PT1157696E - Tratamento da acidose ruminal com inibidores da alfa-amilase - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "TRATAMENTO DA ACIDOSE RUMINAL COM INIBIDORES DA ALFA- AMILASE" A invenção aqui descrita está relacionada com o tratamento da acidose ruminai, sobretudo acidose crónica em ruminantes, e afecções associadas. A acidose ruminai é uma doença metabólica bem documentada dos ruminantes, causada pelo consumo excessivo de hidratos de carbono de fermentação rápida, sendo conhecidos há muitos anos os problemas com ela relacionados: veja-se Nordlund et al, 1995, Nagaraja et al. 1998, Owens et al. 1998 e Dirksen 1969, A acidose pode ser dividida em duas formas: aguda e crónica. Consideramos que a acidose aguda é aquela em que o pH do rúmen se situa entre 4,0 e 5,0, com lactato ruminai elevado, e que a acidose crónica é aquela cujo pH se situa entre 5,0 e 5,5 com concentrações normais de lactato até 5 mM. A bibliografia menciona também a acidose subaguda, cujos valores ruminais de pH são inferiores a 5,0, mas que nalguns casos está associada a concentrações elevadas de lactato e noutros não. Consideramos que o primeiro caso pertence à categoria de acidose aguda ligeira, e o último à categoria de acidose crónica. A principal causa de acidose é o consumo de uma dieta com um teor elevado em hidratos de carbono de fermentação ? rápida e/ου pobre em forragem carnuda. A acidose crónica pode ocorrer quando os animais ingerem grandes quantidades de dietas de fermentação .rápida e em qualquer fase da produção, ou mesmo durante o tempo em que se encontram sob dietas ricas em concentrado» A acidose aguda pode surgir quando há um grande aumento da quantidade de concentrado na dieta, por exemplo, após a pariçâo ou aquando da transferência para a zona de engorda. Contudo, pode também ocorrer após uma perturbação dos padrões normais de alimentação, como a apresentação acidental de ração em excesso ou um período de jejum seguido pela ingestão excessiva de alimento. A redução do pH ruminai pode ainda ser provocada por uma diminuição da proporção de fibra bruta na dieta. A etiologia da acidose baseia-se assim na ingestão absoluta de quantidades excessivas de hidratos de carbono e/ou numa proporção desfavorável de alimentos básicos na ração. 0 tipo de cereal (o milho-grão húmido induz mais a acidose do que o milho ou sorgo laminados a seco) e o tipo de processamento (o cereal floculado a vapor é particularmente digestível), assim como o tipo e a quantidade de forragem carnuda, Os cereais como a cevada, o trigo e o milho-grão húmido, que possuem velocidades elevadas de digestão ruminai de amido, são os que geralmente causam mais problemas. Por exemplo, a cevada, a farinha de trigo, as aveias e o milho floculado a vapor exibem uma disponibilidade ruminai de amido superior a 85%. As orientações para as dietas de gado leiteiro que produzem mais de 35-40 kg de leite sugerem que 25-30% da dieta consista em fibra detergente neutra, da qual 75% seria oriunda de forragem, 35-40% de hidratos de carbono não estruturais e 30-40% de amido (Nocek 1997). 3 A acidose aguda é caracterizada por um decréscimo precipitado do pH ruminai, com uma concentração ruminai elevada de ácido láctico (50 — 100 mM) . A população microbiana ruminai sofre uma mudança significativa, com um aumento das bactérias gram-positivas produtoras de ácido láctico, nomeadamente Streptococcus bovis e Lactobacillus spp. A diminuição do pH leva à morte das bactérias gram-negativas e à redução ou desaparecimento completo de protozoários ciliados. A mudança do padrão fermentativo para a produção de lactato está associada ao decréscimo da produção de ácidos gordos voláteis (AGV). As alterações sistémicas incluem a diminuição do pH do sangue e do bicarbonato e o aumento também no sangue de D-lactato e L-lactato. A acidose aguda pode afectar significativamente as funções fisiológicas, como a estase ruminai e a desidratação, podendo levar a coma e morte. Mesmo que o animal sobreviva, pode nunca recuperar totalmente. A acidose crónica tem sinais clínicos muito mais subtis. Os animais permanecem alertas e consomem ração, mas podem parecer «adoentados». A quebra do pH ruminai para menos de 5,5 deve-se a um aumento geral da fermentação no rúmen, provocando uma maior produção de AGV. O aumento destes no rúmen está muitíssimo correlacionado com a sua elevação no sangue, mas o pH deste não se altera de forma significativa. Os protozoários ciliados ruminais totais decrescem com a diminuição do pH, ainda que a velocidade varie com a espécie, mas não desaparecem totalmente. A contagem de bactérias viáveis totais aumenta com o tempo, nomeadamente a das bactérias amilolíticas. No entanto, o 4 enorme aumento de S, Bovis e de Lactobacillus spp. observado na acidose aguda não ocorre. Apesar de a velocidade de produção de lactato aumentar transitoriamente após o consumo de alimentos, é utilizado imediatamente na produção de AGV e não se acumula no rúmen. Especificamente, os sintomas de acidose crónica são o decréscimo do pH ruminai para 5,0 - 5,5 sem acumulação significativa de acido láctico.

Resumo dos sintomas de acidose aguda e crónica

Normal Acidose crónica Acidose aguda pH do rúmen >6,0 5,5 - 5,0 <5,0 AGV -100 mM Até 200 mM Reduzida Concentração de lactato Até 5 mM Até 5 mM >50 mM Glicose Desprezável Desprezável >10 mM Protozoários Muito reduzidos Mortos Bactérias Elevadas S. bovis e Lactobacillus sp. elevados A acidose ruminai está associada a muitas afecções secundárias que podem ter um impacto significativo no desempenho animal do gado, ou seja, a redução da conversão das rações em carne e/ou leite. A qualidade do leite pode também sofrer com a acidose. Com valores de pH inferiores a 5,5, ocorrem lesões irreversíveis do epitélio ruminai, provocando hiperqueratose, agregação papilar e rumenite do 5 epitélio ruminai. 0 apetite e o desempenho dos animais diminuem devido a uma insuficiente absorção de nutrientes, resultando num menor aumento do peso do gado de corte e numa diminuição da produção e da qualidade do leite em gado leiteiro. Outros efeitos são a laminite, diarreia intermitente, baixo apetite e ingestão cíclica de alimentos, uma taxa de refugagem elevada na manada devido a problemas de saúde mais ou menos indefinidos, más condições do organismo e abcessos sem causas óbvias. A laminite crónica é um dos sinais clínicos mais consistentes, com sulcos na parede dorsal do casco, ulceração da sola, lesões da linha branca, hemorragias da sola e cascos malformados. Em média, os criadores indicam que 25% dos animais das manadas leiteiras do Reino Unido são coxos, é então provável que a verdadeira incidência de laminite crónica seja mais elevada, pois nem sempre causa coxear detectável. Sabe-se que os abcessos do fígado estão associados a acidose e, na maioria das áreas de engorda, a sua incidência é, em média de 12% a 32% do gado abatido e constitui uma causa importante de condenação do fígado. Os abcessos hepáticos não são necessariamente diagnosticados em vida dos animais, mas têm um efeito nocivo no seu desempenho e saúde geral. Além disso, os animais podem exibir depressão da função imunitária, uma elevada incidência de doenças respiratórias e taxas de fertilidade reduzidas. A maioria das manadas leiteiras com problemas de acidose crónica possui uma taxa anual de renovação da manada acima de 45% ou uma taxa anual de refugagem superior a 31%. As razões para a refugagem são normalmente mais ou menos indefinidas. (Nocek 1997, Nordlund 1995, Nagaraja 6 1998, Stock e Britten 1998, AnimalPharm 1999, Kay 1969, McManus 1977),

Outro problema que se pode observar em vacas leiteiras de produção elevada alimentadas com uma dieta rica em hidratos de carbono e/ou pobre em forragem carnuda é a «síndrome de baixo teor em gordura do leite». Quando o pH ruminai decresce, o padrão de fermentação desvia-se no sentido da produção de mais propionato e menos acetato e butirato. Visto que cerca de metade da gordura do leite é produzida a partir de acetato e butirato, isto resulta numa quebra do teor em gordura do leite. {AT Chamberlain & JM Wilkinson, Feeding the Dairy Cow, Chalcombe Publications, UK, 1996).

Estima-se que a acidose ruminai e os problemas a ela relacionados custem à indústria pecuária mais de mil milhões de dólares (perto de 800 mil milhões de euros) por ano devido a perda de desempenho.

Os tratamentos recomendados para a acidose aguda incluem a administração de uma mistura de bicarbonato de sódio, formaldeido, óxido de magnésio e carvão para matar rapidamente as bactérias em divisão. (NebGuide G91-1047-A). São amplamente utilizados tampões (Horn 1979, Kennelly 1999), mas estes nem sempre são eficazes o suficiente para satisfazer a indústria pecuária. O gosto da maioria dos tampões é desagradável e requer uma gestão cuidadosa para evitar a redução do consumo de alimentos. Os antibióticos ionóforos, como a monensina, o lasalócido e a salinomicina são geralmente eficazes contra bactérias gram-positivas, como as principais bactérias ruminais que produzem lactato, 7 S. bovis e Lactobacíllus spp. (Burrin e Britton 1986, Coe 1999, Nagaraja 1985). Em consequência, são eficazes na prevenção de acídose aguda quando se transfere o gado para dietas ricas em concentrado, seja quando chega à zona de engorda, seja após a parição. Além disso actuam reduzindo a produção total de AGV no gado com acidose crónica, estabilizando assim o pH ruminai. No entanto, os ionóforos diminuem também a ingestão de alimentos. Demonstrou-se que outras classes de antibióticos também previnem ou melhoram a acidose aguda, como virginiamicina em ovinos (Thorniley et al. 1998) e o antibiótico peptídico contendo enxofre tiopeptina, que é particularmente eficaz contra S. bovis (Armstrong 1984). No entanto, a utilização de antibióticos como aditivos em rações já não é considerada uma ferramenta de controlo adequada (para uma recensão sobre o tema, veja-se The use of drugs in food animais: benefits and risks, 1999). Foi demonstrado o controlo probiótico com várias espécies, como Selenomonas ruminantium subsp. lactolytica de estirpe JDB201 (Wiryawan et al. 1995), a utilizadora de lactato Megasphaera elsedenii (Das, Kung e Hession 1995} e, em termos mais gerais, a patente WO 96/17525. Esta última reivindica também enzimas que aumentam a degradação de amido ou fibra. Outros tratamentos propostos, embora não comercializados, incluem o uso de bacteriocinas (Teather e Forster 1998) e a manipulação da fermentação ruminai com ácidos orgânicos, economicamente inviável (Martin, 1998, Martin et ai. 1999).

Armstrong, D.G. Antibiotics as feed additives for ruminant livestock in ' Antimicrobials and Agriculture The proceedings of the 4th International symposium on 8 antibiotics in agriculture: benefíts and malefitsr 1984 ed. Woodbine M. Buttewvorths ISBN 0 408 11155 0 Das, N.K. Ruminant feed additive Pedido de patente dos EUA 76-748210 761207

Kennelly, J. J., Robinson, B. e Khorasani, G. R. Influence of carbohydrate source and buffer on rumen fermentation characteristics, mílk yíeld, and milk composition in early-lactation Holstein cows Journal of Dairy Science 1999 82: 2486-2496

Kung, L, e Hession, A.O. Preventing in vitro lactate accumulation in ruminai fermentations by inoculation with Megasphaera elsdenii Journal of Animal Science 1995 73: 250-256

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Martin, S.A., Streeter, M.N., Nisbet, D.J., Hill, G.M. e Williams, S,E. Effects of DL-Malate on ruminai metabolism and performance of cattle fed a high-concentrate diet Journal of Animal Science 1999 77: 1008-1015 Teather, R. M. e Forster, R. J. Manipulating the rumen microflora with bacteriocins to improve ruminant production Canadian Journal of Animal Science 1998 78 (Suplemento): 57-69.

The use of drugs in food animais: benefits and risks CABI publishing 1999 ISBN 0 85199371 0

Thomiley, G.R., Rowe, J.B., Cowcher, P.C., Boyce, M.D. A single drench of virginiamycin to increase safety of feeding grain to sheep. Australian Journal of Agricultural Research 1998 49(5): 899-906 9

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Kay, M., Fell, B.F. e Boyne, R. The relationship between the acidity of the rumen contents and rumenitis in calves fed on barley. Research in Veterinary Science 1969 10 181 -187

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Outras referências: 1. Lameness costs UK dairy herds, says NMR. AnimalPharm 417, 26 de Março de 1999, p. 6 2. Burring, D.G. e Britton, R,A, Response to monensin in cattle during subacute acidosis Journal of Animal Science 1986 63:888-893 3. Coe, M,L„, Nagaraja, T.G,, Sun, Y.D., Wallace, N. Towne, E.G., Kemp, K.E. e Hutcheson, J.P. Effect of Virginiamycin on ruminai fermentation in cattle during adaptation to a high concentrate diet and during an induced acidosis Journal of Animal Science 1999 77:2259-2268 4. Dirksen, G. Acidosis in Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant: Proceedings of the Third International Symposium, Cambridge, England: Agosto de 1969 Ed. A.T. Phillipson, Oriel Press IBSN 0 85362 053 9 5. Nagaraja, T.G. Galyean, M.L. e Cole, N.A. Nutrition and Disease Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice 1998 14 (2) 257-277 6. Nagaraja, T.G., Avery, T.B., Galitzer, S.J. e Harmon, D,L. Effect of ionophore antibiotics on experimentally 10 induced lactic acidosis in cattle. American Journal of Veterínary Research 1985 46 (1 2) 2444-2452 1, Nocek, J.E. Bovine acidosis: Implications on laminitis. Journal of Dairy Science 1997 80:1005-1028 8. Nordlund, K. V. Garrett, E. F. Oetzel, G. R Herd-based rumenocentesis: a clinicai approach to the diagnosis of subacute rumen acidosis. Compendiam on Continuing Education for the Practicing Veterinarian. 1995. 17: 8, Suplemento, S48-S56 9. Owens, F„N. Secrist, D.S. Hill, W.J. e Gill D.R. Acidosis in cattle: a review. Journal of Animal Science 1998 76:275-286 10. University of Nebraska, Lincoln NebGuide G91-1047-A http:/www.inar.uni.edu/pubs/AnimalDísease/gl04 7.htm O documento DE 2658562 expõe derivados de amino-açúcares contendo entre 2 a 18 unidades de açúcar e a patente dos EUA n° 4273765 expõe derivados de amino-açúcares contendo trehalose como agentes inibidores da amilase. Há uma necessidade generalizada de um tratamento eficaz e seguro da acidose ruminai; sobretudo em acidose ruminai crónica e/ou aguda; sobretudo em ruminantes, como gado bovino e ovino; sobretudo em ruminantes em lactação, como gado bovino e ovino; de preferência, que possa ser de fácil administração, por exemplo, na ração ou na bebida; de preferência, que não seja antimicrobiano; de preferência, que possua um sabor agradável para o animal; η de preferência, que apenas seja activo no rúmen e não possua efeitos sistémicos; de preferência, que não apresente resíduos na carne e/ou leite e, de preferência, que não requeira um período de confinamento; de preferência, que não seja tóxico para o animal e para quem lida com a ração (fabricantes e criadores); e/ou que, de preferência, possa estabilizar a fermentação no rúmen, prevenindo assim reduções excessivas do pH e mantendo as proporções de AGV de forma a que a produção de gordura do leite não seja negativamente afectada.

Descobrimos que certos inibidores da α-amilase e/ou a-glucosidase bacterianas podem ser utilizados para reduzir o pH ruminai de forma eficaz, devendo ser úteis no tratamento da acidose crónica e aguda e afecções relacionadas.

Por «inibidor» entende-se aqui um agente individual e misturas de agentes com actividade inibitória, incluindo os produtos de caldos de fermentação abaixo mencionados.

Um aspecto da invenção é o uso de um inibidor eficaz da a-amilase e/ou α-glucosidase, nomeadamente a acarbose ou a trestatina A, B ou C, no fabrico de um composto para o tratamento da acidose ruminai De particular interesse são os inibidores das amilases/glucosidases presentes nas bactérias ruminais, como as mencionadas de ora em diante.

Um outro aspecto da invenção é uma formulação adequada ao tratamento da acidose em animais que contenha um inibidor 12 da α-amilase e/ou α-glucosidase das bactérias ruminais, nomeadamente a acarbose ou a trestatina Ά, B ou C.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com um processo para melhorar a qualidade e/ou a quantidade do leite de ruminantes que intensifique a paliação curativa e tratamento profiláctico de ruminantes com uma quantidade eficaz de um inibidor da α-amilase e/ou oí-glucosidase de bactérias ruminais.

Os outros aspectos da invenção são definidos nas reivindicações.

De preferência, o inibidor da α-amilase e/ou a-glucosidase bacterianas possui uma CI50 igual ou inferior a 10"3M, de maior preferência igual ou inferior a ICT^M e, ainda de maior preferência, igual ou inferior 10“5M nas pesquisas da amílase e da glucosidase aqui descritas.

De preferência, o inibidor da α-amilase e/ou a-glucosidase possui baixa actividade antimicrobiana, mais preferencialmente com uma CIM superior a 50pg/ml nos testes aqui descritos, e ainda mais preferencialmente superior a 100 pg/ml.

Os inibidores da α-amilase e/ou α-glucosidase são as substâncias expostas abaixo e análogos simples das mesmas, incluindo as indicadas nos Exemplos abaixo, que se verifica serem eficazes nas pesquisas à frente indicadas: 13 Amilostattnas c anâtqgos semlsintólicos

definidos como

Compostos expostos genérica e espedficamenie na Patenle da GB 1.482,543; Patente dos EUAn" 4.175.123 e no artigo Agric. Bíol. Criem., 48(7}, 1941-1945. 1982 eacarbose e homólogos superiores»*

Trestatina AN = 2 Treotolina D N = 1 Treslalina C N » 3

Treslafinas.ouseja, as descritas em J. Anlibíotics 36: 1157-1165. (1983) J. Antibiolics 36; 1166-1175, (19B3)E compostos descritos em J. Antibiolics 37(2); 182-186. (1984)

Todas as substâncias aqui referidas podem ser marcadas, por exemplo, com isótopos de certos átomos, como é uso fazer-se no ramo. Estas substâncias marcadas com isótopos estão disponíveis por métodos bem conhecidos deste domínio.

Os inibidores preferidos incluem a acarbose e homólogos superiores da mesma, Trestatina A, Trestatina C.

Um grupo preferido de inibidores é formado por um composto único substancialmente puro ou um produto de fermentação ou de biotransformaçâo parcialmente purificado, inibidores incluindo acarbose e homólogos superiores da mesma, Trestatina A, Trestatina C.

Especialmente preferidos são a acarbose e a Trestatina C. 14

Alguns dos inibidores podem ser produzidos por biotransformação/fermentação, tal como os métodos indicados mais abaixo.

Produtos de biotransformação / fermentação

As culturas de Streptomyces conglobatus ATCC31005, Streptomyces coelicolor subsp. flavus ATCC19894, Streptomyces kursannovii ATCC11912 e Streptomyces lienomycini ATCC43687 foram obtidas da American Type Culture Collection (a ATCC localiza-se em 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209, EUA). As culturas de Streptomyces sp. KC672 isoladas de um sedimento marinho da Baía Suruga, no Japão e Streptomyces sp. CL45763 foram depositadas, de acordo com o Tratado de Budapeste, nas National Collections of Industrial and Marine Bactéria Ltd., tendo-lhes sido atribuídos os números de acesso NCIMB41058 e NCIMB41057 respectivamente. (As NCIMB localizam-se em 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Reino Unido AB24 3RY.)- O depositário foi a empresa Pfizer Central Research, Pfizer Limited, Ramsgate Road, Sandwich, Kent, CT13 9NJ, Reino Unido. A Pfizer Ltd. é uma sociedade subsidiária controlada a 100% pela empresa Pfizer Inc. 235 East 42nd Street, Nova Iorque, Nova Iorque, EUA.

Além destas, podem ser utilizadas estirpes mutantes de Streptomyces conglobatus ATCC.31005, Streptomyces coelicolor subsp. flavus ATCC19894, Streptomyces kursannovii ATCC11912, Streptomyces lienomycini ATCC43687, Streptomyces sp. KC672 e Streptomyces sp. CL45763. Estas estirpes mutantes podem ser obtidas espontaneamente ou pela 5 aplicação de técnicas conhecidas, como a exposição a radiação ionizante, luz ultravioleta e/ou mutagéneos químicos, como N-metil-N-nitrosouretano, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, etilmetilsulfato, etc, As formas geneticamente transformadas e recombinantes incluem mutantes e variantes genéticas produzidas por técnicas de engenharia genética, incluindo, por exemplo, recombinação, transformação, transdução, fusão protoplástica, etc. A fermentação das culturas de Streptomyces conglobatus ATCC31005, Streptomyces coelicolor subsp. flavus ATCC19894, Streptomyces kursannovii ATCC11912, Streptomyces lienomycini ATCC43687, Streptomyces sp. KC672 e Streptomyces sp. CL45763 pode ser realizada segundo os procedimentos habituais conhecidos no ramo para bactérias filamentosas do género Streptomyces. Por exemplo, a cultura do organismo pode realizar-se em meio sólido adequado ou meio líquido aquoso, em condições aeróbias, entre 24°C e 35°C, com fontes apropriadas de carbono, azoto e oligoelementos como ferro, zinco ou manganésio, durante 2 a 30 dias. São utilizados os seguintes meios de fermentação.

Meio de Produção AP5-H

Amido de Milho (Hidex) 80 g

Extracto de levedura (Oxoid) 5 g

KaHPO, 1 g

MgSCh. 7H20 1 g Ácido Glutâmico 1 g

FeS04, 7H20 0,01 g ΗΟΟΝ 0 ‘L Hd 3¾ T X epezjiexeuxmsap enõ-y δ 02 {euiÉjs) SdOW oeduiej, β χο'ο ΟεΗΖ. "'ΌΞθϋ β ς'ο T3M δ Ç'0 ΟεΗΧ '‘OSdW δ I ^ΟάΗεΜ β g εΟΝ5Ν δ 01 ( Áosnjuj,} eÇos ap spuxxen β οοι asoonx^ & 02 χθΛηχοε ορτωγ opeoxjxpoui ε-3Ν¥ οτθη

Ο'ί Hd apy HO^N I I epezixexauTuisap en5\f I\J O οχοχεο ap oqeuoqxeo β 5'2 (emôjs) οβτχχ ap uauirrag

5 ς'ζ (WiPToxO) SFjnpaAeH ap opoexqxH 5 ς'ζ (opoze ap a^uoj - odjxq) auoqxseo (oedep d 01 ;WIX3PTH) opxoe xod opesfxoxpiq ορτιπν β ς 0Ξθοτχ3 {eóxoj 2/i) 003W opsw 0'L Hd apv HOeK I I Eiiauioi ep enBy β L £od^d & 100'0 O£H2'b0SUW β ΙΟΟ'Ο 0EH2‘^0SU2 17

Todos os meios descritos podem ser suplementados com outros amidos, sobretudo amidos hidrolisados ou amidos solúveis, ou ainda hidratos de carbono como D-xilose, D-ribose, D-maltose, D-maltotriose, D-sedobeptulose, D-trehalose, D-glicose e ou fontes de azoto, como asparagina, aspartato e glutamina,

Exemplo 1 ~ Preparação de um caldo de fermentação com actividade inibitória da a-amilase no rúmen a partir de Streptomyces conglobatus ATCC31005.

Foram retirados com uma ansa esporos de Streptomyces conglobatus ATCC31005, em agar inclinado ATCC172 com H da força, e inoculados em dois frascos Erlenmeyer de 300 ml, contendo cada um 50 ml de meio MECO com H da força. Em seguida, foram incubados durante 7 dias a 28°C e 200 rpm num aparelho Infors Multitron Shaker com deslocação de 2,5 cm {1 polegada). Neste ponto, o caldo foi centrifugado a 3500 rpm e o sobrenadante removido do micélio. Foi determinada a actividade inibitória da a-amilase que o sobrenadante possui, a qual é resumida na tabela abaixo.

Diluição do sobrenadante 1:1000 1:10000 1:100000 para o ensaio % Inibição no frasco 1 91 89 65 % Inibição no frasco 2 86 90 58

Exemplo 2 - Preparação de um caldo de fermentação com actividade inibitória da ot-amiiase no rúmen a partir de Streptomyces sp. CL45763 18

Foram retirados com uma ansa esporos de Streptomyces sp. CL4S763, em agar inclinado de Bacto ISP-3, e inoculados em quatro frascos Erlenmeyer de 300 ml, contendo cada um 50 ml de meio AP5-H, Em seguida, foram incubados durante 9 dias a 2 8 °C e 200 rpm num aparelho Infors Multítron Shaker com deslocação de 2,5 cm (1 polegada). Neste ponto, os caldos foram combinados, centrifugados a 3500 rpm e o sobrenadante removido do micêlio. Foi então determinada a actividade inibitória da a-amilase que o sobrenadante possui, a qual é resumida na tabela abaixo.

Diluição do sobrenadante para o ensaio 1:1000 1:10000 1:100000 % Inibição 79 77 53

Exemplo 3 - Preparação de um caldo de fermentação com actividade inibitória da α-amilase do líquido do rúmen a partir de Streptomyces coelícolor subsp . flavus ATCC19894.

Foram retirados com uma ansa esporos de Streptomyces coelícolor subsp. flavus ATCC19894, em agar inclinado ATCC172 com M, da força, e inoculados em dez frascos Erlenmeyer de 300 ml, contendo cada um 50 ml de meio AP5-H. Em seguida, foram incubados durante 4 dias a 28°C e 200 rpm num aparelho Infors Multítron Shaker com deslocação de 2,5 cm (1 polegada). Neste ponto, os caldos foram centrifugados a 3500 rpm e o sobrenadante removido do micélio. Foi determinada a actividade inibitória da or-amilase que os sobrenadantes combinados possuem, a qual é resumida na tabela abaixo. 19

Diluição do sobrenadante para o ensaio 1:1000 1:10000 % Inibição no frasco 1 66 35

Exemplo 4 - Preparaçao de um caldo de fermentação com actividade inibitória da ct-amilase do líquido do rúmen a partir de Streptomyces kursannovii ATCC11912.

Foram retirados com uma ansa esporos de Streptomyces kursannovii ATCC11912, em agar inclinado ATCC172 com H da força, e inoculados em dois frascos Erlenmeyer de 300 ml, contendo cada um 50 ml de meio AP5-H. Em seguida, foram incubados durante 5 dias a 28°C e 200 rpm num aparelho Infors Multitron Shaker com deslocação de 2,5 cm (1 polegada). Neste ponto, os caldos foram centrifugados a 3500 rpm e o sobrenadante removido do micélio. Foi determinada a actividade inibitória da α-amilase que cada sobrenadante possui, a qual é resumida na tabela abaixo.

Diluição do sobrenadante 1:1000 1:10000 1:100000 para o ensaio % Inibição no frasco 1 85 73 27 % Inibição no frasco 2 85 7 Õ 30

Exemplo 5 - Preparação de um caldo de fermentação com actividade inibitória da α-amilase do líquido do rúmen a partir de Streptomyces lienomycini ATCC43687.

Foram retirados com uma ansa esporos de Streptomyces lienomycini ATCC43687, em agar inclinado ATCC172 com H da força, e inoculados em três frascos Erlenmeyer de 300 ml, 20 contendo cada um 50 ml de meio ANG-3 modificado. Em seguida, foram incubados durante 5 dias a 28°C e 200 rpm num aparelho Infors Multítron Shaker com deslocação de 2,5 cm (1 polegada}. Neste ponto, os caldos foram centrifugados a 3500 rpm e o sobrenadante removido do micélio. Foi determinada a actividade inibitória da α-amilase que cada sobrenadante possui, a qual é resumida na tabela abaixo.

Diluição do sobrenadante para o ensaio 1:1000 1:10000 1:100000 % Inibição no frasco 1 87 70 41 % Inibição no frasco 2 85 75 41 % Inibição no frasco 3 85 76 47

Exemplo 6 - Preparação de um caldo de fermentação com actividade inibitória da α-amilase do líquido do rúmen a partir de Streptomyces sp. KC672

Foram retirados com uma ansa esporos de Streptomyces sp, KC672, em agar inclinado ATCC172 com M da força, e inoculados em dois frascos Erlenmeyer de 300 ml, contendo cada um 50 ml de meio ΆΡ5-Ή. Em seguida, foram incubados durante 7 dias a 28°C e 200 rpm num aparelho Infors Multítron Shaker com deslocação de 2,5 cm (1 polegada). Neste ponto, os caldos foram centrifugados a 3500 rpm e o sobrenadante removido do micélio. Foi determinada a actividade inibitória da α-amilase que o sobrenadante possui, a qual é resumida na tabela abaixo. 21

Diluição do sobrenadante no ensaio 1:1000 1:10000 % Inibição no frasco 1 54 21 % Inibição no frasco 2 49 22

Exemplo 7 - Isolamento de um inibidor da Oí-amilase do líquido do rúmen a partir de Streptomyces conqlobatus ATCC31005 - exemplo comparativo

Foram retirados com uma ansa esporos de Streptomyces conglobatus ATCC31005, mantidos em agar inclinado ATCC172 com H da força, e inoculados em dois frascos Erlenmeyer de 300ml contendo cada um 50 ml de meio AP5-H. Após 24 horas de incubação a 28°C e 200 rpm num Infors Multitron Shaker com deslocação de 2,5 cm (1 polegada), estes frascos foram utilizados para inocular dois minicopos de 5 litros (Electrolab1K, Gloucester, Reino Unido), contendo cada um 3,5 litros de meio AP5-H. Estes caldos foram incubados a 28°C com arejamento de 3 1/min e agitação a 300 rpm durante 6 dias. No momento da colheita, os caldos foram centrifugados a 2500 rpm e os sobrenadantes decantados. Em seguida, cada um foi agitado durante 45 minutos com 86 g de carvão e filtrado por um leito de 500 g de Arbocel™. Nesta altura, o pH era de 7. Cada pasta de carbono foi extraída duas vezes com 860 ml de acetona aquosa (1:1), mantendo o pH entre 2 e 3 pela adição de ácido clorídrico concentrado. Os quatro extractos de acetona aquosa foram parcialmente evaporados, combinados e liofilizados, resultando em 40 g de um sólido castanho. Este sólido foi então dissolvido em 500 ml de água desionizada e aplicado a uma coluna de 750 ml Amberlite IR1.20 (forma H+) a um caudal de 2 ml/min. Em 7? seguida, a coluna foi lavada com 1 1 de água e depois eluida com amónia 5N, recolhendo-se fracções de 50 ml. As fracções 13 a 28 foram liofilizadas e resultaram em 1,4 g de um pó castanho-escuro, que foi dissolvido em 15 ml de água, filtrado e o filtrado dai resultante diluído com 5 ml de acetonitrilo. Esta diluição foi injectada em volumes de 2 ml numa coluna Cosmosil NH2-MS (20 * 250 mm) e eluida a 20 ml/min com acetonitrilo em água (60:40). As fracções foram colhidas a cada 30 segundos e analisadas por LC-MS com um instrumento Finnegan AQA™. As fracções que continham M+H+970 foram combinadas e secas, resultando em 70 mg de um sólido semelhante a borracha. 0 sólido foi depois dissolvido em 2 ml de água, filtrado e injectado, uma metade de cada vez, numa coluna Waters Aquam de 5 μπι e 125A (21 x 150 mm) , utilizando um sistema Waters Delta

Prep™ 4000 com detecção com sistema de díodos. As fracções foram recolhidas e duas, ambas fracção 21, foram combinadas, contendo o pico M+H+970, que resultou em 6,5 mg de um sólido branco. A massa exacta foi recolhida num instrumento Bruker Apex II FT-ICR-MS 4.7Tr onde a amostra, dissolvida em metanol/água/ácido acético (50:50:1) a uma concentração aproximada de 0,5 mg/ml, foi introduzida numa fonte de electrovaporização Analytica por infusão directa a 4pl/min, m/z (ESI, FTMS) [M+H]+ = 970,3601, C37H64N028 requer 970,3609 m/z (ESI, FTMS) [M+Na]+ = 992,3452, C37H63N028 requer 992,3429

Os espectros de RMN (protão, carbono 13, TOCSY, HSQC e HMBC) e de massa deste composto da fracção 21, também 23 conhecido por «6942/99/1» são congruentes com a estrutura indicada abaixo.

0 composto exibido acima foi exposto na patente da GB 1 482 543 {Ag. Biol. Chem. 46(7) (1982) 1941).

Posição δΗ Multiplicidade J (Hz) 6c A1~CH20H 4,09/4,20 2 x d 14,2 64,5 AI “ — - 141, 9 A2 5,87 d, br 5, 3 126, 6 A3 3, 51 t, br "5 58,9 A4 3, 63 m - 73, 9 A5 3,73 m - 75,9 A6 4,01 d, br 6,9 74,2 BI 5,28 m 3, 6 102,8 B2 3,57 m - 75, 6 B3 3, 58 m - B4 2,45 t 9,7 67,8 B5 3,72 m „ 72,6 B6 - Me 1,31 d 6, 4 20,2 Anéis C-E: 1 -5,37 d 4,0 -102,4 24 2 3, 60 dd 9,5;4, 0 -74,4 3 -3, 93 t -9,5 -7 6,2 4 -3, 62 t -9, 5 --79,9 5 -3,81 m - -74,2 6-CH2 -2,79/3,83 m - -63,4 a-Fl 5,20 d 3,9 94,9 a-F2 3, 54 dd -9,5;2,9 a-F3 3, 94 t -9,5 76,2 a-F4 3, 62 t -9,5 -79, 9 a-F5 3, 91 m - 72,8 a-F6 - -3,8 m - -63, 4 ch2 (3”F1 4,63 d 7,9 98,8 β-Ρ2 3,25 dd 7, 9;9,5 76, 9 P-F3 3,74 t 9, 5 79, 1 P-F4 3, 63 dd 9,5;8,3 -79, 9 β-FS 3,56 m - 77,5 (3-F6- CH2 -3,87 m - -63,4

Verificou-se que o «Composto da fracção 21» possui um efeito inibitório na pesquisa da amilase aqui mencionada.

Exemplo 8 - Isolamento de um inibidor da g-amilase do liquido do rúmen a partir de Streptomyces conglobatus ATCC31Q05 Exemplo comparativo

Utilizou-se como meio de fermentação o Meio de Produção AP5-H acima referido. 25

Foram retirados com uma ansa esporos de Streptomyces conglobatus ATCC310Q5, em agar inclinado ATCC172 com H da força, e inoculados em dois frascos Erlenmeyer de 300ml contendo cada um 50 ml de meio AP5-H. Em seguida, foram incubados durante 24 horas a 28°C e 200 rpm num aparelho Infors Multitron Shaker com deslocação de 2,5 cm (1 polegada). Neste momento, o inoculo foi transferido para um frasco de Fernbach de 3 1, contendo 1 1 de meio AP5-H, e incubado durante mais 24 horas nas mesmas condições já descritas para os frascos Erlenmeyer. Em seguida, este inoculo foi transferido para 20 1 de meio AP5-H, já esterilizado, num fermentador de aço inoxidável de 30 1 New Brunswick Micros™. 0 caldo foi então agitado a 300 rpm, a 28°C, com ar 20 1/min durante 112 horas e depois colhido. 0 caldo colhido foi centrifugado numa Carr Powerfuge™ a 20 000 G. Ao sobrenadante, a um pH natural de 7,8, adicionou-se 500 g do carvão descolorante activado (Aldrich 16155-1), agitando-se a mistura durante 16 horas. Depois de filtrado através de um auxiliar de filtração, como Arbocel™, o sobrenadante foi tratado com mais 500 g de carvão, durante 1 hora e da mesma forma. As pastas de carvão combinadas foram lavadas com metanol aquoso (10 1 1:1) e extraídas duas vezes com acetona aquosa (10 1 1:1) agitando por 1 hora e depois filtrando pelo auxiliar de filtração. Após evaporação parcial por rotação e liofilização, obtiveram-se 98,7 g de material biologicamente activo. Este material foi dissolvido em 1800 ml de água desmineralizada e carregado numa coluna de 3,5 1 Amberlite IR120 (H)™ a um caudal de 5 ml/min. Após uma lavagem com água (2 1) o produto foi eluído com alíquotas 26 de 1 1 de solução de amónia a 5N. Depois da liofilização, as fracções mais potentes (5 a 8) foram combinadas, resultando em 10,8 g de sólido castanho. 1,1 g deste material foram purificadas por cromatografia, em cinco injecções iguais, utilizando um sistema cromatogrãfico Walters Delta Prep 4000™, uma coluna de 250 * 21,2 mm CromasilNHa (por exemplo, Phenomenex) e um gradiente de 67% de acetonitrilo e 33% de água para 50/50 ao fim de 20 minutos, a um caudal de 24 ml/minuto. Foram colhidas fracções de 12 ml. As fracções que continham o pico de interesse (31 a 35 de cada corrida) foram combinadas e resultaram em 138 mg de sólido branco. Este material foi novamente cromatografado, desta feita numa coluna de 150 * 21,2 mm Aqua (por exemplo, Phenomenex) e um gradiente de 100% de água para 90% de água e 10% de acetonitrilo, em 15 minutos, a um caudal de 21,2 ml/minuto. As fracções foram colhidas em intervalos de meio minuto. Foi obtido, no total, 43 mg do produto desejado das fracções 22 e 23.

Os dados observados são congruentes com a seguinte estrutura, de ora em diante referida como «composto do Exemplo 8»:

..OH OH OH OK

OH C56H95N2O40/ M/z (ESI, FT-MS) [Μ+ΗΓ fórmula molecular 1435,546, correspondendo à (+/-3,028 ppm). 27 Μ/ζ (ΕΞΙ, FT-MS) [M+Na]* = 14 57,528 correspondendo à fórmula molecular CseHg^NsO^oNa ( + /“1,914 ppm) .

Todos os dados de RMN foram registados num aparelho Varian Innova a 600 MHz, a 10°C, em D2O utilizando uma sonda.

Posição H Multiplicidade J (Hz) C AI-CH2OH 4,09/4,21 2 x d 14,2 64,2 AI — “ — 141,7 A2 5,88 d; br 5,3 126,2 A3 3, 52 t; br -5 58,8 A4 3,64 m — -73,9 A5 3,74 m __ -75,9 A6 4,01 d; br 7,2 -7 3,7 Bl 5,33 m 3, 6 -102,2 B2 3,57 m 75, 5 B3 3,58 m “ ? B4 2,45 t 9,7 67,7 B5 3,72 m — 72,2 B5-Me 1,31 d 6, 4 20,0 Cl 5,36 d 3,8 100,1 C2 3,59 dd — 73,8 C3 3,89 t — 76,2 C4 3, 61 t -7 9,3 C5 3,88 m __ -74,2 C6-CH2 3,82 m — -63,1 Dl-CH2OH 4,09/4,21 2 x d 14, 1 64,7 Dl — 13 9,1 D2 5, 95 d; br 4, 1 128,9 D3 3,52 t; br -5 57,7 28

Posição H Multiplicidade J (Hz) C D4 3,82 m -- 71,9 05 4,15 dd 8,2; 5,3 73, 3 D6 4,21 d; br 6, 9 78,4 EI 5,33 m 3,6 -102,2 E2 3,57 m 75, 6 E3 3,58 m — ? E4 2,45 t 9,7 66, 7 E5 3,72 m — 72,2 E5-Me 1,31 d 6, 4 20, 0 Anéis F-H:1 -5,40 d 3,8 -102,2 2 -3,59 dd 9,5/d,0 -75,2 3 -3, 93 t -9,5 -7 6,1 4 -3, 55 m -9,5 -79, 1 5 ~ 3, 82 m — -7 3,8 6-CH2 -3,79/3,83 m -63, 1 a-11 5,21 d 3, 8 94, 9 a-12 3, 54 dd -9,5; 3, 9 a-13 3, 94 t -9,5 76,2 a-14 3, 62 t -9,5 -79, 9 a-15 3,91 m — 72,8 a-16-CH2 -3, 8 m — -63,4 β-11 4,63 d 7,9 98,7 β-12 3,25 dd 7,9; 9,5 76, 9 β-13 3,74 t 9, 5 79,1 β-14 3, 63 dd 9,5; 8,3 -79, 9 β-15 3,56 m 77,5 β-16-ΟΗ2 -3, 87 m — -63,4 NB onde surge «?» na tabela acima, houve sobreposição grave 29

Posição H Multiplicidade J (Hz) C dos sinais, c que significa que não se pode efectuar uma atribuição sem ambiguidade.

Modificações da acarbose e outros inibidores da a-amilase e/ou ot-qlucosidase com ela relacionados Biotransformações

Biotransformação microbiana

Podem ser utilizados organismos microbianos inteiros capazes de glicosilar a acarbose ou outros inibidores da a-amilase e/ou α-glucosidase com ela relacionados para conferir maior actividade inibitória da α-amilase e/ou a-glucosidase, incluindo Bacillus subtilis ATCC550601, Saccharopolyspora erylhrae ATCC116352 e um mutante bloqueado de S.avermitilis ATCC535673. Outros organismos que podem glicosilar incluem Cunninghamella sp. NRRL56951'i e Beauvaria bassiana DSM 875 e DSM 134415. Além disso, a biossintese dirigida pelos microrganismos da acarbose por Actinoplanes sp. CBS 793,96a alimentados com rutina pode também ser utilizada com outros organismos produtores de inibidores da α-amilase e/ou α-glucosidase relacionados. Estes podem produzir análogos da acarbose ou homólogos relacionados de estrutura semelhante à da acarbose que possam também exibir maior actividade inibitória da or-amilase e/ou α-glucosidase. Além disso, podem ainda ser usados microrganismos capazes de O-acilação16, oxidação (incluindo epoxidação17 e formação de cetonas18) , hidroximetilação19, O-metilação20, para produzir novos análogos da acarbose e análogos com ela relacionados que 30 possam também exibir maior actividade inibitória da a-amilase e/ou a-glucosidase.

Biotranformações por enzimas brutas, parcialmente purificadas e purificadas

Podem ser utilizados métodos enzimáticos de glicosilação para sintetizar ou modificar oligossacarideos. Não é necessária protecção e desprotecção específica dos grupos hidroxilo e as enzimas apenas transferem para um ou dois destes grupos. Isto resulta com frequência em menos reacções com menos passos e procedimentos de purificação mais simples. Foi já utilizada a transglicosilação de amilase maltogénica de Bacillus stearothermophilus (BSMA) com acarbose e vários aceptores, tendo a enzima sido um transformante de Escherichia coli que transportava o gene da BSMA.5 Observou-se aqui que a BSMA clivava a primeira ligação glicosídíca da acarbose para produzir o pseudotrissacarídeo (PTS) e depois adicionava uma unidade de glicose na posição α (1-+6) para dar isocarbose, em que a própria acarbose possui uma ligação or (l-»4) à glicose terminal. A adição de vários hidratos de carbono ao digerido originou produtos de transferência, em que o PTS estava ligado sobretudo a (l-*6) a D-glicose, D-manose, D-galactose e metil-a-D-glucopiranosídeo. Com a D-fruto-piranose e a D-xilopiranose, o PTS esteve ligado a α{1-+5) e a a(l->4), respectívamente. Tanto a-a-trehalose como maltitol deram origem a dois produtos importantes, com PTS ligado a α{1-*6) e a α (1-+4) ao resíduo de glicopiranose. O PTS foi sobretudo transferido para o C-6 do resíduo não-redutor de maltose, celobiose, lactose e gentiobiose. A 31 sacarose deu origem a PTS ligado a α (1-+4) do resíduo de glicose. A rafinose deu origem a dois produtos importantes com PTS ligado a α (1-+6) e a a α (1-+4) do resíduo de D-galactopiranose, Ά maltotriose deu origem a dois produtos importantes com PTS ligado a α (1-+6) e a a α (1-+4) do resíduo de glicopiranose terminal não-redutor. 0 xilitol deu origem a PTS ligado a α (1-+4) como produto principal e D-glucitol deu origem a PTS ligado a α (1-+6) como único produto. Todos estes exemplos podem exibir maior actividade inibitória da α-amilase. Podem ser utilizados outros grupos de enzimas para produzir análogos glicosilados de acarbose ou outros inibidores da α-amilase e/ou α-glucosidase que possuam açúcares ou grupos hidroxilo acessíveis. As preparações enzimáticas que podem ser utilizadas incluem a- e β-galactosidase, a- e β-manosidase, β-Ν-acetilglucosaminidase, β-Ν-acetilgalactoaminidase e a-L fucosidase.6 A glicosidação pode dar-se em qualquer uma das extremidades das unidades valienamina ou ciclitol da acarbose e a experiência mostra que, de preferência, a transferência do glicosil deve ocorrer na unidade monossacarídica terminal não-redutora dos substratos.7 Os estudos que utilizam endoglicosídases podem levar a estruturas ramificadas. As preparações enzimáticas descritas podem ser derivadas de microrganismos como Aspergillus niger, A. tezzeus, A, ozyzae, Bacillus cizculans, B. steazothezmophilusf Coccobacillus ou suco de insectos, como caracol, ou obtidos a partir de plantas, como maçãs, cogumelos, sementes de alfafa, farelo não gordo de amêndoa, etc. As glicosiltransferases podem também ser utilizadas para glicosilar a acarbose e análogos relacionados que exibam actividade inibitória da a-amilase, mas são enzimas muito mais raras.8 Muitas destas glicosiltransferases foram já clonadas. Refere-se com frequência que estas actuam de forma bastante rigorosa no último ou nos dois últimos sacarideos e são também muito específicas para o doador do glicosil, podendo ser induzidas a trabalhar com dadores e/ou aceptores não-naturais e manter as suas vantagens de especificidade do local e estereoselectividade, assim como produções elevadas. Apenas estão disponíveis algumas glicosiltransferases e a maioria das experiências foi levada a cabo com galactosiltransferase Gal T.9 Um grupo especial de glicosiltransferases são as ciclodextrinasglucanotransferases (CGTase). Estas enzimas são produzidas por microrganismos e muitas estão disponíveis no mercado; catalisam a ciclodextrinação do amido, mas também transferem uma ou mais unidades de a-glicosil para vários aceptores. Podem ser utilizadas para ampliar glicosídeos ou para a α-glicosilação de muitos compostos. A CGTase de B. stearothermophilus foi utilizada para a transglicosilação da rutina, em que a unidade glicosil foi ampliada em uma ou mais unidades de glicose.10 Poderia ser utilizada uma estratégia semelhante com a acarbose e inibidores semelhantes da α-amilase e/ou a~ glucosidase que contenham unidades de glicose. Outra estratégia consiste em utilizar a fosforilase do glicogénio, que é a bem conhecida enzima responsável pela formação ou degradação de α (l->4) glucanos. A fosforilase requer um substrato activado, como o éster de glicosilfosfato. Com este substrato, uma cadeia de glucano, a unidade iniciadora, pode ser alongada por unidades de glicose, com a libertação de fosfato.11 A modificação da acarbose e inibidores relacionados da α-amilase e/ou a-glucosidase que contenham unidades de açúcar pode também ser realizada utilizando hidrólises selectivas com a própria α-amilase, que pode clivar unidades de açúcar ou transglicosilar.12,13

Para outras modificações dos grupos hidroxilo das unidades de hidratos de carbono, pode ainda recorrer-se a acilases, esterases, lipases, hidrolases e desidratases,

Bibliografia para esta secção 1. Petuch B, R et al. Microbial transformation of immunosuppressive compounds 111. Glucosylation of immunomycin and FK506 by Bacillus subtilis ATCC55060. J. Ind. Microbiol. 13, 131-135, (1994) 2. Arison, B. H et al. Microbial glycosidation of avermectins. Eur. Pat. Appl. (1992) EP 520557 Al. 3. Pacey M. S. et al. Preparation of 13-epi-selamectin by biotransformation using a blocked mutant of Streptomyces avermitilís. J. Antibiotics, 53 (3), 301-305, (2000) 4. Cruegar, A et al, Novel acarviosin glycoside: synthesis of a new saccharase inhibitor via biotransformation. Ger. Offen, (1999) DE 19821038 Al 5. Park, Η. P et al. Transglycosylation reactions of Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase with acarbose and various acceptors. Carbohydrate Res. 313, (1998), 235-246 6. M. Scigelova et al. Glycasidases-a great synthetic tool. J, of Molecular Catalysis B: Enzymatic 6, (1999), 483-494. 34 7. Crout D H G, et al. Glycosidases and glycosyltransferases in glycoside and oligosaccharide synthesis. Curr. Opin. Chem. Biol 2(1}, (1998), 98-111, 8. Kren, V., et al. Glycosylation employing bio-systems: from enzymes to whole cells. Chem. Soc. Rev. 26, (1997), 463 9. C. H. Wong. et al Enzymes in Synthetic Organic Chemistry, Tetrahedron Org. Chem. Ser. Eds. Baldwin J. E & Magnus P. D., Pergamon (1994), Vol 12. 10. Suzuki et al, Agric. Biol. chem. Enzymatic formation of 4-a-D-glucopyranosyl-rutin 55, (1991), 181 11. Evers B et al, Further syntheses employing phosphorylase. Bioorganic & Medicinal Chemistry 5(5), (1997), 857-863 12. Takada, M et al. Chemo-enzymic synthesis of galactosylmaltooligosaccharidonolactone as a substrate analogue inhibitor for mammalian a-amylase. Japan. J. Biochem. (Tokyo) 123(3), (1998), 508-515 13. Kim, T. K et al. Synthesis of glucosyl-sugar alcohols using glycosyltransferases and structural Identification of glucosyl-maltitol. J. Microbiol. Biotechnol. 7(5), (1997), 310-317 . 14. Chatterjj, P et al. Glucosidation of betulinic acid by

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Certas das substâncias aqui mencionadas podem existir em uma ou mais formas geométricas ou estereoisoméricas. A presente exposição inclui cada um destes isómeros e sais dos compostos reivindicados. Certos compostos aqui mencionados podem existir em mais do que uma forma tautomérica. Paralelamente, certos compostos aqui mencionados podem possuir formas zwiteriónicas. Deve entender-se que esta exposição engloba todos estes tautómeros e zwiteriões. A exposição abrange sais aceitáveis em termos veterinários dos compostos aqui mencionados, incluindo a adição de ácido e os seus sais básicos, quando aplicável. Os sais adequados resultantes da adição de ácidos formam-se a partir de ácidos que resultem em sais não-tóxicos, por exemplo, sais 36 de cloridrato, bromidrato, iodidrato, sulfato, hidrogenossulfato, nitrato, fosfato, hidrogenofosfato, acetato, maleato, fumarato, lactato, tartarato, citrato, gluconato, succinato, benzoato, metanossulfonato, benzenossulfonato e p-toluenossulfonato. Os sais de bases adequados formam~se a partir de bases que resultem em sais não-tóxicos, por exemplo, sais de alumínio, cálcio, lítio, magnésio, potássio, sódio, zinco e dietanolamina. Para uma recensão sobre os sais adequados, veja-se Berge et al. J. Pharm. Sei., 66, 1-19 (1977).

Será compreendido por aqueles que possuem conhecimentos neste domínio que certos derivados protegidos dos compostos aqui mencionados, que podem ser produzidos antes de uma etapa de desprotecção final, podem não possuir a actividade biológica desejada, por si, mas que, em certas circunstâncias, podem ser transformados após a entrada no organismo, por exemplo, através do metabolismo, de forma a criar compostos aqui mencionados e que são biologicamente activos. Estes derivados são abrangidos pelo termo «pró-fármaco». Será também certamente apreciado pelas pessoas com conhecimentos nesta área que certos meios deles conhecidos como «pró-meios», por exemplo, os descritos em Design of Prodrugs, de H Bundgaard (Elsevier) 1985, podem ser colocados em funcionalidades adequadas quando estas estiverem presentes nos compostos aqui mencionados, também no sentido de formar «pró-fármacos». Além disso, certos compostos aqui mencionados podem actuar como pró-fármacos de outros compostos também aqui mencionados. 37 A pessoa com conhecimentos no ramo irá compreender que certas substâncias aqui referidas podem ser sintetizadas por métodos que não os descritos neste documento, pela adaptação dos métodos descritos neste documento e/ou pela adaptação dos métodos conhecidos no ramo, por exemplo, no ramo aqui descrito, ou recorrendo a manuais-padrão, como

Comprehensive Organic Trans- formations -A Guide to Functional Group Transformations, RC Larock, VCH {edição de 1989 ou edições posteriores), Advanced Organic Chemistry ~ Reactions, Mechanisms and Structure, J.March, Wiley-Interscience {3a edição ou edições posteriores), Organic Synthesis -The Disconnection Approach, S Warren (Wiley), (edição de 1982 ou edições posteriores), Designing Organic Syntheses S Warren (Wiley) (edição de 1983 ou edições posteriores), Guídebook To Organic Synthesis RK Mackie e DM Smith (Longman) (edição de 1982 ou edições posteriores), Methoden der Organischen Chemie, Houben Weyl, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, The Chemistry of the Hydroxyl Group Partes 1 & 2, Saul Patai, (1971), Interscience Publishers, The Chemistry of the Amino Group, Saul Patai, (1968), Interscience Publishers, Trends in Synthetic Carbohydrate Chemistry, ACS Symposium Series 386, (1989), American

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Chemistry, Volumes 1-8, Academic Press, Nova Iorque, Carbohydrates Synthetic Methods and Applications in Medicinal Chemistry, Ogura, H. et al., (1992), Kodansha, Tóquio e a bibliografia neles constante como guia. 38

Deve entender-se que os métodos de transformação sintética aqui mencionados apenas constituem um exemplo e que podem ser realizados em diferentes sequências para que os compostos pretendidos possam ser montados de forma eficiente. 0 químico experiente irá usar do seu discernimento e capacidades quanto à sequência mais eficiente de reacções para a síntese de um dado composto alvo. Por exemplo, podem ser adicionados substituintes e/ou realizadas transformações químicas em intermediários diferentes dos abaixo mencionados em conjunto com uma reacção particular. Isto irá depender, entre outros, de factores como a natureza de outros grupos funcionais presentes num substrato em particular, da disponibilidade de intermediários importantes e da eventual estratégia de protecção de grupo a adoptar. É óbvio que o tipo de química envolvida irá influenciar a escolha dos reagentes utilizados nos ditos passos de síntese, a necessidade e o tipo de grupos de protecção que se empregam e a sequência para a realização da síntese. Os procedimentos podem ser adoptados da forma mais conveniente aos reaccionantes, reagentes e outros parâmetros da reacção de uma forma que seja evidente para o especialista por referência aos manuais mais utilizados e aos exemplos abaixo proporcionados.

Será óbvio para os especialistas na área que pode ser necessário proteger grupos funcionais sensíveis e desprotegidos durante a síntese de um composto da invenção. Isto poderá realizar-se por métodos convencionais, por exemplo, pelos descritos em Protective Groups in Organic Synthesis de TW Greene and PGM Wuts, John Wiley & Sons Inc. 39 {1999) e na bibliografia nele contida. Os grupos funcionais que podem ser de proteger incluem os grupos oxo, hidroxilo, amina e ácido carboxílico. Os grupos protectores adequados para o grupo oxo incluem os acetais, cetais {por exemplo etilenocetais) e ditianos. Os grupos protectores adequados para o grupo hidroxilo incluem os grupos trialquilsilil e diarilalquilsilil (por exemplo, o tert-butildimetilsilil, tert-butildifenilsilil ou trimetilsilil) e tetrahidropiranil. Os grupos protectores adequados para o grupo amina incluem o tert-butiloxicarbonil, o 9-fluoroenilmetoxicarbonil ou o benziloxicarbonil. Os grupos protectores adequados para o grupo ácido carboxílico incluem Ci-e alquil ou benzil ésteres.

Os inibidores da α-amilase e/ou α-glucosidase podem ser administrados em monoterapêutica ou em associação com um ou mais agentes utilizados no tratamento (incluindo na profilaxia) da doença ou na redução ou supressão dos sintomas, da forma mais conveniente para o tratamento da acidose e afecções relacionadas. Exemplos destes agentes (indicados em jeito de ilustração e não devendo ser considerados limitativos) são tampões, antibióticos, como ionóforos, pró-bióticos, ácidos orgânicos e bacteriocinas, antiparasitários, como fipronil, lufenuron, imidacloprida, avermectinas (por exemplo abamectina, ivermectina, doramectina), milbemicinas, organofosfatos, piretróides; anti-histamínicos, como clorofeniramina, trimeprazina, difenidramina, doxilamina; antifungicos, como fluconazol, cetoconazol, itraconazol, griseofulvina, amfotericina B; antibacterianos, como enroflaxacina, marbofloxacina, ampicilina, amoxicilina; anti-inflamatórios, como 40 prednisolona, betametasona, dexametasona, carprofeno, cetoprofeno; suplementos nutricionais, como ácido gama-linoleico e emolientes. Os inibidores da α-amilase e/ou a~ glucosidase podem ser administrados em monoterapêutica, mas serão geralmente administrados em mistura com um excipiente, diluente ou veiculo adequado, seleccionado tendo em conta a via de administração pretendida e as normas para a prática farmacêutica/veterinária/pecuária.

Poderá constituir uma vantagem para o tratamento de animais como ovelhas e gado bovino a administração da substância activa por via oral utilizando métodos habituais adequados, como a mistura com a ração dos animais, na sua bebida ou em bólus administrado directamente no rumen. Para a administração como alimento medicamentoso sólido, pode ser fornecido um aditivo para ração concentrada ou pré-mistura a mesclar na ração normal dos animais. Podem ainda ser incluídos outros agentes estabilizantes para manter e/ou reforçar a estabilidade das substâncias activas na dita formulação.

Os métodos pelos quais o agente activo pode ser administrado incluem a administração oral em cápsula, bólus, comprimido ou doseador ou, por outro lado, a administração pode ser realizada por injecção ou implante no rumen. Estas formulações podem ser preparadas da forma convencional de acordo com as normas da prática veterinária.

Por exemplo, a substância activa pode ser administrada por via oral sob a forma de soluções, pós ou suspensões, que 41 podem contem agentes aromatizantes ou corantes, para aplicações de libertação imediata, prolongada, modificada, mantida, pulsada ou controlada.

Além da administração como alimento medicamentoso sólido ou na bebida como parte da dieta normal do gado, prevê-se que a substância activa possa ser administrada separadamente entre a ingestão de alimentos e bebidas, por exemplo, sob a forma de uma «guloseima» de sabor agradável, como em formulações à base de melaço.

Para suspensões aquosas e/ou elixires, a substância activa pode ser combinada com vários agentes adoçantes ou aromatizantes, matérias corantes ou corantes, ou agentes emulsionantes e/ou de suspensão e com diluentes como água, etanol, propilenoglicol e glicerina, e combinações dos mesmos. Podem ainda ser incluídos outros agentes estabilizantes para manter e/ou reforçar a estabilidade das substâncias activas na dita formulação. A substância activa pode ainda ser administrada através de uma formulação em bólus de acção prolongada directamente localizada no rumen, onde o dispositivo da formulação é retido no saco ruminoreticular por períodos de tempo prolongados para facilitar a libertação mantida. A retenção ruminai do dispositivo de formulação aqui descrito pode ser realizada utilizando matrizes densas ou reservatórios à base de cilindros de alumínio ou aço ou lamelas formadas por uma mistura de argila, fármaco e outros ingredientes. 42 A substância activa pode, em certos casos, ser também administrada por via parentérica, por exemplo, por via intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea, ou administrada segundo técnicas de perfusão. Para uma administração parentérica deste tipo, a substância activa deve ser utilizada sob a forma de solução aquosa estéril, que pode conter outras substâncias, como sais ou glicose suficientes para tornar a solução isotónica com o sangue, A solução aquosa deve ser adequadamente tamponizada (de preferência, com pH entre 3 e 9), se necessário. A preparação das formulações parentérxcas estéreis adequadas realiza-se sem dificuldade pela metodologia da esterilização terminal ou por fabrico asséptico seguindo as normas relativas às técnicas farmacêuticas bem conhecidas dos especialistas deste domínio.

Em consequência, as doses unitárias da substância activa podem conter entre 0,001 mg e 20 g da substância activa para a administração única ou para a administração de duas ou mais doses de cada vez, conforme for necessário. Por exemplo, foram administrados 15 g de acarbose por animal por dia em dois momentos de alimentação separados, A meta para a posologia aproximada de um composto activo é até cerca de 3 g/animal/dia. 0 veterinário ou criador irá determinar, em qualquer caso, a posologia real mais adequada a cada animal ou grupo de animais, que pode variar com a idade, o peso, a dieta e a resposta do animal em particular. As posologias acima indicadas constituem um exemplo do caso médio. Podem existir, claro, circustâncias individuais em que sejam de utilizar gamas de concentração 43 mais elevadas ou mais baixas, e estas encontram-se no âmbito desta invenção, 0 especialista compreenderá que no tratamento de certas afecções, como a acidose aguda, a substância activa pode ser administrada em dose única, se tal for necessário ou de desejar, A substância activa será normalmente administrada por via oral ou por qualquer outra via adequada (que possa acabar por atingir o rúmen), sob a forma de preparações que contenham o ingrediente activo, opcionalmente sob a forma de um ácido ou base, ou sal de adição orgânico ou inorgânico não-tóxico, numa forma veterinária/farmacêutica aceitável.

Dependendo da afecção e do animal a tratar, assim como da via de administração, as preparações podem ser administradas em diferentes doses (veja~se abaixo).

Apesar de ser possível administrar a substância activa directamente sem qualquer formulação, as substâncias activas são administradas de preferência sob a forma de uma formulação farmacêutica ou veterinária, que contém um veículo, díluente ou excipiente farmacêutica ou veterinariamente aceitável e a substância activa. 0 veículo, diluente ou excipiente pode ser seleccionado tendo em conta a via de administração pretendida e as normas para a prática farmacêutica e/ou veterinária. As composições que compreendam a substância activa podem contê-la numa concentração de 0,1% a 90,0% p/p. 44

As formulações variarão conforme o peso do composto activo nelas contido, dependendo da espécie de animal a tratar, da gravidade e do tipo de afecção e do peso do animal. Para administração parentérica e oral, a dosagem típica da substância activa varia entre 0,0001 e 1000 mg por kg de peso do animal. De preferência, este intervalo é de 0,001 a 20 mg por kg. Por exemplo, a acarbose foi administrada a 16 mg/kg. Ainda de maior preferência, o intervalo vai de 0,001 a 5 mg/kg e o ideal será que se situe entre 0,001 e 0,5 mg/kg. Há que compreender que todas as referências aqui contidas acerca do tratamento incluem as formas de tratamento curativas, paliativas e profilácticas. A eficácia dos agentes pode ser demonstrada utilizando os seguintes Métodos de Teste, em que a acarbose é utilizada como exemplo de um inibidor da α-amilase e/ou a-glucosidase adequado, Métodos de Teste

Ensaio da amilase bacteriana do rúmen - protocolo 1 O ensaio utiliza um kit para a amilase Sigma (577) para determinar se os compostos inibem a acção das amilases do sobrenadante do líquido ruminai. As reacções enzimáticas envolvidas no ensaio são as seguintes:

5 ET-GvPNP - (α-amilase) - 2 ET”G5 + 2 G2PNP + 2 ET-G4 + 2 G3PNP + ET~G3 + G^PNP 2 G2PNP + G3PNP -* (a-glicosidase) -* 4 PNP + 10 glicose 45 A α-amilase bidroliza o 4,6-etilideno-G7~PNP (ET-G7PNP) nos fragmentos G?_, G3 e PNP. A α-glucosidase (a-1,4-glcanoglucohidrolase EC 3.2.1.3) hidrolisa o G2PNP e o G3PNP, produzindo p-nitrofenol and glicose. Cinco moles do substrato (ETG-,ΡΝΡ) são hidrolisadas e produzem 4 moles de p-nitrofenol, O p-nitrofenol absorve luz a 405 nm e após um período de latência de dois minutos, a velocidade de aumento da absorvância a 405 nm é directamente proporcional à actividade da α-amilase no poço.

Colheu-se o líquido ruminai de vitelas Hereford * .frísias de quatro meses de idade (125-135 kg, fornecidas por Cwmnant Calves Ltd., Cwmnant, Tregaron, Ceredigion, País de Gales) alimentadas com uma dieta GH 313. 0 líquido ruminai foi colhido das vitelas abatidas para frascos em vácuo, aquecidos, o mais rapidamente possível após a eutanásia. Em seguida, foi filtrado através de uma camada dupla de gaze absorvente (Absorbent gauze BP, GAUZ 4 de Robert Bailey plc, Stockport, Inglaterra) para remover partículas de feno e ração. O líquido foi centrifugado a uma força centrífuga relativa de 23 300 durante 60 minutos e o sobrenadante decantado, vertendo de forma cuidadosa para evitar a contaminação pela camada superior solta do sedimento. Depois, o sobrenadante foi dividido por tubos de plástico em alíquotas de 50 ml e congelado a -20°C. Quando fosse necessário para a utilização num ensaio, o sobrenadante de líquido ruminai era descongelado mantendo os tubos em água fria. Os compostos ou controlos do teste foram distribuídos pela placa de 96 poços, utilizando-se 4 μΐ por poço. Adicionou-se então a cada poço 100 μΐ de reagente 577 do teste da amilase Sigma (constituindo cerca de metade do 46 volume indicado nas instruções, ou seja, 10 ml para uma ampola de 577-20), acrescentando-se depois 100 μΐ de sobrenadante do liquido ruminai por poço. Nesta fase, efectuou-se uma leitura a 405 nm correspondente a T = 0 utilizando um leitor de placas Anthos. A placa foi depois incubada a temperatura ambiente ou a 37°C até se observar uma janela de densidade óptica de cerca de 1000 U (normalmente, uma hora a 37°C ou três horas a temperatura ambiente). Realizou-se uma segunda leitura a 405 nm, subtraindo-se-lhe a primeira leitura. Os compostos activos causam uma redução das leituras da densidade óptica em relação ao controlo, sem o teste do agente.

Resultados - CI50 na pesquisa da amilase do liquido ruminai (utilizando o kit 577 da Sigma)

Composto CI50 média (pM) Número de ensaios Acarbose 2,03 n = 34 Trestatina A 0,17 n = 8 Tresiatina B 2,89 n = 6 Trestatina C O ·* O UD n = 6 V-1532 0,57 CM í! c Exemplo 7 2,06 n = 8 Exemplo 8 0,44 0 t—1 J! G

Resposta em função da dose de acarbose no ensaio da amilase bacteriana no rúmen [concentração de acarbose em unidades de molaridade] 47

—eae-j........iT025&=e&&

Protocolo do ensaio da qlicosidase no líquido ruminai

Este ensaio é utilizado para determinar os valores de CI50 dos inibidores da actividade da glucosidase bacteriana de uma suspensão celular do líquido do rúmen de bovinos (SCLR) por um ensaio colorimétrico. 0 ensaio determina a conversão de maltose em glicose. As células do líquido ruminai são incubadas com maltose na presença de inibidores e a quantidade de glicose produzida é determinada através de um ponto final colorimétrico vermelho. Quanto maior for o grau de inibição, menos glicose é produzida e menos cor vermelha surge. As placas são lidas a 450 nm.

Reacção principal: 48

Maltose + glicosidase + glicose Ensaio da glicose

Glucose + ATP -+ G-6-P e ADP (Hexocinase e Mg2+) G-6-P e NADP -+ 6-fosfogluconato (6-PG) e NADPH NADPH + metossulfato de fenazina (PMS) -* NADP + PMSH PMSH + INT (cloreto de iodonitrotetrazólio) -*· PMS + INTH O INTH apresenta uma cor vermelha escura.

Colheu-se o liquido ruminai de uma vaca dadora Guernsey de cinco anos, seca e fistulada, alimentada duas vezes ao dia com 1,4 kg de GH313 e 2,3 kg de feno. 0 liquido ruminai foi colhido em frascos sob vácuo pré-aquecidos. Em seguida, foi filtrado através de uma camada dupla de gaze absorvente (Absorbent gauze BP, GAUZ 4 de Robert Bailey plc, Stockport, Inglaterra) para remover partículas de feno e ração. 0 líquido foi centrifugado a uma força centrífuga relativa de 650, durante 15 minutos, para remover partículas de alimentos e protozoários. O sobrenadante foi decantado para tubos novos e centrifugado a uma força centrífuga relativa de 23 300 durante 60 minutos. Tanto o sobrenadante como a camada superior solta do sedimento foram eliminados. O sedimento foi ressuspendido em PBS a 1:8 do volume original, ou seja, 50 ml de PBS para o sedimento de 400 ml de líquido ruminai, e congelado a -20°C. Guando fossem necessárias, as células eram descongeladas mantendo o tubo em água fria e depois diluídas para 4,5 μΐ de células/poço (45|il/ml) . 49

Os compostos do teste ou os controlos foram distribuídos pela placa de 96 poços numa quantidade de 2 μΐ/poço, acrescentando-se 50 μΐ por poço de maltose 10 mM e 50 μΐ/poço de suspensão celular do líquido ruminai. A placa foi incubada a 37°C durante 1 hora. 0 kit de detecção de glicose 115A da Sigma foi reconstituído pela adição de 17 ml de água Millipore e 4 ml de reagente colorido a cada ampola. Adícionou-se 100 μΐ desta solução a cada poço e devolveu-se a placa à incubadora a 37°C por um período de 45 minutos. Em seguida, a placas foi lida a 450 nm. Os compostos activos causam uma redução das leituras da densidade óptica em relação aos poços de controlo sem inibidor.

Resultados - CIS0 na pesquisa da glucosidase de líquido ruminai

Composto CI50 média (μΜ) Número de ensaios Acarbose 1,08 n = 7 Trestatina A 33, 6 n = 3 Trestatina B 4,10 n = 2 Trestatina C 148,5 n = 2 V-1532 65,5 n = 2 Exemplo 7 (comparativo) 6, 38 η = 1 Exemplo 8 (comparativo) 13,1 n - 2 50 O ensaio utiliza a digestão da amilose ligada covalentemente a Azul Brilhante de Remazol R para determinar se os compostos inibem a acção das amilases do sobrenadante do liquido ruminai» Quando o substrato insolúvel é incubado com a amilase, é libertado corante azul no poço. Este pode ser medido por espectrofotometria para determinar a quantidade de actividade de amilase presente e se os compostos do teste são inibidores da amilase,

Colheu-se o liquido ruminai de uma vaca dadora Guernsey de cinco anos, seca e fistulada, alimentada duas vezes ao dia com 1,4 kg de GH313 e 2,3 kg de feno. O liquido ruminai foi colhido em frascos sob vácuo pré-aquecidos. Em seguida, foi filtrado através de uma camada dupla de gaze absorvente (Absorbent gauze BP, GAUZ 4 de Robert Bailey plc, Stockport, Inglaterra) para remover partículas de feno e ração. 0 líquido foi centrifugado a uma força centrífuga relativa de 23 300 durante 60 minutos e o sobrenadante decantado, vertendo de forma cuidadosa para evitar a contaminação pela camada superior solta do sedimento,. 0 sobrenadante foi dividido em alíquotas de 50 ml para tubos de plástico e congelado a -20°C. Quando era necessário para utilização num ensaio, o sobrenadante de líquido ruminai era descongelado mantendo os tubos em água fria. Adicionou-se a cada poço 100 μΐ de uma suspensão a 2% de azul de amilose {Sigma A3508) de um copo que tinha sido bem agitado para garantir uma distribuição homogénea do substrato. Os compostos do teste ou os controlos foram distribuídos pela placa de 96 poços numa quantidade de 4 μΐ/poço, acrescentando-se 100 μΐ por poço de sobrenadante de líquido 51 ruminai. A placa foi então incubada a 37°C durante 2,25 horas. Em seguida, removeu-se com cuidado de cada poço 100 μΐ de líquido, com uma pipeta de 12 canais, transferindo-se para uma nova placa de 96 poços, lida a 620 nm. Os compostos activos causam uma redução das leituras da densidade óptica em relação aos poços de controlo sem inibidor.

Resultados - CI50 na pesquisa da amilase do líquido ruminai (azul de amilose)

Composto Ciso média (μΜ) Número de ensaios Acarbose 2, 39 n = 4 Trestatina A 0,79 n = 2 V-1532 2,07 n - 2 Exemplo 7 0, 56 n = 2 Exemplo 8 9,45 n = 2

Protocolo para a determinação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) em aeróbios

As CIM foram determinadas por uma técnica normal de diluição em agar, de acordo com o National Committee for Clinicai Laboratory Standards (NCCLS, M7 Edição A2). Apresentamos em seguida um esquema do método empregado.

Determinaram-se as CIM utilizando o meio de teste padrão, agar Mueller Hinton (MH) (Unipath).

Preparação das placas de agar: adicionou-se 19 ml de meio de teste a diluições duplas adequadas do composto de teste 52 (1 ml), misturando bem. A mistura foi vertida para uma placa de Petri (90 mm), deixando-se solidificar o agar.

Preparação do inoculo: Inocularam-se quatro a cinco colónias do organismo de teste, retiradas de uma placa de cultura em agar MH, para 10 ml de caldo MH {Unipath) . O caldo foi incubado a 37°C até estar visivelmente turvo. A densidade da cultura foi ajustada a uma turbidez equivalente a 0,5 de padrão de McFarland pela adição de soro fisiológico (0,85¾ v/v).

Inoculação das placas de agar: Deixou-se secar as placas durante cerca de 1 hora numa incubadora a 37°C. As placas foram inoculadas com um Multípoint Inoculator (Denley). As agulhas deste dispositivo libertam 0,001 ml de inoculo na placa (equivalente a 10^-105 organismos).

Incubação das placas: As placas foram invertidas e incubadas a 37°C durante 18 horas.

Determinação dos pontos finais: As CIM foram registadas como a concentração mais baixa do composto de teste que inibiu totalmente o crescimento, não tendo em conta colónias únicas ou ligeiras turvações causadas pelo inoculo.

Bibliografia para esta secção:

National Committee for Clinicai Laboratory Standards Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bactéria that grow aerobically-second edition. Approved Standard reference methods for the determination of MIC of 53 aeroble bactéria by broth macrodilution, broth microdilution and agar dilution. Chair holder J. Allan Waitz, PhD DNAX Research Institute, NCCLS Document M7-A2 Villanova, Pa.: NCCLS, 1990 RESULTADOS COM ACARBOSE NESTE TESTE: N° Espécie bacteriana CIM (pg/ml) 1 E. coli ATCC 10418 >128 2 E448 >128 3 E4 54 >128 4 E459 >128 5 E450 >128 6 E476 >128 7 E461 >128 8 E516 >128 9 E517 >128 10 E520 >128 11 Salm, enteritidis 331234 >128 12 B1227 >128 13 B1240 >128 14 B1218 >128 15 B1231 >128 16 B1233 >128 17 B1232 >128 18 B1235 >128 19 E. faecium 1.1.7 >128 20 1.2.4 >128 21 1.1.6 >128 22 28.7.7 >128 23 1.2.6 >128 54 24 28,6.7 >128 25 5-4 >12 8 2 6 4-5 >128 27 3.1 >128 28 10.1 >128 29 £6 faecalis 1.3.10 >128 30 1.4,12 >128 31 1.1.16 >128 32 1.6.6 >128 33 1.3.13 >128 34 1.10.4 >128 35 28,5.7 >128 36 1.9.5 >128 37 1.1.4 >128 38 28.6.9 >128 39 S. aureus 3.3 >128 40 3.4 >128 41 3.5 >128 42 5.1 >128 43 6.1 >128 4 4 8,2 >128 45 8.3 >128 46 9.3 >128 47 10.3 >128 48 10.4 >128 49 NCTC 6571 >128

DIETAS UTILIZADAS NOS TESTES SEGUINTES 55 [Todas as dietas foram fornecidas por Grain Harvesters Ltd, The Old Colliery, Wingham, Canterbury, Kent CT3 1 LS, Inglaterra.] GH313:

Material Inclusão Análise CEVADA (fina) 24 000 VOLUME 100 000 TRIGO 10 000 PROTEÍNA 1005 FARELO DE TRIGO 11 900 GORDURA 3794 FARELO DE GIRASSOL (EXT) 5100 FIBRA 8501 FARELO DE COLZA (EXT) 10 000 AMIDO 27 309 ERVILHAS 7500 AMIDO + 32 78 3 AÇÚCAR SEMENTES DE LINHO 1200 INTEGRAIS FARELO DE CEREAIS 7500 BETERRABA SACARINA SEM 13 900 MELAÇO GRÂNULOS CALCÁRIOS 1300 SAL 0, 800 SUPL. GADO GHS 0,250 Supl, gado ADDAROME 0,020 MELAÇO 5000 GORDURA VEGETAL 1500 (MISTURADOR) 99 970 Material Inclusão Análise CEVADA (fina) 22 100 VOLUME 100 000 FARELO DE TRIGO 17 500 PROTEÍNA 15 122 GLÚTEN DE MILHO 8800 ÓLEO 4 7 00 FARINHA DE PEIXE (PROVIMI 2500 FIBRA 9601 56 6 6) FARELO DE GIRASSOL (EXT) 4500 AMIDO 17 175 FARELO DE COLZA (EXT 00} 5000 AÇÚCAR 8 7 70 GRÂNULOS DE LUZERNA 10 000 BETERRABA SACARINA COM 20 000 MELAÇO FARINHA CALCÁRIA 0,400 SAL 0, 650 SUPLEMENTO CORDEIRO INT 1,000 (10 kg) ÓLEO VEGETAL EM SPRAY 1600 MELAÇO 5000 GORDURA VEGETAL 1000 (MISTURADOR) 100 050 Material Inclusão Análise CEVADA (fina) 15 000 VOLUME 100 000 TRIGO 50 000 PROTEÍNA 13 984 r /iKliiLiU Uili UaHjU 11 000 ÓLEO 3206 FARELO DE COLZA (EXT) 14 400 FIBRA 4539 GRÂNULOS DE CALCÁRIO 1900 AMIDO 39 523 FOSFATO DICÁLCICO 0,030 AMIDO + 44 838 AÇÚCAR SAL 0,820 SUPLEMENTO GADO GHS 0, 250 COLBORN No°3 0,100 MELAÇO 5,000 GORDURA VEGETAL 1,500 (MISTURADOR) 100 000 57

Avaliaçao de agentes que utilizam a técnica de simulação do ruroen (RUSITEC) para efectuar um modelo da acidose crónica A técnica de simulação do rúmen in vitro (RUSITEC), descrita pela primeira vez por Czerkawski e Breckenridge (1977), foi utilizada para avaliar o efeito do inibidor da of-amilase e/ou a-glucosidase acarbose nos perfis diários de pH e produção de AGV utilizando uma ração concentrada para gado disponível no mercado (GH313 - ver abaixo). Tinha-se anteriormente verificado que a alimentação com 30 g/dia desta ração e 2,5 g/dia de palha de cevada cortada resultava em concentrações de ácidos gordos voláteis (AGV) superiores a 150 mM, ou seja, concentrações associadas a acidose crónica in vivo (Nagaraja, Galyean & Cole, 1998, supra) .

Equipamento: O aparelho consistiu em duas unidades de RUSITEC, contendo cada uma quatro vasos de fermentação. Cada vaso tinha um volume de 1 litro e foi aquecido a 390C num banho de água. A ração foi colocada num saco de nylon (14 x 9 cm, 50 pm) e foi agitada com cuidado por um mecanismo de pistões (8 golpes/min). O tampão (McDougall, 1948) foi infundido continuamente a um caudal de cerca de 750 ml/dia por uma bomba peristáltica de oito canais (Watson Marlow). 0 efluente foi colhido em garrafas de vidro de 1 litro contendo 20 ml de uma solução de ácido oxálico (12 g/lOOml em água desíonizada). Este foi adicionado para inibir a continuação da actividade microbiológica. 58

Ração: Cada vaso foi alimentado diariamente com um saco contendo 30 g da ração GH313 em granulado disponível no mercado (89% de matéria seca) e 2,5 g de palha de cevada (905 de matéria seca) cortada em comprimentos de 1-2 cm. Adicionou-se à fase líquida de todos os vasos de fermentação 7 g de amido de milho (N° de Catál, Sigma S4126), na altura da alimentação, nos quatro últimos dias da experiência para simular a acidose aguda.

Doadora de líquido ruminai: O líquido ruminai foi colhido de uma vaca Guernsey seca de cinco anos. 0 animal foi alimentado duas vezes ao dia com 1,4 kg de GH313 e 2,3 kg de feno. O conteúdo do rúmen foi colhido por uma fístula nele localizada {Bar Diamond Inc. P,O,Box.60. Bar Diamond Lane. Parma. Idaho, 83660-0060. EUA).

Inoculação dos vasos: O conteúdo do rúmen foi colhido do animal doador fistulado às 08:00 h (antes da dose matinal de ração) . 0 material foi para o laboratório em frascos isolados pré-aquecidos e depois pressionado através de quatro camadas de gaze de algodão para outro frasco isolado pré-aquecido, Pesaram-se para cada um de oito sacos de nylon 70 g do resíduo sólido. Um saco contendo sólidos ruminais e outro contendo ração fresca foram colocados na câmara de alimentação de cada vaso, O conteúdo líquido de cada vaso consistiu de 100 ml de água desionizada, 200 ml de tampão artificial e 500 ml de líquido ruminai. Após terem sido montados e selados, os vasos foram colocados nos banhos de água, tendo-se o eixo do pistão sido ligado à barra motriz. Os tubos efluentes foram colocados nos frascos de recolha, O espaço superior de cada vaso foi 59 irrigado com C02, durante 2 minutos, e iniciou-se de seguida o motor do pistão e a bomba de infusão do tampão.

Manutenção diária e procedimento de amostragem: Estes procedimentos foram realizados todos os dias à mesma hora. Prepararam-se oito sacos de ração e aqueceu-se a 39°C uma garrafa de distribuição de 1 litro contendo tampão de infusão. 1. Os motores foram desligados e a bomba de infusão parada. As linhas de infusão foram bloqueadas com uma mola e desligadas da bomba. 2. Os vasos de fermentação foram removidos do banho de água e examinados um de cada vez. 3. Em cada vaso, extraiu-se a câmara de alimentação e os sacos de ração. No 2o dia substituiu-se o saco que continha os sólidos ruminais por um saco novo, enquanto nos dias subsequentes se substituiu o saco que tinha sido incubado durante 48 horas por um novo. A câmara é depois recolocada no vaso de fermentação. 4. 0 saco removido foi colocado num pequeno saco de plástico, ao qual se adicionou 25 ml de tampão do distribuidor. 0 saco foi lavado apertando o tampão durante 20 segundos e depois o liquido foi vertido no vaso. Este procedimento de lavagem foi repetido duas vezes com tampão fresco. 5. Após se voltar a montar o vaso, coloca-se de novo no banho de água e liga-se à barra motriz. A linha do tampão foi novamente ligada e o eléctrodo de pH recolocado. Enquanto se tratava do vaso seguinte, o frasco de recolha do efluente foi trocado e a porção superior do vaso purgada com CO2. 60 6. Repetiu-se este processo em todos os vasos, reiniciaram-se os motores e a bomba de infusão após a passagem do gás. No último vaso, a passagem de gás foi de duração semelhante à dos outros vasos.

Tratamento com acarbose: A acarbose foi obtida a partir de comprimidos Glucobay™ (Bayer, AAH Pharmaceuticals), contendo cada comprimido 100 mg da substância. Trataram-se vasos em duplicado com 0, 1, 10 e 100 mg/dia de acarbose adicionando um comprimido a cada um de dois sacos de ração para proporcionar 100 mg/vaso/dia. As doses inferiores foram preparadas dissolvendo/suspendendo um comprimido em 10 ml de tampão {originando uma solução de 10 mg/ml de acarbose). Em seguida, adicionou-se 1 ml desta solução a 9 ml de tampão, obtendo-se uma solução a 1 mg/ml. Desta, retirou-se 1 ml e adicionou-se aos conteúdos dos dois sacos de ração, obtendo-se 10 e 1 mg/vaso/dia. Por fim, a acarbose foi secada sobre a ração deixando os sacos a temperatura ambiente de um dia para o outro.

Análises: As perdas de matéria seca pelos sacos de nylon, após uma incubação de 48 horas, foram medidas secando os conteúdos do saco lavados numa estufa, durante 23 horas, a 65°C. As amostras do efluente (10 ml) foram colhidas diariamente e armazenadas a -20°C para análise posterior dos AGV e do lactato. O pH foi automaticamente registado em intervalos de 17 minutos, utilizando equipamento fornecido pela Philip Harris Education. Ajustou-se a cada vaso um eléctrodo de combinação através de uma saída estanque ao ar na tampa. Cada eléctrodo foi ligado a um SensorMeter e quatro destes foram ligados a um sistema de recolha e 61 armazenamento de dados DL plus 128. Os valores de pB gravados foram descarregados para um pC com software Datadisk 32 (Philip Harris Education) e depois transferidos para uma folha de dados para análise posterior. Os eléctrodos foram removidos dos vasos (na altura da mudança dos sacos de ração), lavados e colocados em tampão padrão a pH 7,0. A leitura foi de 7,0 + /- 0,1 unidades durante toda a experiência. Os eléctrodos eram recalibrados a pH 7,0 antes de ser recolocados nos vasos. Determinaram-se os AGV adicionando 0,1 ml de uma solução contendo uma mistura de 25g/100 ml de ácido metafosfórico e 1,2 g/100 ml de ácido crotónico a 1 ml de efluente- Esta mistura foi centrifugada durante 10 minutos a 12 000 g e transferiu-se uma aliquota do seu sobrenadante para uma ampola para auto-analisador. Os AGV foram separados e quantificados num cromatógrafo de gás Hewlett Pacitard série 6890 acoplado a um auto-analisador e detector de ionização de chama. Os ácidos foram separados numa coluna BP21 da SGE Ltd de 25 metros (0,33mm diâmetro externo, 0,22mm diâmetro interno e 0,25pm de espessura da película) . Utilizou-se o azoto como gás transportador, a um caudal de 1,9 ml/min. A temperatura da estufa era de 165°C e as portas de injecção e detectores foram mantidos a 250°C. As concentrações foram calculadas utilizando o ácido crotónico como padrão interno e o sistema foi calibrado com uma solução padrão contendo os ácidos acético, propiónico, butírico, isovalérico e n-valérico. O ácido L-lãctico foi determinado com o kit 826 da Sigma e o D-lactaco pelo mesmo procedimento, tendo-se apenas substituído o L-LDH por D-LDH (N° de Catálogo Sigma L2011) e o L-lactato por D-lactato {N° de Catálogo Sigma L0625), Os ensaios foram realizados numa microplaca de 96 poços e as absorvâncias medidas num leitor de microplacas Anthos equipado com um filtro de 34 0 nm. O sistema foi calibrado preparando soluções de D- e L-lactato de 0 a 100 mM.

Esquema cronológico:

Dia 0 Inocular. 3 Iniciar a recolha de efluente 5 Iniciar a medição diária do pH. 10 Iniciar a dosagem com acarbose (0, 1, 10 ou 100 mg/vaso/dia) em pares de vasos. Continuar até ao fim da experiência. 18 Adicionar amido suplementar a todos os vasos. 22 Terminar a experiência.

Bibliografia para esta secção:

Czerkawski, J.W. e Breckenridge, G. 1977. Design and development of a long-term rumen simulation technique (RUSITEC). British Journal of Nutrition, 38, 371 -384.

McDougall, E.I. 1948. Studies on ruminant saliva. 1. The composition and output of sheep's saliva. Biochemical Journal, 43, 99-1 09.

Resultados do Rusitec: acarbose 63 pH médio diário em modelo de acidose crónica Rusitec tratado com acarbose

E3 0 mg/vaso/dia acarbose m 1 mg/vaso/dia acarbose O 10 mg/vaso/dia acarbose 0100 mg/vaso/dia acarbose pH médio diário

Comparando o período de tratamento com o período de controlo precedente, verificou-se uma mudança relacionada com a dose da produção de AGV de -16%, -10%, +3% e -3% em resposta a adições de 100, 10, 1 e 0 mg/vaso/dia de acarbose. Verificou-se um desvio geral dos produtos de fermentação de acetato e propionato para butirato, com todos os tratamentos, entre os períodos de controlo e de tratamento, resultando em aumentos da produção de butirato de 134%, 76%, 27% e 24%, respectivamente, para as doses acima indicadas. Não se verificou acumulação de L-lactato neste estudo, confirmando que o modelo representa acidose crónica e não aguda.

Resultado do RUSITEC com acarbose

Esquema da experiência:

Os procedimentos de manutenção diária são os já descritos para a acarbose. 64

Vaca dadora de liquido ruminai - alimentada com granulado de GH313 e palha de cevada.

Alimentação diária - 30 g de granulado de GH313 mais 2,5 g de palha de cevada cortada EP 1 157 696 Bl.

Preparação do tratamento

Acarbose: adicionou-se 1 comprimido a cada saco para se obter 100 mg/vaso/dia.

Exemplo 8: Oito amostras de 57 mg pré-pesadas armazenadas no frigorifico em 380 2.1. No dia anterior à colocação dos sacos de ração no RUSITEC, dissolveu-se 57 mg de amostra em 2,28 ml de tampão (25 mg/ml) . Adicionou-se 0,21 ml desta solução a 1,9 ml de tampão, obtendo-se uma solução a 2,5 mg/ml. Adicionou-se 1 ml de cada solução a um saco de ração preparado, para se obter 25 e 2,5 mg/vaso/dia, e deixou-se secar de um dia para o outro a temperatura ambiente. 0 Exemplo 8 é utilizado como exemplo comparativo Esquema cronológico:

Dia 0 Inocular. 4 Iniciar a recolha de efluente 5 Iniciar a medição diária do pH. 9 Rever os dados, atribuir os vasos aos tratamentos. 10 Iniciar os tratamentos. 18 Terminar a experiência. 65

Efeito do tratamento com acarbose ou Exemplo 8 no pH médio diário no modelo de acidose crónica Rusitec 65 α

S Controlo 0 Acarbose 0,2 mM j □ Exemplo 8 0,02 mM □ Exemplo jB 0,002 mM i pH médio diário

Resultados e Conclusões: Nesta experiência, a acarbose a 0,02 mM, no Exemplo 8, causou um aumento do pH médio diário de 0,3 unidades, sendo de 0,7 unidades com uma concentração de 0,2 mM. Os tratamentos no Exemplo 8 com 100, 25 ou 2,5 mg de acarbose por vaso por dia, ou nenhum (controlo) provocaram variações da produção total de AGV de -15%, -8%, -1% e -11%, em comparação com o período de controlo precedente. Houve uma tendência para a redistribuição dos produtos de fermentação, aumentando a produção de butirato no período de tratamento relativamente ao controlo. Os aumentos proporcionais foram de 113%, 20%, 18% e 1%, respectivamente. Não se verificou acumulação de L-lactato neste estudo, confirmando que o modelo representa acidose crónica e não aguda.

PESQUISA DO ÁCIDO PROPIÓNICO RUMINAL IN VITRO REAGENTES Líquido ruminai: Uma vaca Guernsey seca, de oito anos, com uma fístula no rúmen (Bar Diamond Inc. P.O.Box.60. Bar 66

Diamond Lane. Parma. Idaho. 83660-0060. EUA) foi alimentada duas vezes ao dia com 1,4 kg de GI-I633 e 2,3 kg de feno. Este animal foi utilizado como fonte de conteúdo ruminai foi colhido às 08:00 h (antes da dose matinal de ração). O material foi levado para o laboratório num frasco isolado pré-aquecido e depois pressionado através de quatro camadas de gaze de algodão para outro frasco isolado pré-aquecido, armazenado numa incubadora a 40°C até o liquido ser distribuído pelos tubos de ensaio.

Tampão: Dissolver as seguintes substâncias em água desionizada. g/1 g/SOO ml 9,88 4,94 3,40 1,70 1,11 0,55

Na2HPCU. 2H20 ΚΗ2Ρ0λ NaH2P0/]. H20

Ajustar a pH 7,0 com NaOH 1 M.

Desoxigenar fazendo borbulhar uma mistura gasosa sem oxigénio (10% CO2, 5% H2 em azoto) pelo menos durante 5 minutos. 68g de amido de milho. Ex Cat. Sigma S-4126. 17g de a-cellulose. Ex Cat. Sigma C-6429. 15 g de farinha de soja de tipo 1. Ex Cat. Sigma S-9633.

Misturar bem.

Suspender em tampão, numa concentração de 200 mg/ml, imediatamente antes de utilizar. 67

Solução de ácidos metafosfórico/crotónico:

Foram dissolvidas as seguintes substâncias em água desioni zada: ácido metafosfórico a 25% (p/v), Ex. Cat. BDH 291 904A mais ácido crotónico a 1.21 (p/v), Ex Cat. Sigma C-4630

Mistura padrão de AGV:

Foram dissolvidas as seguintes substâncias em água desionizada: Concentração nominal PM Peso (mg) mM Acetato de Sódio. Ex Sigma Cat. S-7670 136.1 680 50 Propionato de Sódio. Ex Sigma Cat. P-1880 96,1 192 20 Butirato de Sódio. Ex Sigma Cat B-5887 110.1 110 10 Ácido n-Valérico. Ex Aldrich Cat. 24,037-0 102.1 102 10 Ácido iso-valérico, Ex Sigma Cat. 1-7128 102.1 102 10 Adicionou-se 1 ml de solução dos ácidos metafosfórico/crotónico a 100 i ml de mistura de AGV, dividindo-se em seguida em alíquotas para ampolas de amostrador líquido automático. 68

Procedimento: O ensaio foi realizado em tubos de centrífuga Sorvall de 16 ml.

Um comprimido contendo 100 mg de acarbose foi colocado em 10 ml de tampão e agitado até o comprimido estar completamente desfeito, obtendo-se uma solução de 10 mg/ml de acarbose. Esta solução foi seriadamente diluída em tampão até se obterem concentrações de 2, 0,4, 0,08 e 0,016 mg/ml. Adicionou-se 1 ml destas soluções a tubos de ensaio em triplicado (obtendo-se concentrações finais da mistura para ensaio de 1000, 200, 40, 8 e 1,6 pg/ml). Os tubos de controlo foram preparados substituindo a solução de acarbose por tampão. Adicionou-se 1 ml de suspensão de substrato a todos os tubos de ensaio, seguido de 3 ml de tampão desgaseifiçado aquecido e depois 5 ml de licor ruminai espremido. Inseriram-se rolhas Suba-Seal (n° 29) e reduziu-se a pressão no topo dos tubos passando uma agulha hipodérmica ligada a uma linha de vácuo através da rolha até o conteúdo do tubo fazer espuma. Os tubos foram então colocados numa incubadora a 40°C, durante 6 horas, e agitados de hora a hora. A concentração de AGV antes da incubação foi determinada preparando três tubos, como se se destinassem a incubação, mas adicionou-se a solução de ácidos metafosfórico/crotónico imediatamente após o licor ruminai. Estes tubos foram armazenados a 4°C e processados com os tubos pós-incubação. 69 A incubação foi terminada após 6 horas removendo as rolhas e adicionando uma solução dos ácidos metafosfórico/crotónico. Os tubos foram então centrifugados durante 8 minutos a 18 000 g, a 4°C, e uma alíquota do sobrenadante armazenada numa ampola de amostrador liquido automático até ser necessária para a análise dos AGV por cromatografia gasosa (conforme descrita no protocolo do RUSITEC).

CÁLCULO DOS RESULTADOS A produção de AGV totais e propionato durante a incubação foi determinada da seguinte forma: Em primeiro, calcularam-se as concentrações antes da incubação de AGV totais e ácido propiónico através da média das análises das amostras pré-incubação. Em seguida, para cada amostra incubada, obteve-se a produção durante a incubação subtraindo à concentração após a incubação a concentração antes da incubação. A proporção molar de ácido propiónico em AGV totais produzidos durante a incubação foi também calculada.

Calculou-se a média dos AGV totais e dos valores em % do ácido propiónico nos tubos replicados, assim como a média dos AGV totais e da % de ácido propiónico no controlo normalizada como 100%, e em seguida a variação provocada pelos tratamentos de teste expressa relativamente a este valor. 70 acarbose * Dose AGV Totais % Propionato pg/ml 1000 50 88 200 58 81 40 63 74 8 72 74 Ϊ, 6 92 94 0, 32 96 97 0 100 100

Teste in vivo de gado fistulado

Objectivo: Para determinar o efeito do agente para o teste, neste caso a acarbose, em acidose ruminai crónica induzida em gado fistulado. 0 perfil de pH ruminai representativo de acidose crónica foi induzido pelo aumento gradual do grau de alimentação com concentrado de uma dieta especificada e pela redução da forragem carnuda oferecida. A isto seguiu-se o tratamento de cada animal com acarbose, administrada através de uma fístula ruminai permanente, para avaliar a sua capacidade de normalizar o pH do rúmen.

Animais experimentais: Seis novilhos Hereford χ frísios fistulados, pesando 170-230 kg (fornecidos por Cwmnant Calves Ltd. Cwmnant, Tregaron, Ceredigion, País de Gales}.

Tratamento: Glucobay® 100. Acarbose 100 mg por comprimido.

Controlo: 0 gado foi alimentado com granulado GH651 para produção de carne de elevado teor em cereais (quantidade 71 variável), com palha de cevada (quantidade variável), dividida em dois períodos de alimentação, cerca das 08.00h e das 14,30 horas, todos os dias. Foram registados os tempos precisos de alimentação. Foi disponibilizada água sem restrições. Os animais foram individualmente alojados em baias (9m2 por baia) num edifício de ambiente controlado mantido a 16°C.

Delineamento experimental:

Grupo Tratamento Formulação Via Acarbose (g/m) Volume (ml) N° de animais 1 Acarbose Sol. Aq. Através de fistula 4.0 100 6

Enquanto se induzia a acidose crónica, foram efectuadas determinações manuais do pH cerca de 5 e 8 horas depois da alimentação matinal. Colheram-se amostras de líquido ruminai para análise dos AGV e de lactato. Após ter sido gerado um perfil de pH adequado (veja-se a secção de procedimentos), colocou-se arreios em cada novilho para transporte de um dispositivo de amostragem e armazenamento de dados de pH (Philip Harris Plus 128 + pH First Sense Recorder). Os valores do pH ruminai foram automaticamente registados a cada 17 minutos, durante, no máximo, 21 dias. As amostras de liquido ruminai (10 ml) foram colhidas duas vezes ao dia para determinação das concentrações de AGV, razões molares e concentrações de lactato. Estas foram colhidas (removendo manualmente uma amostra do conteúdo do 72 rúmen com uma pequena concha de aço inoxidável, filtrando-a e transferindo-a para uma ampola de 10 ml de polipropileno) logo antes de a acarbose ser acrescentada ao rúmen em ambos os momentos de administração da dose. As sondas de pH eram removidas para limpeza e recalibração imediatamente antes da alimentação matinal.

Resultados: As curvas diárias de pH foram utilizadas para calcular o período durante o qual o pH ruminai se encontrou abaixo de 5,5, indicando assim acidose crónica.

Tempo a pH abaixo de 5,5 durante as fase de controlo e tratamento com acarbose

IO U> •o o £ '5 ja PS « 2 o X

0 Contrai 5H Acarbose 1 06:00 04:48 03:36 02:24 01:12 00:00

Tratamento

As amostras de líquido ruminai foram colhidas às 13.00h e às 16.00h, ou seja antes e depois da alimentação da tarde. Verificou-se pouca diferença das concentrações de AGV totais entre as amostras das 13.00h, mas a concentração de AGV nas amostras das 14.00h decaiu durante o período de tratamento, o que esteve de acordo com os perfis de pH. A percentagem de propionato foi mais baixa durante o período de tratamento em todos os tempos de amostragem. Não houve acumulação de ácido láctico nas amostras de líquido 73 ruminai, indicando que os animais não sofreram acidose aguda durante a experiência.

EFICÁCIA DA ACARBOSE EM GADO LEITEIRO EM LACTAÇÃO 0 estudo mediu o efeito da acarbose no pH ruminai, produção de leite e composição do leite em vacas leiteiras, às quais se tinha induzido acidose crónica através de uma dieta altamente fermentável. Neste estudo, determinou-se também a velocidade a que o gado se adaptou à introdução e remoção de acarbose.

Os animais da experiência consistiram em seis vacas Holstein/frísias multíparas com produção de leite, entre os 5 e os 11 anos de idade e os 500 e os 750 kg, com cânulas ruminais permanentes. Os animais iniciaram a experiência no começo da lactação, mas não antes do seu máximo, para permitir maior sensibilidade experimental. As principais determinações deste estudo foram o pH do saco ventral do rúmen, a produção de leite e a sua composição.

As práticas de controlo estiveram conforme o UK Home Office code of practice for the Housing and Care of Animais Used in Scientific Procedures (1989) (Código de boas práticas do Ministério do Interior britânico para o Alojamento e Cuidado de Animais Utilizados em Procedimentos Científicos). DELINEAÇÃO EXPERIMENTAL: Os animais incluídos no estudo receberam o artigo de teste durante 21 dias consecutivos, a partir dos momentos abaixo indicados. 74

Grupo de Tratamento Suplemento adicionado a partir do Suplemento adicionado a partir do Suplemento adicionado a partir do Número de animais dia 0 21° dia 42° dia T01 A B A 3 T02 B A B 3 A = Suplemento de Ração de Controlo B = Suplemento de Ração com Acarbose PROCEDIMENTO: Métodos de filtragem/redução de vieses: Foram incluídas no dia -1 do estudo seis vacas Hostein/frísias multíparas em lactação. Os animais foram emparelhados com base na data de parição (agruparam-se as vacas com datas de parição similares) . Em cada par, um animal recebeu T01 e o outro T02, tendo o tratamento sido atribuído aleatoriamente. Sempre que possível, restringiu-se a aleatorizaçâo para que os consumos de ração médios por grupo de tratamento fossem semelhantes. Métodos: Aproximadamente duas semanas antes do dia 0, oito animais iniciaram um período de alimentação preliminar concebido para identificar um regime alimentar que induzisse níveis de pH acidóticos no rúmen. A partir deste momento e até ao fim do estudo, as vacas foram mantidas em baias individuais. Foi proporcionada uma ração mista total (TMR) de controlo e, sempre que necessário, foi efectuado o ajuste da sua quantidade e composição para estabelecer um pH ruminai mínimo de 5,0 a 5,5. Calculou-se o consumo médio 75 durante os últimos cinco dias do período preliminar, valor que foi depois administrado a cada animal durante o ensaio. Os alimentos não consumidos foram removidos e pesados diariamente e antes da alimentação matinal. A TMR foi suplementada com 0,5 kg/dia de trigo moído, sem aditivos (Controlo) ou com o artigo de teste (15 g de acarbose por dia), sendo disponibilizada separadamente em metades iguais nas alimentações da manhã e da tarde. Utilizou-se também um sistema de água para que esta fosse proporcionada sem restrições.

Composição da TMR

Ingrediente % no total da ração DM

Silagem de feno 10,0 Silagem de milho o o Trinca de trigo 16, 7 Cevada moída 9,2 Farelos de colza 4,1 Farelos de soja 6,1 Melaço SBP 9,2 Farelo de trigo 8,2 Regumaize 4,0 Farinha de milho o (—1 Minerais 1/5 Total 100,0

Desde o início do estudo, todos os animais foram ordenhados duas vezes ao dia, cerca das Q6.30h e das 16.00h, por um 76 sistema de tubos, O peso do leite produzido foi registado manualmente e depois transcrito para um ficheiro electrónico diário do leite.

No dia -1, cada animal foi examinado fisicamente por um cirurgião veterinário para avaliar a sua normalidade física e clínica. Os animais cumpriram todos os critérios de inclusão e não apresentavam nenhum dos critérios de exclusão.

No dia 0 teve início o regime de alimentação com o artigo de teste descrito na secção DELINAMENTO EXPERIMENTAL. Três animais seguiram o esquema Controlo/Tratamento/Controlo (A/B/A) em três períodos experimentais consecutivos, enquanto um segundo grupo de três animais seguiu a sequência de tratamento oposta (B/A/B). Os períodos de alimentação experimentais duraram 3 semanas, consistindo em 2 semanas para adaptação e uma semana final para determinações detalhadas.

Os animais foram alimentados duas vezes ao dia, em intervalos desiguais, aproximadamente às Q8.00h e às IS.OOh (ou seja, intervalos de 7 e 17 horas) , para permitir que a amostragem de rúmen para a medição do pH se concentrasse durante o período de pH mínimo (que se calculou ser 2-4 horas após a segunda alimentação). Disponibilizou-se a cada animal 0,5 kg/dia de suplemento de trigo moído, acrescentado à TMR, e dividido igualmente durante os dois períodos de alimentação, não contendo qualquer aditivo (Suplemento A) ou contendo o artigo de teste (Suplemento B) . 77

Todos os animais terminaram o estudo após a medição final de pH do terceiro período experimental, no 62° dia. DETERMINAÇÕES: Utilizou-se um equipamento automático de medição do pH sistema de medição e armazenamento de dados Philip Harris Plus 128 + pH First Sense Recorder) para registar os valores de pH ruminai a cada 17 minutos. Uma amostra de 10-15 ml de líquido ruminai colhida às 07.30h e duas amostras colhidas aproximadamente no momento de pH mínimo (cerca das 18.00h e das 20.00h) foram imediatamente congeladas a -20°C para análise posterior. O peso de TMR fresca disponibilizada e recusada foi registado diariamente em para cada animal. Durante as semanas sem determinações (ou seja, o período preliminar e a Ia e 2a semanas de adaptação de cada período experimental), a matéria seca (MS) dos principais componentes da forragem (silagens de erva e milho) foi determinada cerca de uma vez por semana (ou mais frequentemente se fosse considerado necessário por avaliação visual da silagem). Nas semanas com determinações (ou seja, a 3a semana de cada período experimental), a MS da TMR foi medida diariamente nos últimos 5 dias, enquanto se preparou uma quantidade de cada um dos componentes da TMR (silagem de erva, silagem de milho, mistura de concentrado, trigo moído) a partir dos mesmos cinco dias para análise subsequente da dieta (ou seja, uma amostra por cada alimentação principal por período). Apenas se colheu uma amostra de Regumaize durante o estudo, pois trata-se de um líquido único a granel. 0 material recusado foi amostrado para determinação da MS durante os últimos 5 dias de cada período experimental. Foram colhidas amostras 78 individuais de 20 ml de leite para determinação da gordura, proteínas e lactose, nas ordenhas da manhã e da tarde, em 3 dias alternados de cada semana de adaptação. Durante a semana com determinações, as amostras de leite foram colhidas nos últimos 5 dias consecutivos. Cada amostra de leite foi analisada em separado. Além disso, colheu-se outra amostra de leite de 20 ml em cada ocasião de amostragem de leite das semanas com determinações, sendo congelada a cerca de -20°C para eventuais análises posteriores. Os dados sobre a produção diária de leite foram gerados pela soma das ordenhas da manhã e da tarde em cada data. Determinou-se, em cada período experimental, o peso em vida de cada animal. RESULTADOS: O pH ruminai foi calculado em tempo abaixo de pH 5,5 (ou seja, num estado de acidose crónica) nos períodos de tratamento e controlo. O tempo médio a pH inferior a 5,5 foi de 4,3 horas nos períodos de controlo e 3,4 horas nos períodos de tratamento. A gordura do leite aumentou extraordinariamente nos animais tratados, de uma média de 1033 g/dia para uma média de 1281 g/dia. A proporção de gordura do leite aumentou também, de 32,8 g/1 para 46,1 g/1.

Modelo de acidose aguda: avaliação da acarbose DELINEAMENTO EXPERIMENTAL: 79 TRATAMENTO Via N° de Animais No. Descrição 1 Controlo: ~200 ml água 2*dia durante 7 dias antes da exposição, 12,5 g/kg peso da mistura de exposição* Cânula 5 (3 vacas secas e 2 vitelos) 2 Acarbose: 1,07 mg acarbose/kg peso dissolvida em-^GO mL água 2*dia durante 7 dias, antes da exposição, 12,5 g/kg peso da mistura de exposição contendo 0,02 g/kg peso de acarbose Cânula 5 (2 vacas secas e 3 vitelos) *48,4% amido de milho, 48,4% milho moido, 2,1% caseinato de sódio, 1,1% ureia (grau alimentar) suspendidos em cerca de 19 litros de água morna

Procedimentos: Alojaram-se em grupo dez vacas secas e vitelos Holstein (peso inicial 740 ± 27 (EP) k.g, intervalo = 606-870 kg) durante o período de pré-tratamento; mais tarde, durante o período experimental, foram abrigadas individualmente. Os animais foram movidos para troncos de contenção durante a colheita das amostras, o tratamento, e a primeira exposição. Posteriormente, a amostragem e a administração das doses decorreu nas baias individuais. Disponibilizou-se aos animais cerca de 5 kg de feno de alfafa, 16 kg de silagem e 6 kg de concentrado e 5 kg de palha por dia, numa ração misturada total fornecida em duas alimentações (dieta 60:40 concentrado:forragem carnuda). Os animais só foram deitados em palha durante o período de pré-tratamento. Foi disponibilizada água sem restrições. Antes da administração dos tratamentos, os animais passaram 80 por um período de adaptação à ração de lactação igual ou superior a 10 dias. De um grupo de 6 vacas secas e 5 vitelos sem produção de leite, foram seleccionados 10 com base na exposição prévia à exposição e à sua saúde geral. Os animais foram emparelhados por peso e aleatoriamente atribuídos aos grupos de controlo e tratamento com acarbose em cada par, assegurando uma distribuição similar de vitelos e vacas. Nos dias de tratamento 0 a 6, os animais receberam 1,07 mg de acarbose/kg dissolvida em ~20G ml de água através da cânula do rumen imediatamente antes das alimentações da manhã {07.3 Oh) e da tarde (16.0 Oh). Os animais do Tratamento 1 receberam uma quantidade equivalente apenas de água. Nos dias 7 e 8, administrou-se a cada animal uma exposição à substância através da cânula. Quando o pH atingiu -4,5 e houve evidências de produção de L-lactato, considerou-se induzida a acidose aguda. Quando os animais sofriam acidose aguda por estes critérios, eram removidos os conteúdos do rumen e o rúmen inoculado com os conteúdos de um animal dador. Os animais foram pesados nos dias -1 e 5 para o cálculo da da dose de acarbose e das quantidades das exposições. Para o pH do líquido ruminai, adaptaram-se arreios aos animais para fixar um sistema automático de registo de dados do pH. O pH do rúmen foi registado a cada 10 minutos, durante os dias da exposição, até ao animal sofrer acidose aguda. Colheram-se as amostras de líquido ruminai (-50 ml) da cânula localizada no rúmen através de um tubo de amostragem filtrado. As amostragens foram efectuadas logo antes de cada exposição e 3, 6, 8, 10 e 12 horas depois. O pH foi medido imediatamente. As amostras para análise de AGV e lactato foram preparadas adicionando 10 ml de líquido 81 ruminai a 1 ml de uma solução contendo uma mistura de 25 g/lOOml de ácido metafosfórico e 1,2 g/100 ml de ácido crotónico logo após a colheita- Nalguns casos, a amostra foi filtrada através de gaze antes da medição do pH e tratamento com ácido. Esta mistura foi centrifugada durante 10 minutos a 12 000 g. Uma alíquota do sobrenadante foi removida para análise imediata do lactato e uma congelada para análise subsequente com o kit 826 da Sigma. Uma terceira alíquota foi transferida para uma ampola do auto-analisador para análise posterior dos AGV. Foi realizada uma determinação inicial do L-lactato durante o estudo, com o kit 735 da Sigma, para estabelecer o estado acidótico. Posteriormente, voltou a determinar-se o D- e o L-lactato para análise estatística, conforme é indicado abaixo. Os AGV foram quantificados num cromatógrafo de gás Hewlett Packard série 6890 acoplado a um auto-analisador e detector de ionização de chama. Os ácidos foram separados numa coluna BP21 de 25 metros da SGE Ltd. (0,33mm diâmetro externo, 0,22mm diâmetro interno e 0,25μπι de espessura da película). Utilizou-se azoto como gás transportador, a um caudal de 1,9 ml/min. A temperatura da estufa era de 165°C e as portas de injecção e detectores foram mantidos a 250°C. As concentrações foram calculadas utilizando o ácido crotónico como padrão interno e o sistema foi calibrado com uma solução padrão contendo os ácidos acético, propiónico, butírico, isovalérico e n-valérico. RESULTADOS: pH: Quanto à exposição, os dados de pH são apresentados como cálculo do tempo que o pH ruminai se manteve abaixo de 82 diversos pontos de corte. A primeira exposição não induziu acidose aguda, mas, depois da segunda, quatro dos animais de controlo manifestavam valores de pH abaixo de 4,5. A curta duração dos valores de pH inferiores a 4,5 deveu-se à sua remoção do estudo nesse momento. 0 pH ruminai manteve-se acima de 5,0 em todos os animais tratados, indicando que a acarbose preveniu a acidose aguda após a exposição a hídratos de carbono. Mostrou-se que o efeito do tratamento de redução do número de vacas que se tornaram acidóticas foi significativo (p<0,5) por análise de uma tabela de contingência simples.

Lactatos: Não se detectaram lactatos após a primeira exposição, mas as suas concentrações aumentaram para mais de 50 mM em quatro dos cinco controlos nas 10 horas subsequentes à segunda exposição e permaneceram a zero em todos os animais tratados com acarbose. O quinto controlo, cujo pH era de '-5,0, exibiu um valor máximo de lactato de 6 mM. O D-lactato, o L-lactato e os lactatos totais da segunda exposição são resumidos na tabela. Todos os lactatos foram mais elevados no grupo de controlo do que no grupo de tratamento, tendo havido uma tendência a favor do tratamento por interacção com o tempo (as diferenças aumentaram com o tempo). P-Lactato, L-lactato e Lactatos totais médios no grupo em amostras das exposições do 2° dia (mM) 83 Horas depois da 2 ' exposição D-Lactato L-Lactato Lactatos totais Controlo Acarbose Controlo Acarbose Controlo Acarbose 0 11,48 0, 67 3 , 82 0,35 15,30 1,02 3 42, 93 3, 63 15, 33 1,28 58,26 4,91 5 58, 19 10,91 O co r- I—1 3,08 76,08 13,99 7 74,69 O O CQ t—i 18,98 4,93 93, 92 22,93 Valores P Tratamento 0,0 4 0,03 0,04 Tempo <0,01 <0,01 <, 01 Tratamento 0,13 0,14 0,12 *Tempo Respostas do pH de cada animal à segunda exposição da hidratos de carbono

Tempo abaixo dos valores de corte para o pH após segunda exposição a hidratos de carbono

Φ—Vaca 1 (Γ) -B~Vaca2(C) Hb-Vaca3(T) —'Vaca 4 (Ç) |-^-Vaco 5 (T) -®~Vaca6(C) —Vaca 7 (C) ——Vaca 8 (T) —Vaca 9 (T) —4—Vaca 10 (C)·

4 4.4 5 55 6 65 7pH 84 DISCUSSÃO/CONCLUSÕES: 0 tratamento com acarbose duas vezes ao dia reduziu as respostas do pH a uma carga elevada de hidratos de carbono e bloqueou a produção de L-lactato em resposta a ela. As respostas do pH à primeira exposição foram similares nos dois grupos, tendo sido a segunda exposição que permitiu a distinção. Isto é semelhante às observações de Cowe, et ai. (J. Aním. Sei. 77:2259, 1999), segundo as quais a acidose aguda é induzida após múltiplas exposições.

Lisboa 19/12/2006

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES 1- O uso de um inibidor eficaz da α-amilase e/ou a-glucosidase bacteriana do rúmen na preparação de um medicamento para tratamento curativo, paliativo e profiláctico da acidose ruminai e afecções por ela provocadas, em que o inibidor é seleccionado de entre:

   em que N é 1, 2 ou 3 e quando N = 2 representa Trestatina A, N = 1 representa Trestatina B e N = 3 representa Trestatina C, e em que a acidose ruminai ou a afecção por ela provocada é seleccionada de entre: acidose ruminai crónica, acidose ruminai aguda, laminite, laminite crónica, diarreia intermitente, falta de apetite e ingestão cíclica de alimentos, elevada taxa de refugagem na manada devido a ? problemas de saúde relativamente indefinidos, más condições do organismo, abcessos sem causas óbvias, ulceração das solas, lesões da linha branca, hemorragias das solas, malformação dos cascos, coxear, abcessos hepáticos, doenças respiratórias, redução das taxas de fertilidade, redução do aumento de peso em gado de corte, redução da conversão de alimentos em gado de corte e diminuição da produção e qualidade de leite em gado leiteiro. 2. 0 uso de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor é seleccionado de entre acarbose, Trestatina A e Trestatina C.
2. 3. O uso de acordo com a reivindicação 2, em que o inibidor é seleccionado de entre acarbose e Trestatina C. 4. 0 uso de acordo com a reivindicação 3, em que o inibidor é a acarbose, 5. 0 uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o medicamento se destina ao tratamento de acidose ruminai crónica. 6. 0 uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o medicamento se destina ao tratamento de acidose ruminai aguda.
3. 7. O uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que, quando a afecção a tratar é a redução da qualidade do leite, a sua melhoria se manifesta sob a forma do aumento do conteúdo em gordura deste. 8. 0 uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o inibidor da a-amilase e/ou a-glucosidase bacteriana ruminai é utilizado em associação com um ou mais agentes utilizados no tratamento (incluindo na profilaxia) da doença. 3 9. 0 uso de acordo com a reivindicações 8, em que o inibidor da α-amilase e/ou ct-glucosidase bacteriana ruminai é utilizado em associação com um ou mais agentes antibióticos, antifúngicos, seleccionados de entre: tampões antiparasitários, anti-histaminicos, antibacterianos anti-inflamatórios suplementos nutricionais e emolientes.
4. 10. O uso de um ensaio como método de pesquisa na identificação de um inibidor da α-amilase e/ou a-glucosidase bacteriana ruminai adequado para o tratamento da acidose em ruminantes, em que o ensaio se caracteriza pela incubação de um composto com liquido ruminai e maltose e se mede a conversão de maltose a glicose por meios colorimétricos. Lisboa 19/12/2006