DK167029B1 - Enzymprodukt og dets anvendelse ved saccharificering af stivelse - Google Patents

Description

i DK 167029 B1

Opfindelsen vedrører enzymatisk stivelsesnedbrydning. Nærmere angår opfindelsen et hidtil ukendt enzymprodukt, der er anvendeligt ved saccharificering af stivelse, især flydende stivelse, samt en fremgangsmåde 5 til omdannelse af stivelse til dextrose i form af en sirup.

Nativt stivelse vides at indeholde to typer ma-kromolekyler, der er sammensat af glucoseenheder. En molekyltype, der benævnes amylose, er lineær og består TO udelukkende af a-1,4-forbundne glucoseenheder. Stivelse indeholder ca. 25% amylose. Den anden molekyltype, der benævnes amylopektin er yderst forgrenet og indeholder både a-1,4- og a-1,6-forbundne glucoseenheder. Det totale indhold af a-1,6-bindinger er i almindelighed min-15 dre end 5%.

Sukker fra stivelse i form af koncentrerede dex-trosesirupper fremstilles for tiden i en mængde på adskillige millioner ton om året ved en totrins enzymkatalyseret fremgangsmåde, der involverer: (1) flydendegø- 20 relse (eller fortynding) af fast stivelse med en a-amy-lase til dextriner med en gennemsnitlig polymerisationsgrad på ca. 7-10, og (2) saccharificering af den resulterende flydendegjorte stivelse (dvs. stivelseshydrolysat) med amyloglycosidase, hvilket resulterer i en sirup 25 med stort glucoseindhold (92-96 vægt% af de totale tørstoffer) . Meget af det kommercielt fremstillede dextro-sesirup isomeriseres derefter enzymatisk til en dextro-se/fructoseblanding, der kendes som isosirup.

De to anvendte enzymer a-amylase og amyloglucosi-30 dase adskiller sig fra hinanden i to vigtige henseender.

For det første angriber α-amylase, der er et såkaldt endoenzym, makromolekyler vilkårligt. Amyloglucosidase er på den anden side et såkaldt exoenzym og spalter glucoseenheder successivt fra den ikke-reducerende ende af 35 dextrinmolekylet i stivelseshydrolysatet. For det andet angriber α-amylase udelukkende a-l,4-bindinger, hvorimod 2 DK 167029 B1 amyloglucosidase i lige så høj grad spalter a-l,6-bin-dinger.

Det anbefalede navn for amyloglucosidase er exo- 1,4-a-D-glucosidase, Enzymkommité nummeret er 3.2.1.3 og 5 det systemiske navn er ct-l,4-glucanglucohydrolase. Amyloglucosidase kaldes også AG eller glucoamylase, og det bemærkes, at udtrykkene amyloglucosidase, AG og gluco-amylase, som de anvendes nedenfor, er synonyme.

Eftersom amylopektin kun delvis nedbrydes af a-10 amylt-^e, da dette enzym udelukkende angriber a-l,4-bin-dinger sker der en væsentlig hydrolyse af de forgrenede oligosaccharider ved det efterfølgende saccharifice-ringstrin, der er katalyseret af amyloglucosidase, der også hydrolyserer a-l,6-glucosidbindinger, skønt med en 15 betydelig mindre hastighed end ct-l,4-bindingerne.

Saccharificeringstrinnet ved den ovenfor skitserede kommercielle fremgangsmåde har længe været erkendt at have mangler i visse henseender. Især katalyserer de amyloglucosidaser, der for tiden er tilgængelige, både 20 saccharificering og dextroseomdannelsesreaktioner, f. eks. omdannelse af dextrose til isomaltose, med hastigheder, der afhænger af substratkoncentrationen. Dannelsen af biprodukter på denne måde har begrænset saccharificering af stivelseshydrolysater til dextrose til ikke 25 mere end ca. 95 vægt% dextrose på tørstofbasis (herefter benævnt DX) i sirupper, der indeholder mindst 33% tørstoffer efter vægt.

Ganske rigtigt kan dannelsen af biprodukter fra omdannelsesreaktioner undertrykkes med op til ca. 50% 30 med en ledsagende forøgelse af stivelsesomdannelse på ca. 1 til 2%, såfremt der anvendes et relativt højt niveau af amyloglucosidase kombineret med en fortynding af substratet til ca. 15% tørstoffer (jf. USA patent nr. 4.017.363), men koncentreringen af den resulterende dex-35 troseopløsning til de konventionelle højere tørstofni-veauer er energiforbrugende.

3 DK 167029 B1 I et forsøg på yderligere at forøge DX-værdien, er det blevet foreslået at anvende et afgrenende enzym i forbindelse med amyloglucosidase for mere effektivt at hydrolysere de forgrenede oligosaccharider (indeholdende 5 a-l,6-glucosidbindinger), der er til stede i den flyden-degjorte stivelse.

Europæisk patentansøgning publiserings nr.

0 063 909, beskriver et afgreningsenzym af pullulanase-typen, der frembringes af en bakterie kaldt Bacillus 10 acidopullulyticus. Ifølge beskrivelsen der, har afgre-ningsenzymet optimal virkning ved et pH i området 3,5 til 5,5 (under definerede betingelser) og dets termiske aktivitetsoptimum ved pH 4 til 5 ligger på i det mindste ca. 60°C. Restaktiviteten efter 72 timer ved 60°C ved pH 15 5 er 50% eller mere. Denne sure pullulanase anvendes sammen med et af de saccharificerende enzymer amyloglucosidase eller β-amylase. Anvendelsen af denne sure pullulanase i forbindelse med amyloglucosidase anføres at resultere i et højere dextroseniveau, der er ca. 1% hø-20 jere i sammenligning med det niveau, der opnås med amyloglucosidase alene under tilsvarende betingelser.

Alternativt kan det samme dextroseniveau opnås ved anvendelse af ca. den halve mængde amyloglucosidase.

USA patent nr. 4.335.208 beskriver den kombinere-25 de virkning af amyloglucosidase og et andet afgreningsenzym, nemlig isoamylase fra Pseudomonas amylodera-mosa. Ifølge dette skrift har isoamylasen et pH-optimum, der ligger nær ved optimum for amyloglucosidase, således at mængden af den sidstnævnte kan reduceres betydeligt 30 til opnåelse af det samme eller endog et højere dextroseniveau end med amyloglucosidase alene. Fremgangsmåden har imidlertid en alvorlig ulempe i, at isoamylasen er varmelabil. Dette betyder, at saccharificering i nærværelse af isoamylase ikke er teknisk opnåelig over ca.

35 55°C, hvorimod amyloglucosidase alene normalt anvendes ved 60°C ved saccharificeringen af stivelseshydrolysat.

« 4 DK 167029 B1

Endvidere er mikroorganismer af arten Pseudomonas ikke såkaldte GRAS-mikroorganismer (Generally Regarded As Safe (alment anset som sikre)), således at enzymer, der fremstilles af sådanne mikroorganismer ikke er tilladte 5 i fødevarer og ved fødevareforarbejdning i USA.

USA patent nr. 3.897.305 beskriver den kombinerede anvendelse af amyloglucosidase og pullulanase fra Aerobacter aeroqenes (Klebsiella pneumoniae), der angives at give en forøgelse i DX på op til 2% i sirupper 10 indeholdende mindst 30% tørstoffer. I praksis opnås der imidlertid ingen besparelse i amyloglucosidase på grund af det ugunstige pH-optimum (5,5-6,0) for enzymet fra K. pneumoniae, der gør det nødvendigt at udføre saccharifi-ceringen ved et relativt højt pH, hvor amyloglucosida-15 sens virkning er kraftigt reduceret.

I "Die Starke", vol. 27 (1975), nr. 11, side 377-383 nævnes en termostabil α-amylase, der f.eks. kan stamme fra Bacillus stearothermophilus og en syre-resistent α-amylase fra en anden kilde, nemlig Aspergillus 20 niger. Det anføres, at man kan bestemme mængderne af α-amylase og amyloglucosidase, hvilke bestemmelser kan være vigtige for at sikre, at amyloclucosidase-præpara-ter til kommerciel dextrosefremstilling indeholder passende mængder α-amylase. I den pågældende artikel er det 25 imidlertid ikke beskrevet, at en α-amylase isoleres og/ eller renses fra enzympræparaterne og der sker heller ingen pH bestemmelse. Det pågældende skrift giver ikke basis for at forvente, at tilsætning af sur a-amylase til et amyloglucosidase-præparat skulle medføre nogen 30 forbedring af aktiviteten.

Britisk patentansøgning nr. 2 026 476 vedrører fremstilling af enzymer til anvendelse i forbindelse med alkoholfremstillingen. Under fremstillingen af enzymet holdes pH værdien mellem 4,4 og 6 ved tilsætning af et 35 alkalisk middel, men under gæringen kan pH værdien imidlertid gå op til ca. 5,6-6. Der anføres intet om, hvilke 5 DK 167029 B1 substratkoncentrationer der arbejdes med.

Af Marshall et al. (Febs Letters, bind 9 nr. 2, juli 1970, siderne 85-88) er det anført, at amylogluco-sidase opnået ud fra Aspergillus niger indeholder en 5 α-amylaselignende urenhed, der øjensynlig er væsentlig for den fuldstændige hydrolyse af stivelse til glucose.

Der blev imidlertid ikke gjort noget forsøg på at karakterisere eller isolere denne urenhed, og a-amylase- og amyloglucosidaseaktiviterne blev kun malt ved 30 C, 10 jf· side 85, højre spalte, andet hele afsnit. Der blev således ikke isoleret eller renset nogen α-amylase. ud fra enzympræparaterne og der skete ingen bestemmelse af pH værdierne, ligesom der ikke er anført nogen definition for nogen enzymaktivitet.

15 Det er ved opfindelsen tilsigtet at tilvejebringe et enzymprodukt med α-glucosidbindingsspaltende virkning ved surt pH, som er egnet til saccharificering af stivelse, fortrinsvis flydendegjort stivelse. Enzymproduktet ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at det om-20 fatter amyloglucosidase og en sur α-amylase, hvilken α-amylase har evne til at spalte a-1,4-glucosidiske bindinger og udviser optimal aktivitet ved en forsukringsreaktion ved pH fra 3,5 til 5,0 og en temperatur fra 60 til 75°C, i et forhold på i det mindste 0,16 AAU 25 (acid amylase units) pr. AGI (amyloglucosidase units), idet enzymproduktet er i det væsentlige uden indhold af transglucosidase.

I et andet aspekt angår opfindelsen en fremgangsmåde til omdannelse af stivelse til dextrose i form af 30 sirup, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man saccharificerer stivelsen eller et stivelseshydrolysat under tilstedeværelse af enzymproduktet. Herved opnås sirupper med stort dextroseindhold.

Den i enzymproduktet indgående sure α-amylase kan 35 opnås ud fra amyloglucosidase. Under almindelige opbevaringsbetingelser er den stabil i et tidsrum på ad- 6 DK 167029 B1 skilllige måneder.

Den pågældende sure a-amylase forekommer som en komponent i amyloglucosidasepræparater og kan opnås i i det væsentlige ren form fra sådanne præparater ved an-5 vendelse af en passende adskillelsesteknik, såsom HPLC, der er den foretrukne metode.

Skønt den i enzymproduktet ifølge opfindelsen indgående sure α-amylase, der beskrives nedenfor, opnås ud fra en kommercielt tilgængelig amyloglucosidase fra 10 mikroorganismen Aspergillus niger, og denne er den foretrukne amyloglucosidase, bemærkes det, at mange mikroorganismearter omfatter specier, hvorom det vides, at de producerer en amyloglucosidase. Enhver sådan amyloglucos idase kan anvendes som kilde for den sure a-amy-15 lase, som anvendes i enzymproduktet ifølge opfindelsen. Fortrinsvis anvendes en fungal amyloglucosidase som kilde.

Termostabiliteten af den sure α-amylase, der fås fra Aspergillus niger er bedre end termostabiliteten af 20 niger amyloglucosidase. Den sure a-amylases stabilitet og restaktivitet er også større end, hvad der gælder for amyloglycosidasen.

Enzymproduktet ifølge opfindelsen kan fremstilles ved at sætte den sure α-amylase til et kendt amylogluco-25 sidasepræparat for at forøge indholdet af den sure a-amylase deri.

Fortrinsvis er amyloglucosidasen en Aspergillus niger amyloglucosidase, der beriges med en ligeledes fra Aspergillus niger stammende sur a-amylase.

30 Det omhandlede nye enzymprodukt kan fremstilles ved at sætte den sure α-amylase, fortrinsvis i i det væsentlige ren form, til amyloglucosi-dasen. Alternativt kan der findes en amyloglucosidase-producerende stamme eller variant eller mutant deraf, 35 fortrinsvis tilhørende arten Aspergillus og nærmere speciet Aspergillus niger, der producerer en amyloglucosi- 7 DK 167029 B1 dase med et relativt stort indhold af sur α-amylase i forhold til de indenfor teknikken kendte amyloglucosida-ser, i hvilket tilfælde enzymproduktet kan opnås ved at dyrke denne mikroorganisme i et passende næringsmedium, 5 der indeholder carbon- og nitrogenkilder samt uorganiske salte. Det nye enzymprodukt kan også fremstilles ved selektivt at forbedre gæringsbetingelserne for sur a-amylase eller delvis inaktivering af amyloglucosidasen i eksisterende præparater.

13 Enzymproduktet ifølge opfindelse er, som nævnt, i det væsentlige fri for transglucosidase, eftersom det sidstnævnte enzym kan forårsage dannelse af uønskede biprodukter. Dette kan opnås f.eks. ved at fremstille amyloglucosidase med en transglucosidasenegativ stamme 15 eller ved fjernelse af transglucosidasen fra de anvendte amyloglucosidasepræparater, f.eks. med bentonit.

Det omhandlede enzymprodukt omfatter i det mindste 0,16 AAU sur α-amylase pr. AGI. Hver enhed sur amylaseaktivitet (AAU), som det anvendes her, er den 20 mængde enzym, der hydrolyserer 1,0 mg opløselig stivelse (100% tørstof) pr. minut under standardbetingelser (pH 4,2; 60°C) til et produkt, der efter omsætning med en iodopløsning med kendt styrke giver en optisk tæthed ved 620 nm, der svarer til tætheden af en farvereference, 25 som beskrevet i den iodstivelsesamylasetest, der er angivet nedenfor. En enhed amyloglucosidaseaktivitet (AGI), som det anvendes her, defineres som den mængde enzym, der frigør 1 ymol dextrose fra opløselig stivelse (100% tørstof) pr. minut ved 60°C under optimale betin-30 gelser for stivelsesnedbrydning, som beskrevet nedenfor.

Det nye enzymprodukt indeholder fortrinsvis fra ca. 0,2 til ca. 4,5 AAU sur α-amylase pr. AGI, bedre fra ca. 0,3

til ca. 3,0 AAU pr. AGI, og især fra ca. 0,7 til 1,5 AAU

pr. AGI.

35 Det har overraskende vist sig, at amyloglucosida sepræparater beriget med sur α-amylase ved anvendelse 8 DK 167029 B1 til saccharificering af f lydendegjort stivelse resulterer i uventet høje dextroseniveauer ved korte sacchari-ficeringstider. Anvendelsen af det nye enzymprodukt i fremgangsmåden har den fordel, at der kan anvendes væ-5 sentligt mindre mængder amyloglucosidase til saccharificering af stivelseshydrolysater, der resulterer i større glucoseudbytter pr. enzymenhed (AGI). Det nye enzymprodukt har også den store fordel, at der kan anvendes større substratkoncentrationer ved saccharificering af 10 stivelse og stivelseshydrolysater. Anvendelsen affstørre substratkoncentrationer reducerer væsentligt inddamp-ningsomkostningerne.

Saccharificeringen udføres passende ved et pH i området fra 2,5 til 6, fortrinsvis ved fra ca. 3 til ca.

15 5, og nærmere bestemt ved fra ca. 4,0 til ca.' 4,5. Fremgangsmåden udøves passende ved temperaturer i området fra 40 til 70°C, fortrinsvis fra ca. 50 til ca.

65°C, med omsætningstider i området fra 15 til 96 timer til opnåelse af maksimale udbytter.

20 Foretrukne andele af amyloglucosidase til saccha rificering af stivelseshydrolysater er normalt i området fra ca. 8 til ca. 30 AGI, og fortrinsvis fra ca. 14 til ca. 22 AGI pr. gram tørstoffer.

Det har også vist sig, at saccharificering af 25 stivelse eller et stivelseshydrolysat kan forbedres y-derligere, såfremt fremgangsmåden udøves i nærværelse af det nye enzymprodukt som defineret tidligere, og som også indeholder en effektiv mængde sur pullulanase. En passende sur pullulanase, der kan anvendes hertil, er 30 f.eks. en sur pullulanase som beskrevet i europæisk patentansøgningspublikation nr. 0 063 909. Foretrukne dosis af sur pullulanase, der kan anvendes i forbindelse med det nye enzymprodukt, ligger i området fra 0,005 til 5 pullulanase-enheder (PU), der defineres som i den 35 nævnte europæiske patentansøgning. Anvendelsen af det hidtil ukendte enzynprodukt i forbindelse med sur pullulanase 9 DK 167029 B1 ved fremgangsmåden har den fordel, at der kan opnås u-ventede og betydelige høje dextroseniveauer med korte saccharificeringstider.

En anden passende fremgangsmåde til at bestemme 5 mængden af sur a-amylase i enzympræparater er den modificerede Phadebas Amylase Test, der beskrives nedenfor.

En enhed sur α-amylase aktivitet (AAU'), som det anvendes her, defineres som den mængde enzym, der giver én absorbansenhed ved 620 nm under betingelserne for den 10 modificerede Phadebas amylasetest, der beskrives nedenfor. Værdien på mindst 0,16 AAU sur α-amylase per AGI under iodstivelsesamylaseprøvebetingelser, som defineret tidligere, svarer til værdien på mindst 0,12 AAU' sur α-amylase per AGI under modificerede Phadebas Amylase 15 prøvebetingelser. En ulempe ved den sidstnævnte fremgangsmåde er en synergistisk virkning, der opstår når amyloglucosidase er til stede. Det er endvidere meget vanskeligt, eller endog umuligt, at automatisere fremgangsmåden.

20 Det bemærkes, at med mindre andet er anført, er de AAU-værdier, der nævnes i denne beskrivelse, udtrykt i enheder svarende til den modificerede iodstivelsesamy-laseprøve.

De følgende undersøgelsesmetoder og eksempler be-25 lyser opfindelsen.

Iodstivelsesamylasetest

Denne metode er baseret på måling af den optiske tæthed af iodstivelseskomplekser i nærværelse af en amy-30 loglucosidasehæmmer. Acarbose, Bay g 5421 anvendtes som amyloglucosidasehæmmeren, jf. Schmidt et al. Naturwis-senshaften 6£ (1977) 535.

Reagenser 35 En 2% opløsning af opløselig stivelse (Lintner, J.T. Baker Co.) i citratpuffer (0,013 M, pH 4,2).

10 DK 167029 B1 lod-lageropløsning indeholdende 22 g iod og 44 g kaliumiodid per liter destilleret vand.

Fortyndet iodopløsning: 4 ml iod-lageropløsning og 40 g kaliumiodid opløst i destilleret vand.

5 Destilleret vand tilsat op til 1 liter.

Farvereference indeholdende 250 g cobaltochlorid, 6 aq. og 38,4 g kaliumbichromat per liter i 0,01 N HCl.

10 Procedure.

Stivelsesopløsningen (20 ml) foropvarmedes ved 60°C i 20 minutter. Startende til tidspunktet 0 sattes nøjagtig 10 ml enzymprøve (indeholdende 1,4-1,8 AAU/ml; stuetemperatur) til substratopløsningen. Såfremt amylo-15 glycosidase antages at være til stede i enzymprøven sættes amyloglucosidasehæmmeren Bay g 5421 forinden til enzymprøven i en koncentration på lyg per AGI. Efter 20 minutters inkubation overførtes 1 ml af opløsningen til 5 ml af den fortyndede iodopløsning. Den optiske tæthed 20 måltes umiddelbart ved 620 nm i en 1 cm kuvette med destilleret vand som blankprøve. Denne procedure med overføring og måling gentoges med eet minuts intervaller indtil der fandtes aflæsninger, der var mindre end farveref erencens aflæsning .

25 Tidsrummet T, der er nødvendig for at opnå en ab- sorbans, der var lig med absorbansen af farvereferencen, fandtes grafisk.

Den sure a-amylaseaktivetet i enheder (AAU), der var til stede i inkuberingsopløsningen beregnedes ud fra 50 400/T, hvori : 400: mg opløselig stivelse i inkuberingsopløsningen T : nødvendig reaktionstid (min.).

Modificeret Phadebas Amylasetest 35 Standard Phadebase amylasetesten (Marciniak et al., Starch 34 442 (1982)) modificeret til betingelser 11 DK 167029 B1 med surt pH og en temperatur på 60°C udførtes som følger: I et hætteglas af glas med skruelåg afpipeteredes 1 ml enzymprøve indeholdende 10 AGI og 4,0 ml acetatpuf-5 fer (0,3 M, pH 4,0). Derefter tilsattes en Phadebas-tablet (Pharmacia, batch nr. HE 74112) og efter omslyngning i 15 sek. lukkedes glasset og anbragtes i et vandbad ved 60°C. Reaktionen standsedes nøjagtig 15 minutter efter tablettens tilsætning ved tilsætning af 0,3 N 10 NaOH (5 ml) og omrystning. Efter centrifugering fjernes den ovenstående væske og den optiske tæthed (OD) måltes (i området 0,2-2,0) i en 1 cm's kuvette ved 620 nm i forhold til destilleret vand. En blankprøve (destilleret vand) underkastedes den samme procedure. AOD er et 15 mål for den sure a-amylaseaktivitet. En enhed sur a-amylaseaktivitet (AAU1) defineres som den mængde enzym, der giver én absorbansenhed (AOD = 1) ved 620 nm under disse prøvebetingelser.

20 Amyloqlucosidaseassay

Opløselig stivelse (2 ml, Lintnerstivelse, J.T.

Baker Co.) i en koncentration på 16 g/1 acetatpuffer (0,04 M, pH 4,3) foropvarmedes ved 60°C i 5 minutter og sattes derefter til 2 ml enzymopløsning (0,15-0,55 AGI/-25 ml). Efter blanding inkuberedes suspensionen ved 60°C. Reaktionen standsedes efter 15 minutter ved tilsætning af 20 ml NaOH (0,005 N) og glucosekoncentrationen bestemtes efter glucoseoxidasemetoden.

30 Saccharificerinqsprocessen♦

Saccharificeringsprocessen udførtes på maltodex-trin MD03 (Roguette Fréres) med en dextroseækvivalent (DE) på 16,5. Dette substrat indeholder nogle oligosac-charider med fructosylendegrupper, hvoraf så meget som 35 0,4-0,5% af disaccharidet maltulose dannes ved sacchari-ficeringstrinnet. Til en opløsning af dette substrat 12 DK 167029 B1 (33% tørstoffer) sattes 2100 AGI/100 g tørstoffer. pH justeredes til 4,20 med 1 N eddikesyre. Blandingen inkuberedes ved 60°C i et vandbad. Portioner på 0,1 ml udtoges fra reaktionsblandingen efter 16, 24, 48, 64, 5 72, 80 og 92 timer og sattes til 3 ml destilleret vand i et lukket reagensglas.

Hver fortyndet prøve anbragtes umiddelbart i et kogende vandbad i 10 minutter for at inaktivere enzymet.

Efter afkøling sattes ca. 150 mg tørret Amberlite MB-3 10 harpiks (BDH) til hver prøve for at fjerne HPLC-forstyr-rende salte. Efter henstand i 1 time fjernedes harpiksen og 40 μΐ prøve injiceredes på en HPLC til glucose-bestemmelse efter Scobell et al.'s metode (Cereal Chem., 54 (4), (1977) 905-917), modificeret ved, at der anvend-15 tes en Bio-Rad HPX-87C 300 mm's kolonne. Undersøgelsens præcision og nøjagtighed fandtes at være henholdsvis 0,1% og 0,2% absolut ved en glucosekoncentration i området 90-96%. '

Under disse betingelser opnåedes et topniveau på 20 94,6-94,8% glucose med for tiden kommercielle amyloglu- cosidasepræparater fra Miles (DIAZYME og OPTIDEX), Novo (AMG) og Gist-Brocades (AMIGASE® GM) .

Eksempel 1 25

Isolering og identificering af sur a-amylase.

For at identificere og isolere amylolytiske komponenter i et amyloglucosidasepræparat underkastedes et amyloglycosidaseenzympræparat, frembragt af en transglu-30 cosidasenegativ stamme af A. niger for væskechromatogra-fi med høj ydelse. Systemet omfattede en anionbytterko-lonne og en gelfiltreringskolonne i serie. Efter injektion af en del af AG præparatet på ionbytterkolonnen førtes opløsningsmidlet, der var 0,05 M natriumacetat-35 puffer med et pH på 4,0 gennem begge kolonner indtil de positivt ladede og ikke ladede komponenter havde nået 13 DK 167029 B1 gelkolonnen. De molekyler, der var absorberet på ionkolonnen elueredes med en saltgradient (0,05-1,65 M natriumacetatpuffer pH 4,0) og derefter elueredes de molekyler, der var bundet på gelkolonnen med det oprindelige 5 opløsningsmiddel.

Denne procedure afslørede, som det fremgår af den medfølgende fig. 1, en fremragende adskillelse mellem de amylolytiske enzymer, og begge amyloglycosidaseisomere og en a-amylase identificeredes ved at fraktionere 10 effluenten og inkubere de indsamlede fraktioner med passende substrater, dvs. maltose og opløselig stivelse (10% tørstoffer). De isolerede amyloglucosidasekompo-nenter frembragte glycose ud fra stivelse og maltose, hvorimod den isolerede α-amylase frembragte et typisk 15 oligosaccharidmønster ud fra stivelse.

a-amylasens egenskaber, især i forbindelse med pH og temperatur, bestemtes med opløselig stivelse som substrat. Mængderne af dannede hovedprodukter (di- og trisaccharider) viste et optimum ved et pH på 3,5-5,0, 20 hvilket angiver at enzymet er en sand sur a-amylase (AA) . Temperaturens virkning undersøgtes ved et pH på 4,0 og den sure α-amylase havde sit optimum mellem 65 og 70°C, hvilket bestemtes ud fra opførslen af de dannede trisaccharider. Disse resultater indikerer at den sure 25 α-amylase er tilstrækkelig stabil ved standardsacchari-ficeringstemperaturen 60°C. De fraktioner, der indeholdt AA, hvis aktivitet var stabil i mere end 3 måneder, anvendtes til berigelsesundersøgelser.

30 Eksempel 2

Saccharificerinq med prøver beriget med sur a-amylase Saccharificering udførtes på maltodextrin MD03 med en dextroseækvivalent (DE) på 16,5, til en opløsning 35 af dette substrat (33% tørstoffer) sattes 2100 AGI/100 g tørstoffer. Endvidere tilsattes forskellige mængder sur 14 DK 167029 B1 α-amylase, hvis aktivitet forinden var fastlagt efter den ovenfor beskrevne Phadebas-metode. Under sacchari-ficeringen holdtes stivelseshydrolysatet ved et pH på 4,0-4,2 og en temperatur på 60°C. Under disse betingel-5 ser måltes saccharificerings- eller glycosedannelsesgra-den over tidsrummet mellem 17 og 91 timer. Undersøgelserne med sur a-amylaseberigede prøver, der var fuldstændig fri for transglucosidase, viste at glucoseudbyt-tet var steget og saccharificeringstiden nedsat, hvilket 10 fremgår af resultaterne i tabel I nedenfor.

15 DK 167029 B1 in in vo in cm m -=r rH γν rs r« r. r ctn .=r =r zt ·=τ .=r -=r ( Q\ ΟΛ ΟΛ CT\ C7\ 0\ O'* [j] td S N CO CO CO ^ LT\ Φ C\j «- c* r' r». «— Γζ) c-~ ^ CTN CT\ ΟΊ CT\ CJ\ C7\ CT\ ri ΓΠ μ (¾ ω — ω > <iP g t~- t— o ό o -=r o 4-J — >Γ-| LP\ ^ ^ W- *~v ·— 0) 0)0)

4J \D q· q· in ^ in ί 1A }-) T) M

di σ\ σ\ σ\ σ\ cr\ cr\ cr\ d)OQ) +J -ri ϋ +1 Dl

_jj -H 0) -H

>, T3 H CO O CTi OD CHgrH

-Η CO I I ·Η I Ό

tcf 4J 4T -=T 43- -=Γ -=T | 1 Ό , æ H

p cn d\ σ\ σ\ σ\ σ\ o (d 4J

<D iji S Λ m C . o) 4-) o . -H H VO <3\ CT\ CO CO t-- ’D'dp) O J-ItH »· ^ <v λ »\ Φ 2¾ p Q)^r -=r S .CO) i—i o σ>σ\σ\σ\σ\σ\σ% Cue

“ ί 3 *> S

•Η ^ Φ CM >ΰ O A Η °£ fU 0) μ -=r — Λ ~ - S ^ Ό (doj cm on ·=τ ·=τ tn -=r m ^ nc

Xi σ\ o\ σ\ σ\ σ\ σ\ σ\ . ^5

η -Ρ ·η U

Η 0 g ϊ ® <β η s ι- s m ο a· irtirt J C0 0— *»«»»**** ^ ·"· λ Λ1->

' pq iHC7\OrHC\JCO^r-3- ST £ DC

cq o on m o\ on σι m S 04¾

B--- Q) H

CO s iH

<d +> Ό 4->

S -H H +J

O —Γ U) oiO Q)

<^-s r— o m m o cm co n SC

\ ο o cm on t-- -=r o\ -=r U -- c DO ·>— r- <- ·- r « »· rj Q)m < ο ο ο o iH oj h w τ3 < cn ®

0 . -X, O C

p^_______ r-l {3 0)

>i (C U -P

H g I 0) CQ

o id a +) 0) < t^-LPiinoooj η o)+j I O tH ΡΠ C— LT\ ΓΟ S 54+)0)

— JD I ·· r· «»·*·» ·» fd C'HW

now Ο Ο Ο Ο H CM β 01 > fd <5 Ή τ) rl < Cn +) +1 >i •h id g μ in td td Ο η ω t—I Ή (p (1) U -H +1 01 01

< oo CO CO CO OD CO CO

\ j* v ooooooo Q) P <p

— pj f' r r r r f- Ό -—' O g P

ZD v_- OOOOOOO <D<DM-l(D-rl < -P T) I 4-> 2 ω o - δ w H 4-) D ., ^

•H CD D -R O

---_---P g < ω -η

d) ·· «· M

> — — ~

^54- h cm on -=r in vo t— :5 H

A C _____ 16 DK 167029 B1

Resultaterne i Tabel I viser, at sur a-amylase forøger glucoseudbyttet fra 94,7% til 95,1% under disse betingelser, medens saccharificeringstiden til optimale udbytter faldt fra 70 timer til 24 timer. Dette gør an-5 vendeisen af sur α-amylase kommercielt betydningsfuld og svarende til de resultater, der opnås med pullulanase.

En del af amyloglucosidasen kan erstattes med den sure α-amylase under opnåelse af økonomisk attraktive gluco-seudbytter og saccharificeringstider.

10

Eksempel 3

Under anvendelse af saccharificeringsproceduren fra eksempel 1 udførtes undersøgelser med den normale 15 og det halve af den normale dosis amyloglucosidase og med den halve normale dosis amyloglucosidase beriget med sur α-amylase og sur pullulanase, beskrevet i europæisk patentansøgningspublikation nr. 0 063 909, alene og i kombination. En pullulanase-enhed (PU) defineres som 20 den enzymmængde, der er nødvendig til at frembringe 1 μ-mol reducerende sukker ud fra pullulan pr. minut under standardbetingelser. Resultaterne er anført i tabel II.

17 DK 167029 B1 t— -3- ro 1Λ νβ t— Lf\ CT\ ft·*' «»«*»· «“ co .=r 3· in lti lti in iri σι σι σ\ σ% σι σ\ ct\

5η t-- t~- o r— ·=τ la ro I

. CD i—l ·1# r" ^ r* [fl £ t-— fl· ro ^ in in in in id •η σι σ» on on cr\ σν σ\ λ

4J <D

Ό

rH v£> rH O LO rH m\ -=T (C

ύΡ m r r r* ^ P

—' T3 vo 3· m in in in in in (¾ Φ ή σ\ σ σ σ σ σ σ > 0) +> +> — +) α φ φ φ +> 3· CO ΙΛ Ο ^ 3- >i C OO r. r f / — «* — Φ R2.

XI 2H jo- 3 η 3 in in in iri u i,? Ό 5-i σ\ os os os o\ o\ o\ ,-h ρ φ *n S ή Φ ο ·π ι Ό

g £ m m ο Μ) in σι ν 3 ο ' S +J

U -Η πη 3 η 3 in 3 in in ^nijj 3 Μ 3T cn cn ισ σι σι σι ΟΝ ^ ϋ ·Λ φ (0 5η ο ο ο 3 in on 3 tu Μ -=1- *·»-·* 2·1»- ^ JJ -r-1 <5 CM CM t*«· rH ΓΟ ΓΟ Ο 3Γ ~r ijmj m σι ® οι σι σ σι σ φ ^ S 5η -ϋ ^ φ 00 Η 3 ΓΟ Η -3 ΓΟ ϋ£ t— ·- « ·-«-»- »- «-> _μ .μ ο

Η Ο Ο LTI C— CO CO Ο β IH (J

M CTi CO OO CO CO CO ΟΊ μ -H ^ Μ id T)

__i____ & OP

i s s s w. co ft Ό >< Q I t I CM I CM CM ΦΦΗ

EH bO II I — 1 t' r- m g H

\ I I I rH I rH r-H id +J

P> Ό 4-> CLi -H rH +j in otd d) __ o g c

-- O '-C

3 3 P id \ c·— C— 3Γ 3T VO so I-H φ Ό E3 M O O t— t— CM I CM tn tfi £ ^ <ζ ϋ r r» r· I r O' 0 ΰ <<w O O rH rH ro CO Η ^ Φ

c Η -P

__—__—- g ίδ Φ ω \ CO CO CO CO Π3ΙΗ->Φ - I i co co vo I vo +j °Φ+ί ί3 H —' I 1 ^ «- ·« I ·- rH -jj Φ <00 O O rH H 5 3 “ 3 «a* C· fi in > (d

^ -Η Η H

&> +j -P >i \ -H id Λ £ - co co co co co co co 5h Widro

roM'-' ooooooo ° joS

<C5cd r r- r r r r r Ϊ] Φ ~ < < -— OOOOOOO ·Η +3 10 Φ

rH rH

------ Φ U Φ > Ti- O E >

-Hr- φ φ Ή i -H

• -p W μ rrt -L jJ

h id tHj o in in in in in in rao-em &4 £ 2 Φ O rH O O O O O O !h φ d so

5l Ό +) g C Φ H

_. — — I I I 1 '— " 11 ' ·· ·· ·· Φ ^ Λ > Id Xi Ο ·©. „ Η 5η η ιμ ro 3 in æ s 18 DK 167029 B1

Resultaterne i tabel II viser at glucoseniveauet nåede dets top efter ca. 80 timer med det halve af det normale amyloglucosidase (AG) og en sur a-amylase(AA)-berigelsesfaktor, der er lidt længere end den 70 timers 5 saccharificeringstid, under anvendelse af den normale amyloglucosidasedosis. Topniveauet for glucose steg i-midlertid fra 94,7% til 95,5%, hvilket kan skyldes mindre isomaltosedannelse som følge af den mindre mængde anvendt amyloglucosidase.

10 Tilsvarende resultater opnåedes, da pullulanase og amyloglucosidase anvendtes sammen, skønt betydelige forskelle noteredes i glucoseproduktion ved de kortere saccharificeringstider. Kombinationen af sur a-amylase, pullulanase og den halve mængde amyloglucosidase viste 15 en hurtigere saccharificering resulterende i større glucoseudbytter per enzymaktivitet (AGI) per time.

Disse resultater indikerer, at sur α-amylase bidrager væsentligt til hydrolysen af stivelse i saccha-rificeringstrinnet. Denne overraskende virkning konku-20 rerer med virkningen af sur pullulanase skønt de to enzymer virker efter grundlæggende forskellige mekanismer.

Idet pullulanase menes at være en endo a-l,6-bindings-spalter, har sur α-amylase a-1,4 bindingsspaltende virkning.

25

Eksempel 4

Anvendelse af den hidtil ukendte sure a-amylase ved saccharificerings af stivelse muliggør en forøgelse 30 i glucosetopniveauene, en forkortelse af saccharifice-ringstiderne og en reduktion i det nødvendige forhold mellem amyloglucosidase og tørstoffer (DS). En anden fordel ved anvendelse af sur α-amylase ved saccharificering af flydendegjort stivelse er forøgelsen i sub-35 stratkoncentrationen, der da er mulig, hvilket kan reducere inddampningsomkostningerne betydeligt.

19 DK 167029 B1

Opløsninger indeholdende substrat (MD03) med forskellige tørstofindhold justeredes til pH 4,2 og opvarmedes til 60°C. Den halve normale AG-dosis (10,5 AGI/-gDS) og en 9-doblet mængde sur a-amylase tilsattes.

5 Portioner udtoges med forskellige intervaller og analyseredes som beskrevet i Eksempel 1. Der udførtes også kontrolundersøgelser med normale og halverede AG-dosis uden tilsat sur α-amylase. Resultaterne er anført i Tabel III nedenfor.

10 TABEL ni

Saccharificer- ingstid maksimal %DS1) AGI/sDS AAU/AGI (timer) _ glucose(g) 15 25 10,5 0,074 140-165 95,6 25 10,5 0,74 64 96,1 29 10,5 0, 074 140-165 95,3 29 10,5 0,74 90 95,8 33 10,5 0, 074 140-165 94,6 33 10,5 0,74 90 95,2 20 37 10,5 0,074 140-165 93,9 37 10,5 0,74 71 94,7 45 10,5 0,074 140-165 91,3 45 10,5 0,74 71 92,8 33 1 21 0,074 71_ 94,7 25 maltodextrin MD03.

Dataene i Tabel III viser, at såfremt amylogluco-30 sidase anvendes sammen med den hidtil ukendte sure a-amylase, kan tørstofindholdet (DS) hæves til opnåelse af maksimale glucoseniveauer, der er større end de, der opnås under tilsvarende betingelser under anvendelse af kommercielle amyloglucosidasepræparater. For eksempel 35 opnåedes et glucosetopniveau på 94,7% med et kommercielt amyloglucosidasepræparat ved 33% DS. Det samme maksima- 20 DK 167029 B1 le glucoseniveau opnåede ved den samme inkuberingstid med en 10 doblet tilsætning af sur a-amylase og den halve mængde AG ved 37% DS.

5 Eksempel 5

Sure a-amylaser fra andre kilder, dvs. bakterielle enzymer, der er aktive i det sure pH-område og ved 60°C, kan også anvendes til at forbedre den saccharifi-10 cering, der frembringes af amyloglucosidase. Således anvendtes en rå gæringsprøve af bakterien ATCC 31199 (se britisk beskrivelse nr. 1539694 CPC International), med a-amylaseaktivitet i et saccharificeringseksperiment med amyloglucosidase. Anvendelse af den rå prøve i et for-15 hold AAU/AGI = 0,74 gav betydeligt højere glucoseniveau-er i sammenligning med de, der opnås med blot amyloglucosidase, i en kontrolundersøgelse, skønt værdierne var mindre end de, der opnåedes med en tilsvarende mængde af den fungale sure α-amylase. Resultaterne er vist i den 20 følgende Tabel IV.

21 DK 167029 B1 cm m ko i t—i €> r-- { H -SJ" -=r ον σ\

o CM

LfN rv r' 1

P ON -=T ·=Γ I

0) ON ON

g

•H

-P KO rH CNJ

CO n r' *P co co -=r LPv

<*p ON ON ON

—T3

-H

-P CO LfN C\J

1Ί & «Η ·>« «*· *·* •P tn t-— cm ro in

>1 C ON ON ON

Λ "H

O' P

S $ CM I—) I—I

W -H NO CM CO m

0 Cp ON ON ON

ϋ Ή

3 P

3 en ko c— ^ λ r· P -=r o H -sr

p ON ON ON

td m on ±r -ar O ·- *-> #- H -=r co o -=r

CO ON ON

hi

H

CQ c\J t— < -=r — i B. CM O iH i co co

CO

Q

bo LfN LfN LfN

\ r* <n

M O O O

rH iH tH __ <

M

O -=3- <c t— =3- -=r o tr— c— ΓΟ r r-

< O O O

C____ < Λ

< rH

< Η 1 "i S 3 §

® g> JS

^ η M

to P

’ ro fe , · Q) W tw > + + -n τθι w p o o α CL, < <£ < DK 167029 B1 22

Eksempel 6

Saccharificeringsundersøgelser udførtes efter samme procedure som beskrevet tidligere. Opløsninger 5 indeholdende substrat (MD03, 33% DS) justeredes til pH-værdier mellem 3,5 og 5,0 og opvarmedes til 60°C. Amyloglucosidase (21 AGI/g DS) sammen med 9-dobbelt AA-mængde (i sammenligning med den mængde, der er til stede i AGpræparatet) tilsattes. Prøver udtoges med 10 forkellige intervaller og analyseredes. Kontrolundersøgelser udførtes også. Der opnåedes de følgende data, jr. Tabel V.

tabel v 15___ ~ saccharific.er- - glucose top-

Begynaelses pH efter 94 ingstid (timer). niveau (%) pH__timer__;____ 3,5 3,45 '71 95,3 4, 0 3,85 64 95,3 (9*1,9)* 4,2 3,95 64 95,3 (9*1,8)* 20 4,5 4,1 .64 95,3 (9*1,6)« 5.0__5*2__§5_ 95.2_ * Kontroller (AG-dosis uden ekstra AA-tilsætning.)._ 25

Ved anvendelse af overskud af sur a-amylase opnåedes således sammenlignelige glucosetopniveauer i pH-området 3,5-5,0.

30 Eksempel 7

Opløsninger indeholdende substrat (MD03, 33% DS) justeredes til pH 4,2 og opvarmedes til forskellige temperaturer. Amyloglucosidase (21 AGI/gDS) og en 9-dob-35 belt mængde sur α-amylase tilsattes. Prøver udtoges og analyseredes som beskrevet i Eksempel 2. Kontroller (AG-dosis uden ekstra AA-tilsætning) udførtes også. Re sultaterne er anført i Tabel VI nedenfor.

TABEL VI

23 DK 167029 B1 6 Temperatur AAU/AGI saccharificer- glucose- ______ ingsjtid. (.timer) udbytte^) 55 0, 074 65 94,6 °i 74 47 95,0 57.5 0,074 71 95?0 10 0,74 UT 95; 5 60 0,074 .. 71 94;8 0,74 64 95,3 62.5 0,074 90 94,8 0,74 64 95, 4 .

65 0,074 117 93? o __°;74 89_ 94,6

Disse resultater bekræfter, at sur a-amylase er 20 stabil ved temperaturer op til mindst 65 °C, hvilket gør den meget egnet til brug i forbindelse med amyloglucosi-dase ved relativt høje saccharificeringstemperaturer.

De lavere glucoseværdier ved 65°C skyldes formodentlig AG enzymets mindre termostabilitet i forhold .til AA.

25 Tilstedeværelsen af sur α-amylase har en gunstig virkning på glucoseproduktionen ved høj ere temperatur.

PATENTKRAV

30 1. Enzymprodukt, kendetegnet ved, at det omfatter amyloglucosidase og en sur a-amylase, hvilken α-amylase har evne til at spalte a-l,4-gluco-sidiske bindinger og udviser optimal aktivitet ved en forsukringsreaktion ved pH fra 3,5 til 5,0 og en tempe-35 ratur fra 60 til 75 °C, i et forhold på i det mindste 0,16 AAU (acid amylase units) pr. AGI (amyloglucosidase

Claims (14)

1. 2. Enzymprodukt ifølge krav i, kendetegne t ved, at det indeholder fra 0,2 til 4,5 AAU pr.
2. 5 AGI.
3. 3. Enzymprodukt ifølge krav l eller 2, kendetegnet ved, at amyloglucosidasen stammer fra Aspergillus niger.
4. 4. Enzymprodukt ifølge et vilkårligt af kravene 10 1-3, kendetegnet ved, at den sure a-amylase stammer fra Aspergillus niger.
5. 5. Enzymprodukt ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, kendetegnet ved, det yderligere indeholder en effektiv mængde sur pullulanase.
6. 6. Enzymprodukt ifølge krav 5, kende tegnet ved, at den sure pullulanase er en sådan som kan frembringes af Bacillus acidopullulyticus.
7. 7. Fremgangsmåde til omdannelse af stivelse til dextrose i form af en sirup, kendetegnet 20 ved, at man saccharificerer stivelse eller et stivelseshydrolysat under tilstedeværelse af et enzymprodukt ifølge et vilkårligt af kravene l til 6.
8. 8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at et stivelseshydrolysat med et tør- 25 stofindhold på mindst 30% saccharificeres.
9. 9. Fremgangsmåde ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at saccharificeringen udføres ved en pH-værdi på fra 3 til 5 ved en temperatur i området fra 40 til 70°C.
10. 10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kende tegnet ved, at saccharificeringen udføres ved pH 0 4-4,5 ved en temperatur mellem 50 og 65 C.
11. 11. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 7 til 10, kendetegnet ved, at mængden 35 af amyloglucosidase, som anvendes, andrager fra 8 til 30 AGI pr. g total tørstof. DK 167029 B1
12. 12. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at mængden af amyloglucosidase, som anvendes, andrager fra 14 til 22 AGL pr. g total tørstof.
13. 13. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kra vene 7 til 12, kendetegnet ved, at sacchari-ficeringen udføres under tilstedeværelse af sur pullu-lanase. DK 167029 B1 FIG. I \ frS'ZS ^ K J l: - szTe - S ^ 3 ^ --^<51· · I 2 <~*3>SI' Sg </1SF=3
14. 0. I < 1 O 00 CM