 , 63062 § :¾ h d ti *. φ (Ö Φ (1) -¾¾

B σι -H -P Η I !> $ ij ·§ -Ρ S I

SS ·3ί S' 3« «1 § 1 s' 1 f rt1" « 3 3| ,3§ sij S -S-l -S i

<%fe e. 3-SSSiä 51 S| B-gäSS

CO H CO CD M r-| > 4n > H >> ft ÄH >4J

Il I

0) 03 I :ra S S rt.ä SS« 4>

ra > φ ΊΕ > Φ Φ P

SS fe tJ3 |S h^t 3 § h° o " :ra a) "S | Φ ö :S jlj Sh -B S ro § ti ^ ^ 3 ^ ^ | § ra il c a ^ ^ £ i

g, w h ra tn o > fii >i > h > ft C) > Λ! .G

rH

& I

tl CD Ή I I

8 I « 3§S ! Il f® Is s I I lii i 31 |g * s rt p rt 5 rt f IS TS 1 Is

g g CO H K CD M O > 43 £ ,C G λ: m >-P

4J *H

s | φ | ϋ G jH ^ 3 ^i rH h ri ;ra P en fl

I ? .a l g 9 !i| li» n« 19 !P

οζ? (n — :ra ra ra ra g φ φ φ φφφ φ ra φ φ g

CM C m Φ CD ί-Η <-Η TO f"} '—· riij «-H <~H ph4 ·—I CD H H B

roi-i j - i—ie ra ra > raracn (draw rH g ra ra > 4 S i -¾ rt g S®5??S§5Bi5 S S 13

2 CD

- «fr 5 ra fc -π 0 i S :1 S :π3 s 3 kh -p -p α,^ 1 ra m Φ Φ ra ra Φ ra φ ra <u cg § ^ t ^ e H H H H !fÖ H W t S S p 3 y o> o> <L)Q)fl3> Spy II I s . sPlI, lii Ϊ . lp ora cm :<e ra raragrararararaprara ra ra g •G *ro CO * Φ CD rH rH (Q i—I i—I Ä Hi—IM'—I CD i—li—I ra

CiH i ra ih g ra ra > ra ra m ra ra g m g ra ra > ra -h ά -r-ι p ra ra ro p ra p racocra rap rarara «> z E cd C >>4j>>m > > > ac fi >>43 |3J | |

tri ft «N jq 4J -H -H

O W β _ G Hfl Λ rH

H h -P > o -H ;ra · · :ra .

.o-^SrD&^s <ι> e cn>e

Mractn-H-riftra e cd cu ft ra ijco-H^Q-Pco · ,· · en SOra^ HHro CD Sh ra H -a 8

Is ill I „ 63062

L· akt s as J

d. ΗI Λΐ <HI r-H ,i2 +J

CLi&j rH (Λ f-H ^ f-t m D

•W © p © p © p p WH Ä H Ä H Ä ft ft

i I L

© ro © ns 9 ,

I S I *j I

s|sip a

Oft Λ > E > (DH l«H c d 3 • CO (0 :fc 5 :fc jo © jp © :ro © 3 C/} H > P -J-> 4-> > m > X > X ft 5 *f = (0 HO) > ΉΗ © Ή :(ö

•ΗΓ' ^ H 4J

tip g <v <a h (p <o

Bxn «λ: ii α> Φ ©

'^fsf 51 I

s a © •r~>

CN

O I j

Eh O ft nJ (0 <B

N (1) 1) (1) ©

I 3| I I

a . S

! o ft <tt (0 5} (No© © © ^ rH H Ί Ί ft e ύ w ft m ft (ή 63062 9 S. S. oli- S.pli- nigrifa vaceus catus

Taulukko 2 (jatkoa) NR-320- NR—320— ciens ISP ISP

-- QM7HB 0M7HBS ISP 5072 5319 ___15071 A)

Melaniinin muodostus J

ISP väliaineella 1 (-) (-) J

6 - - I- I

" " 7 (-) (-) - I- -

Hiilen hyväksikäyttö L-arabinoosi ++ ++ + ++ ++ D-ksyloosi ++ ++ + + ++ D-glukoosi ++ ++ ++ ++ ++ D-fruktoosi ++ ++ + + ++

Sakkaroosi ++ ++ - I-inosiitti ++ ++ - + ++

Ramnoosi ++ ++ ++ ++ ++

Raffinoosi ++ ++ - D-mannitoli ++ ++ ++ ++ ++ C)

Kaseiinin hydrolyysi ' + + + + + Tärkkelyksen hydrolyysi + + + + +

Gelatiinin nesteytys + + + + -

Nitraatin pelkistys - - - - -

Maidon koagulointi - - + - + I

Maidon peptonointi + + + + + |

Kasvun lämpötila-alue ISP-2:11a (°C) 20-45 20-45 20-37 20-37 20-45 a: suora ja taipuisa b: spiraalimainen, c: retinaculiaperti, d:ilmahuovasto, e: substraatti-huovasto, f: substraatti-huovaston kääntöpuoli, g: liukoinen pigmentti.

A) -: ei muodostunut, (-): todennäköisesti ei muodostunut B) ++: hyvä hyväksikäyttö, +: hvväksikävttö, +; mahdollinen hyväksikäyttö, -: ei hyväksikäyttöä C) +: positiivinen, negatiivinen.

10 63062 III. Fysiologiset ominaisuudet

Seuraavissa tuntomerkeissä ei havaittu selvää eroa kantojen FERM-P no. 3 664 ja 3 665 välillä.

1) Kasvun lämpötila-alue ISP-2-väliaineella havaittiin kasvu kohtalaisesta runsaasen 20°, 25°, 27°, 30°, 37° ja 45°C:ssa, ei kuitenkaan 6°C:ssa ja 55°C:ssa. Optimaaliseksi kasvulämpötilaksi todettiin noin 37°C.

2) Gelatiinin nesteytys glukoosi-peptoni-gelatiini-agarissa 27°C:ssa.

Kohtuullisen voimakas nesteytyminen tapahtui noin 12. päivänä.

3) Tärkkelyksen hydrolyysi epäorgaaninen suola-tärkkelys-aga-rissa 27°C:ssa.

Tapahtui voimakkuudeltaan keskinkertainen hydrolyysi.

4) Koaguloituminen ja peptonoitUminen väliaineessa, jona oli 10-%:inen kuorittu maito, 37°C:ssa.

Hyvin voimakas peptonoituminen havaittiin noin 5. päivänä. Koaguloituminen oli negatiivinen.

5) Kaseiinin hydrolyysi 10-%:inen kuorittu maito-ravinto-agarissa 27°C:ssa.

Todettiin hydrolyysi, joka oli voimakkuudeltaan kohtalaisesta voimakkaaseen.

6) Nitraatin pelkistys ISP-8-väliaineella 27°C:ssa.

Negatiivinen.

7) Melaniinin muodostus 27°C:ssa.

Peptoni-hiiva-rauta-agarilla (ISP-6) ei muodostu pigmenttiä. Pigmentin muodostus arvioitiin myös tryptoni-hiivaliemessä (ISP-1) ja tyrosiiniagarissa (ISP-7) negatiiviseksi.

8) Hiilihydraatin hyväksikäyttö Pridham-Gottlieb-agar-väliai-neessa (ISP-9) 27°C:ssa.

Runsas kasvu havaittiin L-arabinoosilla, D-ksyloosilla, D-glukoosilla, D-fruktoosilla, sakkaroosilla, inositolilla, raffinoo-silla, D-mannitolilla ja L-ramnoosilla.

Lyhyesti voidaan kantojen FERM-P no. 3 664 ja 3 665 mikrobiologisia ominaisuuksia kuvata seuraavasti:

Kannat ovat Actinomycetales-kantoja ja ne kuuluvat Streptomy-ces-sukuun. Ilmarihmasto on muodoltaan suora ja kierteinen (vallitsevasti suora NR-320-OM7HB:llä ja vallitsevasti kierteinen NR-320-QM7HBS: llä). Silmukoiden muodostumista ei havaittu. Kummankin kannan itiöt ovat pinnaltaan sileitä ja kooltaan 0,6-1,8 x 0,8-1,4 /6. Kannat kehittä- 63062 11 *** '* vät erilaisilla ISP-väliaineilla ilmahuovaston, joka on väriltään vaaleanharmaasta vaaleanruskehtavan harmaaseen ja koostuu kasvusta, joka on väriltään vaaleankellertävän ruskeasta kellertävänruskeaan ja jossa on ruskehtavaa liukoista pigmenttiä. Melanoidista pigmenttiä ei todennäköisesti muodostunut peptoni-hiiva-rauta-agarissa, tryptoni-hiivaliemessä eikä tyrosiini-agarissa. Kannat peptonoivat voimakkaasti kuoritun maidon. Gelatiinin nesteytys oli heikko, kun taas tärkkelyshydrolyysiä tapahtui kohtuullisessa määrässä. Yhdessäkään edellä esitetyllä tavalla suoritetussa testissä ei havaittu eroa NR-320-OM7HBS:n ja NR-320-OM7HB:n välillä.

Nämä tuntomerkit osoittavat, että kannat muistuttavat S. nigrifaciens-kantaa /Waksman, S.A. (1961) Classification, identification and description of genera and species, The Actinomycetes vol. 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Shirling, E. B & D. Gottlieb (1968) Cooperative description of type culture of Streptomyces II. Species description from the first stydy, Inst. J. Syst. Bacteriol., 18:69-189. Buchanan, R. E & N. E. Gibbons (1974) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. painos. The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Waksman, S. A. (1919) Cultural studies of species of Actinomyces, Soil Sci., 8:187-171 .J S. olivaceus /Waksman, S. A. (1961) Classification, identification and description of genera and species, The Actinomycetes vol. 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Shirling, E. B. & D. Gottlieb (1968) Cooperative description of type culture of Streptomyces, II. Species descriptions from the first study, Inst. J. Syst. Bacteriol., 18:69-189. Buchanan, R. E. & N. E. Gibbons (1974) Bergey's Manual og Determinative Bacteriology, B. painos, The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Waksman, S. A. (1919) Cultural studies of species of Actinomyces, Soil Sci., 8:167-171. Breed, R. S., E. G. D. Murray & N. R. Smith (1957) Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 7. painos, The Williams and Wilkins Co., Baltimore/ ja S. plicatus-kantaa Buchanan, R. E. & N. E. Gibbons (1974) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. painos, The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Shirling, E. B. & D. Gottlieb (1969) Cooperative Descrep-tion of type culture of Streptomyces, IV. Species descriptions from the second, third and fourth studies, Inst. J. Syst. Bacteriol., 19:391-512. Parke, Davis and Co. (1954) Antibiotics and methods for obtained same, GB-patenttijulkaisu 707 332. Edellä esitettyjen kantojen vertailu ISP-kantojen kanssa on esitetty taulukossa II.

Käyi ilmi, että nämä molemmat kannat, nimittäin NR-320-OM7HB ja NR- 63062 12 320-OM6HBS olivat erotettavissa jokaisesta näistä kolmesta edellä mainitusta lähisukuisesta lajista.

Verrattuna S. nigrifaciensiin eroaa NR-320-OM7HB tästä kuoritun maidon peptonoinnissa ja sakkaroosin,inositolin ja raffinoo-sin hyväksikäytössä. Morfologisesti ei S. nigrifaciens koskaan muodosta kierteitä. Koska sitä paitsi S. nigrifaciens muodostaa oliivinharmaan ilmahuovaston sekä vihertävänkeltaisen substraatti-huovaston ISP-3-väliaineessa eikä pysty tuottamaan inhibiittoria, on epätodennäköistä, että nämä molemmat kannat muodostaisi identtisen lajin.

Toisaalta S. plicatus ISP 5319:n itiöketju esiintyy pääasiallisesti kierteisessä muodossa ISP-2-, 3-, 4- ja 5-väliaineissa. Vaikka silmukanmuotoista ilmahuovastoa havaitaan harvemmin, ei ISP 5319:ssä nähdä suoraa muotoa, joka erottaa S. plicatuksen NR-320-OM7HB:sta. Lisäksi havaitaan perustavia eroja ilmahuovaston leviämisessä, pigmentoinnissa, koaguloitumisessa, gelatiinin nesteytyksessä ja sakkaroosin ja raffinoosin hyväksikäytössä.

S. olivaceus osoittautuu kolmesta tutkitusta lajista lähimmin NR-320-OM7HB:n sukuiseksi. Niinpä S. olivaceus ISP 5072 oli muodostunut kierukkamaiseksi useimmissa osissa ISP-2-, 3-, 4- ja 5-väliaineissa, osittain siinä oli silmukanmuotoisia suoria itiöket-juja ilmahuovastolia. Se eroaa kuitenkin sekä NR-320-OM7HB:sta että myös NR-320-OM7HBS:sta siinä, että kierukanmuotoiset, silmukanmuo-toiset ja suorat itiöketjut ovat lähellä toisiaan ilmahuovaston kasautuman sisällä, mitä ei koskaan ole havaittu NR-320-OM7HB:ssa ja NR-320-OM7HBS:ssä. ISP 5072:n ja NR-320-OM7HB:n välillä havaitaan edelleen eroja liukoisen pigmentin tuotannossa (ISP 15072:11a ei pigmentointia ISP-2-, 3- ja 5-väliaineissa), ilmahuovaston kehittymisessä (ISP 5072:11a ohut ilmahuovasto), hiililähteen (sakkaroo-si/raffinoosi) hyväksikäytössä ja -amylaasi-inhibiittorin tuotannossa (ISP 5072-metaboliiteilla ei inhibitiovaikutusta). Kaikki nämä tulokset osoittavat, että NR-320-OM7HB sekä myös NR^320-OM7HBS näyttävät lähinnä olevan sukua S. olivaceus ISP 5072-lajin kanssa, mutta ne eivät ole identtisiä sen kanssa.

Sen tähden tuntuu oikeutetulta pitää tätä ryhmää Strepto-myces-suvun uutena lajina ja tätä lajia nimitetään tässä Strepto-myces dimorphogenes nov.sp. WATANABE:ksi ja MARUYAMA:ksi, 1978. S. dimorphogeneksen tyyppikanta on NR-320-OM7HB (FERM-P no. 3664). Etymologia: di (dual), (kreikkaa), morphe' (muoto) + Genesis, perustuu kahden muodon esiintymiseen itiöketjun morfologiassa, ts.

13 63062 kierukkaketjuiset rykelmät esiintyvät paikoitellen itiöketjussa vähemmistönä. Biotyyppiä, NR-320-OM7HBS (FERM-P no. 3665), jossa kierukanmuotoinen itiöketju on vallitseva ja jossa on suoria itiö-ketjuja paikoitellen jakautuneena pienemmiksi kasautumiksi, tulisi silloin tarkoituksen mukaisesti nimittää S. dimorphogenes subsp. sprioformatukseksi, ottaen huomioon ilmahuovaston morfologia. Tyyppikannasta FERM-P no. 3664 tulisi sitten vastaavasti käyttää nimitystä S. dimorphogenes subsp. dimorphogenes.

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa viljelyväli-aineessa, joka sisältää tavallisia ravintoaineita, joita tämä mikro-organismi voi käyttää. Hiililähteitä ovat esimerkiksi tärkkelys, dekstriini, glukoosi, glyseroli, sakkaroosi, trehaloosi, melassi tai niiden seokset: typpilähteitä ovat esimerkiksi soijapapujauhe, lihauute, peptoni, hiivauute, maissin liuötusvesi, ammoniumsulfaat-ti, natriumnitraatti, ammoniumkloridi tai niiden seokset. Viljely-väliaine voi tarvittaessa sisältää sopivia epäorgaanisia aineita, kuten kalsiumkarbonaattia, natriumkloridia ja/tai sinkin, kuparin, mangaanin tai raudan suoloja. Lisäksi voidaan lisätä vaahtoamisen estoainetta, kuten silikonia tai kasviöljyjä, vaahtoamisen estämiseksi viljelyn aikana.

Viljely suoritetaan aerobisissa olosuhteissa vesipitoisessa väliaineessa, erityisesti submerssifermentointina. Väliaineen pH on viljelyn alussa noin 7. Edullinen lämpötila on väliltä 20-40°, erityisesti väliltä 25-30°.

1-5 päivän viljelyn jälkeen edellä mainituissa olosuhteissa saadaan trestatiinit käymisliemestä. Viljely keskeytetään tarkoituksen mukaisesti ajankohtana, jolloin trestatiinien suurin tehokkuus on saavutettu. Saatujen trestatiinien määrä voidaan määrittää seuraa-valla menetelmällä:

Trestatiinien määritys

Trestatiineillä on voimakas inhibitiovaikutus c^-amylaasin aktiivisuuteen. Sen johdosta ne voidaan määrittää menetelmällä, jossa käytetään P. Bernfed'in oi -amylaasi-testiä (Methods in Enzy-mology, I, 149, 1955).

Kaksi yksikköä (yksi yksikkö cAramylaasia on entsyymimäärä, joka myöhemmin esitettävissä olosuhteissa trestatiinin poissaollessa katalysoi pelkistävien sokereiden muodostumista niin, että sokeria muodostuu määrä, joka vastaa 1 mikromoolia maltoosia) sian haima- θ{-amylaasia 0,1 ml:ssa 6,4 mM ammoniumsulfaattiliuosta lisätään 0,6 ml:aan 20 mM fosfaattipuskuria (pH 6,9), joka sisältää ..

14 63062 10 mM natriumkloridia ja eri määriä trestatiinia. Seoksen annetaan tasapainottua 5 minuutin ajan 37°C:ssa ja lisätään 0,5 ml 4-%:ista tärkkelysliuosta, minkä jälkeen seosta inkuboidaan 5 minuuttia 37°C: ssa. Reaktio keskeytetään lisäämällä 2 ml dinitrosalisyylihappo-reagenssia (valmistettu P. Bernfeld'in mukaisesti). Seosta kuumennetaan 5 minuuttia kiehuvalla vesihauteella, ja se laimennetaan sitten 10 ml :11a vettä. Saadun värjäytyneen liuoksen absorptio (A^) mitataan 540 nmrssä, minkä jälkeen 3^-amylaasiaktiivisuuden inhibi-tio voidaan laskea seuraavan yhtälön mukaisesti: inhibitio = (1--^) x 100 (%) a2 " A0

Aq absorptio ilman entsyymiä.

Aj absorptio ilman trestatiinia.

Inhibitioyksikkö (IU) määritellään trestatiini-määräksi, joka edellä kuvatuissa testiolosuhteissa aiheuttaa 50-%:isen entsyymi-inhibition.

Fermentoinnin jälkeen voi valmistettujen trestatiinien eristäminen fermentointiliuoksesta tapahtua sinänsä tunnetuin menetelmin, esimerkiksi erottamalla huovasto linkoamalla tai suodattamalla. Trestatiinit ovat vesiliukoisia, heikosti emäksisiä yhdisteitä. Sen vuoksi voidaan trestatiinien eristämiseen ja puhdistamiseen käyttää tavanomaisia vesiliukoisen emäksisen aineen eristämisessä ja puhdistuksessa käytettyjä menetelmiä. Tämä voidaan toteuttaa esimerkiksi adsorptiomenetelmillä jollakin adsorptioai-neella, kuten aktiivihiilellä, tai kationinvaihtohartseilla: tai saostamalla jollakin liuottimena, kuten alkoholilla tai asetonilla: tai kromatografisilla menetelmillä käyttäen selluloosaa tai Sephadex*ia tai edellä mainittujen menetelmien yhdistelmillä.

Trestatiinin A, trestatiinin B ja trestatiinin C eristäminen yksittäisinä yhdisteinä fermentointisuodoksesta voidaan tarkoituksen mukaisesti suorittaa pylväskromatografisesti käyttäen seosta, jossa on heikosti happaman kationinvaihtohartsin H-muotoa ja ammo-nium-muotoa. Edullinen menetelmä on seuraava:

Fermentointisuodoksen pH säädetään alkalilla, kuten natrium-hydroksidilla, kaliumhydroksidilla, natriumkarbonaatilla tai kaliumkarbonaatilla 7:ään. Suodokseen lisätään sitten aktiivihiiltä ja liuos suodatetaan. Trestatiini eluoidaan hiilestä 30-70-%:isella, edullisesti 50-%:isella vesipitoisella asetonilla. Eluointiaineen pH säädetään edullisesti jollakin hapolla l-3:een ja eluointi 63062 15 suoritetaan 50-70°C:ssa. Eluaatti väkevöidään, ja väkevöite kaadetaan kationinvaihtohartsi-pylvääseen, kuten Dowex 50 (H-muoto). Pylväs pestään vedellä ja eluoidaan IN ammoniakin vesiliuoksella. Jakeet, joilla on amylaasiaktiivisuuden inhibitiovaikutusta, kootaan, väkevöidään alennetussa paineessa ja lyofiloidaan, jolloin saadaan jauhemainen raakatuote, joka sisältää trestatiinit. Raakatuotetta käsitellään metanolilla metanoliin liukenevien epäpuhtauksien poistamiseksi. Trestatiinit ovat lähes liukenemattomia metanoliin. Metanoliin liukenematon jäännös trestatiineineen liuotetaan veteen. Liuos johdetaan anioninvaihtohartsipylvään, kuten Dowex 1 (asetaat-timuoto) (Dow Chemical Co.) läpi. Pylväs eluoidaan vedellä ja eluaat-ti fraktioidaan. Aktiiviset jakeet kootaan, väkevöidään alennetussa paineessa ja johdetaan kationinvaihtohartsi-pylvään, kuten Dowex 50 (ammonium-muoto) (Dow Chemical Co.) läpi. Pylväs eluoidaan vedellä. Jakeet, joilla on amylaasiaktiivisuuden inhibitiovaikutusta, kootaan, väkevöidään ja lyofiloidaan, jolloin saadaan jauhe, joka kuten suurpaine-nestekromatografia osittaa, koostuu pääasiallisesti trestatiinista A, trestatiinista B ja trestatiinista C. Mainittujen trestatiinien vesiliuokset johdetaan kationinvaihto-hartsipylvääseen, joka sisältää Amberlite CG 50 (H-muodon ja ammo-nium-muodon seos) (valmistaja Rohm & Haas ). H-muodon edullinen suhde ammonium-muotoon on välillä 1:9-9:1 (tilavuusosia). Pylväs eluoidaan vedellä, jolloin saadaan trestatiini B, trestatiini A ja trestatiini C tässä järjestyksessä. Jokainen näin saatu trestatiini kromatografoidaan uudestaan, jolloin saadaan puhtaita trestatiine-ja A, B ja C. Nämä trestatiinit voidaan haluttaessa muuttaa eri suoloiksi, kuten hydroklorideiksi, sulfaateiksi, fosfaateiksi, asetaateiksi ja oksalaateiksi.

Hydrokloridien sulamispiste: trestatiini A-hydrokloridi: 163-190°C (hajoaa vaahdoten) trestatiini B-hydrokloridi: 158-186°C (" " ) trestatiini C-hydrokloridi: 190-200°C (" " ).

Hydrokloridien ominaiskiertokulma: trestatiini A-hydrokloridi: = +162,5° (c=l,0, 0,01N HC1) trestatiini B-hydrokloridi: D = +169° (c = 1,0, 0,01N HC1) trestatiini C-hydrokloridi: Ä7d5 = +160,5° (c = 1,0, 0,01N HCl) 16 63062

Tltraus (vedessä); I pKa1 Ekvivalentti I------ I > I Trestatiini A 5,0 ; 720 I " B " 690 I " C " 650 Nämä arvot, yhdessä edellä annetun molekyylipainon kanssa, osoittavat, että trestatiini A, B ja C ovat kaksihappoisia, yksi-happoisia tai kolmihappoisia emäksiä.

Empiiriset kaavat: | Trestatiini A: C56H94N2°40 j ” B: C37H63N028 " C: C75HL2i13°52

Vapaiden emästen muodossa olevien trestatiinien A, B ja C NMR-spektrit (D20:ssa 100 MHzjssä) otettiin JEOL FX-100 spektrometrillä, joka oli kytketty "homo gated decoupling"-järjestelmään (säteilytys 4,71 ppm:ssa) ja käyttäen DSS sisäisenä standardina: NMR-spektrit on esitetty kuvioissa 4, 5 ja 6.

Ohutlevvkromatoarafia:

Levy: piihappogeeli (Merck)

Liuotinjärjestelmä: kloroformi-metanoli-25-%:inen vesipitoinen ammoniakki-vesi (1:4:2:1) f j Kehitys: kuuma rikkihappo

Edellä kuvatuissa olosuhteissa ovat trestatiinien A, B ja C Rf-arvot 0,19, 0,28 ja vastaavasti 0,14.

Korkeapainenestekromatografia:

Pylväs: JÖ-Bondapak/CH (0,3048 m x 6,35 mm, : Waters Co., USA) j Liuotin: Asetonitriili-vesi (63:37) ! Virtausnopeus: 4,0 ml/min.

! Mittaus: UV-absorptio 210 nm:ssä .. - ---- ---1

Edellä kuvatuissa olosuhteissa ovat trestatiinien A, B ja C retentioajat 5,5: 3,4 ja vastaavasti 8,8 min. Kromatogrammit on esitetty kuvassa 7.

17

Paperi-elektroforeesi: 63062 j Paperi: ! Toyo Roshi no. 51 j : Puskuri: muurahaishappo-etikkahappo-vesi 25:75:900, pH 1,8)| Jännite: 3 000 V j

Aika: 40 minuuttia j > ________ __ ___ ___ ___ _ _____ _____ ____ 1

Edellä kuvatuissa olosuhteissa kulkevat kaikki trestatiinit katodia kohti: trestatiini A: 12 cm, trestatiini B: 9 cm, trestatii-ni C: 13 cm.

Rakenne;

Hydrolyvsissä 4N kloorivetyhapon kanssa 80°C:ssa 3 tunnin aikana tuottavat trestatiinit A, B ja C glukoosia ja amiinin.

Amiinin pKa1 on 3,9 ja molekyylikaava ci3H2iN07' j°ka saadaan korkean erotuskyvyn NMR-spektreistä. Trestatiinit A, B ja C sisältävät 5,4 ja 6 moolia glukoosia. Lievä happohydrolyysi (80°C, 4 tuntia) käyttämällä Dowex 50 (H-muoto katalyyttinä) antaa trehaloo-sin (o(-D-glukopyranosyyli-K-D-glukopyranosiidin). Mikään tresta-tiineista A, B ja C ei sisällä aminohappoja.

Edellä mainituista ominaisuuksista voidaan päätellä, että keksinnön mukaiset trestatiinit A, B ja C ovat heikosti emäksisiä aminoglukosideja, trehaloosi yhteisenä rakenteellisena aineosana. Edellä esitetyn perusteella ehdotetaan trestatiineille A ja B kuvassa 8 esitettyjä rakenteita.

Trestatiinilla A, trestatiinilla B ja trestatiinilla C on suuri amylaasia inhiboiva vaikutus, kuten myöhemmin osoitetaan, ja niitä voidaan käyttää täten amylaasi-inhibiittoreina.

Tavanomaisia amylaasi-inhibiittoreita, joita valmistetaan fermentoimalla, ovat seuraavat: 1) Nojirimysin Niwa et ai. (Agr. Biol. Chem., 34, 966, 1970)

Nojirimycin on monosakkaridi ja sen johdosta selvästi erilainen kuin keksinnön mukaiset trestatiinit.

2) Peptidisokeri, S. Ueda et ai. (Agr. Biol. Chem., 37, 2 025, 1973 ja Agr. Biol. Chem., 40, 1 167, 1976). Peptidisokeri sisältää aminohappoja rakenteellisena aineosana.

3) Amylostatiini A, 8. Murao et ai. (Japanilainen patenttihakemus, Kokai 123 891/1975).

Mainitussa patenttihakemuksessa selitetään, että voimakkaasti hapan kationinvaihtohartsi ei absorboi amylostatiini A:ta pH-alueel- la 14. Kuten mainittiin, adsorboi tällainen ioninvaihtohartsi 18 63062 trestatiinit.

4) Amylaasi-inhibiittori, K. Ueda et ai. (Japanilainen patenttihakemus, Kokai 54 990/1976).

Tämän amylaasi-inhibiittorin molekyylipaino on noin 600, mikä poikkeaa trestatiinien A, B ja C molekyylipainoista.

5) Aminosokeri-yhdisteet, W. Frommer et ai. DE-hakemusjulkaisu 2 347 782).

Nämä yhdisteet ovat yksihappoisia emäksiä, kun taas tresta-tiini A on kaksihappoinen emäs ja trestatiini C kolmihappoinen emäs. Trestatiinissa B, vaikkakin se on yksihappoinen emäs, on trehaloosi rakenteellisena aineosana ja se poikkeaa siten Frommer'in et ai. aminosokereista.

Amylaasi-inhibiittoreita, joissa on trehaloosi-rakenneosia, ei tätä ennen ole kuvattu.

Trestatiinien ja niiden suolojen biologiset ominaisuudet ovat seuraavat: 1) Akuutti myrkyllisyys:

Akuuttista myrkyllisyyttä ei havaita, silloinkaan, kun 500 mg/kg trestatiinia A, B ja C syötetään rotille· suun kautta (vastaa 65-700-kertaista vaikuttavaa annosta). Hiiret ja rotat sietävät hyvin 10 päivän ajan trestatiini-seosta, joka vastaa esimerkissä 1 vaiheen III-jauheeksi nimitettyä valmistetta päivittäisinä annoksina 8 000:een mg/kg asti.

2) Antimikrobinen spektri:

Antimikrobisen vaikutuksen puuttuminen trestatiinista A, B ja C, todettuna agar-laimennusmenetelmän avulla, käy ilmi seuraa-vasta taulukosta:

Trestatiinin A, trestatiinin B ja trestatiinin C antimikrobinen spektri

Testiorganismi Tresta- Tresta- Trestatiini A tiini B tiini C

f ~ ' ~ ” '

Aig/ml *jg/ml /ug/ml E. coli NIHJ >100 >100 >100 E. " " SMf " " ·' E. " " STf " " t* E. " K-12 ML1630 " " " E. " CF17 j " " " E. " CF41 ! " ! " » ! j jatkuu... j 63062 19

Taulukko jatkuu edelliseltä sivulta.

Tresta- Tresta- Tresta-

tiini A tiini B tiini C

Testiorganismi /ug/ml /ug/ml /jg/ml

Salmonella typhimurium IF012529 >100 >100 >100 " paratyphi B " " "

Citrobacter " " "

Shigella flexneri " " "

Klebsiella pneumoniae PCI602 " " "

Pseudomonas aeruginosa IF012689 " " " *» n " n n n n p2 n n n

Proteus vulgaris 0X19 ATCC6898 " " "

Bordetella bronchiseptica Aichi 202 M " "

Proteus rettgeri " " "

Serratia marcescens IF012648 " ” "

Staphylococcus aureus FDA209P " ” " " " MS3937 " " " MS 9 2 61 " " Smith

Bacillus subtilis PCI 219 " " "

Sareina lutea ATCC9341 " " "

Candida albicans Yul200 " " "

Mycobacterium smegmatis ATCC607 " " " 3) Vaikutus amylaasl-inhibiittorina

Trestatiinin A, B ja C ja niiden suolojen ja seosten esto-vaikutusta sianhaima-<^-amylaasiin on selvitetty seuraavassa. Esto-vaikutukset määritettiin edellä mainitun menetelmän mukaisesti.

Amylaasi-inhibiittori Inhibitiovaikutus (IU/g) trestatiini-kompleksi* 3,6 x 10^ A 7,1 x 107 " B 1,5 x 106 w C 4,9 x ΙΟ7 i " A.HC1 6,3 x 107 " B.HC1 1,3 x 106 " C.HC1 4,5 x 107 20 63062

Keitetyllä riisitärkkelyksellä aiheutetun veren liikasokerisuuden esto

Rotat Hiiret ! yv) | ED20 (m?/kg) Suun kautta i_______ jtrestatiini A 1,0 1,1 " B 7,7 3,2 C 3,0 | 0,7

Trestatiini-kompleksi tarkoittaa valmistetta, joka saatiin esimerkin 1, -II eristyksen 5) mukaisesti, ja se sisältää trestatii-nia A, trestatiinia B ia trestatiinia C.

XX ) ED2Q on annos, joka 20 minuutin kuluttua aiheuttaa veren liikasokerisuuden 20 %:sen alenemisen, jolloin veren liikasokerisuus on aikaansaatu antamalla suun kautta 2 g/kg kehon painoa keitettyä riisitärkkelystä.

Trestatiinit voivat inhiboida myös Bacillus subtiliksesta ja Aspergillus oryzaesta peräisin olevaa -amylaasia sekä Aspergillus nigeristä peräisin olevaa amylo-c^“l,4-(7^-1,6-glukosidaasia. Niillä ei kuitenkaan ole estovaikutusta bataateista peräisin olevaan β>— amylaasiin.

Tärkkelyksen, joka on päähiilihydraatti ihmisravinnossa, pilkkominen alkaa o(-amylaasin vaikutuksella. Tätä entsyymiä esiintyy syljessä ja haimaeritteessä. Haima-amylaasi vastaa pääasiallisesti tärkkelyksen täydellisestä hajoamisesta ruoansulatuskanavassa. Se katalysoi hiilihydraatti-polymeerin hajottamista, mistä lopulta syntyy maltoosia, joka puolestaan suoli-disakkaridaasien vaikutuksesta hydrolysoituu glukoosiksi. Tämän vuoksi havaitaan pian tärkkelyspitoisia elintarvikkeita sisältävän aterian jälkeen selvää veren liikasokerisuutta (hyperglykemia), joka johtaa insuliinin liikaeritykseen .

Sokeritautisilla tämä veren liikasokerisuus tunnetusti korostuu ja on hyvin epätoivottava. Ylipainoisilla ihmisillä veren liika-sokerisuuteen liittyy usein lisääntynyt insuliinin eritys, joka voi johtaa haiman/^-solujen tyhjentymiseen. Lisäksi insuliinin liikaeritys edistää lipogeneesiä, joka myötävaikuttaa veren liikarasvaisuu-teen.

Trestatiini A, B ja C sekä valmisteet, jotka sisältävät yhden tai useampia näistä trestatiineista, voivat alentaa aterian 63062 21 jälkwiarä hyperglykemiaa ja insuliinin liikaeritystä, kuten kokeista rotilla ja hiirillä tärkkelyskuormituksen (sivu 20 ja taulukko 1) tai ravinnon antamisen jälkeen (taulukko 2) käy ilmi.

Veren liikasokerisuuden aleneminen, joka on aiheutettu antamalla sakkaroosia suun kautta (taulukko 1) osoittaa c^-amylaasin inhibition ohella tiettyä sakkaraasin inhibitiota. Glukoosilla aiheutettuun hyperglykerniaan ei vaikutusta ole.

Keksinnön mukaiset trestatiinit ovat tämän vuoksi arvokkaita hoidettaessa sokeritautia, lihavuutta, liikarasvaisuutta ja vaiti-monkovetustautia.

Koska syljessä esiintyvä o(,-amylaasi voi myötävaikuttaa karieksen syntyyn hajoittamalla suussa tärkkelystä, voidaan tresta-tiineja käyttää myös karieksen muodostumisen ehkäisyyn tai vähentämiseen .

Trestatiineja voidaan lisäksi käyttää biokemiallisina reagensseina.

Taulukko 1

Trestatiinin vaikutus luonnon tärkkelyksellä tai sakkaroosilla suun kautta tapahtunutta kuormitusta seuraavaan hyperglyke-miaan (insuliinin liikaeritykseen).

(Plasmaglukoosi ja insuliini 20 minuuttia hiilihydraattien + trestatiinin jälkeen (1,6 g vehnätärkkelystä/kg tai 3,2 g sakkaroo-sia/kg). Tulokset on annettu prosenttimäärinä hiilihydraatilla kuormitetuista vertailuista (x (p 0,05) , ^ (p 0,01) , 3001 (p 0,001) Kolmogorov-Smirnov-testin mukaisesti).

I Tärkkelys- Sakkaroosi- kuormitus kuormitus

Annos/kg Glukoosi Insuliini Glukoosi

Trestatiini seosx5 6 600 IU 75 ^ 61 x 22 000 IU 60 XXX 59 x 66 000 IU - - 90 x 660 000 IU - - 73 3001

__2 200 000 IU__^__-__64 XXX

Trestatiini A 0,3 mg 68 ^ 66 x 1.0 mg 56 3004 42 ^ 3.0 mg 55 XXX 44 ^ (_30,0 mg___-__84 x

Taulukko jatkuu...

22 63062

Taulukko 1 jatkuu Tärkkelys Sakkaroosi- kuormitus kuormitus

Annos/kg Glukoosi Insuliini Glukoosi

Trestatiini C 0,3 mg 71 xxx 51 xx 1.0 mg 60 XXX 51 xx 3.0 mg 58 xxx 63 xx 30,0 mg - - 85x X ) vastaa vaiheen IV-jauhetta, joka saatiin esimerkin 1, -II eristyksen 4) mukaisesti ja joka sisältää trestatiinia A, trestatiinia B ja trestatiinia C.

Taulukko 2

Trestatiinin vaikutus hyperglykemiaan ja insuliinin liika-eritykseen rotilla ravinnon antamisen jälkeen.

Annos Plä&nan Insuliinia

Ravinto (mg/100 ml + S.E.) (uU/ml + 3.E.) 20 min. 60 min. 120 min. 20 min. 60 min. 120 min.

(vertailu)__275 - 9 228 - 11 191 - 6 59 - 10 44 - 10 30 -5 (vertailu) 205 - 9 190 - 14 184 ± 4 15 - 2 18-3 17 - 2 __XX__X___XX___ + 67 320 IU 197 - 2 173-5 175-3 22-8 14 ± 1 13-1 | XX XX X X XX X | + 224 400 IU 189 - 5 164 - 2 169 - 2 18-3 8-1 9 ± 1 | _ XX_XX_ X__1 X___XX____XX_ i 6 naarasrotan (85-95 g) ryhmää pidettiin ruuatta 24 tuntia ja niille annettiin ravintoaxmahaletkun läpi (2,2 g/6 ml/rotta - tres-tatiini-seostaxx^.

X ) ' normaalia laboratorioravintoa suspendoituna 0,07 %:iseen karrageeniin.

XX) .

vastaa vaiheen IV-^auhetta, }oka saatiin esimerkin 1, II eristyksen 4) mukaisesti ja joka sisältää trestatiinia A, B ja C. Kolmogorovin ja Smirnovin mukainen tilasto x) (p 0,05), xx) (p 0,01), xxx) (p 0,001).

63062 23

Keksinnön mukaisia trestatiinejä ja niiden suoloja voidaan käyttää lääkkeinä esimerkiksi farmaseuttisten valmisteiden muodossa, jotka sisältävät niitä sekoitettuna jonkin enteraaliseen käyttöön sopivan orgaanisen tai epäorgaanisen inertin kantajan, kuten esimerkiksi veden, gelatiinin, arabikumin, laktoosin, tärkkelyksen, magnesiums tearaatin, talkin, kasviöljyjen ja polyalkyleeniglykolien kanssa. Farmaseuttiset valmisteet voivat olla kiinteässä muodossa esimerkiksi tabletteina, rakeina tai kapseleina tai juoksevassa muodossa esimerkiksi liuoksina tai suspensioina.

Annosyksikkö voi sisältää 20-50 mg vaikutusainetta. Päivittäinen annos täyskasvuisella voi olla 10 ja 200 mg:n välillä ja on vaihdeltavissa yksilöllisiä vaatimuksia vastaavasti.

Trestatiinejä ja niiden suoloja voidaan käyttää myös lisäaineina ravintoaineissa ja dieettivalmisteissa, kuten sokerissa, hedelmämehussa, suklaassa, marmelaadissa, perunatuotteissa ja leiväs-. sä. Tarkoituksenmukaisesti tällaiset ravintoaineet tai valmisteet sisältävät keksinnön mukaisia trestatiinejä 0,1-1 paino-%. Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä edelleen.

Esimerkki 1 I. Fermentointi

Valmistettiin ravintoväliaine seuraavista aineosista: perunatärkkelys 20 g glukoosi 20 g " hiivauute 5 g natriumkloridi 2,5 g X ) mineraalisuolaliuos '1 1 ml deionoitu vesi 1 1 X ) 1 Liuos sisältää 50 g ZnSO^^^O ja 5 g CuSO^-S^O ja 5 g MnCl2* 4H2Q/I deionoitua vettä.

Edellä esitetyn liuoksen pH säädettiin lisäämällä 6N natrium-hydroksidia arvoon 6, sen jälkeen lisättiin 3,2 g kalsiumkarbonaat-tia ja 20 g soijapapujauhoa ja ravintoliuosta höyrysteriloitiin 20 minuuttia 120°C:ssa.

Streptomyces dimorphogenes sp.-lajia NR-320-OM7HB (FERM-P no. 3 664 itiöitä ympättiin agarvinopintaviljelmästä 10 reen 500 ml:n~ Erlenmeyer-pulloon, jotka kukin sisälsivät 110 ml steriloitua väliainetta. Pullot pantiin pyörivään tärytyskoneeseen, jonka kierros-luku oli 185 r/min,,ja tärytettiin 72 tuntia 27°C:ssa. Tämän jälkeen viljelmiä käytettiin 50 l:n fermentointiastian ymppäämiseen, joka 24 63062 sisälsi 25 1 samaa väliainetta. Fermentoimisjakson pituus oli noin 43 tuntia, jona aikana lämpötila pidettiin 27°C:ssa ja fermentoriin johdettiin suodatettua ilmaa nopeudella 25 1/min. Sekoitusnopeus oli 300 r/min. Erään tyypillisen trestatiini-käymisliemen (pH 6,9) aktii- 4 visuus oli 3,1 x 10 IU/ml.

II Eristäminen 1) Hiiliadsorptio:

Edellä kuvatusta trestatiini-fermentoinnista saadun käymis-liemen pH säädettiin 5N natriumhydroksidilla 7,0:aan, ja liemi suodatettiin. Suodokseen (19 1, 3,1 x 10^ IU/ml, 5,9 x 10® IU/yhteensä) sekoitettiin 380 g aktiivihiiltä ja seosta sekoitettiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa ja suodatettiin sitten. Hiilikakku pestiin 4 1: 11a vesijohtovettä ja suspendoitiin 10 l:aan kuumaa 50-%:ista vesipitoista asetonia. Suspension pH säädettiin 2:een lisäämällä 6N HC1, seosta pidettiin 20 minuuttia sekoittaen 60°C:ssa, jolloin seoksen pH pidettiin 2:ssa lisäämällä tarvittaessa 6N HCl. Seos suodatettiin sitten ja hiilikakkua käsiteltiin vielä 60 1:11a 50-%:ista vesipitoista asetonia samalla tavalla. Yhdistettyjen suodosten pH säädettiin 7:ään lisäämällä 6N NaOH, ja muodostunut pieni saostuma suoda-

O

tettiin erilleen. Suodos (5,6 x 10 IU/yhteensä) haihdutettiin alennetussa paineessa noin 3 l:ksi. Osa väkevöitettä lyofiloitiin ja saatiin raaka trestatiini-kompleksi tummanruskeana jauheena (3,2 x £ 10 IU/g), jota tässä nimitetään vaiheen I jauheeksi.

2) Dowex 50 adsorptio:

G

Vaiheesta 1 saatu väkevöite (n. 31, 5,6 x 10 IU/yhteensä johdettiin pylvääseen (80 x 7,5 cm), jossa oli Dowex 50 (H-muoto, 3,5 1, 20-50 mesh) nopeudella noin 10 ml/min. Pylväs pestiin 10,5 1:11a deionoitua vettä, eluoitiin IN ammoniakilla ja fraktioitiin.

3

Jakeet, jotka sisälsivät enemmän kuin 3 x 10 IU/ml trestatiinia, yhdistettiin, haihdutettiin alennetussa paineessa ja lyofiloitiin, 6 o jolloin saatiin 75,4 g ruskeata jauhetta (7,0 x 10 IU/g, 5,3 x 10 IU/-yhteensä), jota seuraavassa nimitetään vaiheen II jauheeksi.

3) Metanolikäsittely: 75,4 g vaiheen II jauhetta suspendoitiin 3,770 ml:aan meta-nolia ja sekoitettiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Liukenematon osa suodatettiin, pestiin vähäisellä metanolimäärällä, kuivattiin, ja saatiin 41,5 g ruskeata jauhetta (1,1 x 10 IU/g, 4,6 x 10 IU/yhteensä) , jota seuraavassa nimitetään vaiheen III jauheeksi.

63062 25 4) Dowex 1-kromatogr afia: 41.5 g valheen III jauhetta liuotettiin 100 ml:aan deionoitua vettä. Liuos johdettiin pylvääseen (87 x 5,5 cm), jossa oli Dowex 1 (asetaattimuoto, 2,050 ml, 200-400 mesh). Pylväs eluoitiin deponoidulla vedellä nopeudella 2,5 ml/min ja eluaatti fraktioitiin 17 ml:n jakeiksi. Aktiiviset jakeet 35-70 yhdistettiin, väkevöitiin, haihdutettiin alennetussa paineessa ja lyofiloitiin ja saatiin 22,6 g 7 8 keltaista jauhetta (1,8 x 10 IU/g, 4,1 x 10 IU/yhteensä) , jota jatkossa nimitetään vaiheen IV jauheeksi.

5) Dowex 50-kromatografia: 22.6 g vaiheen IV-jauhetta liuotettiin 50 ml:aan deionoitua vettä ja liuos johdettiin pylvääseen (85 x 6,6 cm), jossa oli Dowex 50 (ammoniummuoto, 2 900 ml, 200-400 mesh). Pylväs eluoitiin deio- noidulla vedellä (2,5 ml/min) ja eluaatti koottiin 17 ml:n jakeina.

Aktiiviset jakeet 65-89 yhdistettiin, väkevöitiin ja lyofiloitiin ja saatiin 10,6 g trestatiinikompleksia vaaleankeltaisena jauheena 7 8 (3,6 x 10 IU/g, 3,8 x 10 IU/yhteensä), jota seuraavassa nimitetään vaiheen V-jauheeksi.

III. Trestätiini-kompleksin erottaminen trestatiiniksi A, B ja C

10.6 g vaiheen V jauhetta liuotettiin 20 ml:aan tislattua vettä ja liuos johdettiin pylvääseen (78 x 4,8 cm), jossa oli Amber-lite CG 50 (sekakerros, joka koostui 3,5 osasta ammonium-muotoa ja 6,5 osasta H-muotoa, 1,420 ml, tyyppi I). Pylväs eluoitiin tislatulla vedellä 2,0 ml/min ja eluaatti koottiin 14 ml:n jakeina. Aktiiviset jakeet saatettiin suurpainenestekromatografiseen käsittelyyn seuraavissa olosuhteissa:

Pylväs: /( Bondapak/hiilihydraatti (1,4” x l1, Waters Associate)

Kantaja: CH3CN:H20 (63:37) Läpivirtausnopeus: 4,0 ml/minuutti

Injektiotilavuus: 2-10 /il

Mittaus: ultravioletti-absorptio 210 nm:ssä.

Vastaavat jakeet yhdistettiin, väkevöitiin ja lyofiloitiin. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: jjae n:o Jäännöksen paino i Aktiivisuus Pääkomponentti j (g) (IU/g) retentioaika) 71- 90 1,40 9,4 x 10® trestatiini B (3,4 min) ! 7 ' 131-165 ; 1,88 5,9 x 10 " A (5,5 min); 1311-380 ! 0,79 4,4 x 107 " C (8,8 min)! ;__i 1 ___’ 26 63062 TV Trestatiinin A puhdistus

Puhdas trestatiini A-valmiste valmistettiin kromatografoimal-la Amberlite CG 50:llä. 1,17 g kohdasta III saatua trestatiinia A liuotettiin 4 ml:aan tislattua vettä ja pantiin pylvääseen (133 x 1.7 cm), jossa oli Amberlite CG 50 (sekakerros, joka koostui 8 osasta H-muotoa ja 2 osasta ammonium-muotoa (300 ml, tyyppi II)). Pylväs eluoitiin tislatulla vedellä ja eluaatti koottiin 7 ml:n jakeina, jolloin yksittäiset jakeet tutkittiin suurpainenestekromatografises-ti, kuten edellä kuvattiin. Jakeet 245-465 sisälsivät trestatiinia A ja ne yhdistettiin, väkevöitiin ja lyofiloitiin ja ne antoivat 649 mg trestatiinia A valkoisena jauheena, jolla oli edellä esitetyt ominaisuudet.

V Trestatiinin B puhdistus

Puhdas trestatiini B-valmiste saatiin kromatografoimalla uudestaan Amberlite CG 50:llä. 450 mg kohdasta III saatua trestatiinia B liuotettiin 2 ml:aan tislattua vettä ja pantiin pylvääseen (122 x 1,7 cm), jossa oli Amberlite CG 50 (sekakerros, joka koostui 8 osasta H-muotoa ja 2 osasta ammonium-muotoa, 280 ml, tyyppi II). Pylväs eluoitiin tislatulla vedellä ja eluaatti koottiin 3 ml:n jakeina ja tutkittiin suurpainenestekromatografisesti, kuten edellä kuvattiin. Jakeet 121-129 sisälsivät trestatiinia B ja ne yhdistettiin, väkevöitiin ja lyofiloitiin. Saatiin 170 mg trestatiinia B valkoisena jauheena, jolla oli edellä esitetyt ominaisuudet.

VI Trestatiinin C puhdistus

Puhdas trestatiini C-valmiste saatiin uudelleenkromatografoi-malla Amberlite CG 50:llä. 720 mg kohdasta III saatua trestatiinia C liuotettiin 3 ml:aan tislattua vettä ja pantiin pylvääseen (133 x 1.7 cm), jossa oli Amberlite CG 50 (sekakerros, joka koostui 6,2 osasta H-muotoa ja 3,8 osasta ammonium-muotoa, 300 ml, tyyppi II). Pylväs eluoitiin tislatulla vedellä ja eluaatti koottiin 6 ml:n jakeina ja tutkittiin suurpainenestekromatografisesti, kuten edellä kuvattiin. Jakeet 42-59 sisälsivät trestatiinia C ja ne yhdistettiin, väkevöitiin ja lyofiloitiin. Saatiin 515 mg trestatiinia C valkoisena jauheena, jolla oli edellä kuvatut ominaisuudet.

Esimerkki 2

Trestatiini A-dihydrokloridin valmistus 95 mg trestatiinia A liuotettiin 1 ml:aan tislattua vettä ja pH säädettiin arvoon 2,0 lisäämällä 0,1N kloorivetyhappoa. Liuos haihdutettiin alennetussa paineessa noin 0,5 ml:n tilavuuteen. Sen jälkeen lisättiin 6 ml etanolia ja muodostunut valkoinen sakka 63062 27 koottiin linkoamalla, pestiin 2 ml:11a etanolia ja kuivattiin alennetussa paineessa. Saatiin 97 mg trestatiini A-dihydrokloridia valkoisena jauheena.

Esimerkki 3

Trestatiini B-monohydrokloridin valmistus 92 mg esimerkin 1 mukaisesti saatua trestatiinia B liuotettiin 1 ml:aan tislattua vettä ja liuoksen pH säädettiin 0,1N kloori-vetyhapolla 2,0:aan. Liuos haihdutettiin alennetussa paineessa noin 0,5 ml:ksi ja lisättiin 7 ml etanolia. Sakka lingottiin erilleen, pestiin 2 ml :11a etanolia ja kuivattiin ja saatiin 91 mg trestatiini-B-monohydrokloridia valkoisena jauheena.

Esimerkki 4

Trestatiini C-trihydrokloridin valmistus 90 mg esimerkin 1 mukaisesti valmistettua trestatiinia C liuotettiin 1 ml:aan tislattua vettä ja liuoksen pH säädettiin 0,1N kloorivetyhapolla 2,0:aan. Liuos haihdutettiin 0,5 ml:ksi, lisättiin 6 ml etanolia, lingottiin, sakka pestiin 2 ml:11a etanolia ja kuivattiin. Saatiin 91 mg trestatiini C-trihydrokloridia valkoisena jauheena .

Esimerkki 5

Analogisesti esimerkissä 1 kuvatun menetelmän kanssa saatiin käyttäen Streptomyces dimorphogenes sp. NR-320-OM7HBS (FERM-P n:o 3 665) trestatiinia A, trestatiinia B ja trestatiinia C.

Kuvat 1, 2 ja 3 esittävät trestatiinin A, trestatiinin B ja ja trestatiinin C infrapuna-absorptiospektriä.

Kuvat 4, 5 ja 6 esittävät trestatiinin A, trestatiinin B ja trestatiinin C ^H NMR-kirjoa (ydinmagneettista resonanssispektriä DjC^ssa 100 MHz:ssä.

Kuvio 7 esittää trestatiinin A, B ja C suurpainenestekroma-togrammia.

Claims (1)

1. 28 Patenttivaatimus 6 30 6 2 Menetelmä kaavan I mukaisten farmaseuttisesti aktiivisten aminosokerijohdannaisten trestatiini A, trestatiini B ja trestatii-ni C sekä niiden suolojen ja seosten valmistamiseksi, CH2OH H CH3 CH2CK CH2CH ^ H OH. 8 Ϊ/η-0^ Vh 'f T ^GB H/ „ |\OH Η/j n RoHH/I n IVgjM r> INf» H OH H H OH H OH _ n li OH HÖH ^ jossa kaavassa n on 1, 2 tai 3, jolloin trestatiini A:11a n = 2, trestatiini B:llä n = 1 ja trestatiini Ctllä n = 3, ja jotka yhteisenä rakennetunnusmerkkinä sisältävät trehaloosia ja joilla on seu-raavat ominaisuudet: a) alkuaine-analyysi: C% H % N % 0% trestatiini A: 46,72 7,13 2,08 43,28 " B: 46,27 7,04 1,65 44,69 " C? 47,55 7,15 2,29 42,66 b) molekyylipaino (osmometria): trestatiini A: 1 470 " B: 975 " C: 1 890 c) sulamispiste: trestatiini A: 221-232°C (hajoaa) " B: 209-219°C (" ) " C: 230-237°C (" ) d) ominaiskiertyminen: trestatiini A: - +177° (c = 1,0, H20) " B: = +187° (c = 1,0, H20) " C: = +169,5° (c = 1,0, H20) e) ultravioletti-absorptiospektri (vedessä): trestatiini A, trestatiini B ja trestatiini C antavat pääte-absorption: f) infrapuna-absorptiospektri. (kBr:ssa) : ks. kuva trestatiini A: 1 " B: 2 " C: 3 63062 29 g) NMR-kirjo (ydinmagneettinen resonanssispektri) (D20:ssa 100 MHz:ssa): ks. kuva trestatiini A: 4 " B: 5 " C: 6 h) liukoisuus liuottimiin: trestatiini A, trestatiini B ja trestatiini C sekä niiden hydrokloridit ovat helppoliukoisia veteen: liukoisia dimetyylisul-foksidiin: heikosti liukoisia etanoliin ja asetoniin: ja liukenemattomia etyyliasetaattiin ja kloroformiin: i) värireaktio: trestatiini A, trestatiini B ja trestatiini C antavat positiivisen permanganaatti- ja antroni-reaktion ja negatiivisen Sakaguchi-reaktion, tunnettu siitä, että viljellään trestatiinia tuottavaa mikro-organismia Streptomyces dimorphogenes NR-320-OM7HB (ATCC 31 484) tai NR-320-OM7HBS (ATCC 31 485) aerobisissa olosuhteissa vesipitoisessa väliaineessa, erotetaan tresta-tiinit käymisliemestä sinänsä tunnetulla tavalla, esimerkiksi sentrifugoimalla tai suodattamalla,sekä adsorptio- tai saostusmene-telmillä tai kromatografiamenetelmillä, ja haluttaessa erotetaan trestatiini A, trestatiini B ja trestatiini C toisistaan, ja haluttaessa eristetään ne suoloinaan. 30 Patentkrav: 6 30 6 2 Förfarande för framställning av de farmaceutiskt aktiva amino-sockerderivaten trestatin A, trestatin B och trestatin C med formeln I samt deras salter och blandningar, CTjOH H C«3 CH2OH CH2CH CH-OH H OH «/T0^ «/Γ0')} νΙΓΝρ ώ^/ljJ^/LaJVLyLa __h Oh h höh höh _Jn höh höh h i vilken formeln n är 1, 2 eller 3, varvid n = 2 i trestatin A, n = 1 i trestatin B och n = 3 i trestatin C. och vilka som gemensamt strukturkännetecken innehäller tre-halos och uppvisar följande egenskaper: a) elementär analys: C% H % N % 0% trestatin A: 46,72 7,13 2,08 43,28 trestatin B: 46,27 7,04 1,65 44,69 trestatin C: 47,55 7,15 2,29 42,66 b) molekylvikt (osmometrl): trestatin A: 1470 trestatin B: 975 trestatin C: 1890 c) smältpunkt: trestatin A: 221-232°C (sönderfaller) trestatin B: 209-219°C (sönderfaller) trestatin C: 230-237°C (sönderfaller) d) specifik vridning: trestatin A: M ^4 - +177° (c = 1,0 , HjO) trestatin B: M 26 . +187° (<J . 1(0f Hj0) trestatin C: r.-j 23 co , , _ „ D =+169,5 (c = 1,0, H20) e) ultraviolett-absorptionsspektrum ( i vatten) : trestatin A, trestatin B och trestatin C ger ändabsorption, f) infraröd-absorptionsspektrum ( iKBr):