JP5160899B2 - グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチド - Google Patents
グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチド Download PDFInfo
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Description
本発明は、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドおよび前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は、また、ポリペプチドを含んでなる核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞ならびにポリペプチドを製造する方法および使用する方法およびデンプンを転化して発酵生成物、例えば、エタノールおよびシロップ、例えば、グルコースを製造するために本発明のグルコアミラーゼを使用することに関する。本発明は、また、本発明のグルコアミラーゼを含んでなる組成物に関する。
グルコアミラーゼ (1,4-α-D-グルカン-グルコヒドロラーゼ、EC 3.2.1.3) は、デンプンまたは関係するオリゴ糖および多糖の分子の非還元性末端からのD-グルコースの解放を触媒する酵素である。グルコアミラーゼはいくつかの糸状真菌および酵母菌により産生され、アスペルギルス (Aspergillus) からのグルコアミラーゼは商業的に最も重要である。
米国特許第4,727,046号には、コルチシウム・ロルフシイ (Corticium rolfsii) (これはまたアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) と呼ばれる) に由来するグルコアミラーゼが開示されている。
WO 99/23248には、タラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) に由来するグルコアミラーゼが開示されている。
WO 00/75296には、サーモアスクス・クルスタセウス (Thermoascus crustaceus) に由来するグルコアミラーゼが開示されている。
本発明は、下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドに関する:
(a) 配列番号2の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1) 配列番号37の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜561のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号1のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号3のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号36のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c) 配列番号2のアミノ酸1〜556の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1) 配列番号37のアミノ酸1〜561の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
(a) 配列番号2の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1) 配列番号37の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜561のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b) 配列番号1のヌクレオチド55〜2166に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(b1) 配列番号36のヌクレオチド55〜2166に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c) 配列番号3のヌクレオチド55〜1725に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1) 配列番号38のヌクレオチド55〜1737に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号1のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号3のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号36のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
(a) 配列番号5の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜575のアミノ酸に対して少なくとも70% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1) 配列番号40の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜565のアミノ酸に対して少なくとも70% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号4のヌクレオチド55〜2189とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号6のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号39のヌクレオチド55〜2182とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号41のヌクレオチド55〜1749中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c) 配列番号5のアミノ酸1〜575の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1) 配列番号40のアミノ酸1〜565の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
(a) 配列番号5の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜575のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1) 配列番号40の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜565のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b) 配列番号4のヌクレオチド55〜2189に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(b1) 配列番号39のヌクレオチド55〜2182に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c) 配列番号6のヌクレオチド55〜1725に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1) 配列番号41のヌクレオチド55〜1749に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号4のヌクレオチド55〜2189とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号6のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号39のヌクレオチド55〜2182とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号41のヌクレオチド55〜1749中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
(a) 配列番号26の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1) 配列番号24の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜548のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a2) 配列番号43の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜523のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号23のヌクレオチド117〜2249とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも低いストリンジェンシイ条件下に配列番号25のヌクレオチド55〜1719中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号42のヌクレオチド52〜1620中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c) 配列番号26のアミノ酸1〜556の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1) 配列番号24のアミノ酸1〜548の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1) 配列番号43のアミノ酸1〜523の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
(a) 配列番号26の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1) 配列番号24の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜548のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a2) 配列番号43の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜523のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b) 配列番号23のヌクレオチド117〜2249に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c) 配列番号25のヌクレオチド52〜1719に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1) 配列番号42のヌクレオチド52〜1620に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号23のヌクレオチド117〜2249とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも低いストリンジェンシイ条件下に配列番号42のヌクレオチド52〜1620中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号25のヌクレオチド52〜1719中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
本発明は、また、発酵生成物またはシロップを製造する方法に関する。
グルコアミラーゼ活性:
用語 「グルコアミラーゼ (1,4-α-D-グルカン-グルコヒドロラーゼ、EC 3.2.1.3) 」 は、デンプンまたは関係するオリゴ糖および多糖の分子の非還元性末端からのD-グルコースの解放を触媒する酵素であるとして定義される。本発明の目的に対して、グルコアミラーゼ活性は下記の節 「材料および方法」 に記載されている手順に従い決定される。
用語 「ポリペプチド」 は、本明細書において使用するとき、SDS-PAGEにより決定して、少なくとも20%の純度、好ましくは少なくとも40%の純度、より好ましくは少なくとも60%の純度、さらにより好ましくは少なくとも80%の純度、最も好ましくは少なくとも90%の純度、さらに最も好ましくは少なくとも95%の純度を有する単離されたポリペプチドを意味する。
用語 「実質的に純粋なポリペプチド」 は、ここにおいて最大10%、好ましくは最大8%、より好ましくは最大6%、より好ましくは最大5%、より好ましくは最大4%、より好ましくは最大3%、さらにより好ましくは最大2%、最も好ましくは最大1%、さらに最も好ましくは最大0.5%の天然に関連する他のポリペプチド物質を含有するポリペプチド調製物を意味する。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、調製物中に存在する全ポリペプチド物質の少なくとも92%の純度、好ましくは少なくとも94%の純度、より好ましくは少なくとも95%の純度、より好ましくは少なくとも96%の純度、より好ましくは少なくとも97%の純度、より好ましくは少なくとも98%の純度、さらにより好ましくは少なくとも99%の純度、最も好ましくは少なくとも99.5%の純度、さらに最も好ましくは100%の純度を有することが好ましい。
2つのアミノ酸の間または2つのヌクレオチド配列の間の関係をパラメーター 「同一性」 で記載する。
本発明の目的に対して、2つのアミノ酸間の同一性の程度は、クルスタル (Clustal) 法 (Higgins、1989、CABS/OS 5: 151-153) により、LASERGENETM MEGALIGNTMソフトウェア (DNASTAR, Inc.、ウィスコンシン州マディソン) を同一性の表および下記の多重アラインメントパラメーターとともに使用して決定される: 10のギャップペナルティーおよび10のギャップ長さペナルティー。対アラインメントパラメーターは次の通りである: Ktuple = 1、ギャップペナルティー= 3、ウィンドウズ= 3およびダイアゴナルス= 5。
用語 「ポリペプチドフラグメント」 は、それぞれ配列番号2または37; または配列番号5または40; または配列番号24、26または43、またはそれらの相同配列のアミノ末端および/またはカルボキシル末端から1または2以上のアミノ酸が欠失されたポリペプチドとして本明細書において定義され、ここでフラグメントはグルコアミラーゼ活性を有する。
用語 「サブ配列」 は、それぞれ配列番号1、36または38; またはそれぞれ配列番号4、39または41; またはそれぞれ配列番号23、25または42、またはそれらの相同配列の5’末端および/または3’末端から1または2以上のヌクレオチドが欠失されたヌクレオチド配列として本明細書において定義され、ここでサブ配列はグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする。
用語 「対立遺伝子変異型」 は、本明細書において同一染色体位置を占有する遺伝子の2またはそれ以上の選択的形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異型は自然に突然変異を通して生じ、そして集団内で多形性を生ずることがある。遺伝子の突然変異はサイレントである (コードされたポリペプチドにおける変化が存在しない) か、あるいは変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドの対立遺伝子変異型は、遺伝子の対立遺伝子変異型によりコードされるポリペプチドである。
用語 「実質的に純粋なポリヌクレオチド」 は、本明細書において使用するとき、他の外来性または不必要なヌクレオチドを含まず、遺伝子操作されたタンパク質製造系内の使用に適した形態であるポリヌクレオチド調製物を意味する。こうして、実質的に純粋なポリヌクレオチドは最大10重量% 、好ましくは最大8%、より好ましくは最大6%、より好ましくは最大5%、より好ましくは最大4%、より好ましくは最大3%、さらにより好ましくは最大2%、最も好ましくは最大1%、さらに最も好ましくは最大0.5%の天然に関連する他のポリヌクレオチド物質を含有する。
用語 「cDNA」 は、真核細胞から得られる成熟スプライスドmRNA分子から逆転写により調製することができるDNA分子として本明細書において定義される。cDNAは対応するゲノムDNA中に通常存在するイントロン配列を欠如する。初期の一次RNA転写物はmRNAに対する前駆体であり、これは1系列の段階に通してプロセスされた後、成熟スプライスドmRNAとして出現する。これらの段階は、スプライシングと呼ぶプロセスによるイントロン配列の除去を含む。したがって、mRNAに由来するcDNAはイントロン配列を欠如する。
用語 「核酸構築物」 は、本明細書において使用するとき、天然に存在する遺伝子から単離された一本鎖または二本鎖の核酸分子、またはそうでなければ天然に存在しない方法で核酸のセグメントを含有するように修飾された一本鎖または二本鎖の核酸分子を意味する。用語 「核酸構築物」 は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に必要な制御配列を含有するとき、用語 「発現カセット」 と同義である。
用語 「制御配列」 は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要なまたは有利であるすべての構成要素を含むとして、本明細書において定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して自然または外来であることができる。このような制御配列は下記のものを包含するが、これらに限定されない: リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーター。最小、制御配列はプロモーター、転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコーディング領域との制御配列の連結を促進する、特異的制限部位を導入する目的で、リンカーを有することができる。
用語 「作用可能に連結された」 は、本明細書において、制御配列がポリペプチドのコード配列の発現を指令するように、ポリヌクレオチド配列のコード配列に関して適当な位置に制御配列が配置されている立体配置を意味する。
本発明において使用するとき、用語 「コード配列」 は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定する、ヌクレオチド配列を意味する。一般に、コード配列の境界はオープンリーディングフレームにより決定され、このオープンリーディングフレームはATG開始コドンまたは選択的開始コドン、例えば、GTGおよびTTGで通常開始する。コード配列は、DNA、cDNAまたは組換えヌクレオチド配列であることができる。
用語 「発現」 は、下記を包含するが、これらに限定されないポリペプチド産生に関係づけられる任意の段階を包含する: 転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌。
用語 「発現ベクター」 は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、そしてその発現を提供する追加のヌクレオチドに作用可能に連結された、線状または環状のDNA分子として本明細書において定義される。
用語 「宿主細胞」 は、本明細書において使用するとき、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物による形質転換、トランスダクションおよびその他に対して感受性である、任意の細胞型を包含する。
用語 「修飾」 は、本明細書において、それぞれ配列番号2のアミノ酸1〜556または配列番号37のアミノ酸1〜561; または配列番号5のアミノ酸1〜575または配列番号40のアミノ酸1〜565; または配列番号26のアミノ酸1〜556または配列番号24のアミノ酸1〜548または配列番号43のアミノ酸1〜523から成るポリペプチドの任意の化学的修飾、ならびに前記ポリペプチドをコードするDNAの遺伝子操作を意味する。1または2以上の修飾は、1または2以上のアミノ酸の1または2以上の置換、1または2以上の欠失および/または1または2以上の挿入、ならびに1または2以上のアミノ酸側鎖の1または2以上の置換であることができる。
本発明において使用するとき、用語 「人工変異型」 は、配列番号1または3 (cDNA); または配列番号36または38 (cDNA); または配列番号4または6 (cDNA) または配列番号39または41 (cDNA); または配列番号23または25 (cDNA) または42 (cDNA) の修飾されたヌクレオチド配列を発現する生物により産生されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。修飾されたヌクレオチド配列は、ヒトの関与に通して、それぞれ配列番号1または3; または配列番号36または38; または配列番号4または6; または配列番号39または41; または配列番号23または25または42に開示されるヌクレオチド配列の修飾により得られる。
グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド
第1の面において、本発明は、それぞれ配列番号2のアミノ酸1〜556または配列番号37のアミノ酸1〜561; または配列番号5のアミノ酸1〜575または配列番号40のアミノ酸1〜565; または配列番号26のアミノ酸1〜556または配列番号24のアミノ酸1〜548または配列番号43のアミノ酸1〜523 (すなわち、成熟ポリペプチド) に対してある程度の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
1つの面において、本発明は、それぞれ配列番号2または37; 配列番号5または40; または配列番号24、26または43のアミノ酸配列の触媒領域/ドメインを含んでなるポリペプチドに関する。
他の面において、本発明は、炭水化物結合性アフィニティー、好ましくはデンプン結合性アフィニティーを有するポリペプチドに関する。
トラメテス (Trametes) グルコアミラーゼ中の結合性ドメインは、配列番号2のアミノ酸466〜556に位置し、そして配列番号3中のポリヌクレオチド1420〜1725によりコードされるか、あるいは配列番号37のアミノ酸471〜561に位置し、そして配列番号38中のポリヌクレオチド1465〜1737によりコードされる。
(a) i) それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド; または
ii) それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド; または
iii) それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
(i) それぞれ配列番号3のヌクレオチド1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737の相補鎖;
(ii) それぞれ配列番号6のヌクレオチド1423〜1725または配列番号41のヌクレオチド1477〜1749の相補鎖;
(iii) それぞれ配列番号25のヌクレオチド1438〜1719または配列番号23のヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のヌクレオチド1399〜1620の相補鎖;
(c) 炭水化物結合性アフィニティーを有する (a) または (b) のフラグメント。
(a) 低いストリンジェンシイの条件下に、好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、下記から成る群から選択されるポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド:
(i) それぞれ配列番号3のヌクレオチド1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737の相補鎖;
(ii) それぞれ配列番号6のヌクレオチド1423〜1725または配列番号41のヌクレオチド1477〜1749;
(iii) それぞれ配列番号25のヌクレオチド1438〜1719または配列番号23のヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のヌクレオチド1339〜1620;
(b) 炭水化物結合性アフィニティーを有する (a) のフラグメント。
本発明のグルコアミラーゼまたは触媒領域は、1または2以上の外来結合性ドメイン (また、結合性モジュール (CBM) と呼ばれる) に、リンカーを介してまたは直接結合することができる。「外来」 結合性ドメインは、問題の本発明の野生型グルコアミラーゼに由来しない結合性ドメインである。結合性ドメインは、好ましくは炭水化物結合性ドメイン (すなわち、炭水化物に対する結合性のアフィニティーを有する) 、特にデンプン結合性ドメインおよびセルロース結合性ドメインである。好ましい結合性ドメインは真菌または細菌由来である。特に考えられるデンプン結合性ドメインの例は、WO 2005/003311に開示されており、これは引用することによって本明細書の一部とされる。
TTTTTTAAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSS (配列番号22)
他の面において、本発明は、下記のポリヌクレオチドによりコードされるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドに関する: (i) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に、好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシイ条件下に、さらにより好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、それぞれ配列番号1のヌクレオチド55〜2166または配列番号36のヌクレオチド55〜2166をもつヌクレオチド配列 (トラメテス (Trametes) ゲノムDNA) とハイブリダイズするポリヌクレオチド、または
(iii) 上記 (i) もしくは (ii) のサブ配列、または (iv) 上記 (i) 、(ii) または (iii) の相補鎖。
(iv) 上記 (i) 、(ii) もしくは (iii) の相補鎖。
塩含有ハイブリダイズ条件下に、有効Tmは有望なハイブリダイズのためにプローブとフィルター結合DNAとの間の要求される同一性の程度を制御する温度である。有効Tmは下記の式を使用して種々のストリンジェンシイ条件下にハイブリダイズする2つのDNAに必要な同一性の程度を決定するために決定することができる。
有効Tm = 81.5+16.6(log M[Na+])+0.41(G+C%)-0.72 (ホルムアミド%)
(www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm参照)
配列番号4または配列番号4のヌクレオチド55〜2189のG+C含有量は60.7%である。配列番号6 (cDNA)または配列番号6のヌクレオチド55〜1725のG+C含有量は63.7%である。
中程度のストリンジェンシイについて、ホルムアミドは35%であり、そして5×SSPE中のNa+濃度は0.75 Mである。この式中これらを値に適用すると、有効Tmは79.0℃である。
他の関係する関係は、2つのDNAの1%のミスマッチがTmを1.4℃だけ低下させるころである。2つのDNAが42℃において中程度のストリンジェンシイ条件下にハイブリダイズするために要求される同一性の程度を決定するために、下記式を使用する:
相同性% = 100-[(有効Tm-ハイブリダイズ温度) /1.4]
(www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm参照)
それ以上の面において、本発明は、それぞれ配列番号2、5、24、26、37、40および43、またはそれらの成熟ポリペプチド中に1または2以上の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる人工変異型に関する。アミノ酸の変化は小さい特質、すなわち、下記の特質を有することが好ましい: タンパク質のフォールディングおよび/または活性に有意に影響を与えない保存的アミノ酸の置換または挿入; 小さい欠失、典型的には1〜約30の欠失; 小さいアミノ末端またはカルボキシル末端のエクステンション、例えば、アミノ末端のメチオニン残基; 約20〜25残基までの小さいリンカーペプチド; または正味の電荷または他の機能を変化させることによって精製を促進する小さいエクステンション、例えば、抗原エピトープまたは結合性ドメイン。
本発明のポリペプチドは任意の属の微生物から得ることができる。本発明の目的に対して、用語 「から得る」 は、本明細書において使用するとき、所定の源に関して、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドがその源により、またはそのヌクレオチド配列が挿入されている菌株により産生されることを意味する。好ましい面において、所定の源から得られるポリペプチは細胞外に分泌される。
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) 菌株は、1995〜1997年にジムバブウェ (Zimbabwe) において収集された。
レウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) 菌株は、2003年にデンマークにおいて収集された。
本発明は、また、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドに関する。好ましい面において、ヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号1、3、4、6、23、25、36、38、39、41または42のいずれかに記載される。他のより好ましい面において、ヌクレオチド配列はそれぞれ大腸菌 (Escherichia coli) DSM 17106または大腸菌 (Escherichia coli) DSM 17105中に含有されるプラスミドpHUda595またはpHUda594中に含有される配列である。他の好ましい面において、ヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号1、3、4、6、23、25、36、38、39、41または42のいずれかの成熟ポリペプチドコーディング領域である。
本発明は、また、制御配列と適合性の条件下に適当な発現宿主中でコード配列の発現を指令する1種または2種以上の制御配列に作用可能に連結された、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物に関する。
糸状真菌宿主細胞に好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼおよびアスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞に有効なポリアデニル化配列は下記の文献に記載されている: GuoおよびSherman、1995、Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990。
本発明は、また、本発明のポリヌクレオチド、プロモーターおよび転写および翻訳停止シグナルを含んでなる組換え発現ベクターに関する。前述の種々の核酸および制御配列を一緒に結合させて、1または2以上の好都合な制限部位を包含することができる組換え発現ベクターを製造し、このような部位におけるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入または置換を可能とすることができる。選択的に、本発明のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド構築物を適当な発現用ベクター中に挿入することによって、発現させることができる。発現ベクターをつくるとき、コード配列が発現のために適当な制御配列に作用可能に連結されるように、コード配列はベクター中に位置する。
酵母宿主細胞において使用する複製起点の例は、2ミクロンの複製起点、AR81、AR84、ARS1とCEN3との組合わせおよびARS4とCEN6との組合わせである。
前述の因子を結合して本発明の組換え発現ベクターを構築するために使用する手順はこの分野においてよく知られている (例えば、下記の文献を参照のこと: Sambrook 他、1989、前掲) 。
本発明は、また、ポリペプチドの組換え製造において好都合に使用される、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる、組換え宿主細胞に関する。本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを宿主細胞中に導入して、ベクターを染色体組込み体としてまたは前述した自己複製染色体外ベクターとして維持する。用語 「宿主細胞」 は、複製間に起こる突然変異のために、親細胞と同一ではない親細胞の子孫を包含する。宿主細胞の選択は、大きい程度に、ポリペプチドをコードする遺伝子およびその源に依存する。
本発明は、また、下記の工程を含んでなる本発明のポリペプチドを製造する方法に関する: (a) ポリペプチドの製造を促進する条件下に、野生型の形態でポリペプチドを製造できる細胞を培養し、そして (b) ポリペプチドを回収する。好ましくは、細胞はトラメテス (Trametes) 、パチキトスポラ (Pachykytospora) またはレウコパキシルス (Leucopaxillus) 属、より好ましくはトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) 、パチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) またはレウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) である。
生ずるポリペプチドはこの分野において知られている方法により回収することができる。例えば、ポリペプチドは下記を包含するが、これらに限定されない手順により回収することができる: 遠心、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿。
本発明は、また、回収可能な量でポリペプチドを発現し、産生するように、本発明のグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換されたトランスジェニック植物、植物部分または植物細胞に関する。ポリペプチドは植物または植物部分から回収できる。選択的に、組換えポリペプチドを含有する植物または植物部分は、例えば、食物または飼料の品質を改良するために、例えば、栄養価、味の良さおよび流動学的性質を改良するために、または抗栄養因子を破壊するために使用できる。
この分野において知られている方法に従い、本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物または植物細胞を構築することができる。簡単に述べると、本発明のポリペプチドをコードする1または2以上の発現構築物を植物宿主ゲノム中に組込み、そして生ずる修飾された植物または植物細胞をトランスジェニック植物または植物細胞に増殖させることによって、植物または植物細胞を構築する。
核酸構築物をこの分野において知られている慣用技術、例えば、下記の技術に従い植物ゲノム中に組込む: アグロバクテリウム (Agrobacterium) 仲介形質転換、ウイルス仲介形質転換、マイクロインジェクション、粒子衝撃およびエレクトロポレーション (Gasser 他、1990、Science 244: 1293; Potrykus、1990、Bio/Technology 8: 535; Shimamoto 他、1989、Nature 338: 274) 。
本発明は、また、本発明のポリペプチドを含んでなる組成物に関する。好ましくは、組成物はこのようなポリペプチドに富んでいる。用語 「富んでいる」 は、組成物のグルコアミラーゼ活性が、例えば、1.1の増分係数で増加されていることを示す。
本発明のこの面によれば、本発明のグルコアミラーゼは、0.3〜5.0のAFAU/AGU比で酸性α-アミラーゼと組合わせることができる。より好ましくは、酸性α-アミラーゼ活性/グルコアミラーゼ活性の比は、少なくとも0.35、少なくとも0.40、少なくとも0.50、少なくとも0.60、少なくとも0.7、少なくとも0.8、少なくとも0.9、少なくとも1.0、少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、少なくとも1.5、少なくとも1.6、少なくとも1.7、少なくとも1.8、少なくとも1.85またはさらに少なくとも1.9 AFAU/AGUである。しかしながら、酸性α-アミラーゼ活性/グルコアミラーゼ活性の比は、好ましくは4.5より小、4.0より小、3.5より小、3.0より小、2.5より小またはさらに2.25より小のAFAU/AGUであるべきである。
本発明のポリペプチド組成物の好ましい使用例を後述する。本発明のポリペプチド組成物の投与量および組成物を使用する他の条件は、この分野において知られている方法に基づいて決定できる。
本発明のトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼは、他のグルコアミラーゼ、例えば、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) 、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) およびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) よりも4〜7倍高いα-1,6-脱分枝活性を有することが発見された (実施例12参照) 。
本発明は、また、本発明のグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドを使用するプロセス/方法に関する。
本発明による使用は、デンプンを、例えば、シロップおよび発酵生成物、例えば、エタノールおよび飲料に転化することを包含する。本発明のグルコアミラーゼを使用できるプロセスの例は下記の特許に開示されているプロセスを包含する: WO 2004/081193、WO 2004/080923、WO 2003/66816、WO 2003/66826およびWO 92/20777 (これらのすべては引用することによって本明細書の一部とされる) 。
糊化デンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法
この面において、本発明は、デンプン含有物質から発酵生成物、特にエタノールを製造する方法に関する。この方法は液化工程および順次にまたは同時に実行する糖化および発酵工程を含む。
(a) α-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を液化し、
(b) 工程 (a) において得られた液化物質を糖化し、そして
(c) 糖化された物質を発酵生物で発酵させる。
x) デンプン含有物質の粒度を、好ましくは微粉砕により、減少させ、そして
y) デンプン含有物質および水を含んでなるスラリーを形成する。
この面において、本発明は、デンプン含有物質を糊化しないで、デンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法に関する。1つの態様において、本発明のグルコアミラーゼを糖化および発酵の間に使用する。本発明によれば、デンプン含有物質を含有する水性スラリーを液化しないで、必要な発酵生成物、例えば、エタノールを製造することができる。1つの態様において、本発明の方法は、糊化温度以下の温度において本発明のグルコアミラーゼの存在下に微粉砕されたデンプン含有物質を糖化して糖を製造することを包含し、この糖は適当な発酵生物により必要な発酵生成物に発酵させることができる。
(a) 下記の配列を有するグルコアミラーゼを使用して、デンプン含有物質を前記ンプン含有物質の初期糊化温度より低い温度において糖化し、
i) 配列番号2中のアミノ酸1〜556または配列番号37中のアミノ酸1〜561として示す配列またはそれに対して少なくとも75%の同一性を有するグルコアミラーゼおよび/または
ii) 配列番号5中のアミノ酸1〜575または配列番号40中のアミノ酸1〜565として示す配列またはそれに対して少なくとも70%の同一性を有するグルコアミラーゼおよび/または
iii) 配列番号24中のアミノ酸1〜548または配列番号26中のアミノ酸1〜556または配列番号43中のアミノ酸1〜523として示す配列またはそれに対して少なくとも60%の同一性を有するグルコアミラーゼ、
そして
(b) 発酵生物を使用して発酵させる。
本発明のプロセスの工程 (a) および (b) は順次にまたは同時に実施することができる。
好ましい態様において、工程 (a) および工程 (b) は同時の糖化および発酵プロセスとして実施される。このような好ましい態様において、このプロセスは典型的には28℃〜36℃、例えば29℃〜35℃、例えば30℃〜34℃、例えば約32℃の温度において実施される。本発明によれば、温度は発酵の間に上下に調節できる。
任意の適当なデンプン含有物質、例えば、粒状デンプンを本発明に従い使用できる。出発物質は一般に必要な発酵生成物に基づいて選択される。本発明の方法において使用するために適当なデンプン含有物質の例は下記のものを包含する: 塊茎、根、幹、果実、全穀粒、トウモロコシ、穂軸、コムギ、オオムギ、ライムギ、マイロ、サゴヤシ、カッサバ、タピオカ、モロコシ、イネ、エンドウまたはサツマイモまたはそれらの混合物、または穀物、糖含有原料、例えば、糖蜜、果実、サトウキビまたはテンサイ、およびセルロース含有物質、例えば、木材または植物残留物またはそれらの混合物。蝋質および非蝋質の両方の型のトウモロコシおよびオオムギが考えられる。
用語 「発酵生成物」 は、発酵生物を使用する発酵工程を含むプロセスにより製造された生成物を意味する。本発明に従い考えられる発酵生成物は下記を包含する: アルコール (例えば、エタノール、メタノール、ブタノール) ; 有機酸 (例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸塩) ; ケトン (例えば、アセトン) ; アミノ酸 (例えば、グルタミン酸) ; 気体 (例えば、H2およびCO2) ;抗生物質 (例えば、ペニシリンおよびテトラサイクリン) ; 酵素 ; ビタミン (例えば、リボフラビン、B12、ベータ-カロテン) ; およびホルモン。
「発酵生物」 は、発酵プロセスにおいて使用するために適当であり、必要な発酵生成物を産生することができる、細菌および真菌の生物を包含する、任意の生物を意味する。特に適当な生物は、糖、例えば、グルコースまたはマルトースを必要な発酵生成物に直接的または間接的に発酵、すなわち、転化することができる。発酵生物の例は真菌生物、例えば、酵母菌を包含する。好ましい酵母菌は、サッカロマイセス (Saccharomyces) 種の菌株、特にサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) を包含する。商業的に入手可能な酵母菌は下記を包含する: 例えば、Red StarTM/lesaffre Etanol Red (入手先: Red Star/lesaffre、米国) 、FALI (入手先: Feischmann’s Yeast、Burns Phlip Food Inc. の部、米国) 、SUPERSTART (入手先: Alltech) 、GERT STRAND (入手先: Gert Strand AB、スウェーデン) およびFERMIOL (入手先: DSM Specialties) 。
グルコアミラーゼ
グルコアミラーゼは好ましくは本発明のグルコアミラーゼである。しかしながら、前述したように、本発明のグルコアミラーゼは他のグルコアミラーゼと組合わせることもできる。
グルコアミラーゼは0.001〜10 AGU/g DS、好ましくは0.01〜5 AGU/g DS、例えば、約0.1、0.3、0.5、1または2 AGU/g DS、特に0.1〜0.5 AGU/g DSまたは0.02〜20 AGU/g DS、好ましくは0.1〜10 AGU/g DSの量で添加することができる。
α-アミラーゼは、本発明によれば、任意の由来であることができる。真菌または細菌の由来のα-アミラーゼは好ましい。
好ましい態様において、α-アミラーゼは酸性α-アミラーゼ、例えば、真菌酸性α-アミラーゼまたは細菌酸性α-アミラーゼである。用語 「酸性α-アミラーゼ」 は、α-アミラーゼ (EC 3.2.1.1) であり、これはpH 3〜7、好ましくはpH 3.5〜6、より好ましくはpH 4〜5において最適活性を有する。
本発明によれば、細菌α-アミラーゼは好ましくはバシラス (Bacillus) 属に由来することができる。
好ましい態様において、細菌α-アミラーゼはバシラス・リヘニフォルミス (B. licheniformis) 、バシラス・アミロリクファシエンス (B. amyloliquefaciens) 、バシラス・サチリス (B. subtilis) またはバシラス・ステアロサーモフィラス (B. stearothermophilus) の菌株に由来するが、他のバシラス (Bacillus) 種に由来することができる。
特別に考えられるハイブリッドα-アミラーゼは、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) α-アミラーゼの445 C末端のアミノ酸残基 (WO 99/19467中の配列番号4として示す) およびバシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) に由来するα-アミラーゼの37 N-末端のアミノ酸残基 (WO 99/19467中の配列番号3として示す) を含んでなり、下記の置換の1または2以上、特にすべてを有する:
G48A + T49I + G107A + H156Y + A181T + N190F + I201F + A209V + Q254S (バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) のナンバリングを使用する)
真菌α-アミラーゼは、アスペルギルス (Aspergillus) 属の菌株、例えば、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、アスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) α-アミラーゼに由来する酸性α-アミラーゼを包含する。
好ましい態様において、真菌酸性α-アミラーゼはハイブリッドα-アミラーゼである。真菌ハイブリッドα-アミラーゼの好ましい例は、 WO 2005/003311または米国特許公開No. 2005/0054071 (Novozymes) または米国特許出願No. 60/638,614 (Novozymes) (引用することによって本明細書の一部とされる) に開示されているハイブリッドα-アミラーゼである。ハイブリッドα-アミラーゼは、触媒ドメイン (CD) および炭水化物結合性ドメイン/モジュール (CBM) および任意のリンカーを含んでなる。
α-アミラーゼを含んでなる好ましい商用組成物は下記を包含する: DSM (Gist-Brocades) からのMYCOLASE、BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM XおよびSANTM SUPER、SANTM EXTRA L (Novozymes A/S) およびCLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETM FRED、SPEZYMTM DELTA AA (Genecor Int.) 、および商品名SP288で販売されている酸性真菌α-アミラーゼ (入手先: Novozymes A/S、デンマーク) 。
酸性α-アミラーゼは、本発明によれば、0.1〜10 AFAU/g DS、好ましくは0.10〜5 AFAU/g DS、特に0.3〜2 AFAU/g DSの量で添加することができる。
本発明は、また、デンプン含有物質からシロップ、例えば、グルコースおよびその他を製造するためにグルコアミラーゼを使用するプロセスを提供する。適当な出発物質は上記節 「デンプン含有物質」 において例示されている。一般に、このプロセスはα-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を部分的に加水分解 (液化) し、次いで本発明のグルコアミラーゼの存在下にさらに糖化して、デンプンまたは関係するオリゴ糖および多糖の非還元性末端からグルコースの解放する工程を含んでなる。
本発明のグルコアミラーゼは、また、固定化された形態で使用することができる。これは特別のシロップ、例えば、マルトースシロップの製造およびさらにフルクトースシロップ、例えば、高フルクトースシロップ (HFS) の製造と関係するオリゴ糖のラフィネート流ために適当でありかつしばしば使用される。
(a) α-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を液化し、そして
(b) 工程 (a) において得られた物質を本発明のグルコアミラーゼで糖化する。
シロップは工程 (b) において得られた糖化された物質から回収することができる。
適当な条件の詳細な説明は前述されている。
本発明のグルコアミラーゼは、また、醸造プロセスにおいて使用することができる。本発明のグルコアミラーゼは、当業者が容易に決定できる量で添加できる。例えば、「低炭水化物」 または超希薄ビールの製造において、より高い比率のアルコールおよび少量の残留デキストリンが望ましい。これらのビールは、限界デキストリンを脱分枝できる酵素添加物を含んでなる外因的酵素組成物を使用して配合される。本発明のグルコアミラーゼ、好ましくはトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) を適用して、限界デキストリンの含有量を減少し、そしてα-1,4-結合を加水分解することができる。
種々の参考文献は本明細書中に引用され、それらの開示は引用することによって本明細書の一部とされる。下記の実施例により本発明をさらに説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
グルコアミラーゼ:
* 配列番号2に開示するトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) に由来するグルコアミラーゼ (入手先: Novozymes A/S) 。
* 配列番号5に開示するパチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) に由来するグルコアミラーゼ (入手先: Novozymes A/S) 。
* 配列番号24に開示するレウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) に由来するグルコアミラーゼ (入手先: Novozymes A/S) 。
* Boel 他 (1984) 、EMBO J. 3 (5) p. 1097-1102に開示されているアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) に由来するグルコアミラーゼ (入手先: Novozymes A/S) 。
* WO 99/28448に開示されているタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) に由来するグルコアミラーゼ (入手先: Novozymes A/S) 。
ハイブリッドα-アミラーゼA: 米国特許出願第60/638,614号および本明細書において配列番号29に開示されている、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBDをもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼ。
Red StarTM (入手先: Red Star/lesaffre、米国) 。
- 大腸菌 (E. coli) DH12α (GIBCO BRL、Life Technologies、米国) 。
- アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) IFO 4177 (入手先: Institute for Fermentation、大阪 (IFO) 、Culture Collection of Microorgansims、日本国〒532-8686 大阪府大阪市淀川区十三本町2丁目17-85。
- アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) BECh-2はWO 2000/39322 (Novozymes) に記載されている。それはIFP 4177の突然変異体であるJaL228 (WO 98/12300に記載されている) の突然変異体である。
- アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 菌株Mbin 119はWO 2004/090155 (実施例11参照) 。
他の材料
プルラン (入手先: Wako Pure Chemical、日本国) 。
下記の生物学的物質は、ブダペスト条約に関してDSMZ (Deutsge Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturenn GmbH、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweig DE) に2005年2月2日に寄託され、そして下記の受け入れ番号が与えられた。
緩衝剤および基質として使用する化学物質は少なくとも試薬等級の商品である。
PDA2: 39 g/lのジャガイモデキシトロース寒天、20 g/lの寒天、50 ml/lのグリセロール。
Cove: 342.3 g/lのスクロース、20 ml/lのCOVE塩溶液、10 mMのアセトアミド、30 g/lのノーブル寒天。
Cove塩溶液: g/lのKCl、26 g/lのMgSO4・7H2O、76 g/lのK2HPO4、50 ml/lのCove微量金属。
YPG: 4 g/lの酵母エキス、1 g/lのKH2PO4、0.5 g/lのMgSO4・7H2O、5 g/lのグルコース、pH 8.0。
STC: 0.8 Mのソルビトール、2 mMのTris pH 8、25 mMのCaCl2。
STPC: STC 緩衝液中の40%のPEG 4000。
MS-9: 30 g/lの大豆粉末、20 g/lのグリセロール、pH 8.0。
MDU-pH 5: 45 g/lのマルトース・1H2O、7 g/lの酵母エキス、12 g/lのK2HPO4、1 g/lのMgSO4・7H2O、2 g/lのK2SO4、0.5 ml/lのAMG微量金属溶液および25 g/lの2-メルカプタトエタンスルホン酸、pH 5.0。
特記しない限り、DNA操作および形質転換は下記の文献に記載されている分子生物学の標準方法に従い実行した: Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY; Ausubel F. M. (編者) “Current Protocols in Molecular Biology”、John Wiley and Sons、1995; Harwood C. R. およびCutting S. M. (編者) “Molecular Biological Methods for Bacillus”、John Wiley and Sons、1990。
グルコアミラーゼ活性はAGI単位またはグルコアミラーゼ単位 (AGU) で測定できる。
グルコアミラーゼ活性 (GA)
グルコアミラーゼ (アミログルコシダーゼに等しい) はデンプンをグルコースに転化する。グルコースの量は、本明細書において、活性測定のグルコースオキシダーゼ法により決定される。この方法は下記の文献に記載されている: 節76-11 Starch-Glucoamylase Method with Subsequent Measurement of Glucose with Glucose Oxidase in “Approved methds of the American Association of Cereal Chemists”、Vol. 1-2 AACC、American Association of Cereal Chemists (2000); ISBN: 1-891127-8。
1グルコアミラーゼ単位 (AGI) は、この方法の標準条件下に1μM/分のグルコースを生成する酵素の量である。
基質: デンプン、濃度ほぼ16 gの乾燥物質/l
緩衝剤: 酢酸塩、ほぼ0.04 M、pH 4.3
pH: 4.3
インキュベーション温度: 60℃
反応時間: 15分
反応の停止 ほぼ0.2 g/l (pH約9) 濃度へのNaOH
酵素濃度: 0.15〜0.55 AA U/ml
ノボグルコアミラーゼ単位 (Novo Glucoamylase Unit) (AGU) は、下記の標準条件下に1μM/分のマルトースを加水分解する酵素の量である: 37℃、pH 4.3、基質: マルトース 23.2 mM、緩衝剤: 酢酸塩 0.1 M、反応時間: 5分。
自動分析装置を使用することができる。存在するα-D-グルコースがβ-D-グルコースに転化されるように、ムタロターゼをグルコースデヒドロゲナーゼ試薬に添加する。グルコースデヒドロゲナーゼは前述の反応においてβ-D-グルコースと特異的に反応してNADHを生成し、これは340 nmにおいて測光計を使用してもとのグルコース濃度の測度として測定される。
基質: マルトース 23.2 mM
緩衝剤: 酢酸塩 0.1 M
pH: 4.30±0.05
インキュベーション温度: 37℃±1
反応時間: 5分
酵素使用範囲: 0.5〜4.0 AGU/ml
GlucDH: 430 U/l
ムタロターゼ: 9 U/l
NAD: 0.21 mM
緩衝液: リン酸塩 0.12 M;
0.15 M NaCl
pH: 7.60±0.05
インキュベーション温度: 37℃±1
反応時間: 5分
波長: 340 nm
α-アミラーゼ活性は、基質としてジャガイモデンプンを使用して決定することができる。この方法は酵素による変性されたジャガイモデンプンの破壊に基づき、次いでこの反応においてデンプン/酵素溶液をヨウ素溶液と混合する。最初に、黒みがかった青色が発生するが、デンプンの破壊間に、青色は薄くなり、徐々に赤みがかった褐色になり、これを着色したガラス標準と比較する。
この分析法をいっそう詳しく記載するフォルダー(EB-SM-0009.02/01) は、ノボザイムA/S (Novozymes A/S、デンマーク) に対する要求に応じて入手可能であり、引用することによって本明細書の一部とされる。
本発明に従い使用するとき、任意の酸性α-アミラーゼの活性はAFAU (酸性真菌α-アミラーゼ単位) で測定できる。選択的に、酸性α-アミラーゼの活性はAAU (酸性α-アミラーゼ単位) で測定できる。
酸性α-アミラーゼの活性はAAU (酸性α-アミラーゼ単位) で測定でき、これは絶対的方法である。1酸性アミラーゼ単位 (AAU) は標準条件下に1 g/時間のデンプン (100%の乾燥物質) を、色参照の1つに等しい既知強度のヨウ素溶液との反応後、620 nmにおける透過率を有する生成物に転化する酵素の量である。
基質: 可溶性デンプン、濃度ほぼ20 g DS/l
緩衝剤: クエン酸塩、ほぼ0.13 M、pH 4.2
ヨウ素溶液: 40.176gのヨウ化カリウム+0.088 gヨウ素/l
都市水: 15〜20°dH (ドイツ硬度)
pH: 4.2
インキュベーション温度: 30℃
反応時間: 11分
波長: 620 nm
酵素濃度: 0.13〜0.19 AA U/ml
酵素作用範囲: 0.13〜0.19 AA U/ml
酸性α-アミラーゼの活性は、酵素標準に関して決定されるAFAU (酸性真菌α-アミラーゼ単位) で測定することができる。1 AFAUは後述する標準条件下に1時間当たり5.260 mgのデンプン乾燥固体を分解する酵素の量として定義される。
酸性α-アミラーゼ、すなわち、エンド-α-アミラーゼ (1,4-α-D-グルカン-グルカノヒドロラーゼ、EC 3.2.1.1) は、デンプン分子の内側領域中のα-1,4-グリコシド結合を加水分解して、異なる鎖長をもつデキストリンおよびオリゴ糖を形成する。ヨウ素で生成される色強度はデンプン濃度に対して直接比例する。アミラーゼ活性は、特定した分析条件下におけるデンプン濃度の減少として、逆比色分析を使用して決定される。
基質: デンプン、ほぼ0.17 g/l
緩衝剤: クエン酸塩、ほぼ0.03 M
ヨウ素 (I2): 0.03 g/l
CaCl2: 1.85 mM
pH: 2.50±0.05
インキュベーション温度: 40℃
反応時間: 23秒
波長: 590 nm
酵素濃度: 0.025 AFAU/ml
酵素作用範囲: 0.01〜0.04 AFAU/ml
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) をPDA2培地上で増殖させ、製造業者の使用説明書に従いキット (FastDNA SPIN for SOIL、Obiogen、米国) を使用して、0.2 gの菌糸体からゲノムDNAを単離した。
縮重プライマーArAF1およびArAF3を使用して、ゲノムDNAに対してPCR反応を実施した:
ArAF1: 5’-CRTRCTYDVCAACATYGG-3’ (配列番号7)
ArAF3: 5’-GTCAGARCADGGYTGRRASGTG-3’ (配列番号8)
ここでD=AまたはGまたはT; R=AまたはG; S=CまたはG; V=AまたはCまたはG; Y=CまたはT。
パチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) をPDA2培地上で増殖させ、製造業者の使用説明書に従いキット (FastDNA SPIN Kit for SOIL、Qbiogen、米国) を使用して、0.2 gの菌糸体からゲノムDNAを単離した。
縮重プライマーAM2FおよびAM4R2を使用して、ゲノムDNAに対してPCR反応 (PCR 1) を実施した:
AM2F: 5’-TGGGGIMGNCCNCARMGNGAYGG-3’ (配列番号9)
AM4R2: 5’-RTCYTCNGGRTANCKNCC-3’ (配列番号10)
ここでI=イノシン; K=GまたはT; M=AまたはC; N=AまたはCまたはGまたはT; R=AまたはG; Y=CまたはT。
AM3F: 5’-TAYGAYYTNYGGGARGA-3’ (配列番号11)
AM4R2: 5’-RTCYTCNGGRTANCKNCC-3’ (配列番号10)
ここでK=GまたはT; N=AまたはCまたはGまたはT; R=AまたはG; Y=CまたはT。
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼの部分的配列から、ベクトレッテキット (Vectorette Kit) (SIGMA-Genosys) によりPCRに基づく遺伝子歩行を使用して、さらに遺伝子配列を得た。遺伝子歩行は基本的には製造業者のプロトコルに記載されているようにして実施した。トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) の0.15 μgのゲノムDNAを独立してEcoRI、BamHIおよびHindIIIで消化した。
TraF1: 5’-TAGTCGTACTGGAACCCCACC-3’ (配列番号12)
HindIII消化ゲノムDNAからのPCR反応により、0.5 kbの増幅されたPCRバンドが得られた。TBE緩衝液を使用して1.0%のアガロースゲル上に反応生成物を単離し、このゲルから切除した。100 μlの無菌水を切除したアガロースゲルフラグメントに添加し、それを95℃における5分間のインキュベーションにより融解してDNAを解放した。リンカー結合ゲノムDNAの代わりに0.5 μlの単離したDNAフラグメントを使用して、前述のPCR反応を反復することによって、DNAバンドを再増幅した。
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) からのグルコアミラーゼ遺伝子のミッシング部分をクローニングするために、クローニングキット (LA PCRTM in vitro Cloning Kit、TAKARA、日本国) を製造業者の使用説明書に従い使用して、PCRに基づく遺伝子歩行を実施した。
C1: 5’-gtacatattgtcgttagaacgcgtaatacgactca-3’ (配列番号13)
TC5’: 5’-cgtatatgtcagcgctaccatgt-3’ (配列番号14)
TC3’: 5’-aaacgtgagcgaccattttctgt-3’ (配列番号15)
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) からのグルコアミラーゼ遺伝子を転写するために、発現ベクターpHUda440を構築した。テンプレートとしてトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) のゲノムDNAを使用するPCR反応をPCRシステム (ExpandTM PCR system) (Roche Diagnostics、日本国) により実行して、下記に示すように、プライマーTFFを使用してBamHI部位を導入し、そしてプライマーTFRを使用してXhoIを導入した。
TFF: 5’-tttggatccaccatgcgtttcacgctcctcacctcc-3’ (配列番号16)
TFR: 5’-tttctcgagctaccgccaggtgtcattctg-3’ (配列番号17)
パチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) からのグルコアミラーゼ遺伝子のミッシング部分をクローニングするために、クローニングキット (LA PCRTM in vitro Cloning Kit) (TAKARA、日本国) を製造業者の使用説明書に従い使用して、PCRに基づく遺伝子歩行を実施した。
C1: 5’-gtacatattgtcgttagaacgcgtaatacgactca-3’ (配列番号13)
PP5’: 5’-cctccctgagtgagcgatgctgc-3’ (配列番号18)
PP3’: 5’-caactccggcctctcctccagcg-3’ (配列番号19)
パチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) からのグルコアミラーゼ遺伝子を転写するために、発現ベクターpHUda450を構築した。テンプレートとしてパチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) のゲノムDNAを使用するPCR反応を、PCRシステム (ExpandTM PCR system) (Roche Diagnostics、日本国) により実行して、下記に示すように、プライマーPPFを使用してBamHI部位を導入し、そしてプライマーPPRを使用してXhoI部位を導入した。
PPF: 5’-tttggatccaccatgcgcttcaccctcctctcctcc-3’ (配列番号20)
PPR: 5’-tttctcgagtcaccgccaggtgtcgttctg-3’ (配列番号21)
アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 菌株BECn-2を100 mlのYPG培地に接種し、32℃、80 rpmにおいて16時間インキュベートした。ペレットを収集し、0.6 MのKClで洗浄し、20 mlの商用β-グルカナーゼ生成物 (GULCANEXTM、Novozymes A/S、デンマーク、バグスバード) を含有する0.6 MのKCl中に600 μl/mlの最終濃度で再懸濁させた。この懸濁液を32℃、80 rpmにおいて、プロトプラストが形成されるまで、インキュベートし、次いでSTS緩衝液で2回洗浄した。
発生するグルコースとのグルコースデヒドロゲナーゼおよびムタロターゼの反応により、上清試料中のグルコアミラーゼ活性をNADH産生の増加として決定し、340 nmにおける吸収を測定した。6 μlの100 mMの酢酸ナトリウムpH 4.3緩衝液中に溶解した酵素試料を、31 μlの100 mMの酢酸ナトリウムpH 4.3緩衝液中の23.2 mMのマルトースと混合し、37℃において5分間インキュベートした。次いで、313 μlの色試薬 (0.12 Mのリン酸塩pH 7.6緩衝液中の430 U/lのグルコースデヒドロゲナーゼ、9 U/lのムタロターゼ、0.21 mMのNADおよび0.15 MのNaCl) を反応混合物に添加し、37℃において5分間インキュベートした。活性を340 nmにおいて分光光度計で測定した。対照として6 μlの蒸留水を酵素試料の代わりに使用した。
アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼおよびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼに対するトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) の相対的性能を小規模発酵を介して評価した。約380 gの微粉砕したトウモロコシ (パイロット規模のハンマーミル中で微粉砕して1.65 mmの篩に通した) を約620 gの水道水に添加した。この混合物に3 mlの1 g/lのペニシリンを補充した。このスラリーを40%のH2SO4でpH 5.0に調節した。乾燥固形分 (DS) レベルは三重反復実験において約32%であることが決定された。ほぼ5 gのこのスラリーを15 mlの管に添加した。
投与後、トウモロコシマッシュ上で22.5時間増殖させた酵母増殖細胞 (RED STARTM酵母) の0.04 ml/gのマッシュを管に接種した。管に上部に小さい針で穴あけして気体の放出を可能とした蓋をし、短時間攪拌した後、秤量し、32℃においてインキュベートした。70時間の発酵を実施し、管を秤量することによって、エタノール収量を決定した。管を短時間攪拌した後、秤量した。この実験の結果を表5に示す。
アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼおよびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼに対するパチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) の相対的性能を小規模発酵を介して評価した。約380 gの微粉砕したトウモロコシ (パイロット規模のハンマーミル中で微粉砕して1.65 mmの篩に通した) を約620 gの水道水に添加した。この混合物に3 mlの1 g/lのペニシリンを補充した。このスラリーを40%のH2SO4でpH 5.0に調節した。乾燥固形分 (DS) レベルは三重反復実験において約32%であることが決定された。ほぼ5 gのこのスラリーを15 mlの管に添加した。
投与後、トウモロコシマッシュ上で22.5時間増殖させた酵母増殖細胞 (RED STARTM酵母) の0.04 ml/gのマッシュを管に接種した。管に上部に小さい針で穴あけして気体の放出を可能とした蓋をし、短時間攪拌した後、秤量し、32℃においてインキュベートした。70時間の発酵を実施し、管を秤量することによって、エタノール収量を決定した。管を短時間攪拌した後、秤量した。この実験の結果を表6に示す。
小規模発酵を介して、すべての処理を評価した。410 gの粉砕トウモロコシを590 gの水に添加した。この混合物に3.0 mlの1 g/lのペニシリンおよび1 gの尿素を補充した。このスラリーを5 N NaOHでpH 4.5に調節した (調節前の初期のpHは約3.8であった) 。乾燥固形分 (DS) レベルは約35%であることが決定された。ほぼ5 gのこのスラリーを20 mlのバイアルに添加した。各バイアルに適当量の酵素を投与し、次いで200 μlの酵母増殖細胞/5 gの発酵物を添加した。
α-アミラーゼおよびグルコアミラーゼの相乗効果が下記表において表されている。トラメテス・シングラタ (T. cingulata) グルコアミラーゼを単独で1工程発酵において使用したとき、それはそれぞれ24、48および70時間の発酵後に54.1、81.2および99.0 g/lのエタノールを生産した。リゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) からのハイブリッドα-アミラーゼAを発酵において使用したとき、それはそれぞれ24、48および70時間の発酵後に90.5、124.6および138.1 g/lのエタノールを生産した。
キット (AastDNA SPIN Kit for Soil) (Qbiogen、米国) を製造業者の使用説明書に従い使用して、レウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) の新鮮な果実本体の胞子形成層の0.2〜2 gをゲノムDNA抽出に使用した。
縮重プライマーArAF1およびArAF3を使用して、ゲノムDNAに対してPCR反応を実施した:
ArAF1 5’-CRTRCTYDVCAACATYGG-3’ (配列番号7)
ArAF3 5’-GTCAGARCADGGYTGRRASGTG-3’ (配列番号8)
ここでD=AまたはGまたはT; R=AまたはG; S=CまたはG; V=AまたはCまたはG; Y=CまたはT。
Nc1R2: 5’-GGTAGACTAGTTACCTCGTTGG-3’ (配列番号31)
Nc1F0: 5’-GCTTCCCTAGCCACTGCCATTGG-3’ (配列番号32)
プライマーNc1R2で増幅したHindIII消化ゲノムDNAからのPCR反応により、1.7 kbの増幅されたPCRバンドが得られた。このプライマーを使用するPCR生成物の配列決定は、それがグルコアミラーゼ遺伝子の残りの600塩基対を5’方向にコードすることを示した。
Nc1R2: 5’-GTTGATTTAACTTGGAGCTATGC (配列番号33)
レウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) グルコアミラーゼの部分的配列から、遺伝子配列がさらに得られた。
下記のPCRクローニングプライマーを使用した:
前方向プライマー:
5’-TCCCTTGGATCCAGGATGCATTTCTCTGTCCTCTC-3’ (配列番号34) BamHI
逆方向プライマー:
5’-CTTATCCTCGAGCTACTTCCACGAGTCATTCTGG-3’ (配列番号35) XhoI
アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 菌株Mbin119 (WO 2004/090155参照) のプロトプラストを作った。約5 μgのpENI3372をプロトプラスト中に形質転換した。生ずるアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 形質転換細胞をグルコアミラーゼ活性について試験した。
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) 、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) 、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) およびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) に由来するグルコアミラーゼのα-1,6-脱分枝活性を研究した。
試験の結果は図1に示される。
種々の参考文献は本明細書中に引用され、それらの開示は引用することによって本明細書の一部とされる。
Claims (74)
- 下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド:
(a)配列番号2の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド; または
(a1)配列番号37の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜561のアミノ酸に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド; または
(b)少なくとも高いストリンジェンシイの条件下に配列番号1のヌクレオチド55〜2166の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列(i)または少なくとも高いストリンジェンシイ条件下に配列番号3のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列(ii)によりコードされるポリペプチド; および
(b1)少なくとも高いストリンジェンシイの条件下に配列番号36のヌクレオチド55〜2166の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列(i)または少なくとも高いストリンジェンシイ条件下に配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列(ii)によりコードされるポリペプチド; および
(c)配列番号2のアミノ酸1〜556の1〜10個のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1)配列番号37のアミノ酸1〜561の1〜10個のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。 - 配列番号2のアミノ酸1〜556若しくは配列番号37のアミノ酸1〜561に相当する成熟部分、またはそのフラグメントであって配列番号2のアミノ酸1〜455若しくは配列番号37のアミノ酸1〜460に相当する触媒領域を含みグルコアミラーゼ活性を有するものから成る請求項1に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸1〜556または配列番号37のアミノ酸1〜561の1〜10個のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号2中のアミノ酸1〜455または配列番号37のアミノ酸1〜460の触媒領域を含んでなる、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に位置する結合性ドメインを含んでなる、請求項1に記載のポリペプチド。
- 大腸菌 (E. coli) DSM 17106中に収容されているプラスミドpHUda595中に含有されるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項1に記載のポリペプチド。
- 下記から成る群から選択される、炭水化物結合性アフィニティーを有するポリペプチド:
(a)それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
(b)高いストリンジェンシイの条件下に、配列番号3のヌクレオチド1420〜1725相補鎖または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737の相補鎖であるポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド。 - 炭水化物結合性アフィニティーがデンプン結合性アフィニティーである、請求項7に記載のポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項7または8に記載のポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561を含んでなる、請求項7に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが、それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に比較してアミノ酸の1個〜5個の置換、欠失および/または挿入を有するアミノ酸を含んでなる人工変異型である、請求項7〜9のいずれかに記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが、それぞれ配列番号3中の位置1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737に示すポリヌクレオチド配列の炭水化物結合性ドメインコード部分によりコードされるアミノ酸配列に比較して、アミノ酸の1個〜5個の置換、欠失および/または挿入を有するアミノ酸配列を含んでなる人工変異型である、請求項7〜9のいずれかに記載のポリペプチド。
- 高いストリンジェンシイ条件下に、配列番号3のヌクレオチド1420〜1725の相補鎖または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737の相補鎖であるポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる、請求項7〜12のいずれかに記載のポリペプチド。
- 請求項1及び3〜5のいずれか1項に記載のポリペプチドから成るグルコアミラーゼ活性を有するハイブリッドポリペプチドにおいて、配列番号2のアミノ酸456〜465又は配列番号37の461〜470に相当する配列が配列番号22に示すリンカーで置換されていることを特徴とするハイブリッドポリペプチド。
- 請求項1〜14のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
- 発現宿主におけるポリペプチドの産生を指令する1または2以上の制御配列に作用可能に連結された請求項15に記載のポリペプチドを含んでなる核酸構築物。
- 請求項16に記載の核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクター。
- 請求項16に記載の核酸構築物または請求項17に記載の組換え発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
- 下記の工程を含んでなる請求項1〜14のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法:
(a)ポリペプチドの産生を促進する条件下に、野生型の形態においてポリペプチドを産生することができる細胞を培養し、そして
(b)ポリペプチドを回収する。 - 下記の工程を含んでなる請求項1〜14のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法:
(a)ポリペプチドの産生を促進する条件下に、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物を含んでなる宿主細胞を培養し、そして
(b)ポリペプチドを回収する。 - 下記から成る群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(a)配列番号2の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;若しくは
(a1)配列番号37の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜561のアミノ酸に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(b)配列番号1のヌクレオチド55〜2166に対して少なくとも90%の同一性を有するポリヌクレオチド;若しくは
(b1)配列番号36のヌクレオチド55〜2166に対して少なくとも90%の同一性を有するポリヌクレオチド;または
(c)配列番号3のヌクレオチド55〜1725に対して少なくとも90%の同一性を有するポリヌクレオチド;若しくは
(c1)配列番号38のヌクレオチド55〜1737に対して少なくとも90%の同一性を有するポリヌクレオチド;または
(d)少なくとも高いストリンジェンシイの条件下に配列番号1のヌクレオチド55〜2166の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列(i)、若しくは少なくとも高いストリンジェンシイ条件下に配列番号3のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列(ii);若しくは
(d1)少なくとも高いストリンジェンシイの条件下に配列番号36のヌクレオチド55〜2166の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列(i)、若しくは少なくとも高いストリンジェンシイ条件下に配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列(ii)。 - 下記の工程を含んでなるデンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法:
(a)α-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を液化し、
(b)上記工程(a)において得られた液化物質を請求項1〜14のいずれかに記載のグルコアミラーゼで糖化し、そして
(c)発酵生物により糖化物質を発酵させる。 - 発酵後、発酵生成物を回収する、請求項22に記載の方法。
- 前記工程(a)および(c)を順次にまたは同時に(すなわち、SSFプロセス)実施する、請求項22又は23に記載の方法。
- 前記発酵生成物がエタノールである、請求項22〜24のいずれかに記載の方法。
- 前記デンプン含有出発物質が全穀粒である、請求項22〜25のいずれかに記載の方法。
- 前記発酵生物がサッカロマイセス(Saccharomyces)の菌株である、請求項22〜26のいずれかに記載の方法。
- 工程(a)の前に、下記の工程をさらに含んでなる、請求項22〜27のいずれかに記載の方法:
x)前記デンプン含有物質の粒度を減少させ、そして
y)当該デンプン含有物質および水を含んでなるスラリーを形成する。 - 前記スラリーを糊化温度より上に加熱する、請求項28に記載の方法。
- スラリーを95〜140℃の温度において1〜15分間煮沸する、請求項29に記載の方法。
- 下記の工程を含んでなるデンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法:
(a)i)請求項1〜14のいずれかに記載のグルコアミラーゼ、および/または
ii)配列番号2中のアミノ酸1〜556若しくは配列番号37中のアミノ酸1〜561として示す配列を有するグルコアミラーゼまたは前記配列に対して少なくとも90%の同一性を有するグルコアミラーゼ、
によりデンプン含有物質の初期糊化温度より低い温度においてデンプン含有物質を糖化し、そして
(b)発酵生物を使用して発酵させる。 - 前記の方法を1〜250時間の間実施する、請求項31に記載の方法。
- 前記方法をpH 3〜7において実施する、請求項31又は32に記載の方法。
- 乾燥固形分(DS)が20〜55重量%の範囲内である、請求項31〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 糖濃度が糖化および発酵の間において6重量%より低いレベルに保持される、請求項31〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)前に水およびデンプン含有物質を含んでなるスラリーを調製する、請求項31〜35のいずれか1項に記載の方法。
- デンプン含有物質の粒度を0.1〜0.5 mmの粒度に減少することによって、デンプン含有物質を調製する、請求項31〜36のいずれか1項に記載の方法。
- デンプン含有物質の粒度の減少を微粉砕により実施する、請求項31〜37のいずれか1項に記載の方法。
- デンプン含有物質が粒状デンプンである、請求項31〜38のいずれか1項に記載の方法。
- デンプン含有物質が全穀粒である、請求項31〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 糖化および発酵を同時に実施する、請求項31〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 同時の糖化および発酵または工程(b)における発酵の間の温度が28℃〜36℃である、請求項41に記載の方法。
- グルコアミラーゼが0.001〜10 AGU/g DSの量で存在する、請求項31〜42のいずれか1項に記載の方法。
- α-アミラーゼが存在する、請求項31〜43のいずれか1項に記載の方法。
- α-アミラーゼが真菌α-アミラーゼでありる、請求項44に記載の方法。
- 真菌α-アミラーゼがα-アミラーゼの触媒ドメイン(CD)および炭水化物結合性モジュール/ドメイン(CBM)および必要に応じてリンカーまたは野生型真菌酸性α-アミラーゼ触媒ドメイン(CD)および炭水化物結合性モジュール(CBM)および必要に応じてリンカーを含んでなるハイブリッド酵素である、請求項45に記載の方法。
- アテリア・ロルフシイ(Athelia rolfsii)AMGリンカーおよびSBD(配列番号29)をもつリゾムコル・プシルス(Rhizomucor pusillus)α-アミラーゼ、アテリア・ロルフシイ(Athelia rolfsii)グルコアミラーゼリンカーおよびSBD(配列番号30)をもつメリピルス・ギアンテウス(Meripilus giganteus)α-アミラーゼから成る群から選択される、請求項46に記載の方法。
- ハイブリッドα-アミラーゼがアスペルギルス・カワチイ(Aspergillus kawachii)リンカーおよびデンプン結合性ドメイン(SBD)をもつアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)α-アミラーゼである、請求項46に記載の方法。
- α-アミラーゼが0.01〜10 AFAU/g DSの量で存在する、請求項44〜48のいずれか1項に記載の方法。
- α-アミラーゼおよびグルコアミラーゼを0.1〜10 AGU/AFAUの比で添加する、請求項44〜49のいずれかに記載の方法。
- 他のグルコアミラーゼをまた添加する、請求項31〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記他のグルコアミラーゼが、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼ、アテリア・ロルフシイ(Athelia rolfsii)グルコアミラーゼおよびタラロマイセス・エメルソニイ(Talaromyces emersonii)グルコアミラーゼまたはそれらの混合物から成る群から選択される、請求項51に記載の方法。
- 発酵生成物を発酵後に回収する、請求項31〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 発酵生成物がアルコールである、請求項31〜53のいずれか1項に記載の方法。
- デンプン含有物質が塊茎、根、幹、果実、種子または全穀粒から得られる、請求項31〜54のいずれか1項に記載の方法。
- デンプン含有物質がトウモロコシ、穂軸、コムギ、オオムギ、ライムギ、マイロ、サゴヤシ、カッサバ(cassava)、カッサバ(manioc)、タピオカ、モロコシ、イネまたはジャガイモから得られる、請求項31〜55のいずれか1項に記載の方法。
- デンプン含有物質が粒状デンプンである、請求項31〜56のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)における糖化の間の温度が30℃〜75℃である、請求項31〜57のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)または(b)を順次にまたは同時に(すなわち、1工程発酵)実施する、請求項31〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 下記の工程を含んでなる、デンプン含有物質からシロップを製造する方法:
(a)α-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を液化し、そして
(b)前記工程(a)において得られた物質を請求項1〜14のいずれか1項に記載のグルコアミラーゼで糖化する。 - シロップの精製、転化および/または回収をさらに含んでなる、請求項60に記載の方法。
- シロップおよび/または発酵生成物を製造するための請求項1〜14のいずれか1項に記載のグルコアミラーゼの使用。
- 出発物質が糊化または非糊化デンプン含有物質である、請求項62に記載の使用。
- 醸造のための請求項1〜14のいずれか1項に記載のグルコアミラーゼの使用。
- 請求項1〜14のいずれかに記載のグルコアミラーゼを含んでなる組成物。
- α-アミラーゼをさらに含んでなる、請求項65に記載の組成物。
- 前記α-アミラーゼが酸性α-アミラーゼである、請求項66に記載の組成物。
- 前記α-アミラーゼが真菌由来である、請求項66又は67に記載の組成物。
- 前記α-アミラーゼが、アスペルギルス(Aspergillus)属、リゾムコル(Rhizomucor)属、またはメリピルス(Meripilus)属の菌株に由来する、請求項66〜68のいずれか1項に記載の組成物。
- α-アミラーゼがハイブリッドα-アミラーゼである、請求項66〜69のいずれか1項に記載の組成物。
- 他のグルコアミラーゼをさらに含んでなる、請求項65〜70のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記グルコアミラーゼが、アスペルギルス(Aspergillus)属、アテリア(Athelia)属、タラロマイセス(Talaromyces)属、リゾプス(Rhizopus)属、またはフミコラ(Humicola)属の菌株に由来する、請求項71に記載の組成物。
- トラメテス・シングラタ(Trametes cingulata)グルコアミラーゼに由来するグルコアミラーゼ、アテリア・ロルフシイ(Athelia rolfsii)AMGリンカーおよびSBDをもつリゾムコル・プシルス(Rhizomucor pusillus)α-アミラーゼに由来するα-アミラーゼおよびタラロマイセス・エメルソニイ(Talaromyces emersonii)に由来するグルコアミラーゼを含んでなる、請求項71または72に記載の組成物。
- トラメテス・シングラタ(Trametes cingulata)に由来するグルコアミラーゼ、アテリア・ロルフシイ(Athelia rolfsii)AMGリンカーおよびSBDをもつリゾムコル・プシルス(Rhizomucor pusillus)α-アミラーゼに由来するα-アミラーゼおよびアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)に由来するグルコアミラーゼを含んでなる、請求項71または72に記載の組成物。
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