KR100291597B1 - 탄수화물 분해효소 저해 물질 및 그것의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 탄수화물 분해효소 저해 물질 및 아카보오스 분해성 아밀레이즈를 이용한 그것의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 아카보오스를 당 수용체 존재하에서 아카보오스 분해성 아밀레이즈로 반응시키는 것으로 이루어지며, 본 발명에 의해 탄수화물 분해효소를 효과적으로 억제할 수 있는 아이소아카보오스를 효소적으로 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 탄수화물 분해효소 저해 물질 및 그것의 제조방법에 관한 것이다.
탄수화물 분해효소를 저해하는 대표적인 화합물인 아카보오스는 α-글루코시데이즈, 글루코아밀레이즈, α-아밀레이즈 그리고 사이클로덱스트린 글루코트랜스퍼레이즈(이하 CGTase)와 같은 탄수화물 분해효소의 저해제로 이용되고 있다. 따라서 소장에서 분비하는 효소인 α-글루코시데이즈를 효과적으로 저해하여 글루코오스의 섭취를 억제하는 효과가 있어 현재 당뇨병 치료제로 널리 이용되고 있다.
아카보오스 외에, 탄수화물 분해효소를 억제할 수 있는 아카보오스의 유도체를 얻기 위하여 산가수분해, 수소분해, 산화, 환원 및 치환반응과 같은 여러 가지 화학적 방법이 시도되어 왔다 (B. Junge, H.J. Stoltefuβ, L.(1980) in Enzyme inhibitors (Brodbeck, U., Ed.) pp.123-137, Verlag Chemie, Weinheim).
한 예로, 아카보오스를 묽은 황산으로 100℃에서 1시간 정도 가열하여 글루코오스 분자를 제거하여 얻어지는 아카비오신-글루코오스는 다음과 같은 구조를 가지는 유사삼탄당(pseudotrisaccharide, 이하 PTS)으로, 아카보오스의 환원성 말단의 글루코오스 한 분자가 가수분해되어 제거된 유사삼탄당으로 아카보오스와 같이 탄수화물 분해효소에 대한 저해효과를 나타낸다고 보고되었다.
그러나, 이 방법은 화학적 분해 방법으로 특이성이 높지 않고 여러 가지 부반응이 일어날 수 있으며 반응 후에 아카비오신-글루코오스를 정제해야 하는 복잡한 공정을 거쳐야 한다.
본 발명의 목적은 탄수화물 분해효소를 저해하는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 탄수화물 분해효소를 저해하는 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1는 아이소아카보오스 생산 반응액의 박막크로마토그라피 사진이다.
도 2는 아이소아카보오스 생산 반응액의 고성능이온크로마토그램이다.
도 3은 아이소아카보오스의13C 핵자기공명분석(NMR) 스펙트럼이다.
본 발명은 다음의 구조식으로 표시되는, 탄수화물 분해효소를 저해하는 신규한 화합물에 관한 것이다.
아이소아카보오스는 α-글루코시데이즈, 글루코아밀레이즈, α-아밀레이즈 그리고 사이클로덱스트린 글루코트랜스퍼레이즈(이하 CGTase)와 같은 탄수화물 분해효소의 활성을 저해하며, 따라서 당뇨병 치료제 등으로 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 탄수화물 분해효소를 저해하는 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은, 수용체인 당 존재하에서 아카보오스를 아카보오스 아카보 분해성 아밀레이즈로 가수분해하는 것으로 이루어진다.
본 발명자들은 전분을 가수분해하여 주로 말토오스와 소량의 글루코오스를 생산하고, 풀루란을 분해하여 주로 판노오스를 생성하며, 사이클로덱스트린을 분해하여 주로 말토오스와 소량의 글루코오스를 생성하며 아카보오스를 분해하는 탄수화물 가수분해효소가 아카비오신-글루코오스를 글루코오스, 셀로바이오스, 젠티오바이오스 등 여러 가지 당류에 전이하는 특성이 있음을 발견하였다.
본 출원 명세서에서 아카보오스 분해성 아밀레이즈는 전분을 가수분해하여 주로 말토오스를 생산하고, 풀루란을 분해하여 주로 판노오스를 생성하며, 사이클로덱스트린을 분해하여 주로 말토오스를 생성하며 아카보오스를 분해하며 아카비오신-글루코오스를 단당류 또는 이당류 이상의 올리고당에 전이하는 효소를 의미한다.
한 예로, 한국특허출원번호 96-25135에 보고된,Bacillus stearothermophilus(KFCC-10896)부터 생산되는 말토제닉 아밀레이즈(maltogenic amylase) (이하 BSMA라 함)를 사용하여 탄수화물분해효소를 저해시키는 화합물을 제조할 수 있다. 또다른 예로, 미국특허 5583039에 보고된Bacillus licheniformis(ATCC 27811)에서 분리된 말토제닉 아밀레이즈 역시 탄수화물분해효소를 저해시키는 화합물을 제조할 수 있다. 이들 아밀레이즈는 전분을 가수분해하여 주로 말토오스를 생산하고, 풀루란을 분해하여 주로 판노오스를 생성하며, 사이클로덱스트린을 분해하여 주로 말토오스를 생성하며 아카보오스를 글루코오스와 아카비오신-글루코오스로 가수분해하며, 아카비오신-글루코오스를 글루코오스, 셀로바이오스, 젠티오바이오스 등 여러 가지 당에 전이하는 특성을 가진다. 이와 같은 아카비오신-글루코오스 전이 특성은 종래에 알려진 아밀레이즈에서는 보고된 바가 없다.
본 발명의 방법에서 당 수용체로는 글루코오스, 셀로바이오스, 젠티오바이오스, 만노오스, 갈락토오스, 프럭토오스, 자일로오스,α-메틸 글루코사이드, 락토오스, 트레할로오스, 수크로오스, 라피노오스, 솔비톨, 자일리톨 등이 사용될 수 있다. 당 수용체의 양은 특별히 한정되지 않으며 당 수용체가 전이되기에 충분한 양, 예를 들어 아카보오스와 동일하거나 많게 첨가한다.
한 예로, 본 발명의 방법에 의해, 특히 아카보오스와 수용체 당으로 글루코오스를 사용하였을 때 아카보오스 분해로 생성된 아카비오신-글루코오스에 글루코오스가 전이되어 아이소아카보오스를 효과적으로 생산할 수 있다.
아래에서 실시예를 통하여 본 발명을 설명하고자 하나, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다.
실시예 1. 아이소아카보오스의 제조 및 정제
대한민국 서울특별시 서대문구 신촌동 134번지에 위치하는 사단법인 한국종균협회에 수탁번호 KFCC-10896으로 기탁된, 아밀레이즈 생산 균주를 LB배지에 접종하여 37℃에서 전배양한 후 같은 배지에서 10시간 배양하고 원심분리하여 균체를 얻었다. 회수한 균체를 pH 7.5의 50 mM Tris-Cl 완충용액으로 현탁시킨 다음 초음파로 파괴한 뒤 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 황산암모니움으로 분획하고 컬럼크로마토그래피로 DEAE-TOYOPEARL 및 Mono Q column을 통과시켜 정제된 아밀레이즈를 얻었다.
50 mM 사이트레이트 완충용액(pH 6.0)에 5%(w/v)의 아카보오스와 10%(w/v)의 글루코오스를 용해시켜 기질로 사용하였다. 기질 용액을 미리 50℃ 수조에 10분간 방치한 후 아카보오스 1 mg 당 10 Cu의 BSMA를 첨가하여 18시간 동안 반응시켰다. 반응후 반응액을 끓는 물에서 5분간 가열하여 반응을 종결시켰다. 반응액을 BioGel P-2 컬럼(2.5×90cm)을 통과시켜 아이소아카보오스를 정제하였으며 핵자기공명분석을 위하여는 분취 박막크로마토그라피를 이용하여 아이소아카보오스를 순수하게 정제하였다.
실시예 2. 박막크로마토그라피를 이용한 아이소아카보오스의 분석
반응 종결 후 박막크로마토그라피(thin layer chromatography, TLC)를 이용하여 반응산물을 분석하였으며 그 결과를 도 1에 나타낸다. A는 말토올리고당 표준물질(G1-G7), B는 아카보오스를 BSMA로 가수분해시켰을 때 반응혼합물(위에서부터 글루코오스, 아카비오신-글루코오스, 아카보오스, 아이소아카보오스), C는 실시예 1에서 얻은 반응산물이다. 각 시료를 Whatman K5F TLC 플레이트(20cm×20cm)에 1μL씩 로딩하여 아이소프로필 알코올, 에틸 아세테이트, 증류수의 비가 3:1:1 (v/v/v)인 전개액에서 2번 전개시켰다. 전개 후에 플레이트를 잘 건조시켜 메탄올에 0.3%(w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민과 5%(v/v) 황산을 용해시킨 발색액에 담갔다 꺼낸 후 110℃ 오븐에서 10분동안 발색시켰다. 아카보오스보다 아래쪽에 새로운 물질이 생성된 것을 확인할 수 있었고α-1,6 결합은α-1,4 결합보다 Rf값이 작으므로 이것이 이소아보오스임을 확인하였다. 덴시토미터로 측정한 결과 반응액 중의 아이소아카보오스의 농도는 7.4mg/mL였다.
실시예 3. 고성능이온크로마토그라피를 이용한 아이소아카보오스의 분석
실시예 1에서의 반응액을 고성능이온크로마토그라피(High Performance Ion Chromatography, HPIC)를 이용하여 분석하여 도 2에 나타낸다. 피크 1은 글루코오스, 피크 2는 아카비오신-글루코오스, 피크 3은 아이소아카보오스, 피크 5는 아카보오스를 나타낸다. 박막크로마토그라피와는 반대로 HPIC에서는α-1,6 결합이α-1,4 결합보다 먼저 용출되므로 피크 4는 아카비오신-글루코오스에 글루코오스가α-1,3으로 결합된 화합물이다. HPIC 분석은 Dionex사(미국)의 GP40 그래디언트 펌프와 ED40 전기화학적 검출기 및 CarboPac PA1 컬럼을 이용하여 시행하였으며, 용매는 150 mM NaOH 용액을 사용하였고 600 mM 소디움 아세테이트로 30분 동안 30%까지의 농도구배를 걸어주었다. 시료는 반응액을 초준수로 400배 희석하여 0.45μm 박막여과지로 여과하여 20μL를 주입하였고 유속은 1mL/min로하여 분석하였다.
실시예 4.13C NMR을 이용한 아이소아카보오스의 구조 분석
아이소아카보오스의 구조를 규명하기 위하여13C 핵자기공명분석(NMR; JNM LA-400 FT-NMR 스펙트로미터(Jeol, 일본) 사용)을 수행하여 도 4과 표 1에 나타낸다. 아카보오스의 애노머 카본(anomeric carbon) (표 2. 링 C의 1번 탄소) 공명에 대한 화학적 전이(chemical shifts)는 100.3과 100.4 ppm에서 나오며 이는 해당탄소의α-1,4 결합을 나타낸다. 반면에 아이소아카보오스의 애노머 카본 (표 2. 링 C의 1번 탄소) 공명에 대한 화학적 전이는 98.6과 98.7 ppm에서 나오며 이는 해당 탄소의α-1,6 결합을 나타낸다. 또한 Heteronuclear Multiple Bond Connectivity(HMBC) 방법에 의해서도 아이소아카보오스의α-1,6 결합이 확인되었다. 방법을 사용하여 구조를 분석하였다. 시료는 실시예 1에서 순수 정제한 이소아카보오스 35mg을 D2O에 용해시킨 것을 사용하였다.
[표 1]
아카보오스와 아이소아카보오스의13C 핵자기공명분석(NMR) 화학적 전이 값
1아카보오스와 아이소아카보오스의 화학적 전이 차이값
실시예 5. 아이소아카보오스의 효소저해특성 실험
아카비오신-글루코오스의 탄수화물 가수분해효소에 대한 저해 특성을 알아보기 위하여 각 효소에 대한 Ki 값을 구하였다.
사용한 효소는 제빵 효모에서 분리한α-글루코오시데이즈, 쥐에서 분리한α-글루코시데이즈, 돼지 췌장에서 분리한α-아밀레이즈, 그리고 Bacillus marcrans CGTase였고 각각 다음과 같은 방법으로 반응속도를 측정하였다.
1.α-글루코오시데이즈
말토오스를 기질로 사용하였고 효소에 의해 가수분해된 글루코오스는 글루코오스 옥시데이즈-퍼옥시데이즈 효소법으로 스펙트로포토미터에서 정량하였다. 즉, 큐벳에 기질 0.6mL, 발색시약 (4-아미노안티피린) 50μL, 발색효소(글루토오스 옥시데이즈, 퍼옥시데이즈) 50μL, 효소저해제(아카보오스 혹은 아카비오신-글루코오스) 50μL 그리고α-글루코오시데이즈 50μL를 넣고 500 nm에서 흡광도를 연속적으로 측정했으며 반응온도는 37℃로 유지하였다. 이 때 넣어준α-글루코오시데이즈는 반응 전에 해당 효소저해제 용액에서 5분간 방치하였다. 반응 속도는 10분간 흡광도변화의 평균 기울기로 구하였다.
2.α-아밀레이즈
가용성 전분을 기질로 사용하여, 6 mM의 NaCl이 첨가된 pH 7.0인 50 mM 인산완충용액을 사용하여 37℃ 항온수조에서 반응시켰다. 기질의 농도를 각각 0.0444, 0.0889, 0.444, 1.07mg/ml로 사용하였다. 1200μL 기질에 100μL의 효소저해제 (아카보오스, 아이소아카보오스)와 50μL의α-아밀레이즈를 첨가하여 반응을 시켰다. 시간별로 반응액 100 ㎕를 취하여 발색시약이 들어있는 마이크로플레이트 리더(microplate reader)에 넣어서 반응을 정지하였다. 85℃에서 35분간 발색을 시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 초기 반응 속도를 구하였다.
발색방법으로 구리-바이신코니네이트 환원법(copper-bicinchoninate reducing value method)를 사용하였다. 97.1 g의 다이소디움 2,2'-바이신코니네이트, 3.2 g의 소디움 카르보하이드레이트 모노하이드레이트, 1.2 g의 소디움 바이카르보네이트를 증류수에 녹여 50 ml로 맞춘 용액 A와, 62 mg의 2가 황산구리, 63 mg의 L-세린을 증류수에 녹여 50 ml로 맞춘 용액 B를 1:1로 섞어서 사용하였다.
3. CGTase
기질로 말토덱스트린(평균 Dp=13)을 이용하였고 1 mM 염화칼슘이 첨가된 pH 6.0 50 mM 이미다졸 용액을 완충액으로 사용하여 25 ℃ 항온 수조에서 반응시켰다. 400μL의 0.5 mM 메틸오렌지용액과 500μL의 기질용액의 혼합액에 100μL의 효소액을 첨가하여 반응시키면서, 528 nm에서의 흡광도 감소를 분광분석기로 연속적으로 측정하여 초기 반응속도를 구하였다. 생성된 싸이클로덱스트린의 양은α-싸이클로덱스트린이 메틸오렌지와 포접화합물을 형성할 때의 흡광도의 감소정도를 측정하여 작성한 정량 곡선으로부터 구하였다.
각각의 효소에 대한 Ki 값을 표 1에 나타낸다. 아이소아카보오스는 아카보오스에 비해,α-아밀레이즈에 대하여 Ki 값이 현저히 낮았으며 15.2배의 저해 상승 효과를 얻을 수 있었다. CGTase에 대해서도 약 2배 정도의 낮은 Ki 값을 나타내었다.
[표 2]
아카보오스와 아이소아카보오스의 Ki 값
본 발명에 의해 탄수화물 분해효소를 효과적으로 억제할 수 있는 아이소아카보오스를 효소적으로 생산할 수 있다.
Claims (3)
- 다음 구조식으로 표시되는 아이소아카보오스.
- 아카보오스를 당 수용체 존재하에서 아카보오스 분해성 아밀레이즈로 반응시키는 것으로 이루어지는 탄수화물 분해효소 저해물질을 제조하는 방법
- 제 1항에 있어서, 상기 당 수용체가 글루코오스인 방법.
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