ES2552756T3 - Mezcla de flavonoides cítricos para mejorar la fermentación ruminal - Google Patents

Abstract

Mezcla que comprende del 10 al 25 % en peso de naringina, del 10 al 65% en peso de extracto de naranja amarga y la cantidad suficiente hasta el 100 % en peso de sepiolita para su uso en la mejora de la fermentación ruminal en rumiantes, en donde dicha mejora comprende limitar el crecimiento de las bacterias que causan acidosis ruminal.

Description

DESCRIPCION

Mezcla de flavonoides cftricos para mejorar la fermentacion ruminal

5 La presente invencion se refiere al uso de una mezcla de flavonoides cftricos destinada a mejorar la fermentacion ruminal.

ABREVIATURAS

10 AGV ACt AACt DGGE M. elsdenii 15 ns PCR S. bovis

Acidos grasos volatiles Incremento de los ciclos de amplificacion.

Incremento en los ciclos de amplificacion respecto a las muestras control en la PCR Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante Megasphaera elsdenii No significativo

Reaccion de la polimerasa en cadena Streptococcus bovis

Los animales mamferos no poseen enzimas digestivos adecuados para digerir los hidratos de carbono 20 estructurales, i.e. la celulosa. Por ello y con el objetivo de poder acceder a esta fuente de nutrientes tan importante, los animales herbfvoros han desarrollado unos compartimentos de fermentacion donde se instaura una flora simbiotica que es capaz de digerirlos o fermentarlos. Estos compartimentos se situan bien antes de la digestion enzimatica del animal hospedador (rumiantes) o posterior (fermentadores post-gastricos i.e. equidos, conejos). Los microorganismos del rumen utilizan, solo parcialmente, estos carbohidratos y liberan, como productos de 25 fermentacion, acidos grasos volatiles (acidos acetico, propionico y butmco) que constituyen la fuente de energfa mas importante en los animales rumiantes. Los microorganismos que proliferan en el rumen son aquellos capaces de adaptarse a las condiciones del compartimiento y utilizar los alimentos ingeridos. Las diferentes fracciones de alimento, carbohidratos y protemas se fermentan y la produccion de AGV se complementa con el excedente de la biomasa que se genera en el rumen y que constituye a su vez la principal fuente de protema absorbida finalmente en 30 el duodeno.

Las bacterias que fermentan la celulosa (celulolfticas) crecen a un pH optimo de 6.4-7 y producen mas acido acetico que las bacterias que fermentan de almidon y azucar (amilolfticas). Su pH optimo se situa en torno a 5.5 y cuando estos niveles descienden, se incrementa la produccion relativa de acido lactico.

35

Con la intensificacion de los sistemas de produccion de rumiantes, la alimentacion basada en forrajes ha sido sustituida por la administracion de raciones concentradas formuladas con cereales, lo que incrementa los ritmos de crecimiento y reduce los costes de explotacion. Sin embargo, las raciones concentradas o la sustitucion de hidratos de carbono estructurales (celulosa) por hidratos de carbono solubles de rapida fermentacion (almidon) lleva, sin 40 embargo, a la aparicion de ciertas disfunciones digestivas, i.e. acidosis y timpanismo.

La acidosis ruminal se puede definir como la alteracion digestiva producida por ingestion de grandes cantidades de alimentos ricos en carbohidratos fermentables y es una de las disfunciones mas comunes en el cebo de terneros. Puede desencadenar la muerte y empieza modificando la poblacion bacteriana de Gram negativos a Gram positivos, 45 favoreciendo el desarrollo de ciertas especies como S. bovis o Megasphaera elsdenii y modificando la proporcion de AGV. Tambien disminuye la proporcion de acido acetico y propionico y aumenta la de butmco y lactico. El aumento de acido lactico afecta la motilidad ruminal produciendo meteorismo por la incapacidad de eliminar el gas producido. Las manifestaciones de un cuadro agudo son anorexia, heces acuosas amarillo verdosas, atoma ruminal, cojeras, retraccion abdominal y deshidratacion. Las formas subagudas comprenden meteorismo frecuente, pelo anormal y 50 aparicion de abscesos hepaticos, que son observables en el despiece.

El timpanismo o meteorismo se define como una alteracion digestiva causada por la excesiva produccion y acumulacion de gas procedente de la fermentacion (dioxido de carbono y metano) lo que provoca una distension anormal en el reticulo-rumen.

55

Convencionalmente la adicion de sustancias antibioticas (ionoforos tales como la monensina) ha mantenido las disfunciones ruminales citadas previamente en un estado latente. Sin embargo la retirada paulatina de dichas sustancias como promotores de crecimiento ha desencadenado la aparicion de estas patologfas y ello se ha traducido en tasas de mortalidad o morbilidad elevada que tienen un efecto negativo en la rentabilidad de la 60 explotacion. El impacto de esta gestion sobre la productividad de las explotaciones es tan importante que son necesarias alternativas a estas sustancias antibioticas.

La patente US4443471 se refiere a diversos derivados qmmicos de los potenciadores de crecimiento de rumiantes M-139603 y M-139603 y a su uso en la reduccion de la proporcion de metano producida por la fermentacion ruminal.

La patente US5196432 se refiere al uso de antagonistas de los adrenoceptores alpha-2 en el tratamiento de los 5 rumiantes afectados de acidosis lactica.

La patente US5709894 describe un aditivo alimentario para rumiantes que comprende productos de fermentacion del acido glutamico y del mafz para aumentar la fermentacion ruminal.

10 La solicitud de patente US2003165487 describe procedimientos y composiciones basadas en el enzima amilasa de Aspergillus oryzae para mejorar la eficiencia de la fermentacion ruminal y prevenir el aumento perjudicial de las concentraciones de acido lactico ruminal, asf como para promover el crecimiento de los microorganismos ruminales beneficiosos.

15 La solicitud de patente US2004009209 describe un procedimiento para mantener sano el rumen en ruminates consistente en una mezcla de molasas de baja humedad y un agente tampon.

La solicitud PCT WO9119489 aporta un procedimiento para regular los niveles del pH ruminal por administracion de sales del acido succmico y de otros acidos carboxflicos en rumiantes alimentados con raciones altamente 20 energeticas.

La solicitud PCT WO9325616 se refiere a un preparado de almidon encapsulado en una matriz derivada de la reaccion de Maillard de protemas heterologas solubles y de azucares reductores para la mejora de la eficiencia de la fermentacion microbiana en el rumen de animales rumiantes.

25

La solicitud PCT WO2004009104 se refiere a una nueva cepa de M. elsdenii y a sus usos, incluyendo la prevencion y el tratamiento de la acidosis lactica en rumiantes.

La solicitud PCT WO2005000035 se refiere a un procedimiento para mejorar la fermentacion ruminal y en particular 30 reducir la metanogenesis, consistente en la administracion a los rumiantes de un extracto soluble de alfalfa obtenido a partir de alfalfa fresca.

La EP1323354 describe un aditivo alimentario natural basado en material vegetal.

35 Es conocido alimentar al ganado con subproductos de cultivos agrarios y del procesado industrial de alimentos.

Por ejemplo, subproductos cftricos alimentarios pueden ser usados como componentes de sistemas alimentarios para rumiantes. Estos contienen una variedad de substratos energeticos para los microbios del rumen (Bampidis et al. Animal Feed Science and Technology, Elsevier, vol. 128, 2006, 175-217). JP-52 028922 describe un medicamento que contiene entre otros componentes, piel de naranja amarga. Este medicamento se administra a 40 caballos, vacas y aves.

Los inventores de la presente solicitud han descubierto que una mezcla de flavonoides cftricos, especfticamente la naringina, extracto de naranja amarga y sepiolita es capaz de regular los procesos de fermentacion microbiana derivados de la administracion de raciones concentradas en rumiantes, incrementando la eficiencia de los procesos 45 de fermentacion microbiana y limitando el crecimiento de ciertas especies directamente relacionadas con los procesos de acidosis ruminal, especfticamente S. bovis.

Asf, la presente invencion se refiere a una mezcla que comprende naringina, extracto de naranja amarga y sepiolita para su uso en la mejora de la fermentacion ruminal en rumiantes.

50

En la presente solicitud el concepto “rumiante” incluye las especies de bovinos, ovinos, caprinos y camelidos.

Esta mezcla presenta un conjunto de ventajas frente al estado de la tecnica que la hace sumamente valiosa en el area de la nutricion de especies rumiantes. Las ventajas a destacar son que todos los ingredientes de la mezcla son 55 productos de origen natural y son facilmente asequibles. Por otra parte, la mezcla es de facil manejo y puede prepararse de acuerdo con los procedimientos industriales de formulacion conocidos por los expertos en la materia. Asimismo, la mezcla tiene la ventaja adicional de limitar el crecimiento de ciertas bacterias causantes de la acidosis ruminal, especialmente el S. bovis. Asf, la presente invencion se refiere en particular a dicha mezcla para su uso en la mejora de la fermentacion ruminal causada por un desajuste de la flora bacteriana natural del rumen. La presente 60 invencion tambien se refiere a dicha mezcla para su uso en la prevencion de la disminucion de la fermentacion ruminal que puede ser causada por un desajuste de la flora bacteriana natural del rumen. Un proposito particular del uso de la mezcla de la invencion es limitar el crecimiento de las bacterias que causan acidosis ruminal tales como Lactobacillus spp., por ejemplo Lactobacillus acidophilus y especialmente S. bovis.

La mezcla es activa cuando se incorpora en el pienso en forma solida en concentraciones del orden de 100 a 300 ppm (de 100 a 300 g/tonelada de pienso). Ello se basa en los estudios realizados in vitro en los que se analizo el efecto de la mezcla natural a dosis que variaron entre 100 y 300 ppm.

Segun un aspecto, la cantidad de naringina en la mezcla de la invencion es del 10% al 25%, preferentemente del 15% al 25% y mas preferentemente alrededor del 20% en peso.

Segun un segundo aspecto de la invencion, la cantidad de extracto de naranja amarga en la mezcla de la invencion 10 es del 10% al 65%, preferentemente del 20% al 60% y mas preferentemente alrededor del 40% en peso. Hay que destacar que el extracto de naranja amarga comprende naringina y por lo tanto la cantidad total de naringina en la mezcla de la invencion sera mayor que la cantidad arriba indicada.

Segun un tercer aspecto, la cantidad de naringina, extracto de naranja amarga y sepiolita es del 100% del peso de la 15 mezcla.

En una primera realizacion, la invencion se refiere a una mezcla que comprende del 10% al 25% en peso de naringina, del 10% al 65% en peso de extracto de naranja amarga y una cantidad suficiente hasta el 100% en peso (el balance de la mezcla) de sepiolita, para su uso en la mejora de la fermentacion ruminal en rumiantes.

20

En una realizacion derivada de la anterior, la mezcla comprende del 15% al 25% en peso de naringina, del 20% al 60% en peso de extracto de naranja amarga y la cantidad suficiente hasta el 100% de sepiolita y, mas espedficamente, el 20% en peso de naringina, el 40% en peso de extracto de naranja amarga y el 40% en peso de sepiolita.

25

Las proporciones arriba indicadas (% en peso) se refieren al peso total de la mezcla.

En otra realizacion, la mezcla para usar de mas arriba regula los procesos de fermentacion microbiana derivados de la administracion de raciones alimenticias concentradas.

30

En otra realizacion, la mezcla para usar de mas arriba limita el crecimiento de bacterias causantes de la acidosis ruminal, espedficamente el S. bovis. Asf, la presente invencion se refiere a la mezcla arriba descrita para usar en la prevencion o tratamiento de la acidosis ruminal, incluyendo las formas agudas y subagudas descritas en el presente documento.

35

En otra realizacion, la mezcla para usar de mas arriba optimiza la produccion en el engorde intensivo de rumiantes, especialmente terneras.

En otra realizacion, la mezcla para usar de mas arriba comprende la adicion al pienso en forma solida a 40 concentraciones de 10 a 2000 ppm en peso, espedficamente de 50 a 1000 ppm, y aun mas espedficamente de 100 a 300 ppm.

Los flavonoides son una clase de pigmentos vegetales hidrosolubles de creciente interes medicinal. La naringina es un flavonoide, concretamente una flavanona glicosilada, que se extrae de la piel de algunos dtricos (pomelo, Citrus 45 paradisi, y naranja amarga, Citrus aurantium) y es el principal responsable de su sabor amargo. Esta presente tambien en la pulpa de los frutos, en hojas, flores y semillas de la planta.

Algunos estudios sugieren que la biosmtesis de la naringina, como la de otras flavanonas, esta influenciada por factores ambientales y geneticos, determinando variaciones en los niveles de concentracion de estos compuestos, 50 estimado entre 15 a 18 g por kg de cascara fresca de pomelo como valor frecuente de concentracion. Ademas, la cantidad de piel vana, siendo mayor en frutos inmaduros que en maduros.

Usada en perfumena y para dar sabor a golosinas, bebidas y productos de panadena, la naringina continua siendo usada por sus propiedades antioxidantes y antimutagenicas, y como estabilizadora de aceites.

55

El extracto de naranja amarga puede obtenerse de frutas cftricas (especialmente Citrus aurantium) mediante operaciones ordinarias en la tecnica tales como extraccion, filtracion, concentracion, precipitacion, clarificacion y secado final. Los procesos de extraccion pueden llevarse a cabo en sistemas binarios alcanol/agua, donde el alcanol se selecciona entre metanol, etanol, propanol y similares. Se usa preferentemente metanol. Un extracto de naranja 60 amarga tfpico comprendera del 31,5 al 71,5% en peso, p.e. del 45 al 55% en peso de flavonoides totales (si se determina mediante HPLC). Los flavonoides en particular incluyen naringina, neohesperidina y poncirina. Tfpicamente, el contenido total de flavonoides comprendera (a) del 17,5 al 35,1 % en peso, p.e. del 25 al 27 % en

peso, de naringina, (b) del 7,7 al 16,9 % en peso, p.e. del 11 al 13 % en peso, de neohesperidina y (c) del 2,1 al 6.5 % en peso, p.e. del 3 al 5 % en peso, de poncirina.

A su vez, la sepiolita es un silicato natural hidratado de magnesio que debe su origen a la sedimentacion calcarea de 5 fosiles marinos. Se trata de un mineral de arcilla de color blanco o con ligera coloracion amarilla. Se ha utilizado desde antiguo como pasta dental en polvo.

La mezcla de la presente invencion se administra a ruminates que sufren o tienen riesgo de sufrir un deterioro de la fermentacion ruminal. Tales rumiantes incluyen en particular:

10 1) Rumiantes alimentados con dietas altamente concentradas (cereales), p.e. para mejorar la eficiencia

alimentaria e impedir la aparicion de procesos de quetosis, especialmente si el rumiante es

a) un animal de engorde bajo un sistema intensivo;

b) una hembra con producccion alta de leche en el pico de lactancia, cuando el aporte del concentrado alcanza la mayor proporcion; o

15 c) una oveja o cabra en avanzado estado de gestacion que lleva mas de una cna cuya capacidad de

ingesta ha sido reducida.

2) Rumiantes sujetos a cambios de dieta repentinos, especialmente si el cambio es

a) desde pasto (forraje) a raciones altamente concentradas; o

b) desde almidon poco digerible (sorgo or mafz) a uno muy digerible (trigo o cebada).

20

A modo de ilustracion simplemente, se aporta el siguiente ejemplo a fin de una mayor comprension de la invencion.

Eiemplo 1: Efectos de la mezcla en terneros a dosis de 100 y 300 ppm.

25 La dinamica de fermentacion se analizo a partir del protocolo propuesto por Theodorou M K et al., Animal Feed Science and Technology, 48 (3), p.185-197, Aug 1994. Para ello se utilizo inoculo lfquido ruminal de terneros procedentes de explotaciones comerciales en regimen de cebo intensivo. La mezcla de la invencion se incubo con el inoculo y pienso comercial de terneros (600 mg) suplementado con paja de cereales en las proporciones habituales (80:20; concentrado: paja). Las dosis de mezcla se incubaron por triplicado en dos tandas (2 terneros) en botellas 30 hermeticamente cerradas con 800 mL de una dilucion del inoculo.

La prueba tuvo una duracion de 48 horas registrandose la presion en el interior de la botella a las 2, 4, 6, 12, 24, 36 y 48 h. A partir de los valores de presion se establecio la produccion de gas. Tras 10 horas de incubacion una de las botellas fue apartada y se procedio al muestreo del contenido para la determinacion de AGV y aislamiento del DNA 35 que se utilizo para las pruebas de genetica molecular.

La extraccion de DNA se realizo mediante un QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Qiagen Ltd, Carwley, West Sussex, UK). La concentracion y pureza del DNA (DNA total) fue determinada espectrofotometricamente (NanoDrop®) midiendo la absorbancia a 260 y 280 nm.

40

La cuantificacion del DNA bacteriano y del S. bovis se realizo mediante PCR a tiempo real mediante el equipo ABI PRISM® 7000, Sequence Detection System, utilizando cebadores espedficos para bacterias totales (Maeda H et al., FEMS Immunology and Medical Microbiology, 39 (1), p.81-86, Oct 2003) y de S. bovis (Tajima K et al., Applied and Environmental Microbiology, 67 (6), p.2766-2774, Jun 2001). Como referencia para calcular la concentracion de 45 bacterias totales en el medio se utilizo un concentrado de DNA de muestras de bacterias obtenidas por centrifugacion diferencial del lfquido ruminal (500 g, 10 min., seguido por 20,000 g, 20 min.). La abundancia de S. bovis se expreso de forma relativa al de bacterias totales utilizando la expresion AACt descrita por Livak K J et al., Methods (San Diego, Calif.), 25 (4), p.402-408, Dec 2001.

50 Los estudios de biodiversidad bacteriana se realizaron mediante DGGE utilizando cebadores espedficos (Nubel U et al., Journal of Bacteriology, 178 (19), p.5636-5643, Oct 1996). La electroforesis se realizo en un gel de acrilamida al 8% con un gradiente desnaturalizante de urea/formamida, comprendido al 50-65%, durante 16 horas a 80V. La tincion del gel se realizo utilizando el kit Amersham Biosciences (Suecia) y tras ser escaneados se analizo el patron de bandas mediante el programa UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Arithmetic averages).

55

El efecto de la mezcla sobre la fermentacion ruminal se analizo segun un diseno factorial 2 x 2 (mezcla x dosis), considerando el animal como bloque experimental.

RESULTADOS

1.- Produccion de gas

En las condiciones in vitro descritas previamente, la inclusion de la mezcla en el medio no tuvo ningun efecto, ni en la cinetica de produccion de AGV ni en la produccion total de AGV. El tratamiento experimental tampoco afecto a las proporciones molares de los AGV mas importantes, que mostraron una proporcion media de 60 % de acido acetico, 29 % de acido propionico y 9 % de acido butmco.

5

2 - Cuantificacion bacteriana por PCR a tiempo real

En la Tabla 1 se presenta la concentracion total de DNA obtenida por espectrofotometna (260 nm) y en ella se aprecia como la concentracion de DNA en el medio de cultivo no era modificada por la inclusion de la mezcla. Sin 10 embargo, la determinacion de la cantidad de DNA bacteriano mediante un procedimiento mas espedfico, la PCR a tiempo real, permitio observar como la inclusion de la mezcla daba lugar a un incremento significativo en DNA bacteriano que refleja un incremento en el crecimiento bacteriano. La existencia de diferencias significativas en el crecimiento microbiano derivadas de la presencia de la mezcla, sin que dichas diferencias puedan constatarse ni en la produccion de gas (CO2 + NH3) ni en una mayor liberacion de AGV al medio, indica un efecto positivo de la mezcla 15 sobre la eficiencia de la smtesis microbiana.

En la misma tabla se presenta tambien la concentracion de copias de secuencias espedficas de DNA para el S. bovis, habiendose identificado esta bacteria como una de las principales productoras de acido lactico y por tanto relacionada con las patologfas derivadas de una acidosis ruminal. La adicion de la mezcla produjo una limitacion 20 significativamente alta de la concentracion de la especie en el medio, siendo expresada dicha concentracion como numero de copias de DNA correspondientes a S. bovis (2(ACt)*1000) en relacion al numero total de copias de DNA bacteriano o como una reduccion en el porcentaje del numero de copias frente al medio control (2(AACt)).

Tabla 1: Concentracion de diferentes tipos de DNA en el medio de cultivo calculada mediante PCR a tiempo real. Se 25 presenta tambien el numero de copias 16S DNA en el medio como mdice de la biodiversidad bacteriana

Dieta

Control Mezcla Significacion

Dosis (ppm)

100 300 RSD Dieta Dosis

DNA Total

(pg/ml) 37,3 39.7 32.3 6,98 ns ns

DNA Bacteriano

(pg/ml) 8,19 24.3 b 21.5b 2,75 0,0018 ns

S. bovis

2(ACt) *1000 4,03 1.17 b 1.1 b 0,84 0,01 ns

S. bovis

2(AACt) 0,31 0.29 0,14 ns

DGGE

N 15,50 15,0 15.9 1,44 ns ns

Al analizar el efecto dosis de la mezcla sobre los parametros anteriores, no se aprecian diferencias significativas con 30 la concentracion de la mezcla. Por tanto, los resultados obtenidos sugieren que las concentraciones iniciales de 100 y 300 ppm exceden el umbral de actividad de dichos compuestos sobre los procesos de fermentacion ruminal. Por otra parte, aunque la mezcla objeto del presente estudio modifico la concentracion de S. bovis, no modifico la biodiversidad de la poblacion. Esto confirma el efecto selectivo de dichas sustancias sobre ciertas poblaciones microbianas.

35

3.- Conclusiones y ventajas

La suplementacion de la mezcla en estudio sobre inoculos procedentes de raciones alimenticias concentradas administradas en condiciones de cebo intensivo comercial da lugar a variaciones significativas en los procesos de 40 fermentacion ruminal.

La presencia de la mezcla no modifica los niveles de produccion de gas ni de AGV. Sin embargo, muestra un efecto significativo sobre las diferentes poblaciones microbianas del inoculo. Asf, mientras promueve un incremento significativo en los niveles de smtesis en la poblacion, reprime significativamente el crecimiento de S. bovis.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Mezcla que comprende del 10 al 25 % en peso de naringina, del 10 al 65% en peso de extracto de naranja amarga y la cantidad suficiente hasta el 100 % en peso de sepiolita para su uso en la mejora de la fermentacion

   5 ruminal en rumiantes, en donde dicha mejora comprende limitar el crecimiento de las bacterias que causan acidosis ruminal.
2. 2. Mezcla de la reivindicacion 1, donde la mezcla comprende del 15 al 25 % en peso de naringina, del 20 al 60 % en peso de extracto de naranja amarga y la cantidad suficiente hasta el 100 % de sepiolita.

   10
3. 3. Mezcla de la reivindicacion 2, donde la mezcla comprende el 20 % en peso de naringina, el 40 % en peso de extracto de naranja amarga y el 40 % en peso de sepiolita.
4. 4. Mezcla de las reivindicaciones 1 a 3 donde el extracto de naranja amarga comprende del 31,5 al 71,5% en peso 15 de total de flavonoides.
5. 5. Mezcla de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el extracto de naranja amarga comprende del 44 al 55% en peso del total de flavonoides.

   20 6. Mezcla de la reivindicacion 4 o 5 donde el total de flavonoides comprende (a) del 17,5 a 35,1% en peso de naringina, (b) del 7,7 al 16,9% en peso de neohesperidina y (c) del 2,1 al 6,5% en peso de poncirina.
6. 7. Mezcla de la reivindicacion 4 o 5 donde el total de flavonoides comprende (a) del 25 a 27% en peso de naringina, (b) del 11 al 13% en peso de neohesperidina y (c) del 3 al 5% en peso de poncirina.

   25
7. 8. Mezcla de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde dicha mejora regula los procesos de fermentacion microbiana en rumiantes a los que se administra raciones alimenticias concentradas.
8. 9. Mezcla de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde

   30 la bacteria causante de la acidosis ruminal es el Streptococcus bovis.
9. 10. Mezcla de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde dicha mejora optimiza la produccion del engorde intensivo de rumiantes.

   35 11. Mezcla de la reivindicacion 10 donde los rumiantes son terneras.
10. 12. Mezcla de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende la adicion de la mezcla al pienso en forma solida a concentraciones de 10 a 2000 ppm en peso.

    40 13. Mezcla de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende la adicion de la mezcla al pienso en forma solida a concentraciones de 50 a 1000 ppm en peso.
11. 14. Mezcla de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende la adicion de la mezcla al pienso en forma solida a concentraciones de 100 a 300 ppm en peso.

    45
12. 15. Uso de una mezcla que comprende del 10 al 25 % en peso de naringina, del 10 al 65% en peso de extracto de naranja amarga y la cantidad suficiente hasta el 100 % en peso de sepiolita en la fabricacion de un medicamento para mejorar la fermentacion ruminal en rumiantes, en donde dicha mejora comprende limitar el crecimiento de las bacterias que causan acidosis ruminal.

    50

    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION

    Esta lista de referencias citadas por el solicitante es unicamente para la comodidad del lector. No forma parte del 5 documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilacion de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

    Documentos de patentes citados en la descripcion

    10

    • US 4443471 A [0009]

    • US 5196432 A [0010]

    • US 5709894 A [0011]

    • US 2003165487 A [0012]

    • US 2004009209 A [0013]

    • WO 9119489 A [0014]

    Literatura diferente de patentes citada en la descripcion

    WO 9325616 A [0015]

    WO 2004009104 A [0016] WO 2005000035 A [0017] EP 1323354 A [0018]

    JP 52028922 A[0019]

    • BAMPIDIS et al. Animal Feed Science and Technol-

    15 ogy a.i'b. ,'o. 1^-. Ut ’\-! [0019]

    • THEODOROU M K. Animal Feed Science and Technology. August 1994, vol. 48 (3), 185-197 [0042]

    • MAEDA H et al. FEMS Immunology and Medical

    20

    • TAJIMA K et al. Applied and Environmental Microbiology, June 2001, vol. 67 (6), 2766-2774 [0045]

    • LIVAK K J et al. Methods, December 2001, vol. 25 (4), 402-408 [0045]

    • NUBEL U et al. Journal of Bacteriology, October 1996, vol. 178 (19), 5636-5643 [0046]