TWI423767B

TWI423767B - 用以增進瘤胃發酵的檸檬酸類黃酮之混合物

Info

Publication number: TWI423767B
Application number: TW098100588A
Authority: TW
Inventors: Maria Del Mar Serra; Fernando Heredia; Joaquim Balcells; Francisco Javier Crespo
Original assignee: Exquim S A
Priority date: 2008-01-09
Filing date: 2009-01-09
Publication date: 2014-01-21
Also published as: JP2011509276A; BRPI0907120A2; EP2085083A1; US20100291239A1; CL2009000030A1; KR101563759B1; EP2242490B1; DK2242490T3; AR070133A1; KR20100102633A; CA2710651A1; CN101909616B; AU2009203752A1; WO2009087194A1; PL2242490T3; TW200936057A; RU2010133259A; HK1150781A1; JP5337166B2; US8377487B2

Description

用以增進瘤胃發酵的檸檬酸類黃酮之混合物

本發明係關於使用一種檸檬酸類黃酮之混合物用以增進瘤胃發酵。

縮寫

VFA　揮發性脂肪酸

ΔCt　在擴增循環數目上的增加

ΔΔCt　相對於在PCR中之控制樣品的擴增循環數目上的增加

DGGE　變性梯度凝膠電泳

M. elsdenii 　埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii )

ns　無顯著性

PCR　聚合酶鏈反應

S. bovis 　牛鏈球菌(Streptococcus bovis )

哺乳動物不具有用於分解結構性碳水化合物(亦即纖維素)之適當消化酵素。因此，為了攝取此類重要的營養源，草食性動物已經發展出供收容能夠分解或發酵此類營養物之共生群相的發酵隔室。此等隔室位於宿主之酵素消化作用之前(反芻動物)，或接續在其之後(後胃發酵槽，亦即馬科動物、兔子)。瘤胃的微生物僅部份使用此等碳水化合物，並釋放出揮發性脂肪酸(醋酸、丙酸與丁酸)做為發酵產物，其為反芻動物最重要的能量來源。在瘤胃中繁殖之微生物為該等，能夠適應該隔室之條件並可利用已攝取食物者。在瘤胃中不同食物部分(碳水化合物與蛋白質)被發酵，並由瘤胃中所產生之過剩生物質來補充VFA生產，接著，主要的蛋白質來源最後於十二指腸中被吸收。

纖維素發酵性細菌(纖維素分解性)最適生長於6.4-7之pH值下，且較發酵澱粉與糖類之品種(澱粉分解性)產生更多醋酸。其最適的pH值為約5.5左右，且當此等含量減低時，乳酸之相對產量會增加。

隨著反芻動物生產系統之強化，以飼料為主的飼育方式已經被取代以，供給與穀物調配成之濃縮口糧，可增加生長速率及降低操作成本。然而，濃縮口糧或是將結構性碳水化合物(纖維素)置換以快速發酵的可溶性碳水化合物(澱粉)，會導致出現某些消化功能障礙，例如酸中毒及timpanism症。

反芻動物之酸中毒可定義為，因攝入大量富含可發酵性碳水化合物所產生的消化病變，且其為肥育期小牛最常見之功能障礙。其會導致死亡且開始於細菌族群從革蘭氏陰性改變成革蘭氏陽性，有利於諸如牛鏈球菌(S. bovis )或埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii )等菌種之發展，及改變VFAs的比例。醋酸與丙酸的比例減少，而丁酸與乳酸的增加。乳酸增加影響瘤胃之運動性，產生由於無法排除所產生之氣體而造成的鼓脹(meteorism)。急性症狀為食慾減退、黃綠色水樣面容、瘤胃無緊張力、跛行、異常退縮及脫水。次急性形式包含經常性鼓脹、毛髮異常及在屠殺後發現有肝膿腫出現。

timpanism症或鼓脹係定義為，一種因為自發酵作用過量製造及累積氣體(二氧化碳與甲烷)，導致網-瘤胃異常膨脹所造成的消化病變。

傳統上，添加抗生物質(離子通道劑例如莫能菌素(monensin))，已可使前述瘤胃功能障礙維持在潛伏狀態。然而，為增加生長而逐漸取消此類物質，會導致此等病況出現，造成高死亡率或罹病率，對於反芻動物具有負面衝擊。在畜農產量之衝擊上很重要，以致有需要取代此等抗生物質之替代品。

美國專利第4443471號揭示，M-139603之不同化學衍生物與M-139603反芻動物生長增強劑，及其用於減低因瘤胃發酵產生之甲烷量的用途。

美國專利第5196432號揭示，阿伐-2腎上腺素受體拮抗劑用於治療受乳酸中毒之反芻動物的用途。

美國專利第5709894號描述，用於反芻動物增進瘤胃發酵之食物添加劑，其包含谷胺酸與玉米發酵產物。

美國專利申請案第2003165487號描述，以米曲霉(Aspergillus oryzae )之澱粉酵素為主，用以增加瘤胃發酵效率並預防有害增加瘤胃乳酸濃度，促進有益的瘤胃微生物生長之方法及組成物。

美國專利申請案第2004009209號涵括一種用於保持反芻動物瘤胃健康之方法，其包含低濕度糖蜜與緩衝劑之混合物。

PCT專利申請案WO9119489描述一種用於調節瘤胃pH值之方法，其係藉由將琥珀酸與其他羧酸鹽類施予餵給高能量配額食物之反芻動物。

PCT專利申請案WO9325616揭示一種包封於衍生自可溶異源性蛋白質與還原糖之美拉德反應(Mailard reaction)之基材中的澱粉產物，用以改善反芻動物瘤胃中之微生物發酵作用的效率。

PCT專利申請案WO2004009104揭示一種埃氏巨球形菌之新菌株及其用途，包括預防及治療反芻動物之乳酸中毒。

PCT專利申請案WO2005000035揭示一種用於增進瘤胃發酵，及(特別是)減低甲烷生成之方法，其包含投予得自新鮮紫花苜蓿草之可溶性苜蓿萃取物。

EP 1 323 354描述一種以植物原料為主之天然飼料添加物。

將農作物及食品加工業之副產品餵食給家畜為已知。舉例而言，柑橘副產品飼料可用做為反芻動物餵養系統的組成份。彼等含有各種供給瘤胃微生物之能量受質(龐比迪斯等人，動物飼料科學與技術，艾司維爾，卷128，2006，175-217)。JP-52 028922描述一種含有(尤其是)苦橙皮之藥劑。該藥劑係餵予馬、牛或家禽類。

本申請案之發明人已發現，檸檬酸類黃酮(特別是柚及苷)、苦橙萃取物與海泡石之混合物，能夠調節反芻動物中由於餵予濃縮口糧所衍生出的微生物發酵過程，增加微生物發酵過程之效率，及限制某些與瘤胃酸中毒過程直接相關之特定菌種(特別是牛鏈球菌)的生長。

因此，本發明關於一種包含柚皮苷、苦橙萃取物與海泡石之混合物，用於增進反芻動物之瘤胃發酵的用途。

於本申請案中，“反芻動物”包括牛、綿羊、山羊與駱駝科動物。

此混合物呈現一系列與該技藝現況相關的優點，使其在反芻動物營養領域中具有極高價值。優點在於，混合物之所有成份皆為天然來源之產物且可容易獲得。另一方面，該混合物容易掌控，且可根據該領域中熟練者已知之工業調配程序製備得。此混合物亦具有限制某些與瘤胃酸中毒出現相關之特定菌種(特別是牛鏈球菌)的生長之額外優點。因此，本發明尤其係關於該混合物用於增進，因瘤胃中天然細菌群相不平衡而減弱之瘤胃發酵的用途。本發明亦關於該混合物用於預防，其可能因瘤胃中天然細菌群相不平衡所造成之瘤胃發酵減弱的用途。一項使用本發明混合物之目的為，欲限制引起瘤胃酸中毒之細菌，例如乳桿菌屬(例如嗜酸乳桿菌[Lactobacillus acidophilus ])及特別是牛鏈球菌的生長。

混合物當呈固體形式，以濃度為100至300ppm(100至300克/噸飼料)添加於飼料中時具有活性。此係以活體外研究為基準，其中係於100至300ppm之劑量範圍下分析天然混合物的功效。

根據一方面，本發明混合物中柚皮苷之含量為10重量%至25重量%，較佳地15重量%至25重量%且更佳地為約20重量%。

根據第二方面，本發明混合物中苦橙萃取物之含量為10重量%至65重量%，較佳地20重量%至60重量%且更佳地為約40重量%。須注意，苦橙萃取物包含柚皮苷，而因此本發明混合物中柚皮苷之含量將會高於前述所載之含量。

根據第三方面，柚皮苷、苦橙萃取物與海泡石之量為混合物之100重量%。

於第一項具體態樣，本發明揭示一種包含10重量%至25重量%之柚皮苷，10重量%至65重量%之苦橙萃取物與足量達到100重量%(混合物的扣除後餘額)之海泡石的混合物，用於增進反芻動物之瘤胃發酵的用途。

於一項衍生自前述之具體態樣，該混合物包含15重量%至25重量%之柚皮苷、20重量%至60重量%之苦橙萃取物與足量達到100重量%之海泡石，且更特別地包含20重量%之柚皮苷、40重量%之苦橙萃取物與40重量%之海泡石。

前述所載之比例值(重量%)係指該混合物之總重量。

於另一項具體態樣，前述混合物之用途係調節由於投予濃縮食物配糧所衍生出的微生物發酵過程。

於另一項具體態樣，前述混合物之用途係限制引起瘤胃酸中毒之細菌(特別是牛鏈球菌)的生長。因此，本發明亦關於前述混合物用於預防或治療瘤胃酸中毒，包括本文所描述之急性與次急性形式的用途。

於另一項具體態樣，前述混合物之用途係使反芻動物(特別是小牛)之集約肥育產量達到最佳化。

於另一項具體態樣，前述混合物之用途包含將彼等呈固體形式，以濃度為10至2000ppm(以重量計)，特別是50至1000ppm，且甚至更特別地100至300ppm，添加於飼料中。

類黃酮是一類醫藥界漸感興趣之水溶性植物色素。柚皮苷為一種類黃酮(特別是經糖苷化之黃烷酮)，其得自某些柑橘類果實(葡萄柚(Citrus paradisi )及苦橙(Citrus aurantium ))，且為彼等的苦味主要成因。其亦經發現存在於植物之果肉、葉、花與種子中。

有些研究暗示，柚皮苷之生合成(類似其他黃烷酮)受到環境及遺傳因子影響，決定此等化合物濃度在程度上之變異，以每公斤新鮮葡萄柚果皮含15至18克做為經常濃度值進行評估。果皮中的量亦有差異，未成熟果實中的高於成熟果實。

柚皮苷因其具有抗氧化及抗突變發生特性，以及做為油類安定劑，而持續被使用於香料製造，及添加香料於甜點、飲料與烘焙產品。

苦橙萃取物可藉由該項技藝之一般操作，例如萃取、過濾、濃縮、沈澱、澄清及最後的乾燥，而自匍匐性柑橘類果實(特別是苦橙[Citrus aurantium ])獲得。萃取過程可於二元之烷醇/水系統中進行，其中烷醇係選自甲醇、乙醇、丙醇及其類似者。較佳係使用甲醇。代表性之苦橙萃取物將包含31.5重量%至71.5重量%(例如45至55重量百分比)之總體類黃酮(若以HPLC測定)。類黃酮尤其包括柚皮苷、新橙皮苷與枸橘苷。代表性地，總體類黃酮內含物將包含(a)17.5重量%至35.1重量%(例如25至27重量%)之柚皮苷、(b)7.7重量%至16.9重量%(例如11至13重量%)之新橙皮苷與(c)2.1重量%至6.5重量%(例如3至5重量%)之枸橘苷。

其次，海泡石為一種來源屬於海洋化石之石灰質沈積的天然水合矽酸鎂。其為白色或淡黃色黏土礦物。自從古代以來已經被使用做為粉末牙膏。

本發明之混合物係應用於，罹患瘤胃發酵減弱或有罹患瘤胃發酵減弱危險之反芻動物。此等反芻動物尤其包括：

1)餵給高-濃縮(穀類)食物之反芻動物，以(例如)改善飼料效率及避免出現酮病(ketosis)過程，特別是若該反芻動物為：

a)於集約系統下之肥育期動物；

b)正值產乳高峰期之高產乳雌性，當濃縮補給品達到最高比例時；或

c)懷有一隻以上子羊，其吸收能力已經受限制之疲倦妊娠期母羊或山羊。

2)遭逢突然的飲食改變之反芻動物，特別是若該改變係：

a)從牧草(高粗料)改變成高濃縮口糧；或

b)從低可消化澱粉(高粱或玉米)改變成高可消化性者(小麥或大麥)。

為例舉說明之目的，下列實施例係提供用以更加瞭解本發明。

實施例1：以劑量為100及300ppm之混合物於小牛中之功效

發酵動力學係基於由提歐多魯M K等人，動物飼料科學與技術 ，48(3)，p.185-197，1994年8月所提出之程序進行分析。所使用之接種物為從得自商業上集約肥育操作的小牛取得之瘤胃液體。將本發明之混合物(20重量%之柚皮苷、40重量%之苦橙萃取物與40重量%之海泡石)與該接種物及補充以通常比例之穀類稻草(80:20濃縮物：稻草)的市售小牛飼料(600mg)進行培育。將混合物確實分兩批(2隻小牛)以三重複，培育於具有800ml接種物稀釋液之密封瓶中。

該項測試持續48小時，於第2、4、6、12、24、36及48小時記錄瓶內的壓力。從壓力值確立氣體產量。經培育10小時後，將其中一瓶分開，並取樣其內容物用於測定VFA及分離DNA，用於分子遺傳學測試。

DNA萃取係由DNA Stool Mini套組(奎爾金股份有限公司，卡爾利，西薩西克斯郡，UK)完成。藉由分光光度計()，測量於260及280nm下之吸光度，而測定得DNA濃度與純度(總體DNA)。

藉由即時PCR使用ABI7000序列偵測系統，以特異於總體細菌(梅達H等人，FEMS免疫學與醫學微生物學 ，39(1)，p.81-86，2003年10月)與牛鏈球菌(田島K等人，應用與環境微生物學，67(6)，p.2766-2774，2001年6月)的引子，定量細菌及牛鏈球菌之DNA。吾等使用藉由瘤胃液之差速離心(500g ，10min，隨後以20.000g ，20min)所獲得之細菌樣本的DNA濃度，做為計算培養基中總體細菌濃度之參考值。使用由李瓦克K J等人，方法(聖地牙哥，加州)，25(4)，p.402-408，2001年12月所描述之ΔΔCt表示法，來表示牛鏈球菌相對於總體細菌之含量。

細菌之生物多樣性研究，係藉由使用特異性引子之DGGE(紐貝爾U等人，細菌學期刊，178(19)，p.5636-5643，1996年10月)來進行。電泳術係使用具有50%-65%變性尿素/甲醯胺梯度之8%丙烯醯胺凝膠，於80V下進行16小時。將凝膠使用艾默遜生物科學(瑞典)套組染色，並(在染色後)使用UPGMA(未稱重配對-組方法算術平均值)程式分析條帶型式。

混合物對於瘤胃發酵之影響，係根據2×2(混合物×劑量)複因子設計(考量該動物為一種實驗妨礙)進行分析。

結果

1.引引產量

於前述之活體外條件，將混合物包含於培養基中，並不影響VFA生產之動力學或總體VFA產量。實驗處理不影響最重要之VFA的莫耳比例，其顯示平均比例為60%醋酸、29%丙酸與9%丁酸。

2.由PCR之即時細菌定量

表1列示經由分光光度計(260nm)獲得之總體DNA濃度，且吾等可看見培養基中的DNA濃度，如何不因混合物之內含物而受到改變。然而，藉由較特異性之程序(即時PCR)測定細菌DNA，顯示混合物之內含物顯著增加細菌之DNA，表示細菌生長增加。在因混合物之存在所衍生出的細菌生長方面存在有顯著差異，而在氣體(CO₂ ＋NH₃ )產量或較大VFA釋出方面則未發現該差異，表示該混合物對於微生物合成效率具有正面影響。

同一表格亦列示特異於牛鏈球菌之DNA序列副本的濃度，已經確定此細菌為乳酸之主要生產者，而因此與由瘤胃酸中毒所衍生出之病況相關。添加該混合物可產生高度顯著限制此菌種在培養基中的濃度，其中該濃度係以對應於牛鏈球菌之DNA副本數量相對於細菌DNA副本之總數量(2(ΔCt)*1000)，或以副本數量相對於對照組培養基之減少百分比值(2(ΔΔCt))表示。

當吾等分析混合物對於前述參數之影響時，發現混合物濃度間並無顯著差異。因此，所得之結果暗示，最初的濃度100及300ppm超出該化合物對於瘤胃發酵過程之活性的閥值。另一方面，雖然該研究混合物改變牛鏈球菌之濃度，但其並未改變該族群的生物多樣性。此確定該物質對於某些特定微生物族群具有選擇性作用。

3.結論與優點

補充該研究混合物與得自在商業上集約肥育條件中所餵予之濃縮食物配糧的接種物，對於瘤胃發酵過程產生明顯變化。

混合物之存在並不會改變氣體或VFA生產程度。然而，其對於培養基中的不同微生物族群具有顯著影響。雖然其促進族群合成量之顯著增加，但明顯地壓制牛鏈球菌生長。

Claims

一種包含10重量%至25重量%之柚皮苷(naringin)、10重量%至65重量%之苦橙萃取物與足量達到100重量%之海泡石的混合物之用途，其係用於增進反芻動物中之瘤胃發酵。
根據申請專利範圍第1項之用途，其中該混合物包含15重量%至25重量%之柚皮苷、20重量%至60重量%之苦橙萃取物與足量達到100重量%之海泡石。
根據申請專利範圍第2項之用途，其中該混合物包含20重量%之柚皮苷、40重量%之苦橙萃取物與40重量%之海泡石。
根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中苦橙萃取物包含31.5重量%至71.5重量%之總體類黃酮。
根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中苦橙萃取物包含44重量%至55重量%之總體類黃酮。
根據申請專利範圍第4項之用途，其中總體類黃酮包含(a)17.5重量%至35.1重量%之柚皮苷，(b)7.7重量%至16.9重量%之新橙皮苷(neohesperidine)與(c)2.1重量%至6.5重量%之枸橘苷(poncirin)。
根據申請專利範圍第5項之用途，其中總體類黃酮包含(a)17.5重量%至35.1重量%之柚皮苷，(b)7.7重量%至16.9重量%之新橙皮苷與(c)2.1重量%至6.5重量%之枸橘苷。
根據申請專利範圍第4項之用途，其中總體類黃酮包含(a)25重量%至27重量%之柚皮苷，(b)11重量%至13重量%之新橙皮苷與(c)3重量%至5重量%之枸橘苷。
根據申請專利範圍第5項之用途，其中總體類黃酮包含(a)25重量%至27重量%之柚皮苷，(b)11重量%至13重量%之新橙皮苷與(c)3重量%至5重量%之枸橘苷。
根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該增進係調節被餵予濃縮食物配糧之反芻動物中的微生物發酵過程。
根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該增進包含限制引起瘤胃酸中毒之細菌的生長。
根據申請專利範圍第11項之用途，其中該引起瘤胃酸中毒之細菌為牛鏈球菌(Streptococcus bovis )。
根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該增進係使反芻動物之集約肥育產量達到最佳化。
根據申請專利範圍第13項之用途，其中該反芻動物為小牛。
根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其包含將混合物呈固體形式，以濃度為10至2000ppm(以重量計)添加於飼料中。
根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其包含將混合物呈固體形式，以濃度為50至1000ppm(以重量計)添加於飼料中。
根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其包含將混合物呈固體形式，以濃度為100至300ppm(以重量計)添加於飼料中。