DE60124030T2

DE60124030T2 - Behandlung von Pansenacidose mit Amylasehemmern

Info

Publication number: DE60124030T2
Application number: DE60124030T
Authority: DE
Inventors: Bernard Joseph Sandwich Banks; Mark Andrew Sandwich Haxell; Graham Sandwich Lunn; Michael Stephen Sandwich Pacey; Lee Richard Sandwich Roberts
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2001-05-17
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2021-05-18
Also published as: TWI298021B; EP1745790A3; IL143225A; MY136145A; KR20010107661A; HU0102159D0; EP1745790A2; AU4619201A; EP1157696A3; EP1157696A2; IL186223A0; CA2348245A1; AU785303B2; EP1157696B1; DE60124030D1; ATE343391T1; CA2348245C; KR100643946B1; JP3798261B2; ES2272418T3

Description

Die hierin beschriebene Erfindung bezieht sich auf die Behandlung von Pansenazidose, insbesondere chronischer Azidose in Wiederkäuern, und damit in Beziehung stehende Zustände.
Pansenazidose ist eine durch übermäßige Aufnahme leicht fermentierbarer Kohlenhydrate verursachte gut dokumentierte metabolische Erkrankung von Wiederkäuern und mit dem Zustand assoziierte Probleme sind seit vielen Jahren bekannt: siehe Nordlund et al., 1995, Nagaraja et al., 1998, Owens et al., 1998 und Dirksen, 1989. Azidose kann in zwei Formen geteilt werden: akut und chronisch. Wir definieren akute Azidose als einen Pansen-pH zwischen pH 4,0 und 5,0 mit erhöhtem ruminalem Lactat und chronische Azidose als einen Pansen-pH zwischen 5,0 und 5,5 mit normalen Lactatgehalten von bis zu 5 mM. Die Literatur bezieht sich auch auf subakute Azidose, die Pansen-pH-Werte unter 5,0 hat, aber in manchen Fällen mit hohen Lactatgehalten assoziiert ist und in anderen nicht. Wir stufen den erstgenannten Fall als milde akute Azidose und den letzteren als chronische Azidose ein.
Die Hauptursache von Azidose ist der Verzehr einer Nahrung bzw. eines Futters mit einem hohen Gehalt leicht fermentierbarer Kohlenhydrate und/oder die wenig Rauhfutter hat. Chronische Azidose kann auftreten, wenn Tiere große Mengen leicht fermentierbaren Futters essen und kann in jeder beliebigen Stufe der Herstellung auftreten, oder tatsächlich während der Zeit, für die sie hoch konzentriertes Futter erhalten. Akute Azidose kann auftreten, wenn eine große Erhöhung der Konzentratmenge in der Ernährung stattfindet, z.B. nach Kalben oder aufgrund des Transfers zur Mastviehlaufhofanlage ("feedlot"). Sie kann jedoch auch nach einer Unterbrechung des normalen Futter-Aufnahmemusters, wie einer unbeabsichtigten Darreichung von überschüssigem Futter oder einer Fastenzeit, gefolgt von Überfressen, auftreten. Reduzierter Pansen-pH kann auch durch eine Verringerung des Rohfaser-Anteils in der Diät verursacht werden. Die Ätiologie von Azidose beruht daher auf der absoluten Aufnahme übermäßiger Mengen von Kohlenhydraten und/oder einem ungünstigen Anteil an Grundnahrungsmitteln in der Ration. Die Art des Getreides (Mais hoher Feuchtigkeit ist stärker Azidose-induzierend als trocken gewalzter Mais oder Sorghum) und die Art der Bearbeitung (Dampf-geflocktes Getreide ist besonders verdaulich) ist zusammen mit Art und Menge des Rauhfutters wichtig. Getreide wie Gerste, Weizen und Mais hoher Feuchtigkeit, die schnelle Raten ruminaler Stärke-Verdauung haben, verursachen üblicherweise die meisten Probleme. Zum Beispiel haben Gerste, Weizenmehl, Buchweizen und Dampf-geflockter Mais alle ruminale Stärkeverfügbarkeit von mehr als 85%. Richtlinien für die Fütterung von Milchvieh, das mehr als 35–40 kg Milch produziert, schlagen neutrale reinigende Faser von 25–30% des Futters, mit 75% davon aus Feldfutter, einen Gehalt nicht-struktureller Kohlenhydrate von 35–40% und Stärke von 30–40% (Nocek, 1997) vor.
Akute Azidose ist durch eine steile Abnahme des ruminalen pHs mit einer hohen Konzentration ruminaler Milchsäure (50–100 mM) gekennzeichnet. Die ruminale mikrobielle Population macht eine signifikante Verschiebung durch mit einem Anstieg Gram-positiver Milchsäure-bildender Bakterien, insbesondere Streptococcus bovis und Lactobacillus-Arten. Der fallende pH führt zum Tod Gram-negativer Bakterien und zur Verringerung oder vollständigem Verschwinden begeiselter Protozoen. Die Verschiebung zu Lactat-Produktion im Fermentationsmuster ist verknüpft mit verringerter Produktion flüchtiger Fettsäuren ("volatile fatty acid") (VFA). Systemische Änderungen schließen verringerten (verringertes) Blut-pH und Bicarbonat und erhöhtes Blut-D- und -L-Lactat ein. Akute Azidose kann signifikante Beeinträchtigung physiologischer Funktionen, wie ruminale Stase und Dehydration, verursachen, die letztendlich zu Koma und Tod führen. Selbst wenn das Tier überlebt, erholt es sich vielleicht nie vollständig.
Chronische Azidose hat viel subtilere klinische Anzeichen. Die Tiere bleiben munter und verzehren Futter, können aber "angeschlagen" aussehen. Der Abfall des Pansen-pHs auf unter 5,5 liegt an einer allgemeinen Steigerung der Fermentation im Pansen, die zu größerer Produktion von VFAs führt. Der Anstieg von VFAs im Pansen ist sehr hoch mit Anstiegen im Blut korreliert, aber Blut-pH ändert sich nicht signifikant. Gesamte begeiselte ruminale Protozoen nehmen aufgrund des fallenden pHs, mit Art-Unterschieden in der Rate, ab, verschwinden aber nicht völlig. Bakterielle Gesamtlebendkeimzahlen steigen über der Zeit an, einschließlich erhöhter amylolytischer Bakterien. Der bei akuter Azidose beobachtete überwältigende Anstieg von S. bovis und Lactobacillus-Arten tritt jedoch nicht auf. Während die Lactat-Produktionsrate vorübergehend nach dem Füttern steigt, wird Lactat sofort bei der Produktion von VFAs verwendet und akkumuliert nicht im Pansen. Die Symptome chronischer Azidose sind besonders ein Abfall des ruminalen pHs auf 5,0–5,5 ohne signifikante Milchsäure-Akkumulation.
Zusammenfassung von Symptomen akuter und chronischer Azidose
Pansenazidose ist mit vielen sekundären Zuständen assoziiert, die eine signifikante Auswirkung auf Viehbestand-Tierleistung, d.h. Verringerung der Futterverwertung zu Fleisch und/oder Milch, haben können. Auch Milchqualität kann im Zusammenhang mit Azidose leiden. Hyperkeratose, papilläre Verklumpung und Rumenitis des ruminalen Epithels verursachender irreversibler Schaden am ruminalen Epithel tritt bei einem Pansen-pH unter 5,5 auf. Die Tiere haben verringerte(n) Appetit und Leistung aufgrund beeinträchtigter Nährstoff-Absorption, was reduzierte Gewichtszunahme bei Fleischvieh und verringerte(n) Milchertrag und Qualität bei Milchvieh bewirkt. Andere Auswirkungen sind Laminitis, intermittierende Diarrhöe, schlechte(r) Appetit und zyklische Futteraufnahme, eine hohe Herden-Merzvieh-Rate wegen schlecht definierter Gesundheitsprobleme, schlechter Körperzustand und Abszesse ohne offensichtliche Ursachen. Chronische Laminitis ist eines der beständigsten klinischen Anzeichen, mit Erhöhungen in der dorsalen Hufwand, Ulceration der Sohle, Läsionen der weißen Linie, Hämorrhagien der Sohle und missgestalteten Hufen. Im Durchschnitt berichten Landwirte, dass 25% der Tiere in britischen Milchviehherden ("UK dairy herds") lahm sind, und es ist wahrscheinlich, dass die wahre Inzidenz chronischer Laminitis höher ist, da sie nicht immer feststellbare Lahmheit bewirkt. Leberabszesse sind dafür bekannt, mit Azidose verknüpft zu sein, und in den meisten Mastplätzen beträgt die Inzidenz von Leberabszessen 12% bis 32% der geschlachteten Rinder und ist ein Hauptgrund für Leber-Beschlagnahmung. Leberabszesse werden nicht notwendigerweise diagnostiziert, während das Tier lebt, haben aber eine schädliche Auswirkung auf ihre Leistung und allgemeine Gesundheit. Tiere können auch gesenkte Immunfunktion, eine hohe Inzidenz respiratorischer Erkrankungen und reduzierte Fertilitätsraten haben. Die meisten Milchvieh-Herden mit einem chronischen Azidoseproblem haben eine jährliche Herden-Umsatzrate von mehr als 45% oder eine jährliche Merzvieh-Rate von mehr als 31%. Die Gründe für Keulung ("culling") sind üblicherweise schlecht definiert (Nocek, 1997, Nordlund, 1995, Nagaraja, 1998, Stock und Britten, 1998, AnimalPharm, 1999, Kay, 1969, McManus, 1977).
Ein weiteres Problem, das bei Hochleistungs-Milchkühen gesehen werden kann, die mit einer Ernährung mit hohem Kohlenhydratgehalt und/oder wenig Rauhfutter gefüttert werden, ist das Azidose-bezogene "wenig-Milchfett-Syndrom" ("low milk fat syndrome"). Wenn der pH im Pansen fällt, verschiebt sich das Fermentationsmuster in Richtung Bildung von mehr Propionat und weniger Acetat und Butyrat. Da ungefähr die Hälfte des Milchfetts aus Acetat und Butyrat gebildet wird, bewirkt dies einen Abfall des Milchfett-Gehalts (AT Chamberlain & Jm Wilkinson, Feeding the Dairy Cow, Chalcombe Publications, UK, 1996).
Es wird geschätzt, dass Pansen-Azidose und dazu in Beziehung stehende Probleme die Tierindustrie aufgrund verlorener Leistung mehr als 1 Milliarde Dollar pro Jahr kosten.
Empfohlene Behandlungen für akute Azidose schließen Verabreichung einer Mischung von Natriumbicarbonat, Formaldehyd, Magnesiumoxid und Kohle, um die sich rasch teilenden Bakterien zu töten, ein (NebGuide G91-1047-A). Puffer werden weithin verwendet (Horn, 1979, Kennelly, 1999), scheinen aber nicht wirksam genug zu sein, um die Tierindustrie zufrieden zu stellen. Die Schmackhaftigkeit der meisten Puffer ist gering und erfordert vorsichtige Handhabung, um reduzierte Futteraufnahme zu vermeiden. Ionophore Antibiotika, wie Monensin, Lasalocid und Salinomycin sind allgemein gegen Gram-positive Bakterien wirksam, einschließlich der hauptsächlichen ruminalen Lactat-bildenden Bakterien, S. bovis und Lactobacillus-Arten (Burrin und Britton, 1986, Coe, 1999, Nagaraja, 1985). Sie sind daher wirksam beim Verhüten akuter Azidose beim Übergang zu Hochkonzentrat-Fütterung, wenn Rinder zuerst den Mastviehlaufhofanlagen erreichen oder nach Kalben. Sie wirken auch um Gesamt-VFA-Bildung in Rindern mit chronischer Azidose zu reduzieren und stabilisieren deshalb den Pansen-pH. Ionophore verringern jedoch auch die Futteraufnahme. Es ist auch gezeigt worden, dass andere Antibiotikaklassen akute Azidose verhüten oder verbessern, einschließlich Virginamycin in Schafen (Thorniley et al., 1998) und des schwefelhaltigen Peptidantibiotikums Thiopeptin, das gegen S. bovis besonders wirksam ist (Armstrong, 1984). Jedoch wird anhaltende Verwendung von antibiotischen Futterzusatzstoffen nicht länger als ein geeignetes Management-Werkzeug angesehen (zum Überblick siehe: The use of drugs in food animals: benefits and risks, 1999). Probiotische Steuerung ist mit einer Anzahl von Arten, einschließlich Selenomonas ruminantium subsp. lactolytica-Stamm JDB201 (Wiryawan et al., 1995), dem Lactat-Verwerter Megaspaera elsedenii (Das, Kung und Hession 1995), und in allgemeineren Begriffen in Patentanmeldung WO 96/17525 gezeigt worden. Die Letztere beansprucht auch Enzyme, die Degradation von Stärke oder Faser erhöhen. Andere vorgeschlagene, aber nicht kommerzialisierte Behandlungen schließen die Verwendung von Bakteriocinen (Teather und Forster, 1998) und die nicht ökonomisch durchführbare Manipulation ruminaler Fermentation mit organischen Säuren (Martin, 1988, Martin et al., 1999) ein.

• Armstrong, D. G., Antibiotics as feed additives for ruminant livestock in 'Antimicrobials and Agriculture.
The proceedings of the 4^th International symposium on antibiotics in agriculture: benefits and malefits', 1984, Hrsg. Woodbine M. Butterworths, ISBN 0 408 11155 0.
• Das, N. K., Ruminant feed additive, Patent application US 76-748210 761207.
• Kennelly, J. J., Robinson, B. und Khorasani, G. R. Influence of carbohydrate source and buffer on rumen fermentation characteristics, milk yield, and milk composition in early-lactation Holstein cows, Journal of Dairy Science, 1999, 82: 2486–2496.
• Kung, L. und Hession, A. O. Preventing in vitro lactate accumulation in ruminal fermentations by inoculation with Megasphaera elsdenii, Journal of Animal Science 1995, 73, 250–256.
• Martin, S. A., Manipulation of ruminal fermentation with organic acids: a review, Journal of Animal Science, 1998, 76: 3123–3132.
• Martin, S. A., Streeter, M. N., Nisbet, D. J., Hill, G. M. und Williams, S. E., Effects of DL-Malate on ruminal metabolism and performance of cattle fed a high-concentrate diet, Journal of Animal Science, 1999, 77: 1008–1015.
• Teather, R. M. und Forster, R. J., Manipulating the rumen microflora with bacteriocins to improve ruminant production, Canadian Journal of Animal Science, 1998, 78 (Supplement): 57–69.
• The use of drugs in food animals: benefits and risks, CABI publishing, 1999, ISBN 0 85199 371 0.
• Thorniley, G. R., Rowe, J. B., Cowcher, P. C., Boyce, M. D., A single drench of virginiamycin to increase safety of feeding grain to sheep, Australian Journal of Agricultural Research, 1998, 49 (5): 899–906.
• Wiryawan, K. G. und Brooker, J. D., Probiotic control of lactate accumulation in acutely grain-fed sheep, Australian Journal of Agricultural Research, 1995, 46 (8): 1555–68.
• Kay, M., Fell, B. F. und Boyne, R., The relationship between the acidity of the rumen contents and rumenitis in calves fed on barley, Research in Veterinary Science, 1969 10, 181–187.
• McManus, W. R., Lee, G. J. und Robinson, V. N. E. Microlesions on rumen papillae of sheep fed diets of wheat grain, Research in Veterinary Science, 1977, 22: 135–137.

Weitere Literaturverweise:

1. Lameness costs UK dairy herds, says NMR AnimalPharm, 417, 26. März 1999, S. 6.
2. Burring, D. G. und Britton, R. A., Response to monensin in cattle during subacute acidosis, Journal of Animal Science, 1986, 63: 888–893.
3. Coe, M. L., Nagaraja, T. G., Sun, Y. D., Wallace, N. Towne, E. G., Kemp, K. E. und Hutcheson, J. P. Effect of Virginiamycin on ruminal fermentation in cattle during adaptation to a high concentrate diet and during an induced acidosis, Journal of Animal Science, 1999, 77: 2259–2268.
4. Dirksen, G., Acidosis in Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant: Proceedings of the Third International Symposium, Cambridge, England: August 1969 Hrsg. A. T. Phillipson, Oriel Press, IBSN O 85362 053 9.
5. Nagaraja, T. G., Galyean, M. L. und Cole, N. A., Nutrition and Disease Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, 1998, 14 (2), 257–277.
6. Nagaraja, T. G., Avery, T. B., Galitzer, S. J. und Harmon, D. L. Effect of ionophore antibiotics on experimentially induced lactic acidosis in cattle, American Journal of Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, 1998, 14 (2), 257–277.
7. Nocek, J. E., Bovine acidosis: Implications on laminitis, Journal of Veterinary Research, 1985, 46 (12) 2444–2452.
8. Nordlund, K. V., Garrett, E. F., Oetzel, G. R., Herd-based rumenocentesis: a clinical approach to the diagnosis of subacute rumen acidosis, Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian, 1995, 17: 8, Supplement, S48–S56.
9. Owens, F. N., Secrist, D. S., Hill, W. J. und Gill, D. R., Acidosis in cattle: a review Journal of Animal Science, 1998, 76: 275–286.
10. University of Nebraska, Lincoln NebGuide G91-1047-A, http:/www.inar.unl.edu/pubs/AnimalDisease/g1047.htm.

DE 26 58 562 offenbart zwei bis acht Zuckereinheiten enthaltende Aminozuckerderivate, und US 4,273,765 offenbart Trehalose enthaltende Aminozuckerderivate als Amylase inhibierende Agenzien.
Es gibt einen allgemeinen Bedarf an einer sicheren wirksamen Behandlung für Pansenazidose;
besonders chronische und/oder akute Pansenazidose;
besonders in Wiederkäuern wie Rindern und Schafen;
besonders in laktierenden Wiederkäuern wie Rindern und Schafen;
die bevorzugt einfach verabreicht werden können, wie mit Nahrung oder Getränk;
die bevorzugt nicht-antimikrobiell ist;
die bevorzugt für das Tier schmackhaft ist;
die bevorzugt nur im Pansen aktiv ist und keine systemischen Wirkungen hat;
die bevorzugt keine Rückstände in Fleisch und/oder Milch darstellt und
die bevorzugt keine Vorenthaltungs-Zeitspanne erfordert;
die nicht-toxisch für Tier- und Futter-Handhabende (Hersteller und Landwirt) ist;
und/oder die bevorzugt die Pansen-Fermentation stabilisieren kann, daher übermäßige Verringerungen des pHs verhütet und VFA-Anteile erhält, so dass Milchfettbildung nicht nachteilig beeinträchtigt wird.
Wir haben entdeckt, dass bestimmte Inhibitoren (Hemmer) bakterieller α-Amylase und/oder α-Glucosidase verwendet werden können, um ruminalen pH in einer wirksamen Weise zu reduzieren, die in der Behandlung von sowohl chronischer, als auch akuter Azidose und damit in Beziehung stehender Zustände nützlich sein sollten.
Durch "Inhibitor" sind hierin individuelle Agenzien und Mischungen von Agenzien, die inhibitorische Aktivität haben, einschließlich unten genannter Fermentationsbrühen-Produkte, gemeint.
Ein Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines wirksamen Inhibitors von bakterieller α-Amylase und/oder α-Glucosidase, namentlich Acarbose oder Trestatin A, B oder C, in der Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Pansenazidose. Von besonderem Interesse sind Inhibitoren von in ruminalen Bakterien vorhandenen Amylasen/Glucosidasen, wie jene die nachstehend genannt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine für die Behandlung von Azidose in Tieren geeignete Formulierung, die einen Inhibitor von Pansen-bakterieller α-Amylase und/oder α-Glucosidase, namentlich Acarbose oder Trestatin A, B oder C, umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Verbessern der Milchqualität und/oder Quantität von Wiederkäuern, das die kurative, palliative und prophylaktische Behandlung eines Wiederkäuers mit einer wirksamen Menge eines Inhibitors von Pansen-bakterieller α-Amylase und/oder α-Glucosidase umfasst.
Weitere Aspekte der Erfindung sind wie in den Ansprüchen definiert.
Vorzugsweise hat der Inhibitor bakterieller α-Amylase und/oder α-Glucosidase eine IC₅₀ von 10^–3 M oder weniger, besonders bevorzugt 10^–4 M oder weniger, noch stärker bevorzugt 10^–5 M oder weniger, in den hierin beschriebenen Pansen-Amylase- und -Glucosidase-Screenings.
Vorzugsweise hat der Amylase- und/oder α-Glucosidase-Inhibitor eine niedrige antimikrobielle Aktivität, besonders bevorzugt mit einem MIC-Wert von mehr als 50 μg/ml in den hierin beschriebenen Tests, noch stärker bevorzugt mehr als 100 μg/ml.
Die α-Amylase- und/oder α-Glucosidase-Inhibitoren sind die im unten Stehenden offenbarten Substanzen und einfache Analoga davon, die in den unten stehenden Beispielen enthalten sind, die in den unten genannten Screenings als wirksam befunden werden:
Alle hierin erwähnten Substanzen können z.B. mit Isotopen bestimmter Atome markiert werden, wie es auf dem Fachgebiet gut bekannt ist. Solche Isotopen-markierten Substanzen sind durch im Fachgebiet gut bekannte Verfahren erhältlich.
Bevorzugte Inhibitoren schließen Acarbose und höhere Homologe davon, Trestatin A, Trestatin C, ein.
Eine bevorzugte Gruppe in Inhibitoren sind substantiell reine Einzelverbindung oder partiell gereinigtes Fermentations- oder Biotransformationsprodukt, Inhibitoren einschließlich Acarbose und höhere Homologe davon, Trestatin A, Trestatin C.
Acarbose und Trestatin C werden besonders bevorzugt.
Einige der Inhibitoren können durch Biotransformation/Fermentation, wie den hierin im Nachfolgenden beschriebenen Verfahren, hergestellt werden.
Biotransformation/Fermentationsprodukte
Die Kulturen von Streptomyces conglobatus ATCC31005, Streptomyces coelicolor subsp. flavus ATCC19894, Streptomyces kursannovii ATCC11912 und Streptomyces lienomycini ATCC43687 wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, ansässig in 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA) erhalten. Die Kulturen Streptomyces sp. KC672, isoliert von einem Meeressediment in Suruga Bay, Japan, und Streptomyces sp. CL45763 sind in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag bei den National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. hinterlegt und mit den Eingangsnummern NCIMB41058 bzw. NCIMB41057 bezeichnet worden (NCIMB befindet sich in 23 St. Machar Drive, Aberdeen, U.K., AB24 3RY.). Der Hinterleger war Pfizer Central Research, Pfizer Limited, Ramsgate Road, Sandwich, Kent, CT13 9NJ, Vereinigtes Königreich. Pfizer Ltd. ist eine 100%ige Tochtergesellschaft von Pfizer Inc., 235 East 42nd Street, New York, New York, USA.
Zusätzlich können mutante Stämme von Streptomyces conglobatus ATCC31005, Streptomyces coelicolor subsp. flavus ATCC19894, Streptomyces kursannovii ATCC11912, Streptomyces lienomycini ATCC43687, Streptomyces sp. KC672 und Streptomyces sp. CL45763 verwendet werden. Solche Mutantenstämme können spontan oder durch Anwendung bekannter Techniken, wie Exposition gegenüber ionisierender Strahlung, ultraviolettem Licht und/oder chemischen Mutagenen wie N-Methyl-N-nitrosourethan, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanadin, Ethylmethylsulfat etc. erhalten werden. Genetisch transformierte und rekombinante Formen schließen durch genetische Techniken, einschließlich z.B. Rekombinati on, Transformation, Transduktion, Protoplastenfusion etc., hergestellte Mutanten und genetische Varianten ein.
Fermentation der Kulturen von Streptomyces conglobatus ATCC31005, Streptomyces coelicolor subsp. flavus ATCC19894, Streptomyces kursannovii ATCC11912, Streptomyces lienomycini ATCC43687, Streptomyces sp. KC672 und Streptomyces sp. CL45763 kann unter Verwendung von im Fachgebiet gut bekannten Standardverfahren für filamentöse Bakterien der Gattung Streptomyces ausgeführt werden. Zum Beispiel kann Wachstum des Organismus auf geeignetem Festmedium oder wässrigem Flüssigmedium unter aeroben Bedingungen im Bereich von 24 bis 35°C unter Verwendung geeigneter Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und Spurenelementen wie Eisen, Zink, Mangan für 2 bis 30 Tage stattfinden.

Verwendung der folgenden Fermentationsmedien wird gemacht. AP5-H-Produktionsmedium

Maisstärke (Hidex)	80 g
Hefeextrakt (Oxoid)	5 g
K₂HPO₄	1 g
MgSO₄·7H₂O	1 g
Glutaminsäure	1 g
FeSO₄·7H₂O	0,01 g
ZnSO₄·2H₂O	0,001 g
MnSO₄·2H₂O	0,001 g
CaCO₃	7 g
Leitungswasser	1 l
NaOH	auf pH 7,0

MECO-Medium halber Stärke

Glucose	5 g
Säurehydrolysierte Stärke (Hidex^TM, Japan)	10 g
Casitone^TM (Difco – Stickstoffquelle)	2,5 g
Hefeextrakt (Oxoid^TM)	2,5 g
Weizenkeim (Sigma)	2,5 g
Calciumcarbonat	2,0 g
entmineralisiertes Wasser	1 l
NaOH	auf pH 7,0

Modifiziertes ANG-3-Medium

Lösliche Stärke	20 g
Glucose	100 g
Sojabohnenmehl (Trusoy^TM)	10 g
NaNO₃	2 g
K₂HPO₄	1 g
MgSO₄·7H₂O	0,5 g
KCl	0,5 g
FeSO₄·7H₂O	0,01 g
MOPS-Puffer (Sigma)	20 g
entmineralisiertes Wasser	1 l
NaOH	auf pH 7

Alle beschriebenen Medien können mit anderen Stärken, partiell hydrolysierten Stärken oder löslichen Stärken und/oder Zuckern wie D-Xylose, D-Ribose, D-Maltose, D-Maltotriose, D-Sedoheptulose, D-Trehalose, D-Glucose und/oder Stickstoffquellen wie Asparagin, Aspartat und Glutamin supplementiert werden.
Beispiel 1 – Herstellung einer Fermentationsbrühe, die Pansenflüssigkeits-α-Amylase-inhibitorische Aktivität von Streptomyces conglobatus ATCC31005 zeigt
Auf einem 1/4-starken ATCC172-Schrägagar gehaltener Streptomyces conglobatus ATCC31005 wurde als eine Öse voll Sporen in zwei 300 ml-Erlenmeyerkolben, jeweils 50 ml 1/2-starkes MECO-Medium enthaltend, inokuliert. Es wurde ihnen dann erlaubt für 7 Tage bei 28°C, 200 U/min auf einem Infors Multitron-Schüttler mit 1'' (2,5 cm) Hub zu inkubieren. An diesem Punkt wurde die Brühe bei 3.500 U/min zentrifugiert und der Überstand wurde vom Mycel entfernt. Die α-Amylase-inhibitorische Aktivität wurde für den Überstand bestimmt, was in der unten stehenden Tabelle zusammengefasst ist.
Beispiel 2 – Herstellung einer Fermentationsbrühe, die Pansenflüssigkeits-α-Amylase-inhibitorische Aktivität von Streptomyces sp. CL45763 zeigt
Auf Schrägagar aus Bacto ISP-3 gehaltener Streptomyces sp. CL45763 wurde als eine Öse voll Sporen in vier jeweils 50 ml AP5-H-Medium enthaltende 300 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert. Es wurde ihnen dann erlaubt, für 9 Tage bei 28°C 200 U/min auf einem Infors Multitron-Schüttler mit 1'' (2,5 cm) Hub zu inkubieren. An diesem Punkt wurden die Brühen kombiniert, bei 3.500 U/min zentrifugiert und dann der Überstand vom Mycel entfernt. Die α-Amylase-inhibitorische Aktivität wurde dann für den Überstand bestimmt, was in der unten stehenden Tabelle zusammengefasst ist.
Beispiel 3 – Herstellung einer Fermentationsbrühe, die Pansenflüssigkeits-α-Amylase-inhibitorische Aktivität von Streptomyces coelicolor subsp. flavus ATCC19894 zeigt
Auf einem 1/4-starken ATCC172-Schrägagar gehaltener Streptomyces coelicolor subsp. flavus ATCC19894 wurde als eine Öse voll Sporen in zehn jeweils 50 ml AP5-H-Medium enthaltende 300 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert. Es wurde ihnen dann ermöglicht, für 4 Tage bei 28°C, 200 U/min auf einem Infors Mulitron-Schüttler mit 1'' (2,5 cm) Hub zu inkubieren. An diesem Punkt wurden die Brühen bei 3.500 U/min zentrifugiert und der Überstand wurde vom Mycel entfernt. Die α-Amylase-inhibitorische Aktivität wurde für die vereinigten Überstände bestimmt, was in der unten stehenden Tabelle zusammengefasst ist.
Beispiel 4 – Herstellung einer Fermentationsbrühe, die Pansenflüssigkeits-α-Amylase-inhibitorische Aktivität von Streptomyces kursannovii ATCC11912 zeigt
Auf einem 1/4-starken ATCC172-Schrägagar gehaltener Streptomyces kursannovii ATCC11912 wurde als eine Öse voll Sporen in zwei jeweils 50 ml AP5-H-Medium enthaltende 300 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert. Es wurde ihnen dann erlaubt, für 5 Tage bei 28°C, 200 U/min auf einem Infors Mulitron-Schüttler mit 1'' (2,5 cm) Hub zu inkubieren. An diesem Punkt wurden die Brühen bei 3.500 U/min zentrifugiert und der Überstand wurde vom Mycel entfernt. Die α-Amylase-inhibitorische Aktivität wurde für jeden Überstand bestimmt, was in der unten stehenden Tabelle zusammengefasst ist.
Beispiel 5 – Herstellung einer Fermentationsbrühe, die Pansenflüssigkeits-α-Amylase-inhibitorische Aktivität von Streptomyces lienomycini ATCC43687 zeigt
Auf einem 1/4-starken ATCC172-Schrägagar gehaltener Streptomyces lienomycini ATCC43687 wurde als eine Öse voll Sporen in drei jeweils 50 ml modifiziertes ANG-3-Medium enthaltende 300 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert. Es wurde ihnen dann erlaubt, für 5 Tage bei 28°C, 200 U/min auf einem Infors Mulitron-Schüttler mit 1'' (2,5 cm) Hub zu inkubieren. An diesem Punkt wurden die Brühen bei 3.500 U/min zentrifugiert und der Überstand wurde vom Mycel entfernt. Die α-Amylase-inhibitorische Aktivität wurde für jeden einzelnen Überstand bestimmt, was in der unten stehenden Tabelle zusammengefasst ist.
Beispiel 6 – Herstellung einer Fermentationsbrühe, die Pansenflüssigkeits-α-Amylase-inhibitorische Aktivität von Streptomyces sp. KC672 zeigt
Auf einem 1/4-starken ATCC172-Schrägagar gehaltener Streptomyces sp. KC672 wurde als eine Öse voll Sporen in zwei jeweils 50 ml AP5-H-Medium enthaltende 300 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert. Es wurde ihnen dann erlaubt, für 7 Tage bei 28°C, 200 U/min auf einem Infors Mulitron-Schüttler mit 1'' (2,5 cm) Hub zu inkubieren. An diesem Punkt wurden die Brühen bei 3.500 U/min zentrifugiert und der Überstand wurde vom Mycel entfernt. Die α-Amylase-inhibitorische Aktivität wurde für die Überstände bestimmt, was in der unten stehenden Tabelle zusammengefasst ist.
Beispiel 7 – Isolierung eines Pansenflüssigkeits-α-Amylase-Inhibitors aus Streptomyces conglobatus ATCC31005 – Vergleichsbeispiel
Eine Öse voll Sporen von Streptomyces conglobatus ATCC31005, gehalten auf 1/4-starkem ATCC172-Agar, wurde in zwei jeweils 50 ml AP5-H-Medium enthaltende 300 ml Erlenmeyerkolben inokuliert. Nach 24-stündiger Inkubation bei 28°C, 200 U/min auf einem Infors Multitron-Schüttler mit 1'' (2,5 cm) Hub wurden diese Kolben verwendet, um zwei jeweils 3,5 Liter von AP5-H-Medium enthaltende 5 Liter-Minijars (Electrolab^TM, Gloucester, UK) zu inokulieren. Diese Brühen wurden bei 28°C mit einer Belüftung von 3 l/min und Rühren bei 300 U/min für 6 Tage inkubiert. Bei der Ernte wurden die Brühen bei 2.500 U/min zentrifugiert und die Überstände dekantiert. Sie wurden jeweils für 45 min mit 86 g Aktivkohle gerührt und dann durch ein 500 g-Bett Arbocel^TM filtriert. Der pH in dieser Stufe war pH 7. Jeder Kohlekuchen wurde zweimal mit 860 ml wässrigem Aceton (1:1), den pH zwischen 2 und 3 durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure haltend, extrahiert. Die vier wässrigen Acetonextrakte wurden partiell verdampft, vereinigt und lyophilisiert, um 40 g eines braunen Feststoffs zu ergeben. Dieser Feststoff wurde dann in 500 ml entionisiertem Wasser gelöst und auf eine Säule von 750 ml Amberlite IR120 (H⁺-Form) bei einer Flussrate von 2 ml/min aufgebracht. Die Säule wurde dann mit 1 l Wasser gewaschen und dann mit 5 N Ammoniaklösung eluiert, wobei 50 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Fraktionen 13–28 wurden lyophilisiert, um 1,4 g eines dunkelbraunen Pulvers zu ergeben. Dieses wurde dann in 15 ml Wasser gelöst, filtriert und das resultierende Filtrat mit 5 ml Acetonitril verdünnt. Dieses wurde dann in 2 ml-Volumen auf eine Cosmosil NH₂-MS-Säule (20 × 250 mm) injiziert und bei 20 ml/min mit Acetonitril-Wasser (60:40) eluiert. Fraktionen wurden alle 30 Sekunden gesammelt und unter Verwendung eines Finnegan AQA^TM-Instruments durch LC-MS analysiert. M + H⁺970 enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und getrocknet, um einen Gummifeststoff zu ergeben, 70 mg. Der Feststoff wurde dann in 2 ml Wasser gelöst, filtriert und in zwei Hälften auf eine Waters Aqua^TM 5 μm 125A-Säule (21 × 150 mm) unter Verwendung eines Waters δ Prep^TM 4000-Systems mit Diodenarray-Detektion injiziert. Fraktionen wurden gesammelt und zwei, beide Fraktionen 21, enthaltend den M + H⁺970-Peak, wurden unter Erhalt eines weißen Feststoffs, 6,5 mg, kombiniert.
Exakte Massendaten wurden auf einem Bruker Apex II FT-ICR-MS 4.7 T-Instrument gesammelt, wo die Probe, gelöst in Methanol/Wasser/Essigsäure (50:50:1) bei ungefähr 0,5 mg/ml, durch direkte Infusion mit 4 μl/min in eine Analytica-Elektrospray-Quelle eingeführt wurde.
m/z (ESI, FTMS) [M + H]⁺ = 970,3601, C₃₇H₆₄NO₂₈ erfordert 970,3609
m/z (ESI, FTMS) [M + Na]⁺ = 992,3452, C₃₇H₆₃NO₂₈Na erfordert 992,3429
Die NMR-(Proton, Kohlenstoff-13, TOCSY, HSQC und HMBC) und Massenspektren dieser Fraktion 21-Verbindung, auch bekannt als "6942/99/1" sind mit der unten gezeigten Struktur im Einklang.
Die oben gezeigte Verbindung ist auch in GB-Patent 1 482 543 und (Ag. Biol. Chem. 46(7) (1982) 1941) offenbart worden.
Tabelle: ¹H- und ¹³C-NMR chemische Verschiebungen von 6942/99/1 (δ in ppm relativ zu internem Dioxan)
Es wurde festgestellt, dass die "Fraktion 21-Verbindung" eine inhibierende Wirkung im hierin erwähnten Amylase-Screening hat.
Beispiel 8 – Isolierung eines Pansenflüssigkeits-α-Amylase-Inhibitors von Streptomyces conglobatus ATCC-31005 (Vergleichsbeispiel)
Das oben erwähnte AP5-H-Produktionsmedium wurde als Fermentationsmedium verwendet.
Auf einem 1/4-starken ATCC172-Schrägagar gehaltener Streptomyces conglobatus ATCC31005 wurde als eine Öse voll Sporen in zwei jeweils 50 ml AP5-H-Medium enthaltende 300 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert. Es wurde ihnen dann ermöglicht, für 24 Stunden bei 28°C, 200 U/min aus einem Infors Multitron-Schüttler mit 1'' Hub zu inkubieren. An diesem Punkt wurde das Inokulum in 1 Liter AP5-H-Medium, enthalten in einem 3 Liter Fernbachkolben transferiert, und für weitere 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen wie für die Erlenmeyerkolben beschrieben inkubiert. Dieses Inokulum wurde dann in 20 Liter AP5H-Medium, das zuvor in einem 30 Liter-New Brunswick Micros^TM-Edelstahlfermenter sterilisiert worden war, transferiert. Die Brühe wurde dann bei 300 U/min bei 28°C mit 20 l/min Luft für 112 Stunden gerührt und dann geerntet.
Die geerntete Brühe wurde unter Verwendung einer Carr Powerfuge^TM bei 20.000 g zentrifugiert. Zu dem Überstand, bei einem natürlichen pH von 7,8, wurden 500 g aktivierte entfärbende Aktivkohle (Aldrich 16155-1) zugesetzt und die Mischung rührte für 16 Stunden. Anschließend an Filtration durch ein Filterhilfsmittel, wie Arbocel^TM, wurde der Überstand mit weiteren 500 g Aktivkohle für 1 Stunde auf die gleiche Weise behandelt. Die vereinigten Aktivkohle-Kuchen wurden mit wässrigem Methanol (10 l 1:1) gewaschen und dann zweimal mit wässrigem Aceton (10 l 1:1) durch Rühren für 1 Stunde, gefolgt von Filtration durch ein Filterhilfsmittel, extrahiert. Nach teilweiser Rotationsverdampfung und Gefriertrocknung wurden 98,7 g biologisch aktiven Materials erhalten.
Dieses Material wurde in 1.800 ml entmineralisiertem Wasser gelöst und auf eine Säule aus 3,5 l Amberlite IR 120(H)^TM bei einer Rate von 5 ml/Minute geladen. Nach einer Wasserwäsche (2 l) wurde das Produkt mit 1 l Aliquoten von 5 N Ammoniak-Lösung eluiert. Nach Gefriertrocknung wurden die wirksamsten Fraktionen (5 bis 8) vereinigt, um 10,8 g braunen Feststoff zu ergeben.
1,1 g dieses Materials wurden durch Chromatographie, in fünf gleichen Injektionen, unter Verwendung eines Waters Delta Prep 4000^TM-Chromatographiersystems, einer 250 × 21,2 mm Cromasil-NH₂ (ex Phenomenex) und eines Gradienten von 67% Acetonitril 33% Wasser zu 50/50 bei 20 Minuten bei einer Flussrate von 24 ml/Minute, gereinigt. 12 ml-Fraktionen wurden gesammelt.
Die den interessierenden Peak enthaltenden Fraktionen (31 bis 35 aus jedem Lauf) wurden vereinigt, um 138 mg weißen Feststoff zu ergeben.
Dieses Material wurde wieder chromatographiert, dieses Mal unter Verwendung einer 150 × 21,2 mm Aqua-Säule (ex Phenomenex) und eines Gradienten von 100% Wasser zu 90% Wasser 10% Acetonitril über 15 Minuten bei einer Flussrate von 21,2 ml/Minute. Fraktionen wurden in Halbminuten-Intervallen gesammelt. Eine Gesamtmenge von 43 mg des erwünschten Produkts, I wurde aus Fraktionen 22 und 23 erhalten.
Die festgestellten Daten sind mit der folgenden Struktur, auf die hierin als die "Beispiel 8-Verbindung" Bezug genommen wird, in Einklang:
m/z (ESI, FTMS) [M + H]⁺ = 1435,546, entsprechend einer Molekülformel von C₅₆H₉₅N₂O₄₀ (+/–3,028 ppm)
m/z (ESI, FTMS) [M + Na]⁺ = 1457,528, entsprechend einer Molekülformel von C₅₆H₉₄N₂O₄₀Na (+/–1,914 ppm).
Alle nachstehend angegebenen NMR-Daten wurden auf einer Varian Innova 600 MHz-Maschine bei 10°C in D₂O unter Verwendung einer 3 mm-Sonde aufgenommen.

NB: Wo in der oben stehenden Tabelle ein "?" erscheint, gab es schwere Signalüberlappung, was bedeutet, dass eine eindeutige Zuordnung nicht gemacht werden konnte.
Modifikationen an Acarbose und anderen damit in Beziehung stehenden α-Amylase- und/oder α-Glucosidase-Inhibitoren
Biotransformationen
Mikrobielle Biotransformation
Zur Glycosylierung von Acarbose oder anderen damit in Beziehung stehenden α-Amylase- und/oder α-Glucosidase-Inhibitoren fähige mikrobielle ganze Organismen könnten verwendet werden, um erhöhte α-Amylase- und/oder α-Glucosidase-inhibitorische Aktivität zu ergeben, die Bacillus subtilis ATCC55060¹, Saccharopolyspora erythrae ATCC11635² und eine blockierte Mutante von S. avermitilis ATCC53567³ einschließen. Andere Organismen, die glycosylieren können, schließen Cunninghamella sp. NRRL5695¹⁴ und Beauvaria bassiana DSM 875 und DSM 1344¹⁵ ein. Darüber hinaus könnte die mikrobiell geführte Biosynthese von Acarbose durch einen mit Rutin ernährten Actinoplanes sp. CBS 793.96⁴ auch mit anderen damit in Beziehung stehendem α-Amylase- und/oder α-Glucosidase-Inhibitor produzierenden Mikroorganismen verwendet werden. Diese können Analoga von Acarbose oder damit in Beziehung stehenden Acarbose-artigen Homologen ergeben, die auch erhöhte α-Amylase- und/oder α-Glucosidase-inhibitorische Aktivität zeigen könnten. Darüber hinaus könnten Mikroorganismen, die zur O-Acylierung¹⁶, Oxidation (einschließlich Epoxidation¹⁷- und Keton¹⁸-Bildung), Hydroxymethylierung¹⁹, O-Methylierung²⁰, etc. fähig sind, auch verwendet werden, um neue Analoga von Acarbose und damit in Beziehung stehenden Analoga herzustellen, die auch erhöhte α-Amylase- und/oder α-Glucosidase-inhibitorische Aktivität zeigen könnten.
Rohe, partiell gereinigte und gereinigte Enzym-Biotransformationen
Enzymatische Glycosylierungsverfahren können verwendet werden, um Oligosaccharide zu synthetisieren oder zu modifizieren. Spezifische(r) Schutz und Entschützung von Hydroxylgruppen ist nicht erforderlich und die Enzyme übertragen nur an eine oder oder zwei Hydroxylgruppen. Dies führt oft zu weniger Reaktionsschritten und einfacheren Reinigungsverfahren.
Transglycosylierung von Bacillus stearothermophilus Maltose-bildender Amylase (Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase) (BSMA) mit Acarbose und verschiedenen Akzeptoren ist verwendet worden, wobei das Enzym eine das BSMA-Gen tragende Escherichia coli-Transformante war.⁵ Hier wurde beobachtet, dass die BSMA die erste glycosidische Bindung von Acarbose spaltete, um das Pseudotrisaccharid (PTS) zu ergeben und dann eine Glucoseeinheit an der α(1→6)-Position anfügte, um Isocarbose zu ergeben, wo Acarbose selbst eine α(1→4)-Verknüpfung an der endständigen Glucose hat. Der Zusatz einer Anzahl unterschiedlicher Kohlenhydrate zu dem Aufschluss ergab Transferprodukte, in denen das PTS vorrangig α(1→6)-angeheftet an D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose und Methyl-α-D-glucopyranosid war. Mit D-Fructopyranose und D-Xylopyranose war PTS α(1→5)- bzw. α(1→4)-verknüpft. Sowohl α-α-Trehalose als auch Maltitol ergaben zwei Hauptprodukte mit zum Glucopyranose-Rest α(1→6)- und α(1→4)-verknüpftem PTS. PTS wurde hauptsächlich an C-6 des nicht-reduzierenden Rests von Maltose, Cellobiose, Lactose und Gentiobiose übertragen. Saccharose ergab mit dem Glucose-Rest α(1→4)-verknüpftes PTS. Raffinose ergab zwei Hauptprodukte mit zum D-Galactopyranose-Rest α(1→6)- und α(1→4)-verknüpftem PTS. Maltotriose ergab zwei Hauptprodukte mit zum nicht-reduzierenden endständigen Glucopyranose-Rest α(1→6)- und α(1→4)-verknüpftem PTS. Xylitol ergab α(1→5)-verknüpftes PTS als das Hauptprodukt und D-Sorbitol ergab α(1→6)-verknüpftes PTS als das einzige Produkt. Alle diese Beispiele können verbesserte α-Amylase-inhibitorische Aktivität zeigen.
Andere Enzymgruppen können verwendet werden, um glycosylierte Analoga von Acarbose oder anderen Amylase- und/oder α-Glucosidase-Inhibitoren, die zugängliche Zucker oder Hydroxylgruppen haben, herzustellen. Enzymatische Zubereitungen, die verwendet werden können, schließen α- und β-Galactosidase, α- und β-Mannosidase, β-N-Acetylglucosaminidase, β-N-Acetylgalactoaminidase und α-Fucosidase ein.⁶ Glycosilierung kann an jedem Ende des Valienamins oder der Cyclitoleinheit von Acarbose stattfinden und die Erfahrung zeigt, dass der Glycosyltransfer bevorzugt an der nicht-reduzierenden endständigen Monosaccharid-Einheit von Substraten stattfindet. Endoglycosidasen verwendende Studien können zu verzweigten Strukturen führen. Die beschriebenen Enzymzubereitungen können mikrobiell abgeleitet sein, z.B. Aspergillus niger, A. terreus, A. oryzae, Bacillus circu lans, B. stearothermophilus, Cocobacillus, oder Insektensaft, z.B. Schmecke, oder Pflanzenabgeleitet, z.B. Äpfel, Pilze, Alfaalfa-Samen, entfettetes Mandel-Mehl etc.⁶
Glycosyltransferasen können auch verwendet werden, um Acarbose und damit in Beziehung stehende, α-Amylase-inhibitorische Aktivität zeigende Analoga zu glycosylieren, sind aber viel seltenere Enzyme.⁸ Viele dieser Glycosyltransferasen sind kloniert worden. Es wird oft davon gesprochen, dass sie ziemlich stringent zu den 1 bis 2 Saccharidresten seien und auch sehr spezifisch bezüglich des Glycosyl-Donors sind. Sie können davon überzeugt werden, mit sowohl unnatürlichen Donatoren als auch Akzeptoren zu arbeiten, wobei sie ihre Vorteile strikter Regio- und Stereoselektivität und hohe Ausbeuten aufrechterhalten. Nur ein paar Glycosyltransferasen sind leicht erhältlich und die meisten Experimente sind mit Galactosyltransferase Gal T ausgeführt worden.⁹
Cyclodextrin-Glucantransferasen (CGTase) sind eine spezielle Gruppe von Glycosyltransferasen. Diese Enzyme werden von Mikroorganismen produziert und viele sind kommerziell erhältlich. Sie katalysieren Cyclodextrinierung von Stärke, können aber auch eine oder mehrere α-Glycosyleinheit(en) auf verschiedene Akzeptoren übertragen. Sie können zum Verlängern von Glycosiden oder zu α-Glucosylierung vieler Verbindungen verwendet werden. CGTase aus B. stearothermophilus wurde für die Transglucosylierung von Rutin verwendet, wobei die Glucosyleinheit durch eine oder mehrere Glucoseeinheiten verlängert wurde.¹⁰ Ein ähnlicher Ansatz könnte für Acarbose und damit in Beziehung stehende α-Amylase- und/oder α-Glucosidase-Inhibitoren, die Glucoseeinheiten enthalten, verwendet werden.
Ein weiterer Ansatz ist es, Glycogen-Phosphorylase zu verwenden, die ein für die Bildung oder Degradation von α(1→4)-Glucanen verantwortliches, gut bekanntes Enzym ist. Phosphorylase erfordert ein aktiviertes Substrat, wie die Glucosyl-Phosphatester. Mit diesem Substrat kann eine Glucankette, die Primer-Einheit, durch Glucoseeinheiten unter der Freisetzung von Phosphat verlängert werden.¹¹
Modifikation von Acarbose und damit in Beziehung stehenden α-Amylase- und/oder α-Glucosidase-Inhibitoren, die Zuckereinheiten enthalten, kann auch unter Verwendung selektiver Hydrolysen mit α-Amylase selbst, die entweder Zuckereinheiten spalten oder transglycosylieren kann, durchgeführt werden.^12,13
Für andere Modifikationen der Hydroxylgruppen von Zuckereinheiten können auch Acylasen, Esterasen, Lipasen, Hydrolasen und Dehydratasen verwendet werden.
Literaturverweise für diesen Abschnitt

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Bestimmte der hierin erwähnten Substanzen können in einer oder mehreren geometrischen und/oder stereoisomeren Formen existieren. Die vorliegende Offenbarung schließt alle solchen individuellen Isomeren und Salze der beanspruchten Verbindungen ein. Bestimmte hierin erwähnte Verbindungen könnten in mehr als einer tautomeren Form existieren. Gleichermaßen können bestimmte hierin erwähnte Verbindungen zwitterionische Form haben. Es versteht sich, dass die Offenbarung alle solchen Tautomeren, Zwitterionen umfasst.
Die Offenbarung schließt tiermedizinisch verträgliche Salze der hierin erwähnten Verbindungen ein, einschließlich der Säureadditions- und der Basensalze davon, wo angemessen. Geeignete Säureadditionssalze werden von Säuren gebildet, die nicht-toxische Salze bilden, und Beispiele sind die Hydrochlorid-, Hydrobromid-, Hydroiodid-, Sulfat-, Hydrogensulfat-, Nitrat-, Phosphat-, Hydrogenphosphat-, Acetat-, Maleat-, Fumarat-, Lactat-, Tartrat-, Citrat-, Guconat-, Succinat-, Benzoat-, Methansulfonat-, Benzolsulfonat- und p-Toluolsulfonatsalze. Geeignete Basensalze werden von Basen gebildet, die nicht-toxische Salze bilden, und Beispiele sind die Aluminium-, Calcium-, Lithium-, Magnesium-, Kalium-, Natrium-, Zink- und Diethanolaminsalze. Für eine Übersicht über geeignete Salze siehe Berge et al., J. Pharm. Sci., 66, 1–19 (1977).
Es wird von Fachleuten auf dem Gebiet geschätzt werden, dass bestimmte geschützte Derivate von Verbindungen, die hierin erwähnt werden, die vor einer finalen Entschützungsstufe gemacht werden können, nicht die gewünschte biologische Aktivität als solche besitzen können, aber, in bestimmten Fällen, nach Verabreichung in den Körper, z.B. durch Metabolismus, umgewandelt werden können, um hierin erwähnte Verbindungen zu bilden, die biologisch aktiv sind. Solche Derivate sind im Begriff "Pro-Pharmacon" ("Prodrug") eingeschlossen. Es wird weiterhin von Fachleuten auf dem Gebiet geschätzt werden, dass den Fachleuten auf dem Gebiet als "Pro-Moieties" bekannte bestimmte Reste, z.B. wie in "Design of Prodrugs" von H. Bundgaard (Elsevier) 1985 beschrieben, auf geeignete Funktionalitäten abgestellt werden können, wenn solche Funktionalitäten in hierin erwähnten Verbindungen vorhanden sind, auch um ein "Pro-Pharmacon" zu bilden. Weiterhin können bestimmte hierin erwähnte Verbindungen als Pro-Pharmaka anderer hierin erwähnter Verbindungen wirken.
Der Fachmann wird es schätzen, dass bestimmte hierin erwähnte Substanzen durch andere Verfahren als die oben beschriebenen hergestellt werden können, durch Anpassung der hierin beschriebenen Verfahren und/oder Anpassung von im Fachgebiet bekannten Verfahren, z.B. des hierin beschriebenen Standes, oder unter Verwendung von Standard-Textbüchern wie:

"Comprehensive Organic Transformations – A Guide to Functional Group Transformations", RC Larock, VCH (1989 oder spätere Auflagen),
"Advanced Organic Chemistry – Reactions, Mechanisms and Structure", J. March, Wiley-Interscience (3. oder spätere Auflagen),
"Organic Synthesis – The Disconnection Approach", S. Warren (Wiley), (1982 oder spätere Auflagen),
"Designing Organic Syntheses" S. Warren (Wiley) (1983 oder spätere Auflagen), "Guidebook To Organic Synthesis" R. K. Mackie und D. M. Smith (Longman) (1982 oder spätere Auflagen),
"Methoden der Organischen Chemie", Houben Weyl, Georg Thieme Verlag, Stuttgart,
"The Chemistry of the Hydroxyl Group", Teile 1 & 2, Saul Patai, (1971), Interscience Publishers,
"The Chemistry of the Amino Group", Saul Patai, (1968), Interscience Publishers,
"Trends in Synthetic Carbohydrate Chemistry", ACS Symposium, Series 386, (1989), American Chemical Society, Washington, DC,
"Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry", Bände 1–39, Academic Press, New York "Carbohydrate Chemistry", Bände 1–11, The Chemical Society, London,
"Methods in Carbohydrate Chemistry", Bände 1–8, Academic Press, New York,
"Carbohydrates Synthetic Methods and Applications in Medicinal Chemistry", Ogura, H. et al, (1992), Kodansha, Tokyo,

Es ist zu verstehen, dass die hierin erwähnten synthetischen Transformationsverfahren nur beispielhaft sind und dass sie in vielen unterschiedlichen Reihenfolgen ausgeführt werden können, damit die gewünschten Verbindungen effizient zusammengesetzt werden können. Der befähigte Chemiker wird sein Urteil und seine Fähigkeit hinsichtlich der effizientesten Folge von Reaktionen zur Synthese einer gegebenen Zielverbindung ausüben. Zum Beispiel können nachstehend im Zusammenhang mit einer besonderen Reaktion genannten Intermediaten Substituenten hinzugefügt und/oder Umwandlungen daran ausgeführt werden. Dies wird unter anderem von Faktoren wie der Natur anderer funktioneller Gruppen, die in einem besonderen Substrat vorhanden sind, der Verfügbarkeit von Schlüsselintermediaten und der anzuwendenden Schutzgruppen-Strategie (falls vorhanden) abhängen. Die Art der beteiligen Chemie wird klar die Wahl des in den besagten Syntheseschritten verwendeten chemischen Reagens, die Notwendigkeit und Art von Schutzgruppen, die verwendet werden, und die Reihenfolge zum Bewerkstelligen der Synthese beeinflussen. Die Verfahren können wie es für die Reaktanden, Reagenzien und anderer Reaktionsparameter zweckdienlich ist, in einer Weise angepasst werden, die dem Fachmann durch Referenz auf Standard-Textbücher und auf die nachfolgend bereitgestellten Beispiele offensichtlich sein wird.
Es wird für Fachleute offensichtlich sein, dass empfindliche funktionelle Gruppen während der Synthese einer Verbindung der Erfindung geschützt und entschützt werden müssen. Dies kann durch konventionelle Verfahren erreicht werden, wie z.B. in "Protective Groups in Organic Synthesis" von TW Greene und PGM Wuts, John Wiley & Sons Inc. (1999) und Literaturverweisen darin beschrieben. Funktionelle Gruppen, die zu schützen wünschenswert sein kann, schließen Oxo, Hydroxy, Amino und Carbonsäure ein. Geeignete Schutzgruppen für Oxo schließen Acetale, Ketale (z.B. Ethylenketale) und Dithiane ein. Geeignete Schutzgruppen für Hydroxy schließen Trialkylsilyl- und Diarylalkylsilylgruppen (z.B. tert-Butyldimethylsilyl, tert-Butyldiphenylsilyl oder Trimethylsilyl) und Tetrahydropyranyl ein. Geeignete Schutzgruppen für Amino schließen tert-Butyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl ein. Geeignete Schutzgruppen für Carbonsäure schließen C_1-6-Alkyl- oder Benzylester ein.
Die Amylase- und/oder α-Glucosidase-Inhibitoren können entweder alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren in der Behandlung (einschließlich Prophylaxe) von Krankheiten oder in der Reduktion oder Suppression von Symptomen für die Behandlung von Azidose und damit in Beziehung stehender Zustände verwendeten Agenzien verabreicht werden. Beispiele solcher Agenzien (die im Zuge der Veranschaulichung bereitgestellt werden und nicht als beschränkend ausgelegt werden sollten) schließen Puffer, Antibiotika einschließlich Ionophore, Probiotika, organische Säuren und Bacteriocine, Antiparasitika, z.B. Fipronil, Lufenuron, Imidacloprid; Avermectine (z.B. Abamectin, Ivermectin, Doramectin), Milbemycine, Organophosphate, Pyrethroide; Antihistaminika, z.B. Chlorpheniramin, Trimeprazin, Diphenhydramin, Doxylamin; Antimykotika, z.B. Fluconazol, Ketoconazol, Itraconazol, Griseofulvin, Amphotericin B; antibakterielle Substanzen, z.B. Enroflaxacin, Marbofloxacin, Ampicillin, Amoxycillin; Antiinflammatorika, z.B. Prednisolon, Betamethason, Dexamethason, Carprofen, Ketoprofen; Nahrungsergänzungsmittel, z.B. γ-Linolensäure; und erweichende Mittel ein.
Die Amylase- und/oder α-Glucosidase-Inhibitoren können alleine verabreicht werden, werden aber im Allgemeinen in Beimischung mit einem geeigneten Exzipienten, Verdünnungsmittel oder Trägerstoff, ausgewählt im Hinblick auf den beabsichtigten Verabreichungsweg und pharmazeutische/tiermedizinische/landwirtschaftliche Standardpraktiken, verabreicht werden.
Zur Behandlung von Viehbestands-Tieren, wie Schafen und Rindern, kann das aktive Agens vorteilhafter Weise unter Verwendung von Standardverfahren oral verabreicht werden, wie z.B. mit dem Futter des Tieres gemischt, in der Trinkflüssigkeit oder direkt in den Pansen eingebrachten Bolus. Zur Verabreichung im Futter kann ein konzentrierter Futterzusatzstoff oder Premix zum Mischen mit dem normalen Tierfutter bereitgestellt werden. Zusätzliche physikalische und chemische Stabilisierungsagenzien können ebenfalls eingeschlossen werden, um die Stabilität des aktiven Agens in der besagten Formulierung zu erhalten oder zu verstärken.
Die Verfahren, durch die das aktive Agens verabreicht werden kann, schließen orale Verabreichung durch Kapsel, Bolus, Tablette oder Tränkung ein, oder, alternativ, können sie durch Injektion oder als ein Implantat in den Pansen verabreicht werden. Solche Formulierungen können auf eine konventionelle Weise in Übereinstimmung mit tiermedizinischen Standardpraktiken hergestellt werden. Zum Beispiel kann das aktive Agens oral in der Form von Lösungen, Pulvern oder Suspensionen verabreicht werden, die Aromastoffe oder Färbemittel enthalten können, für Anwendungen mit sofortiger, verzögerter, modifizierter, anhaltender, gepulster oder kontrollierter Freisetzung.
Zusätzlich zur Verabreichung im Futter oder im Getränk mit Teilen der normalen Diät des Rinds ist es vorgesehen, dass das aktive Agens separat zwischen normalem Füttern und Trinken verabreicht werden könnte, z.B. in der Form einer schmackhaften "Versuchung" ("treat"), wie in einer Melasse-basierten Formulierung.
Das aktive Agens kann für wässrige Suspensionen oder Elixiere mit verschiedenen Süßungsmitteln oder Aromastoffen, Färbemitteln oder Farbstoffen, mit Emulgatoren und/oder Suspendiermitteln und mit Verdünnungsmitteln, wie Wasser, Ethanol, Propylenglykol und Glycerin und Kombinationen davon kombiniert werden. Zusätzliche physikalische und chemische Stabilisierungsmittel können auch eingeschlossen werden, um die Stabilität des aktiven Agens in der besagten Formulierung zu erhalten oder zu verstärken.
Das aktive Agens kann auch durch eine lang wirkende Bolus-Formulierung direkt an den Pansen abgegeben werden, wobei die Formulierungs-Anordnung im ruminoretikulären Sack für verlängerte Zeitspannen zurückgehalten wird, um andauernde Freisetzung zu erleichtern. Ruminale Retention der Formulierungs-Anordnung, wie in diesem Beispiel beschrieben, kann durch Verwendung dichter Matrizes oder von Reservoiren, basierend auf Aluminium- oder Stahlzylindern oder aus einer Mischung von Ton, Droge und anderen Inhaltsstoffen geformten Pellets erreicht werden.
Das aktive Agens kann, in bestimmten Fällen, auch parenteral verabreicht werden, z.B., intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, intramuskulär oder subkutan, oder durch Infusionstechniken verabreicht werden. Für solche parenterale Verabreichung wird das aktive Agens am besten in Form einer sterilen wässrigen Lösung, die andere Substanzen, z.B. genügend Salze oder Glucose, um die Lösung isotonisch mit Blut zu machen, enthalten kann, verwendet. Die wässrige Lösung sollte, falls notwendig, in geeigneter Weise gepuffert sein (vorzugsweise auf einen pH von 3 bis 9). Die Zubereitung geeigneter steriler parenteraler Formu lierungen wird leicht durch Endsterilisations-Methodik oder durch aseptische Herstellung unter Verwendung pharmazeutischer Standardtechniken, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, erreicht.
Einzeldosen des aktiven Agens können daher von 0,001 mg bis 20 g des aktiven Agens zur Verabreichung einzeln oder von zwei oder mehr zu einer Zeit, soweit erforderlich, enthalten. Acarbose ist z.B. bei 15 g pro Tier pro Tag in zwei separaten Fütterungen verabreicht worden. Ein Zielbereich für eine aktive Verbindung ist bis zu ca. 3 g/Tier/Tag. Der Tierarzt/Landwirt wird auf jeden Fall die tatsächliche Dosierung, die für ein beliebiges individuelles Tier oder eine Gruppe von Tieren die geeignetste sein wird, bestimmen und sie kann mit dem Alter, Gewicht, Diät und Reaktion des einzelnen Tieres variieren. Die oben genannten Dosierungen sind beispielhaft für den durchschnittlichen Fall. Es kann, natürlich, individuelle Fälle geben, bei denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche begründet sind, und solche sind innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Der Fachmann wird einsehen, dass in der Behandlung bestimmter Zustände, wie einer akuten Azidose, das aktive Agens wie benötigt oder gewünscht als eine einzelne Dosis gegeben werden kann.
Das aktive Agens wird normalerweise oral oder durch einen anderen geeigneten Weg (der schließlich den Pansen erreicht) in Form von Zubereitungen, umfassend den aktiven Inhaltsstoff, optional in der Form eines nicht-toxischen, organischen oder anorganischen Säure- oder Base-Additionssalzes, in einer verträglichen tiermedizinischen/pharmazeutischen Dosierungsform verabreicht. Die Zusammensetzungen können, abhängig von der Störung und dem zu behandelnden Tier wie auch dem Verabreichungsweg in variierenden Dosen verabreicht werden (siehe unten).
Obwohl es möglich ist, das aktive Agens direkt ohne jegliche Formulierung zu verabreichen, werden die aktiven Agenzien bevorzugt in der Form einer pharmazeutischen oder tiermedizinischen Formulierung, umfassend einen pharmazeutisch oder tiermedizinisch verträglichen Trägerstoff, das Verdünnungsmittel oder der Exzipiens und aktives Agens, eingesetzt. Der Trägerstoff, Verdünnungsmittel oder Exzipient können unter gebührender Berücksichtigung des beabsichtigten Verabreichungsweges und pharmazeutischer und/oder tiermedizinischer Standardpraktiken ausgewählt werden. Das aktive Agens umfassende Zusammensetzungen können von 0,1 Gew.-% bis 90,0 Gew.-% des aktiven Inhaltsstoffs enthalten.
Die Formulierungen werden mit Rücksicht auf das Gewicht der darin enthaltenen aktiven Verbindung, abhängig von der zu behandelnden Tierart, der Schwere und Art des Zu stands und des Körpergewichts des Tieres variieren. Für parenterale und orale Verabreichung sind typische Dosisbereiche des aktiven Inhaltsstoffes 0,0001 bis 1.000 mg pro kg Körpergewicht des Tieres. Der Bereich ist bevorzugt 0,001 bis 20 mg pro kg. Acarbose würde z.B. mit 16 mg/kg verabreicht. Besonders bevorzugt ist der Bereich 0,001 bis 5 mg/kg und insbesondere bevorzugt 0,001 bis 0,5 mg/kg.
Es ist besonders zu würdigen, dass alle Referenzen auf Behandlung hierin kurative, palliative und prophylaktive Behandlung einschließen.
Die Wirksamkeit von Agenzien kann unter Verwendung der folgenden Testverfahren gezeigt werden, in denen Acarbose als ein Beispiel eines geeigneten Amylase- und/oder α-Glucosidaseinhibitors verwendet wird.
Testverfahren
Pansen-bakterieller Amylaseassay-Protokoll 1
Der Assay verwendet einen Sigma-Amylasekit (577), um zu bestimmen, ob Verbindungen die Wirkung von Amylasen des Pansenflüssigkeitsüberstandes inhibieren. Die am Assay beteiligten enzymatischen Reaktionen sind wie folgt: 5ET-G₇PNP → (α-Amylase) → 2ET-G₅ + 2G₂PNP + 2ET-G₄ + 2G₃PNP + ET-G₃ + G₄-PNP 2G₂PNP + 2G₃PNP → (α-Glucosidase) → 4PNP + 10 Glucose
α-Amylase hydrolysiert 4,6-Ethyliden-G₇-PNP (ET-G₇PNP) zu G₂-, G₃- und G₄-PNP-Fragmenten. α-Glucosidase (α-1,4-Glucan-glucohydrolyse EC 3.2.1.3) hydrolysiert G₂PNP und G₃PNP, um p-Nitrophenol und Glucose zu ergeben. Fünf mol Substrat (ET-G₇PNP) werden hydrolysiert, um 4 mol p-Nitrophenol zu ergeben. p-Nitrophenol absorbiert Licht als 405 nm, und nach einer 2-minütigen Verzögerungsphase ist die Rate der Erhöhung der Absorption bei 405 nm direkt proportional zur α-Amylase-Aktivität in der Kavität.
Pansenflüssigkeit wurde von mit Futter GH 313 gefütterten 4-Monate alten Hereford × Friesen-Rind-Kälbern (125–135 kg, geliefert von Cwmnant Calves Ltd. Cwmnant. Tregaron. Ceredigion) gesammelt. Die Pansenflüssigkeit wurde von geschlachteten Kälbern direkt in vorgewärmte Vakuumflaschen, so bald sie nach Euthanasie möglich, gesammelt. Sie wurde dann durch eine doppelte Lage absorbierender Gaze (Absorbent gauze BP, GAUZ 4 von Robert Bailey plc, Stockport) filtriert, um Heu und Futterpartikel zu entfernen. Die Flüssigkeit wurde bei einer relativen Zentrifugalkraft von 23.300 für 60 Minuten zentrifugiert, und der Überstand dekantiert, wobei durch vorsichtiges Abgießen Kontamination aus der losen oberen Schicht des Pellets vermieden wird. Der Überstand wurde dann in 50 ml-Kunststoffröhrchen aliquotiert und bei –20°C eingefroren. Wenn zur Verwendung in einem Assay erforderlich, wird der Pansenflüssigkeits-Überstand durch Stellen der Röhrchen in kaltes Wasser aufgetaut. Testverbindungen oder Kontrollen wurden zu 4 μl/Kavität in die 96 Kavitäten-Assayplatte (96 well assay plate) verteilt. Dann wurden zu jeder Kavität 100 μl pro Kavität Sigma-Amylasereagens 577 (zur Hälfte des Volumen aufgefüllt, das in den Anleitungen beschrieben ist (d.h. 10 ml für ein 577-20 Fläschchen)) zugesetzt, gefolgt von 100 μl pro Kavität Pansenflüssigkeit-Überstand. Unter Verwendung eines Anthos-Plate Readers wurde eine T = 0 Ablesung bei 405 nm in dieser Stufe genommen. Die Platte wurde dann bei Raumtemperatur oder 37°C inkubiert bis ein optisches Dichtefenster von ungefähr 1,000 U gesehen wurde (typischerweise 1 Stunde bei 37°C oder 3 Stunden bei Raumtemperatur). Eine zweite Ablesung wurde bei 405 nm genommen und die erste Ablesung davon abgezogen. Aktive Verbindungen verursachen eine Verringerung der Ablesungen optischer Dichte im Vergleich zur Kontrolle ohne das Agens, das getestet wird.
Ergebnisse – IC₅₀ im Pansenflüssigkeits-Amylase-Screening (unter Verwendung von Sigmakit 577)
Dosisreaktion von Acarbose im Assay für Pansen-bakterielle Amylase [Acarbose-Konzentration in molaren Einheiten]
Assayprotokoll für Pansenflüssigkeits-Glucosidase
Dieser Assay wird verwendet, um IC50-Werte für Inhibitoren bakterieller Glucosidase-Aktivität von boviner Pansenflüssigkeit-Zellsuspension (RFCS) unter Verwendung eines kolorimetrischen Assays zu bestimmen.
Der Assay misst Umwandlung von Maltose zu Glucose. Pansenflüssigkeitszellen werden mit Maltose in der Anwesenheit von Inhibitoren inkubiert und die Menge gebildeter Glucose wird unter Verwendung eines roten kolorimetrischen Endpunkts bewertet. Je höher der Inhibierungsgrad, desto niedriger die gebildete Glucose und desto weniger gebildete rote Farbe. Die Platten werden bei 450 nm abgelesen.
Hauptreaktion:

• Maltose + Glucosidase → Glucose

Glucose-Assay:

• Glucose + ATP → G-6P und ADP (Hexokinase und Mg²⁺)
• G-6-P und NADP → 6-Phosphogluconat (6-PG) und NADPA
• NADPH + Phenazinmethosulfat (PMS) → NADP + PMSH
• PMSH + INT (Iodnitrotetrazoliumchlorid) → PMS + INTH INTH ist tiefrot gefärbt.

Pansenflüssigkeit wurde von einer zweimal täglich mit 1,4 kg GH313 und 2,3 kg Heu gefütterten fistulierten 5 Jahre alten trockenen Guernsey-Spenderkuh gesammelt. Die Pansenflüssigkeit wurde in vorgewärmten Vakuumflaschen gesammelt. Sie wurde dann durch eine doppelte Lage absorbierender Gaze (Absorbent gauze BP, GAUZ 4 von Robert Bailey plc, Stockport) filtriert, um Heu und Futterpartikel zu entfernen. Die Flüssigkeit wurde bei einer relativen Zentrifugalkraft von 650 für 15 Minuten zentrifugiert, um Futterpartikel und Protozoen zu entfernen. Der Überstand wurde in frische Röhrchen dekantiert und bei einer relativen Zentrifugalkraft von 23.300 für 60 Minuten zentrifugiert. Der Überstand und die lose obere Schicht des Pellets wurden verworfen. Das Pellet wurde in PBS zu 1:8 des Originalvolumens resuspendiert, d.h. 50 ml PBS für das Pellet von 400 ml Pansenflüssigkeit, und bei –20°C eingefroren. Wenn für die Verwendung erforderlich, wurden die Zellen durch Einstellen des Röhrchens in kaltes Wasser aufgetaut und dann auf 4,5 μl Zellen/Kavität (45 μl/ml) verdünnt.
Die Testverbindungen oder Kontrollen wurden in die 96 Kavitäten/Assayplatten zu 2 μl/Kavität verteilt, gefolgt von 50 μl/Kavität 10 mM Maltose und 50 μl/Kavität Pansenflüssigkeit/Zellsuspension. Die Platte wurde bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Sigma-Glucosenachweiskits 115A wurde durch Zusatz von 17 Millipore-Wasser und 4 ml Farbreagens zu jedem Fläschchen rekonstituiert. 100 μl dieser Lösung wurden pro Kavität zugesetzt und die Platte wurde für 45 Minuten zum 37°C-Inkubator zurückgebracht. Die Platte wurde dann bei 450 nm ausgelesen. Aktive Verbindungen verursachen eine Verringerung der Ablesungen der optischen Dichte im Vergleich zu den Kontrollkavitäten ohne Inhibitor.
Ergebnisse – IC₅₀ im Pansenflüssigkeits-Glucosidase-Screening
Assay-Protokoll 2 für Pansen-bakterielle Amylase
Der Assay verwendet einen Verdau von kovalent mit Remazol Brilliant Blue R-verknüpfter Amylose, um zu bestimmen, ob Verbindungen die Wirkung von Amylasen des Pansenflüssigkeitsüberstandes inhibieren. Wenn das unlösliche Substrat mit Amylase inkubiert wird, wird blauer Farbstoff in die Kavität freigesetzt. Dieser kann spektralphotometrisch gemessen werden, um zu bestimmen, wie viel Amylaseaktivität vorhanden ist und ob Testverbindungen Amylase-Inhibitoren sind.
Pansenflüssigkeit wurde von einer zweimal täglich mit 1,4 kg GH313 und 2,3 kg Heu gefütterten fistulierten 5 Jahre alten trockenen Guernsey-Donorkuh gesammelt. Die Pansenflüssigkeit wurde in vorgewärmten Vakuumflaschen gesammelt. Sie wurde dann durch eine doppelte Lage absorbierender Gaze (Absorbent gauze BP, GAUZ 4 von Robert Bailey plc, Stockport) filtriert, um Heu und Futterpartikel zu entfernen. Die Flüssigkeit wurde dann bei einer relativen Zentrifugalkraft von 23.300 für 60 Minuten zentrifugiert und der Überstand dekantiert, wobei Kontamination von der losen oberen Lage des Pellets durch vorsichtiges Abgießen vermieden wurde. Der Überstand wurde dann in 50 ml-Kunststoffröhrchen aliquotiert und bei –20°C eingefroren. Wenn zur Verwendung in einem Assay erforderlich, würde der Pansenflüssigkeits-Überstand durch Einstellen der Röhrchen in kaltes Wasser aufgetaut. Zu jeder Kavität wurden 100 μl pro Kavität einer 2%igen Suspension von Amylose azure (Sigma A3508) aus einem Becher, der währenddessen gerührt wurde, um eine gleichmäßige Verteilung des Substrats sicherzustellen, zugesetzt. Testverbindungen oder Kontrollen wurden in die 96 Kavitäten-Assayplatte zu 4 μl/Kavität verteilt, gefolgt von 100 μl pro Kavität Pansenflüssigkeits-Überstand. Die Platte wurde dann bei 37°C für 2,25 Stunden inkubiert. 100 μl der Flüssigkeit wurden sanft aus jeder Kavität unter Verwendung einer 12-Kanalpipette entfernt, in eine frische 96 Kavitäten-Platte überführt und bei 620 nm ausgelesen. Aktive Verbindungen verursachen eine Verringerung in den Ablesungen optischer Dichte im Vergleich zu den Kontrollkavitäten ohne Inhibitor.
Ergebnisse – IC₅₀ in Pansenflüssigkeits-Amylase-Screening (amylose azure)
Protokoll zur Bestimmung minimaler inhibitorischer Konzentrationen (MICs) in Aeroben
MICs wurden durch eine Standard-Agar-Verdünnungstechnik gemäß dem National Committee für Clinical Laboratory Standards (NCCLS, M7 Ausgabe, A2) bestimmt. Eine Kurzfassung des eingesetzten Verfahrens ist im Nachstehenden kurz beschrieben.
Die MICs wurden unter Verwendung des Standardtestmediums, Mueller Hinton (MH)-Agar (Unipath) bestimmt.
Vorbereitung von Agarplatten: 19 ml Testmedium wurde zu entsprechenden Verdoppelungsverdünnungen der Testverbindung (1 ml) zugegeben und gründlich gemischt. Die Mischung wurde in eine Petrischale (90 mm) gegossen, und dem Agar wurde es erlaubt zu verfestigen.
Vorbereitung von Inokulum: Vier bis fünf Kolonien des Testorganismusses wurde von einer MH-Agarplattenkultur in 10 ml MH-Brühe (Unipath) inokuliert. Die Brühe wurde bei 37°C inkubiert, bis sie sichtbar trüb war. Die Dichte der Kultur wurde durch Zugabe von Sole (0,85% V/V) auf eine Trübung eingestellt, die zu dem eines 0,5 McFarland-Standards gleich war.
Inokulation von Agarplatten: Die Platten wurden für ungefähr 1 Stunde in einem 37°C-Inkubator getrocknet. Platten wurden mit einem Multipoint Inoculator (Denley) inokuliert. Die Nadeln auf diesem Gerät geben 0,001 ml Inokulum an die Platte ab (entsprechend 10⁴–10⁵ Organismen).
Inkubation von Platten: Platten wurde umgedreht und bei 37°C für 18 Stunden inkubiert.
Bestimmung von Endpunkten: MICs wurden als die niedrigste Konzentration der Testverbindung, die Wachstum vollständig hemmte, unter Vernachlässigen einer einzelnen Kolonie oder eines durch das Inokulum verursachten schwachen Nebels, aufgezeichnet.
Literaturverweise für diesen Abschnitt:

National Committee for Clinical Laboratory Standards Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically – 2. Ausgabe. Approved standard reference methods for the determination of MIC of aerobic bacteria by broth macrodilution, broth microdilution and agar dilution. Chair holder J. Allan Waitz, PhD DNAX Research Institute, NCCLS Document M7-A2 Vilanova, Pa.: NCCLS, 1990.

ERGEBNISSE UNTER VERWENDUNG VON ACARBOSE IN DIESEM TEST:
IN DEN FOLGENDEN TESTS VERWENDETE FUTTERMITTEL [Alle Futtermittel bzw. Diäten wurden durch Grain Harvesters Ltd., The Old Colliery, Wingham, Canterbuty, Kent CT3 1LS, England, zur Verfügung gestellt.] GH313:
GH633
GH561:
GH654:
Bewertung von Agenzien unter Verwendung der Pansensimulationstechnik (rumen simulation technique) (RUSITEC) zum Nachahmen von chronischer Azidose.
Die in vitro-Pansensimulationstechnik (RUSITEC), zuerst beschrieben von Czerkawski und Breckenridge (1977), wurde verwendet, um den Effekt des Inhibitors bakterieller α-Amylase und/oder α-Glucosidase Acarbose auf tägliche pH-Profile und VFA-Bildung unter Verwendung einer kommerziellen Rinder-Konzentratration (GH313 – siehe später) zu bewerten. Es war kürzlich herausgefunden worden, dass Füttern von 30 g/d dieser Ration mit 2,5 g/d gehäkseltem Stroh Gesamtkonzentrationen flüchtiger Fettsäuren (VFA) von mehr als 150 mM, d.h. Konzentrationen, die mit chronischer Azidose in vivo verknüpft sind, ergibt (Nagaraja, Galyean & Cole, 1998, supra).
Ausstattung: Der Apparat bestand aus zwei jeweils vier Fermentationsbehälter enthaltenden RUSITEC-Einheiten. Jeder Behälter hatte ein Volumen von 1 l und wurde in einem Wasserbad auf 39°C geheizt. Das Futter wurde in eine Nylontasche (14 × 9 cm, 50 μm) gegeben und wurde unter Verwendung eines Kolbenmechanismus (8 Schläge/min) sanft bewegt. Puffer (McDougall, 1948) wurde kontinuierlich bei einer Rate von ungefähr 750 ml/Tag durch eine Acht-Kanal-Peristaltikpumpe (Watson Marlow) eingeleitet. Diese abfließende Flüssigkeit wurde in 20 ml Oxalsäure-Lösung (12 g/100 ml in entionisiertem Wasser) enthaltenden 1 l-Glasflaschen gesammelt. Dies wurde zugesetzt, um weitere mikrobielle Aktivität zu hemmen.
Futter: Jeder Behälter wurde täglich mit einem Beutel, enthaltend 30 g der kommerziellen pelletierten Ration GH313 (89% Trockenmasse) und 2,5 g Gerstenstroh (90% Trockenmasse), in 1 bis 2 cm Länge gehäkselt, gefüttert.
7 g Maisstärke (Sigma Kat. Nr. S4126) wurde der Flüssigphase aller Fermenter-Behälter beim Füttern an den letzten vier Tagen des Experiments zugesetzt, um akute Azidose zu stimulieren.
Pansenflüssigkeits-Donor: Pansenflüssigkeit wurde von einer 5 Jahre alten trockenen Guernseykuh gesammelt. Das Tier wurde dreimal täglich mit 1,4 kg GH313 und 2,3 kg Heu gefüttert. Panseninhalte wurden über eine Pansenfistel (Bar Diamond Inc., P.O. Box 60, Bar Diamond Lane, Parma, Idaho, 83660-0060, USA) gesammelt.
Behälterinokulation: Dem fistulierten Donortier wurden Panseninhalte um 08:00 h (vor dem Morgenfutter) entnommen. Das Material wurde in vorgewärmten isolierten Flaschen in das Labor gebracht und dann durch vier Lagen Baumwollgaze in eine weitere vorgewärmte isolierte Flasche abgeseiht. 70 g des festen Rückstands wurden in jede der acht Nylontaschen eingewogen. Eine Pansenfeststoffe enthaltende Tasche und eine frisches Futter enthaltende Tasche wurden in der Futterkammer für jeden Behälter platziert. Die flüssigen Inhalte jedes Behälters waren 100 ml entionisiertes Wasser, 200 ml künstlicher Puffer und 500 ml Pansenfluid. Nach Zusammensetzen und Verschließen der Behälter wurden sie in den Wasserbädern platziert und der Kolbenstab am Antriebsgestänge befestigt. Die Leitungen für abfließende Flüssigkeit wurden in den Sammelflaschen platziert. Der Kopfraum in jedem Behälter wurde für 2 Minuten mit CO₂ gespült, dann wurden der Kolbenantriebsmotor und die Pufferinfusionspumpe gestartet.
Tägliche Instandhaltungs- und Probennahme-Prozedur: Diese Prozeduren wurden an jedem Tag zur gleichen Zeit ausgeführt. Acht Futtertaschen wurden vorbereitet und eine Infusionspuffer-enthaltende 1 Liter-Spenderflasche wurde auf 39°C erwärmt.

1. Antriebsmotoren wurden abgeschaltet und die Infusionspumpe gestoppt. Infusionsleitungen wurden abgeklemmt und von der Pumpe abgehängt.
2. Die Fermentationsbehälter wurden aus dem Wasserbad entfernt und der Reihe nach gewartet.
3. Bei jedem Behälter wurde die Futterkammer herausgezogen und die Futtertaschen ausgetauscht. Am Tag 2 ersetzte die neue Tasche die Pansenfeststoffe enthaltende, während die neue Tasche an den nachfolgenden Tagen die ersetzte, die 48 Stunden inkubiert war. Die Kammer wurde dann wieder in den Fermentationsbehälter eingesetzt.
4. Die entfernte Tasche wurde in eine kleine Kunststofftasche platziert und 25 ml Puffer aus dem Spender wurden zugesetzt. Die Tasche wurde durch Quetschen im Puffer für 20 Sekunden gewaschen, dann wurde die Flüssigkeit in den Behälter gegossen. Diese Waschprozedur wurde zweimal mit frischem Puffer wiederholt.
5. Nach Wiederzusammensetzen des Behälters wurde er wieder im Wasserbad platziert und an das Antriebsgestänge angeschlossen. Die Pufferleitung wurde wieder angeschlossen und die pH-Elektrode zurückgesetzt. Die Sammelflasche für überlaufende Flüssigkeit wurde ausgetauscht und der Behälterkopfraum mit CO₂ gespült, während der nächste Behälter gewartet wurde.
6. Dieses Verfahren wurde bei allen Behältern wiederholt, dann wurden die Antriebsmotoren und die Infusionspumpe wieder gestartet, wenn Begasung abgeschlossen war. Beim letzten Behälter erfolgte eine Begasung für eine gleiche Dauer wie bei den anderen Behältern.

Behandlung mit Acarbose: Acarbose wurde als Glucobay^TM-Tabletten (Bayer, AAH Pharmaceuticals) erhalten. Jede Tablette enthält 100 mg Acarbose. Doppelte Behälter wurden mit 0, 1, 10 und 100 mg/Tag Acarbose durch Zusetzen einer Tablette zu einer von zwei Futtertaschen, um 100 mg/Behälter/d zu ergeben, behandelt. Die niedrigeren Dosen wurden durch Auflösen/Suspendieren einer Tablette in 10 ml Puffer (eine 10 mg/ml-Lösung von Acarbose ergebend) zubereitet. Ein ml dieser Lösung wurde dann, eine 1 mg/ml-Lösung ergebend, zu 9 ml Puffer zugesetzt. Ein ml dieser Lösung wurde dann zu den Inhalten von zwei Futtertaschen zugesetzt, um 10 und 1 mg/Behälter/d zu ergeben. Schließlich wurde die Acarbose auf dem Futter dadurch getrocknet, dass die Taschen über Nacht bei Raumtemperatur belassen wurden.

Analysen: Trockenmasseverluste aus den Nylontaschen nach 48 Stunden Inkubation wurden durch Trocknen der gewaschenen Tascheninhalte in einem Ofen für 23 Stunden bei 65°C gemessen. Proben der ablaufenden Flüssigkeit (10 ml) wurden täglich genommen und bei –20°C für nachfolgende VFA- und Lactatanalyse gelagert. pH wurde automatisch in 17 Minuten-Intervallen unter Verwendung von durch Philip Harris Education gelieferter Ausrüstung aufgezeichnet. In jeden Behälter war eine Kombinationselektrode über einen gasdichten Stutzen im Deckel eingesetzt. Jede Elektrode war an einem SensoMeter angeschlossen und vier SensoMeter wurden an einem DL plus 128-Datenlogger angeschlossen. Die ausgezeichneten pH- Werte wurden auf einen Datadisk 32-Software (Philip Harris Education) betreibenden PC heruntergeladen und dann zur weiteren Analyse in eine Tabelle überführt. Die Elektroden wurden aus den Behältern entfernt (wenn die Futtertaschen getauscht wurden), gespült und in pH 7,0-Standard-Puffer platziert. Die Ablesungen waren 7,0 +/– 0,1 Einheiten über das Experiment hinweg. Die Elektroden wurden auf pH 7,0 rekalibriert, bevor sie wieder in die Behälter eingesetzt wurden. VFAs wurden durch Zusetzen von 0,1 ml einer Lösung, enthaltend ein Gemisch aus 25 g/100 ml Metaphosphorsäure und 1,2 g/100 ml Crotonsäure, zu 1 ml der abfließenden Flüssigkeit gemessen. Diese Mischung wurde für 10 min bei 12.000 g zentrifugiert und ein Aliquot des Überstandes wurde in ein Autosampler-Fläschchen überführt. VFAs wurden auf einen mit einem Autosampler und Flammenionisationsdetektor ausgestatteten Hewlett Packard 6890 Series Gaschromatographen getrennt und quantifiziert. Die Säuren wurden auf einer SGE Ltd. 25 Meter BP21-Säule (0,33 mm O.D., 0,22 mm I.D., 0,25 μm Filmdicke) getrennt. Stickstoff wurde als das Trägergas mit einer Flussrate von 1,9 ml/min verwendet. Die Ofentemperatur war 165°C und Injektionsports und Detektoren wurden bei 250°C gehalten. Konzentrationen wurden durch Verwendung von Crotonsäure als einem internen Standard berechnet und das System wurde unter Verwendung einer Standardlösung, enthaltend Essig-, Propion-, Butter-, Isovalerian- und n-Valeriansäure, kalibriert. L-Milchsäure wurde unter Verwendung von Sigma-Kit 826 gemessen und D-Lactat wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens gemessen, außer dass L-LDH durch D-LDH (Sigma-Katalog Nr. L2011) ersetzt wurde und L-Lactat durch D-Lactat (Sigma Katalog Nr. L625) ersetzt wurde. Assays wurden in einer 96-Kavitäten-Mikrotiterplatte ausgeführt und die Absorptionen unter Verwendung eines Anthos-Mikrotiterplattenlesers, ausgestattet mit einem 340 nm Filter, gemessen. Das System wurde durch Zubereiten von Lösungen von D- und L-Lactat von 0 bis 100 mM kalibriert. Zeitplan:

Tag
0	Inokulieren.
3	Starte Sammeln ablaufender Flüssigkeit.
5	Starte tägliche pH-Messung.
10	Beginne Dosieren mit Acarbose (0, 1, 10 oder 100 mg/Behälter/d) zu Paaren von Behältern. Setze bis zum Ende des Experiments fort.
18	Setze zusätzliche Stärke zu allen Behältern zu.
22	Beende Experiment.

Literaturverweise für diesen Abschnitt:

Czerkawski, J. W. und Breckenridge, G., 1977. Design and development of a long-term rumen simulation technique (RUSITEC). British Journal of Nutrition, 38, 371–384.
McDougall, E. J., 1948, Studies on ruminant saliva. The composition and output of sheep's saliva. Biochemical Journal, 43, 99–109.

Rusitec-Ergebnisse: Acarbose Täglicher mittlerer pH in mit Acarbose behandeltem Rusitec-Modell chronischer Azidose
Vergleichen der Behandlungsperiode mit der vorangehenden Kontrollperiode zeigte eine Dosis-abhängige Änderung der VFA-Bildung von –16%, –10%, +3% und –3% in Reaktion auf Zugaben von 100, 10, 1 und 0 mg/Behälter/d Acarbose. Bei allen Behandlungen gab es eine generelle Verschiebung von Fermentationsprodukten von Acetat und Propionat zu Butyrat zwischen den Kontroll- und Behandlungsperioden, was in Erhöhungen der Butyratbildung von 134%, 76%, 27% bzw. 24% für die oben genannten Dosen resultierte. Es gab in dieser Studie keine L-Lactat-Anhäufung, was bestätigte, dass das Modell eher chronische als akute Azidose darstellte.
RUSITEC-Ergebnis unter Verwendung von Acarbose
Experimenteller Grundriss:
Tägliche Wartungsprozeduren wie vorher für Acarbose beschrieben.
Pansenflüssigkeit Donor-Kuh – gefüttert GH313-Pellets plus Gerstenstroh.
Tägliches Futter – 30 g GH313-Pellets plus 2,5 g gehäkseltes Gerstenstroh.
Behandlungsvorbereitung
Acarbose: 1 Tablette zu jeder Tasche zugesetzt, um 100 mg/Behälter/d zu ergeben.

Beispiel 8: Acht × 57 mg vorgewogene Proben, gelagert im Kühlschrank in 380 2.1. Einen Tag bevor die Futtertaschen im RUSITEC zu platzieren waren, wurde eine 57 mg-Probe in 2,28 ml Puffer (25 mg/ml) gelöst. 0,21 ml dieser Lösung wurden zu 1,9 ml Puffer zugesetzt, um eine 2,5 mg/ml Lösung zu ergeben. 1 ml jeder Lösung wurde zu einer vorbereiteten Futtertasche zugesetzt, um 25 und 2,5 mg/Behälter/d zu ergeben und dann über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Beispiel 8 wird als ein Vergleichsbeispiel verwendet. Zeitplan:

Tag
0	Inokulieren.
4	Starte Sammeln abfließender Flüssigkeit
5	Starte tägliche pH-Messung
9	Schaue Daten noch einmal durch, weise Behälter zu Behandlungen zu.
10	Beginne Behandlungen.
18	Beende Experiment.

Effekt der Behandlung mit Acarbose oder Beispiel 8 auf mittleren täglichen pH im Rusitec-Modell chronischer Azidose
Ergebnisse und Schlussfolgerungen: In diesem Experiment ergab 0,02 mM – Beispiel 8 – eine Erhöhung des mittleren täglichen pHs von 0,3 Einheiten im Vergleich zu 0,7 Einheiten für 0,2 mM Acarbose. Behandlungen mit 100 mg Acarbose, 25 oder 2,5 mg – Beispiel 8 – pro Behälter pro Tag oder keine (Kontrolle) verursachten Änderungen der gesamten VFA-Bildung von –15%, –8%, –1% und –11%, wenn mit der vorangehenden Kontrollperiode verglichen. Es gab einen Trend zur Neuverteilung von Fermentationsprodukten mit steigender Butyratbildung in der Behandlungsperiode verglichen mit der Kontrolle. Die proportionalen Steigerungen waren 113%, 20%, 18% bzw. 1%. Es gab in dieser Studie keine L-Lactats-Akkumulation, was bestätigt, dass das Modell eher chronische als akute Azidose darstellte.
IN VITRO-PANSENPROPIONSÄURE-SCREENING
REAGENZIEN
Pansenflüssigkeit: Eine acht Jahre alte trockene Guernsey-Kuh, ausgestattet mit einer Pansenfistel (Bar Diamond Inc., P.O. Box 60, Bar Diamond Lane, Parma, Idaho, 83660-0060, USA) wurde zweimal täglich mit 1,4 kg GH633 und 2,3 kg Heu gefüttert. Dieses Tier wurde als eine Quelle für Panseninhalte verwendet, die um 08:00 h (vor dem Morgenfutter) entnommen wurden. Das Material wurde in einer vorgewärmten isolierten Flasche zum Labor gebracht, dann durch vier Lagen Baumwollgaze in eine weitere vorgewärmte Flasche abgeseiht, die in einem Inkubator bei 40°C gelagert wurde, bis die Flüssigkeit in die Teströhrchen verteilt wurde.
Puffer: Löse das Folgende in entionisiertem Wasser.
Stelle mit 1 M NaOH auf pH 7,0 ein.
Befreie von Sauerstoff durch Hindurchperlenlassen einer Sauerstoff-freien Gasmischung (10% CO₂, 5% H₂ in Stickstoff) für mindestens 5 Minuten.
Substratmischung:

68 g Maisstärke. Ex Sigma Kat. S-4126.
17 g α-Cellulose. Ex Sigma Kat. C-6429.
15 g Typ 1 Sojamehl. Ex Sigma Kat. S-9633.

Gut mischen.
Suspendiere in Puffer zu 200 mg/ml unmittelbar vor Verwendung.
Metaphosphor/Crotonsäure-Lösung:
Das Folgende wurde in entionisiertem Wasser gelöst:
25% G/V) Metaphosphorsäure. Ex BDH Kat. 291904A plus
1,2% (G/V) Crotonsäure. Ex Sigma Kat. C-4630.
VFA-Standardmischung:
Das Folgende wurde in 100 ml entionisiertem Wasser gelöst.
1 ml Metaphosphorsäure/Crotonsäure-Lösung, zugesetzt zu 10 ml VFA-Mischung, dann aliquotiert in automatische Flüssigkeitssampler-Gefäße.
Verfahren:
Der Assay wurde in 16 ml Sorvall-Zentrifugenröhrchen durchgeführt.
Eine 100 mg Acarbose enthaltende Tablette wurde in 10 ml Puffer eingesetzt und geschüttelt, bis die Tablette vollständig aufgebrochen war, was eine 10 mg/ml-Lösung von Acarbose ergab. Diese Lösung wurde seriell auf 2, 0,4, 0,08 und 0,016 mg/ml mit Puffer verdünnt.
Ein ml dieser Lösungen wurde zu dreifachen Teströhrchen (endgültige Assay-Mischungskonzentrationen von 1000, 2000, 40, 8 und 1,6 μg/ml ergebend) zugesetzt. Kontrollröhrchen wurden durch Ersetzen der Acarboselösung mit Puffer hergestellt. Ein ml der Substratsuspension wurde zu allen Assayröhrchen zugesetzt, gefolgt von 3 ml gewärmtem entgastem Puffer und dann von 5 ml abgeseihter Pansenflüssigkeit. Suba-Seal-Stopfen (Nr. 29) wurden angepasst und der Kopfdruck in den Röhrchen wurde durch Durchführen einer an einer Vakuumleitung angeschlossenen subkutanen Nadel durch den Stopfen reduziert, bis die Röhrcheninhalte aufschäumten. Die Röhrchen wurden dann für 6 Stunden in einen 40°C Inkubator gestellt und stündlich geschüttelt.
Prä-Inkubations-VFA-Konzentration wurde durch Herstellen von drei Röhrchen wie zur Inkubation bestimmt, aber Metaphosphor-/Crotonsäure-Lösung wurde sofort nach der Pansenflüssigkeit zugesetzt. Diese Röhrchen wurden bei 4°C gelagert und mit den Post-Inkubations-Röhrchen verarbeitet.
Die Inkubation wurde nach 6 h durch Entfernen der Stopfen und Zusetzen von 1 ml Metaphosphor-/Crotonsäure-Lösung beendet. Die Röhrchen wurden dann für 8 Minuten bei 18.000 g bei 4°C zentrifugiert. Ein Aliquot des Überstandes wurde in einem automatischen Probensammler-Gefäß gelagert, bis es für VFA-Analyse durch Gaschromatographie benötigt wurde (wie im RUSITEC-Protokoll beschrieben).
BERECHNUNG DER ERGEBNISSE:
Bildung von Gesamt-VFA und Propionat während der Inkubation wurde wie folgt bestimmt. Erstens, zuerst wurden die Prä-Inkubations-Konzentrationen von Gesamt-VFA und Propionsäure als der Mittelwert der Analysen der Prä-Inkubations-Proben berechnet. Dann ergab für jede inkubiere Probe Post- minus Prä-Inkubationskonzentration die Produktion während der Inkubation. Das molekulare Verhältnis von Propionsäure an der während der Inkubation produzierten Gesamt-VFA wurde auch berechnet.
Die Gesamt-VFA- und % Propionsäure-Werte wurden für die wiederholten Röhrchen gemittelt und die mittlere Kontroll-Gesamt-VFA und % Propionsäure-Werte als 100% normalisiert, dann die durch die Testbehandlungen verursachte Änderung relativ zu diesem Wert ausgedrückt.
In vivo-Testen in fistulierten Rindern
Ziel: Den Effekt des Agens zum Testen, in diesem Fall Acarbose, auf in fistulierten Rindern induzierte chronische Pansenazidose zu bestimmen. Ein für chronische Azidose repräsentatives Pansen-pH-Profil wurde durch schrittweise Erhöhung des Gehalts der Konzentratfütterung einer spezifischen Diät und einer Verringerung des angebotenen Rauhfutters induziert. Dies wurde gefolgt von Behandlung jedes Tieres mit Acarbose, verabreicht über eine permanente Pansenfistel, um seine Fähigkeit, Pansen-pH zu normalisieren, zu bewerten.
Experimentelle Tiere: Sechs fistulierte Hereford × Friesenrind-Stiere, 170–230 kg wiegend (geliefert von Cwmnant Calves Ltd., Cwmnant, Tregaron, Ceredigion)
Behandlung: Glucobay^® 100. Acarbose 100 mg pro Tablette.
Handhabung: Den Rindern wurden GH651 cattle high cereal beef-Pellets (variable Menge) mit Gerstenstroh (variable Menge), verteilt auf zwei, etwa um 08.00 Uhr und 14.30 Uhr jeden Tag gegebene, gleiche Fütterungen verfüttert. Genaue Fütterungszeiten wurden aufgezeichnet. Wasser war ad-lib. verfügbar. Rinder wurden in einem umgebungsbezogen auf 16°C geregelten Gebäude einzeln in Boxen (9 m²/Box) untergebracht.
Entwurf:
Während chronische Azidose induziert wurde, wurden manuelle pH-Messungen ungefähr 5 und 8 Stunden nach der Morgenfütterung genommen. Pansenflüssigkeit-Proben wurden für VFA- und Lactat-Analyse genommen. Sobald ein geeignetes pH-Profil erzeugt war (siehe Prozeduren-Abschnitt) wurde jeder Stier mit einem Geschirr ausgestattet, um eine automatisierte pH-Probennahme und Aufzeichnungs-Vorrichtung (Philip Harris Plus 128 Datenlogger + pH. First Sense Recorder) zu tragen. Pansen-pH-Werte wurden automatisch alle 17 Minuten für ein Maximum für 21 Tage aufgezeichnet. Pansenflüssigkeitproben (10 ml) wurden zweimal täglich für Messungen von VFA-Gehalten, Molverhältnissen und Lactatgehalten genommen. Diese wurden (durch manuelles Abnehmen einer Probe des Panseninhalts mit einem kleinen Edelstahlschöpfer, Filtrieren und Überführen in ein 10 ml-Polypropylengefäß) gerade bevor Acarbose zum Pansen zugesetzt wurde zu beiden Dosierungszeiten genommen. Die pH-Sonden wurden unmittelbar vor der Morgenfütterung für Reinigung und Rekalibration entfernt.
Ergebnisse: Die täglichen pH-Kurven wurden verwendet, um die Zeitspanne zu kalkulieren, in der Pansen-pH unter pH 5,5 und daher chronische Azidose anzeigend war.
Zeit unter pH 5,5 während Kontroll- und Acarbose-Behandlungsphasen
Pansenflüssigkeits-Proben wurden um 13:00 und 16:00, d.h. vor und nach der Nachmittagsfütterung, genommen. Es gab wenig Unterschied bei Gesamt-VFA-Konzentrationen bei den 13:00-Proben, aber die VFA-Konzentration in den 14:00-Proben fiel während der Behandlungszeitspanne. Dies war mit dem pH-Profil konsistent. Zu allen Probennahmezeiten war der Prozentsatz von Propionat während der Behandlungszeitspanne niedriger. Es gab keine Akkumulation von Milchsäure in den Pansenflüssigkeitsproben, was darauf hinweist, dass die Tiere während des Experiments keine akute Azidose erfuhren.
WIRKSAMKEIT VON ACARBOSE IN LAKTIERENDEN MILCHRINDERN
Die Studie maß den Effekt von Acarbose auf Pansen-pH, Milchertrag und Milchzusammensetzung bei laktierenden Kühen, in denen chronische Azidose durch Anbieten einer hoch fermentierbaren Diät induziert worden war. Die Studie schloss Messungen der Rate der Adaption an die Einführung und Entfernung von Acarbose ein.
Experimentelle Tiere waren sechs laktierende multipaare Holsteiner/Friesen-Rind-Kühe zwischen 5 und 11 Jahren Alter und 500–750 kg mit permanenten Pansen-Kanülen. Die Tiere begannen das Experiment früh in der Laktation, aber noch vor Spitzenlaktation, um größere experimentelle Empfindlichkeit zu erlauben. Die hauptsächlichen Messungen dieser Studie waren pH im ventralen Sack des Pansens ("ventral sac of the rumen"), Milchertrag und Milchzusammensetzung.
Handhabungspraktiken stimmten überein mit dem UK Home Office code of practice for the Housing and Care of Animals Used in Scientific Procedures (1989).
ENTWURF: In die Studie ein geschriebene Tiere erhielten den Testartikel 21 Tage lang ab den unten beschriebenen Startzeitpunkten.

A: = Kontroll-Ergänzungsfutterration
B: = Acarbose enthaltende Ergänzungsfutterration

PROZEDUR:
Maskierung/Verfahren zum Verringern des systematischen Fehlers: Sechs Taktierende Multipaare Holsteiner/Friesen-Rind-Kühe wurden am Tag –1 in die Studie eingeschrieben. Basierend auf ihrem Kalbungsdatum wurden Tiere gepaart (Kühle mit gleichen Daten paarten zusammen). Innerhalb jedes Paares erhielt ein Tier T01 und das andere T02. Die Behandlung wurde zufällig zugeordnet. Wo es möglich war, wurde die Randomisierung beschränkt, so dass die durchschnittlichen Futteraufnahmen pro Behandlungsgruppe gleich waren.
VERFAHREN:
Bei ungefähr 2 Wochen vor Tag 0 begannen 8 Tiere eine vorläufige Fütterungsperiode, die entworfen war, um ein Fütterungsregimen zu identifizieren, das azidotische pH-Werte im Pansen induzierte. Jede Kuh wurde von diesem Punkt bis zum Abschluss der Studie in einem Anbindestall gehalten. Kontroll-Gesamtmischration ("control total mixed ration") (TMR) wurde gefüttert und wo nötig wurden die Menge und die Zusammensetzung angepasst, um einen minimalen Pansen-pH von 5,0–5,5 zu etablieren. Die mittlere Aufnahme über die letzten 5 Tage der vorläufigen Periode wurde berechnet und diese mittlere Menge wurde jedem Tier während des Versuchs angeboten. Nicht verzehrtes Futter wurde entfernt und auf einer täglichen Basis und vor dem Morgenfutter gewogen.

Die TMR wurde supplementiert mit 0,5 kg/Tag gemahlenen Weizen entweder ohne Zusatzstoff (Kontrolle) oder den Testartikel (Acarbose bei 15 g pro Tag) enthaltend, und separat in gleichen Hälften über die Morgen- und Abendfütterungen angeboten. Ein automatisches Tränkesystem wurde auch eingesetzt, um Wasser ad-libitum anzuwenden. TMR-Zusammensetzung:

Bestandteil	% in Gesamtration TM
Gras-Silage	10,0
Mais-Silage	30,0
gebrochener Weizen	16,7
gemahlene Gerste	9,2
Rapssamenschrot	4,1
Sojabohnenschrot	6,1
melassierte SBP	9,2
Weizenfutter	8,2
Regumaize	4,0
Fischmehl	1,0
Mineralien	1,5
Gesamt:	100,0

Ab dem Beginn der Studie wurden alle Tiere zweimal täglich über ein Rohrleitungssystem ungefähr um 06.30 h und 16.00 h gemolken. Das Milchertragsgewicht wurde manuell aufgenommen und dann in eine elektronische Tagesmilch-Datei übertragen.
Am Tag –1 wurde jedes Tier durch einen Tierarzt physisch untersucht, um physische und klinische Normalität zu beurteilen. (Die) Tiere entsprachen allen der Einschlusskriterien und keinem der Ausschlusskriterien.
Am Tag 0 begann das im ENTWURF beschriebene Testartikel-Fütterungsregime. Drei Tiere folgten dem Entwurf Kontrolle/Behandlung/Kontrolle (A/B/A) in drei aufeinander folgenden experimentellen Perioden, während eine zweite Gruppe von drei Tieren der entgegengesetzten Behandlungssequenz (B/A/B) folgte. Experimentelle Fütterungsperioden dauerten 3 Wochen, bestehend aus zwei Wochen zur Anpassung und einer abschließenden Woche für detaillierte Messungen.
(Die) Tiere wurden zweimal täglich bei ungleichen Intervallen um ungefähr 08.00 h und 15.00 h (d.h. 7 und 17 h-Intervalle) gefüttert, um zu erlauben, Pansenprobennahme für pH-Messung während der Periode minimalen pHs (geschätzt 2–4 h nach der zweiten Fütterung) zu verdichten. Jedem Tier wurden 0,5 kg/Tag gemahlenes Weizen-Ergänzungsfutter zum TMR, über die zwei Fütterungen gleichmäßig verteilt und entweder keinen Zusatzstoff (Ergänzungsfutter A) oder den Testartikel (Ergänzungsfutter B) enthaltend angeboten.
Jedes Tier schloss die Studie nach der abschließenden pH-Messung der dritten expe rimentellen Periode am Tag 62 ab.
MESSUNGEN: Automatisierte pH-Messausrüstung (Philip Harris Plus 128 Data logger + pH First Sense Recorder) wurde verwendet, um Pansen-pH-Werte alle 17 Minuten aufzunehmen. Eine 10 ml–15 ml-Probe Pansenflüssigkeit, genommen um 07.30 hrs, und zwei bei ungefähr minimalem pH (um ungefähr 18.00 hrs und 20.00 hrs) genommene Proben wurden sofort bei –20°C für weitere Analyse eingefroren. Frisches Gewicht der angebotenen und verweigerten TMR wurde täglich für jedes Tier aufgenommen. Während Nicht-Messungs-Wochen (d.h. vorläufige Periode und Anpassungswochen 1 und 2 in jeder experimentellen Periode) wurde Trockenmasse^TM der Hauptfutterkomponenten (Gras- und Mais-Silagen) ungefähr wöchentlich (oder, falls es aufgrund der visuellen Beurteilung der Silage nötig erschien, öfter) bestimmt. Für Messungswochen (d.h. Woche 3 in jeder experimentellen Periode) wurde die TM der TMR täglich während der letzten 5 Tage gemessen, während eine Hauptmenge von jeder der einzelnen TMR-Komponenten (Gras-Silage, Mais-Silage, Konzentratmischung, gemahlener Weizen) aus den gleichen Tagen für nachfolgende Diätanalyse (d.h. eine Probe jedes Hauptfutters pro Periode) hergestellt wurden. Da es ein einzelner Flüssigkeitsraum ist, wurde nur eine Probe von Regumaize genommen. Von Verweigerungen wurden Proben zur TM-Bestimmung während der letzten 5 Tage jeder experimentellen Periode genommen. Einzelne 20 ml-Milchproben für Fett, Protein und Lactose wurden beim Morgen- und Nachmittagsgemelk (am and pm milkings) an 3 alternierenden Tagen in jeder Anpassungswoche genommen. Während der Messwoche wurden Milchproben an den 5 letzten aufeinander folgenden Tagen genommen. Jede Milchprobe wurde separat analysiert. Zusätzlich wurde eine weitere 20 ml-Milchprobe bei jeder Gelegenheit, zu der während der Messwochen Proben von der Milch genommen wurden, genommen und sofort bei ungefähr –20°C für mögliche nachfolgende Analysen eingefroren. Tägliche Milchertrags-Daten wurden durch Summierung der Morgen- und Abendgemelke an einem gegebenen Datum generiert. Lebendgewicht wurde in jeder experimentellen Probe bei jedem Tier gemessen.
ERGEBNISSE: Pansen-pH wurde berechnet als Zeit unter pH 5,5 (d.h. in einem Zustand chronischer Azidose) für die Behandlungs- und Kontrollperioden. Die durchschnittliche Zeit unter pH 5,5 war 4,3 Stunden für Kontrollperioden und 3,4 Stunden für Behandlungsperioden. Milchfett erhöhte sich dramatisch bei behandelten Tieren, von einem Durchschnitt von 1033 g pro Tag auf 1281 g pro Tag. Der Gehalt an Fett in der Milch war ebenfalls erhöht, von 32,8 g/l auf 46,1 g/l. Modell akuter Azidose: Beurteilung von Acarbose EXPERIMENTELLER ENTWURF:

* 48,4% Maisstärke, 48,4% gemahlener Mais, 2,1% Natriumcaseinat, 1,1% Harnstoff (Lebensmittelqualität), suspendiert in ungefähr 5 Gallonen lauwarmem Wasser.

Prozeduren: Zehn trocken gestellte Holsteiner-Kühe und -Färsen (anfängliches Gewicht 740 ± 27 (SE) kg, Bereich = 606–870 kg) wurden während der Vorbehandlungsperiode ("pretreatment period") in der Gruppe gehalten und während der experimentellen Periode einzeln gehalten. (Die) Tiere wurden während Probennahme, Behandlung und erster Herausforderung ("first challenge") zu einer Halsfangvorrichtung gebracht. Anschließend wurden ihnen Proben entnommen und sie dann ihren Einzelboxen ("individual pens") zugeteilt. Den Tieren wurden ungefähr 5 kg Alfaalfa-Heu, 16 kg Silage, 6 kg Konzentrat und 5 kg Stroh täglich in einer in zwei Fütterungen angebotenen gesamten gemischten Ration (60:40 Konzentrat:Rauhfutter-Diät) angeboten. Sie wurden nur während der Vorbehandlungsperiode auf Stroh gebettet. Wasser wurde ad libitum bereitgestellt. (Die) Tiere wurden für mindestens 10 Tage an die Taktierende Ration gewöhnt, bevor Behandlungen verabreicht wurden. Aus einer Gruppe von 10 trocken stehenden Kühen und nicht-Taktierenden Färsen wurden 10, basierend auf vorheriger Exposition gegenüber Herausforderung ("challenge") und allgemeiner Gesundheit, ausgewählt. Tiere wurden durch Körpergewicht zu Paaren angeordnet und wurden zufällig zu Kontroll- und Acarbose-Behandlungsgruppen innerhalb des Paares zugewiesen, wobei gleiche Verteilung von Färsen und Kühen sichergestellt wurde. An Tagen 0–6 der Behandlung: Tiere 1,07 mg Acarbose/kg, aufgelöst in ~200 ml Wasser, durch die Pansenkanüle gerade vor den Vormittags- (07:30) und Nachmittags- (16:00)Fütterungen. Behandlung 1-Tiere erhielten nur eine äquivalente Menge Wasser. An Tagen 7 und 8 wurde jedem Tier eine Herausforderung durch die Kanüle verabreicht. Wenn pH ~4,5 erreichte und es Anzeichen von L-Lactat-Bildung gab, wurde akute Azidose als induziert betrachtet. Wenn ein Tier akute Azidose durch diese Kriterien erfuhr, wurden Panseninhalte entfernt und der Pansen mit Panseninhalten von einem Donortier inokuliert. Tiere wurden an Tagen –1 und 5 zur Berechnung der Acarbose-Dosierung und Herausforderungsmengen ("challenge amounts") gewogen. Um Pansenflüssigkeits-pH zu messen, wurden Tiere mit einem Geschirr zum Halten eines automatisch pH-Daten-aufnehmenden Systems ausgestattet. Der Pansen-pH wurde alle 10 Minuten während der Tage der Herausforderung ("days of challenge") aufgenommen, bis ein Tier akute Azidose erfuhr. Pansenflüssigkeits-Proben wurden von der Pansen-Kanüle durch ein filtriertes Probenröhrchen genommen (~50 ml). Probennahmezeiten waren gerade vor jeder Herausforderung und 3, 6, 8, 10 und 12 Stunden nach jeder Herausforderung. Der pH wurde sofort gemessen. Proben für VFA und Lactatanalyse wurden hergestellt durch Zusetzen von 10 ml Pansenflüssigkeit zu 1 ml einer eine Mischung von 25 g/100 ml Metaphosphorsäure und 1,2 g/100 ml Crotonsäure enthaltenden Lösung direkt nach Sammlung. In manchen Fällen wurde die Probe vor pH-Messung und Säurebehandlung durch Gaze filtriert. Diese Mischung wurde für 10 min bei 12.000 g zentrifugiert. Ein Aliquot des Überstandes wurde für sofortige Lactatanalyse entfernt, eines für anschließende Lactatanalyse unter Verwendung von Sigmakit 826 eingefroren. Ein drittes Aliquot wurde für anschließende VFA-Analyse in ein Autosampler-Gefäß überführt. Während dieser Studie wurde eine anfängliche Bestimmung von L-Lactat unter Verwendung von Sigma-Kit 735 gemacht, um azidotischen Status zu etablieren. Anschließend wurden D- und L-Lactat zur statistischen Analyse, wie unten beschrieben, nachgemessen. VFAs wurden auf einem mit einem Autosampler vom Flammenionisationsdetektor ausgestatteten Hewlett Packard 6890-Serie Gaschromatographien gemessen. Die Säuren wurden auf einer SGE Ltd. 25 metre BP21-Säule (0,33 mm O.D., 0,22 mm I.D., 0,25 μm Filmdicke) getrennt. Stickstoff wurde als das Trägergas in einer Flussrate von 1,9 ml/min verwendet. Die Ofentemperatur war 165°C, und Einspritzblock und Detektoren wurden bei 250°C gehalten. Konzentrationen wurden durch Verwendung von Crotonsäure als einem internen Standard berechnet, und das System wurde unter Verwendung einer Essig-, Propion-, Butter-, Isovalian- und n-Valeriansäuren enthaltenden Standardlösung kalibriert.
ERGEBNISSE:
pH: Für die Herausforderung werden pH-Daten dargestellt als eine Berechnung der Zeit, die Pansen-pH unterhalb eines Bereichs von Höchstgrenzen war. Die erste Herausforderung induzierte keine akute Azidose, aber nach der zweiten Herausforderung hatten vier der Kontrollrinder Pansen-pH-Werte unter 4,5. Die kurze Dauer unter pH 4,5 lag an ihrer Entfernung aus der Studie an diesem Punkt. In all den behandelten Rindern blieb Pansen-pH über 5,0, was darauf hinweist, dass Acarbose akute Azidose anschließend an Kohlenhydrat-Herausforderung ("carbohydrate challenge") verhütete. Durch eine einfache Kontingenz-Tabellenanalyse wurde gezeigt, dass der Behandlungseffekt des Reduzierens der Anzahl an Kühen, die azidotisch wurden, signifikant waren (P < 0,5).
Lactate: Es wurde nach der ersten Herausforderung kein Lactat detektiert, aber die Level stiegen auf > 50 mM für vier von fünf Kontrollen innerhalb von 10 Stunden der Herausforderung auf der zweiten und blieben in all den Acarbose-behandelten Tieren bei Null. Die fünfte Kontrolle, die pH von ~5,0 hatte, hatte einen maximalen Lactatpegel von 6 mM. Mittlere D-, L- und Gesamtlactate aus der zweiten Herausforderung sind in der Tabelle zusammengefasst. Alle Lactate waren höher in der Kontroll- als Behandlungsgruppe, und es gab einen Trend für Behandlung durch zeitliche Wechselwirkung (die Unterschiede wurden über die Zeit größer).
Gruppen-mittlere(s) D-Lactat, L-Lactat und Gesamt-Lactate in Proben von Tag 2-Herausforderungen (mM)
Einzeltier-pH-Reaktionen auf zweite Kohlenhydrat-Herausforderung Zeit unter pH-Höchstgrenzen-Werten anschließend an zweite Kohlenhydrat-Herausforderung
DISKUSSION/SCHLUSSFOLGERUNGEN. Zweimal täglich Acarbose-Behandlung reduzierte pH-Reaktionen auf eine hohe Kohlenhydrat-Belastung und blockierte L-Lactat-Bildung in Reaktion auf die Belastung. Die pH-Reaktionen auf die erste Herausforderung waren bei den zwei Gruppen ähnlich; es war die zweite Herausforderung, die Unterscheidung erlaubte. Dies ist ähnlich zu den Beobachtungen von Cowe et al. (J. Anim. Sci. 77: 2259, 1999), in denen akute Azidose nach mehrfachen Herausforderungen induziert wird.

Claims

Verwendung eines wirksamen Inhibitors von Pansen-bakterieller α-Amylase und/oder α-Glucosidase in der Herstellung eines Medikaments für die kurative, palliative und prophylaktische Behandlung von Pansenazidose und sekundären Zuständen von Pansenazidose, wobei der Inhibitor ausgewählt ist aus:
und Trestatinen der Formel:
wobei N 1, 2 oder 3 ist und wenn N = 2, diese Trestatin A darstellt, wenn N = 1, diese Trestatin B darstellt und wenn N = 3, diese Trestatin C darstellt, und wobei die Pansenazidose oder der sekundäre Zustand von Pansenazidose ausgewählt ist aus: chronischer Pansenazidose, akuter Pansenazidose, Laminitis, chronischer Laminitis, intermittierender Diarrhoe, schlechtem Appetit und cyclischer Futteraufnahme, einer hohen Herden-Merzvieh-Rate ("herd cull rate") wegen schlecht definierter Gesundheitsprobleme, schlechtem Körperzustand, Abszessen ohne offensichtlichen Ursachen, Ulceration der Sohle, Läsionen der weißen Linie, Hämorrhagien der Sohle, missgestalteten Hufen, Lahmheit, Leberabszessen, respiratorischen Erkrankungen, reduzierten Fertilitätsraten, reduzierter Gesichtszunahme bei Fleischvieh, reduzierter Futterverwertung bei Fleischvieh und verringertem (verringerter) Milchertrag und -qualität bei Milchvieh.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Inhibitor aus Acarbose, Trestatin A und Trestatin C ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Inhibitor aus Acarbose und Trestatin C ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Inhibitor Acarbose ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Medikament für die Behandlung von chronischer Pansen-azidose ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Medikament für die Behandlung von akuter Pansenazidose ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei, wenn der zu behandelnde Zustand reduzierte Milchqualität ist, die Verbesserung der Milchqualität als eine Erhöhung des Fettgehalts der Milch manifestiert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Inhibitor von Pansen-bakterieller α-Amylase und/oder α-Glucosidase in Kombination mit einem oder mehreren in der Behandlung (einschließlich Prophylaxe) von Erkrankungen verwendeten Agenzien verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Inhibitor von Pansen-bakterieller α-Amylase und/oder α-Glucosidase in Kombination mit einem oder mehreren Agenzien verwendet wird, die ausgewählt sind aus: Puffern, Antibiotika, Antiparasitika, Antihistaminika, Antimykotika, antibakteriellen Substanzen, Antiinflammatoria, Nahrungsergänzungsmitteln und erweichenden Mitteln.
Verwendung eines Assays als ein Screeningverfahren bei der Identifizierung eines zur Behandlung von Azidose in einem Wiederkäuer geeigneten Inhibitors einer Pansen-bakteriellen α-Glucosidase, wobei der Assay gekennzeichnet ist durch Inkubieren einer Verbindung mit Pansenflüssigkeit und Maltose und Messen der Umwandlung von Maltose zu Glucose durch kolorimetrische Mittel.