DE19821038A1

DE19821038A1 - Neue Glykoside des Acarviosins, Synthese eines neuen Saccharase-Inhibitors durch Biotransformation der Acarbose

Info

Publication number: DE19821038A1
Application number: DE19821038A
Authority: DE
Inventors: Anneliese Crueger; Michael Doerschug; Fred-Robert Heiker; Hasso Von Hugo; Erich Rauenbusch
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1998-05-11
Publication date: 1999-11-18

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Biotransformation des bekannten Glykosidhydrolase-Inhibitors Acarbose durch wachsende Mikroorganismen zu einem neuen, in vitro aktiver Saccharase-Inhibitor der Formel DOLLAR F1.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Biotransformation des bekannten Glykosid hydrolase-Inhibitors Acarbose durch wachsende Mikroorganismen zu einem neuen, in vitro aktiveren Saccharase-Inhibitor, als die Acarbose selbst. Biotransformations verfahren sind aus der Literatur hinreichend bekannt. ["Enzyme catalysis in organic synthesis" a comprehensive handbook, ed. by K. Drauz and H. Waldmann - Wein heim, New York, Basel, Cambridge, Tokyo, VCH 1995, ISBN 3-527-28479-6 und Kurt Faber "Biotransformation of non-natural compounds; state of the art and future development" 1997 IuPAC, Pure and Applied Chemistry 69, 1613-1632 und Johannes Tramper "Chemical versus biochemical conversion; when and how to use biocatalysts"; Biotechnology and Bioenginecring, 52, 290-295 (1996)].

Glykosidhydrolase-Inhibitoren aus Actinoplanaceen und ihre Verwendung als Thera peutika bei der Behandlung von z. B. Diabetes wurden bereits in der Patentschrift DE-20 64 092-C2 beschrieben.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß man bei der fermentativen Herstellung der Acarbose unter Verwendung eines "definierten" Mediums mit dem Actinoplanes- Stamm SE 50/110 (einschließlich seiner Varianten und Mutanten), durch Zusatz eines Glykosids wie z. B. dem Rutin, die Bildung eines bisher unbekannten Saccharase-Inhibitors erreichen konnte. Im Standard-HPLC-System für Acarbose konnte die neue Hemmsubstanz nicht nachgewiesen werden, wohl aber aufgrund der hohen Hemmaktivität im enzymatischen Saccharase-Inhibitions-Test (SIE-Test). Die gewonnenen Reinpräparate hatten im Saccharase-Inhibitionstest gegenüber der Acarbose eine etwa um den Faktor 6 gesteigerte Hemmaktivität.

Die Struktur des Inhibitors konnte durch die Kombination von instrumenteller und klassisch-chemischer Analytik als verzweigtes Pseudotetrasaccharid, zusammenge setzt aus dem Acarviosin der Acarbose und Rutin, ermittelt werden. Die Herkunft und Stammbeschreibung des Wildtyps SE 50 der für die Biotransformation einge setzten Variante SE 50/110 ist der Patentschrift DE 20 64 092 C2 zu entnehmen.

Die Strukturformel des Inhibitors stellt sich wie folgt dar:

Der neue Saccharase-Inhibitor ist durch die folgenden physikalisch-chemischen Parameter charakterisiert:

1. Summenformel: C₄₀H₅₁NO₂₃
2. Masse: 913
3. Drehwinkel: [α]²⁰D= +106,2° (C = 0,96, H₂O)

Die Substanz, ein hellgelbes amorphes Pulver, ist in Wasser und Methanol gut lös lich. Unter acetolytischen Spaltbedingungen (Essigsäureanhydrid, konz. Schwefel säure) erhält man als Hauptprodukte peracetylierte Rhamnose und Komponente 2 der Acarbose (ein Acarviosylrest mit 1 → 4 verknüpfter Glucose).

Es wurde gefunden, daß man den erfindungsgemäß verwendbaren Saccharase-Inhi bitor erhält, wenn man Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mine ralsalze enthält unter aeroben Bedingungen kultiviert und die Verbindung isoliert. Zur Gewinnung des Inhibitors eignen sich innerhalb der Ordnung Actinomycetales beson ders Vertreter der Familie Actinoplanaceae und hier hauptsächlich solche aus der Gat tung Actinoplanes, die in der Lage sind, den Glykosidhydrolase-Inhibitor Acarbose zu bilden. Als Beispiel sei Actinoplanes Stamm SE 50/110 (einschließlich seiner Varian ten und Mutanten) genannt. Ein Muster dieses Stammes wurde unter Nummer 793.96 beim Centralbureau vor Schimmelkulturen (Baarn, Holland) als Actinoplanes spec. SE 50/110 hinterlegt.

Für die Kultivierung wurde zur Gewinnung des Inhibitors vorrangig die Kohlenstoff quelle Maltose und als Stickstoffquelle Asparagin eingesetzt. Die Mineralsalze, wel che im Nährmedium enthalten sein sollen, liefern z. B. folgende Ionen: Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, K⁺, Cl⁻, SO₄⁻⁻, PO₄⁻⁻⁻ sowie Ionen der üblichen Spurenelemente wie Fe, Mn, Zn, Co.

Falls die Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen bzw. das verwendete Wasser nicht aus reichend diese Salze bzw. Spurenelemente enthalten, ist es zweckmäßig, das Nährme dium entsprechend zu ergänzen. Vor Beimpfen der Nährlösung, werden dem Medium Glycoside, wie z. B. Rutin, steril zugegeben. Die Zusammensetzung des Nähmediums kann in weiten Bereichen variiert werden. Art und Zusammensetzung des Nährme diums werden im allgemeinen davon abhängig sein, welche Bestandteile jeweils be sonders günstig zur Verfügung stehen. Bei der Durchführung des Verfahrens kann es günstig sein, zu Beginn der Kultivierung nur relativ geringe Konzentrationen der löslichen Nährlösungsbestandteile zu verwenden und dann im Laufe der Kultivierung diese Bestandteile in Form steriler, relativ konzentrierter Lösungen dem Kulturansatz fraktioniert zuzufüttern.

Der pH-Wert der wachsenden Kulturen sollte zwischen etwa 5,5 und etwa 9,5 ge halten werden, vorrangig jedoch liegt der pH-Wert um den Neutralbereich bei pH 6,8. Ein zu starker pH-Abfall in den sauren Bereich kann durch Zusätze einer organischen oder anorganischen Base, vorzugsweise CaCO₃ vermieden werden. Wie in der Fer mentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchge führt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säuren, z. B. H₂SO₄ oder sterile Lauge, z. B. NaOH in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt wird.

Es ist zweckmäßig, sicherzustellen, daß die Mikroorganismen ausreichend mit Sauer stoff sowie den Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach den allge mein üblichen Methoden wie Schütteln und Rühren erfolgen. Die Züchtungstempera tur kann zwischen etwa 10 und etwa 40°C liegen, vorrangig jedoch bei 28°C. Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z. B. die Zusammensetzung des Nährmediums und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. Die jeweiligen optima len Bedingungen können von jedem Fachmann auf dem mikrobiologischen Gebiet leicht festgelegt werden.

Es hat sich herausgestellt, daß die Menge des sich in der Kulturbrühe anreichernden Inhibitors im allgemeinen ihr Maximum zwischen dem 1. und 12., vorzugsweise je doch zwischen dem 7. bis 9. Tag nach Züchtungsbeginn erreicht. Die parallel gebil dete Acarbose hat ihr Optimum am Tag 5 bis 6 und nimmt danach sehr stark nahezu gegen 0 gehend zum Tag 8 wieder ab. Dies ist verständlich, wenn der neue Inhibitor durch Biokonversion aus der Acarbose entsteht.

Wie allgemein bei mikrobiologischen Verfahren üblich, sollten Fremdinfektionen der Kulturmedien vermieden werden. Hierzu werden die üblichen Vorkehrungen getrof fen, wie Sterilisation der Nährmedien, der Kulturgefäße, sowie der für die Belüftung notwendigen Luft. Zur Sterilisation der Vorrichtungen kann z. B. Dampf als auch die Trockensterilisation verwendet werden. Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht, können die üblichen Schaumdämpfungsmittel, z. B. flüssige Fette und Öle, Öl-Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole wie z. B. Octadecanol, Siliconöl, Polyoxyethylen- bzw. Polyoxypropylenverbindungen zugesetzt werden. Schaum kann auch mit Hilfe der üblichen mechanischen Vorrichtungen (welche z. B. Zentrifugalkräfte benutzen) gedämpft oder beseitigt werden.

Der neue Saccharase-Inhibitor kann aus dem Kulturmedium nach allgemein üblichen physikalisch-chemischen Methoden isoliert werden. Die Isolierung und Reinigung des erfindungsgemäßen Saccharase-Inhibitors kann z. B. im Falle, daß ein flüssiges wäßri ges Nährmedium verwendet wird, wie folgt vorgenommen werden: Nach seiner An reicherung im Kulturüberstand werden Kulturfiltrat und Mycel mit üblichen Methoden separiert (z. B. Zentrifugation). Aus dem Kulturfiltrat kann der Saccharase-Inhibitor mit Hilfe von üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromato graphieverfahren, isoliert und gereinigt werden. Die Chromatographie kann in Form der Säulenchromatographie durchgeführt werden. Als Adsorptionsmittel können die üblichen anorganischen oder organischen Adsorptionsmittel eingesetzt werden, wie z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aktivkohle, Cellulose, Cellulose- Derivate, Kunstharze wie Polyamide, Dextrangele oder Agarosegele.

Als Laufmittel können die verschiedensten Lösungsmittel oder Lösungsmittelge mische verwendet werden, in welchen der erfindungsgemäße Saccharase-Inhibitor lös lich ist. Bevorzugt wird Wasser oder ein Gemisch aus Wasser und Methanol einge setzt. Bevorzugt werden zur Isolierung des Saccharase-Inhibitors Chromatographie- Verfahren verwendet, z. B. unspezifische Adsorption an hydrophobe Sorbentien oder andererseits Ionenaustauschchromatographie. Dieses sind die von der Reinigung was serlöslicher basischer Naturstoffe her bekannte Methoden. Für die technische Herstel lung des Inhibitors bevorzugt man die Gewinnung durch Adsorption und anschließen de Desorption an einem hydrophoben Trägerharz (z. B. Lewapol). Die Desorption kann z. B. mit kurzkettigen aliphatischen Alkoholen durchgeführt werden, bevorzugt Methanol oder Ethanol. Weiterhin kann eine Ionenaustauschchromatographie durch geführt werden, vorzugsweise an Ionenaustauschern vom Phosphorsäuretyp (z. B. Phospho-Cellulose) oder vom Sulfonsäuretyp (z. B. Dowex® 50-Typen oder Lewatit LGP 3789) aber auch schwächer saure Austauscher vom Carbonsäuretyp (wie z. B. Lewatit® CNP/LF, CM-Sepharose CL 6B oder Amberlite IRC-50) können eingesetzt werden. Der Ionenaustausch kann mit Hilfe der Gradientenelution durchgeführt wer den, wobei sowohl reine pH-Gradienten, reine Salzgradienten, als auch gemischte pH/Salzgradienten mit oder ohne Zusatz von Alkoholen erfolgreich eingesetzt werden können. Aus seinen Lösungen wird der Saccharase-Inhibitor nach den üblichen Me thoden, z. B. Verdampfen des Lösungsmittels, Gefriertrocknung usw., erhalten.

Analytik 1. Saccharaseinhibitorische Aktivität

Die Analytik der saccharaseinibitorischen Aktivität erfolgt mittels eines gekoppelten enzymatischen Testes, bei dem die Spaltung von Saccharose in Glucose und Fructose durch das Enzym Saccharase bestimmt wird. Die gebildete Glucose wird zum Glu conolacton oxidiert, wobei NAD zu NADH+H⁺ reduziert wird. Die Bildung von NADH+H⁺ führt zu einer Zunahme der Absorption bei 340 nm. Die Berechnung der saccharaseinhibitorischen Aktivität (SIE-Einheiten) erfolgt wie in der Patentschrift DE-20 64 092-C2 beschrieben.

2. Analytik der Acarbose

Die Analytik von Acarbose und Acarbosenebenkomponenten erfolgt mittels HPLC auf einer Aminophase (z. B. Shandon Hypersil APS). Die Trennung erfolgt isokratisch in einem Phosphatpuffer/Acetonitrilgemisch (24/76) bei 35°C. Die Komponenten wer den bei 210 nm detektiert. Die Quantifizierung erfolgt gegen einen externen Standard.

3. Analytik von Rutin und dem Inhibitor

Die Analytik von Rutin und dem Inhibitor erfolgt mittels HPLC auf einer RP-Phase (z. B. Hypersil C18) bei Raumtemperatur. Als Puffer wird 1 mM Hexansulfonsäure, pH 3,0, verwendet. Die Komponenten werden mit einem linearen Gradienten von 3% bis 35% Acetonitril in Puffer eluiert. Die Detektion erfolgt bei 354 nm, quantifiziert wird gegen einen externen Standard.

Beispiel 1

Auf Schrägagar der Zusammensetzung

Maisstärke	2,0%
D(+)-Glucose	1,0%
NZ-Amine (Sheffield Chem.)	0,5%
Hefeautolysat	1,0%
CaCO₃, p. a.	0,4%
Agar	2,0%
Wasser, ad	100%

gewachsenes Mycel des Stammes SE 50/110 wird auf je 120 ml steriler, in 1-Ltr.- Erlenmeyerkolben befindlicher Nährlösung (im folgenden "Nährlösung A" genannt) der Zusammensetzung

Sojamehl, entfettet	3,0%
Glycerin, reinst	3,0%
CaCO₃, p. a.	0,2%
Wasser, ad	100%

überimpft. Die Kolben werden 4 Tage bei 28°C auf der Rundschüttelmaschine bei 250 Upm inkubiert.

Je 120 ml Nährlösung der Zusammensetzung

Maltose	9,00%
Asparagin	2,00%
K₂HPO₄	0,30%
CaCO₃	0,30%
MgSO₄	0,10%
FeCl₃	0,20%
MnCl₂	0,01%
CoCl₂	0,01%
ZnCl₂	0,01%
Wasser, ad	100,00%

wird 10 min bei 121°C sterilisiert.

Eine Stammlösung von Rutin wird getrennt 10 min bei 121°C sterilisiert und der Nährlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,6% zugesetzt. Der pH-Wert wird mit steriler 5%iger NaOH auf 6,7 eingestellt. Die Nährlösung wird mit 2,5% einer 72 Std. in NL A gewachsener Kultur mit Stamm SE 50/110 beimpft und etwa 192 bis 240 Std. bei 28°C auf der Rundschüttelmaschine bei 250 Upm inkubiert.

Beispiel 2

Die gemäß Beispiel 1 erhaltene Kulturbrühe aus mehreren Erlenmeyerkolbenansätzen wird in einer Zentrifuge geklärt. Das Myzel wird verworfen und das Kulturfiltrat von z. B. 3 Ltr. unter Rühren mit 600 g Lewapol LGP 4429 versetzt und 1,5 Std. gerührt. Das Harz war zuvor mit 80% Methanol, 20% 2N-Natronlauge, Wasser, Methanol und Wasser ausgewaschen worden. Die Suspension wird über eine Glasfritte G1 abgesaugt. Das Filtrat enthielt noch 5 bis 8% der Hemmwirkung. Das auf dem Filter bleibende Harz wird im Stutzen mit 4 Ltr. 0,2 N-Salzsäure versetzt, 1 Std. gerührt und wieder abgesaugt. Das Filtrat enthielt 4 bis 6% der Hemmwirkung.

Zur Elution wird das Harz mit 6 Ltr. 40%igem Methanol wieder 1 Stunde gerührt und abgesaugt und nochmals mit 3 Ltr. 40%igem Methanol 1 Stunde gerührt und abgesaugt.

Das erste Eluat enthielt 60 bis 70% der Hemmwirkung. Das 2. Eluat enthielt 10 bis 15% der Hemmwirkung. Die Gesamtausbeute in den vereinigten Eluaten war 75 bis 85%. Zur weiteren Aufarbeitung wurde Methanol und Wasser im Vakuum abdestil liert bis zu einem Restvolumen von etwa 1,5 Ltr. In diesem Konzentrat wurde durch Zugabe von Natronlauge ein pH-Wert von 5,0 eingestellt und die Lösung gefrierge trocknet.

Beispiel 3

Eine Säule mit 2,6 cm Durchmesser und 100 cm Länge wird mit CM-Sepharose CL 6B fast flow auf eine Betthöhe von 74 cm gefüllt. Das Gelbett wird mit 0,02 M Natriumacetatpuffer pH 4,0 äquilibriert. 5 g der Substanz aus Beispiel 2 werden in 100 ml Wasser gelöst und auf die Säule aufgetragen. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt 420 ml/h (79 cm/h). Die Elution erfolgt bei gleicher Geschwindigkeit mit einem linearen Gradienten von 9 Ltr. des obigen Puffers auf 9 Ltr. desselben Puffers mit einem Zusatz von 0,3 M-Natriumchlorid. Die Elutionskurve bei 280 nm aufge nommen, zeigt nach Anfangsmaxima ohne Hemmwirkung ein breites Maximum bei einer Natriumchloridkonzentration von etwa 0,18 M.

Die an der Vorderseite liegenden Schultern Fraktion 21-31 mit 21% der Hemm wirkung wurde abgetrennt und später rechromatographiert. Die Hauptfraktion (Fr. 32-41) 3,3 Ltr. enthielt 69% der Hemmwirkung.

Beispiel 4

Zur Entsalzung wird die Hauptfraktion auf etwa 200 ml eingeengt und auf eine Säule mit 2,6 cm Durchmesser und 100 cm Länge aufgetragen. Die Säule war zuvor mit Lewatit LGP 4429 auf eine Betthöhe von 80 cm gefüllt und mit 80% Methanol, 20% 2N-Natronlauge, Methanol und Wasser gewaschen worden. Die Durchflußgeschwin digkeit betrug 96 ml/h (18 cm/h). Nach dem Auftragen wird die Säule 3 Stunden mit Wasser gewaschen und die Substanz anschließend mit 60% Methanol eluiert. Die Fraktion wurde vereinigt (240 ml), das Methanol im Volumen entfernt und die Lö sung gefriergetrocknet. Die Ausbeute der gesamten Reinigung vom Kulturfiltrat bis zur Reinsubstanz betrug 49%, gemessen an der Saccharase-Inhibition.

Claims

1. Verbindung der Formel

2. Verfahren zur Herstellung von der Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Acarbose produzierenden Mikroorganismus in Anwesenheit von Rutin kultiviert.

3. Arzneimittel enthaltend die Verbindung nach Anspruch 1.