CN103275952B - 一种中温酸性淀粉酶amy-8及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中温酸性淀粉酶AMY-8及其基因和应用。本发明提供了一种来源于红冬孢酵母菌Rhodosporidium sp.S8的淀粉酶AMY-8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述淀粉酶的编码基因amy-8。本发明的淀粉酶的具有以下性质：最适pH4.5，最适温度55℃，比活为128.6U/mg，具有较好的稳定性。做为一种新型的酶制剂，有效与糖化酶协同作用利用淀粉双酶法制取葡萄糖，可广泛用于饲料、食品、轻工、能源行业等。

Description

一种中温酸性淀粉酶AMY-8及其基因和应用

技术领域

发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中温酸性淀粉酶AMY-8及其基因和应用。

背景技术

淀粉是一类由α-D-葡萄糖依靠α-1,6糖苷键与α-1,4糖苷键的连接而组成的葡萄糖的高聚体。是植物储藏碳水化合物的一种重要形式，主要位于植物的块茎和种子中，除了直接作为食品原料外，还是多种工业的主要或重要原料。淀粉酶是可以水解淀粉的一类酶的总称，广泛存在于植物和微生物中。根据淀粉降解酶的作用方式主要分为三类：外切淀粉酶、内切淀粉酶和分支淀粉酶。

对淀粉酶的研究已有半个世纪，主要研究集中在适合于麦芽糖浆、食品烘培、纺织退浆工业等方面的淀粉酶，已经从不同来源的植物与微生物中分离到大量的不同类型不同功能的淀粉酶，并分离出多种淀粉酶基因，现已工业化生产多种淀粉酶产品。近年来，中温酸性淀粉酶已经引起研究人员的广泛关注，在发酵工业中，使用中温酸性淀粉酶最大优势是可以使淀粉液化和糖化在同一个pH条件下进行，将简化淀粉的加工工艺，节约试剂的消耗，降低产品的加工成本。另外，在麦芽糖生产行业，耐酸性淀粉酶可以在较低pH条件下(pH5.0)液化淀粉，减少副产物异麦芽糖的生成。在食品烘培加工行业，中温酸性淀粉酶的使用可将部分淀粉水解成糊精和可发酵糖，这些物质可以作为面包红冬孢酵母发酵的底物，在被利用的过程中，改善面团发酵效果，增加面团体积，改善表皮颜色和松脆结构，防止腐败。纺织工业中，采用中温淀粉酶实现退浆，可以避免在传统碱法处理过程中出现的损伤织物带来污染的缺陷，而且还能够缩短工艺流程，改善劳动条件，降低能耗。在动物饲料行业，添加耐酸性的淀粉酶更有利于在动物胃肠的酸性环境中发挥水解作用，有助于营养物质的吸收。

目前商业化的淀粉酶为高温中性(pH6.0～7.0)，而糖化酶多为中温（50～60℃）酸性（pH4.5），在生淀粉降解过程中需要而步法处理，进行温度和pH的调整，处理步骤繁琐，增加了生产成本。本发明中，来源于红冬孢酵母菌Rhodosporidium sp.S8的淀粉酶AMY-8最适pH4.5,在pH3.5下仍具有30%的活性，并且在pH3～10具有良好的稳定性；最适温度55℃；并在毕赤红冬孢酵母表达系统高效分泌表达。其在中温酸性条件下具有高活力能有效与糖化酶协同作用一步法处理马铃薯淀粉生成葡萄糖，节约工艺流程，降低生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够应用的中温酸性淀粉酶。

本发明的再一目的是提供编码上述中温酸性淀粉酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述中温酸性淀粉酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述中温酸性淀粉酶的应用。

本发明提供了一种中温酸性淀粉酶AMY-8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1：

MRLFLRCLIAVLAATMAQPACGLSAAEWRQQSIYQVMTDRFARTDLSTTATCSTSAAIYCGGTYQGLIAKLDYIQGMGFTAIWISPVVAQMSGNTADGSSYHGYWAQDIYSLNPSFGTADDLLSLSVALHARGMYLMVDVVTNHFAYDGCGDCVDYSIFDPFNSSSFFHPFCLIDYNNQTSIEQCWEGDNIVSLPDLRTEASNVRAIWNKWITNLVAQYQIDGLRIDSVRNMETSFWAGFGSAAGVFMIGEVDDGDPTVLAPYQEYLPGVLDYASCYWITQAFQSSSGSISNLASGINTLKSIAIDTSLYGSFLENHDQPRFPSLTSDVAQAKNAIAFTMLKDGIPIVYQGQEQYYAGGAVPADREAIWLSGYPTSATLYSWIAALNEIRSTAIAQDSSYLTYQAWPVYTDGNNIAMRKGSDGYQVVGLFTNTGSSGSPSVTLTASMTGFTAGEAVVDVMSCTTFITNSDGSLRHADWDDDIYLRDEYVLPSYDFCLVVTDSSAASSSCTATAVATNPSTAARLTTSYGETVKLAGNVAALGNWDTDDAVSLSASQYTSSKPLWSGTVSLTPGTEVQYKFMQVDSSGAVTWEADPNHTYSVPCAAATVSSSWQS

其中，该酶基因编码614个氨基酸，N端22个氨基酸为信号肽序列“mrlflrcliavlaatmaqpacg”(SEQ ID NO.3)。

因此，成熟的中温中温酸性淀粉酶AMY-8的理论分子量为64.1kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

LSAAEWRQQSIYQVMTDRFARTDLSTTATCSTSAAIYCGGTYQGLIAKLDYIQGMGFTAIWISPVVAQMSGNTADGSSYHGYWAQDIYSLNPSFGTADDLLSLSVALHARGMYLMVDVVTNHFAYDGCGDCVDYSIFDPFNSSSFFHPFCLIDYNNQTSIEQCWEGDNIVSLPDLRTEASNVRAIWNKWITNLVAQYQIDGLRIDSVRNMETSFWAGFGSAAGVFMIGEVDDGDPTVLAPYQEYLPGVLDYASCYWITQAFQSSSGSISNLASGINTLKSIAIDTSLYGSFLENHDQPRFPSLTSDVAQAKNAIAFTMLKDGIPIVYQGQEQYYAGGAVPADREAIWLSGYPTSATLYSWIAALNEIRSTAIAQDSSYLTYQAWPVYTDGNNIAMRKGSDGYQVVGLFTNTGSSGSPSVTLTASMTGFTAGEAVVDVMSCTTFITNSDGSLRHADWDDDIYLRDEYVLPSYDFCLVVTDSSAASSSCTATAVATNPSTAARLTTSYGETVKLAGNVAALGNWDTDDAVSLSASQYTSSKPLWSGTVSLTPGTEVQYKFMQVDSSGAVTWEADPNHTYSVPCAAATVSSSWQS

本发明的淀粉酶AMY-8同时具有好的热稳定性并在中温下在酸性和中性的范围内均具有高活性等特性。本发明筛选到Rhodosporidiumsp.S8所产生的淀粉酶，其最适pH值为4.5，在pH4.0～5.0的范围内维持60%以上的酶活性；最适温度为55℃，在65℃仍具有40％左右的酶活力。

本发明提供了编码上述中温酸性淀粉酶基因amy-8。具体地，该基因的基因序列如SEQ ID NO.4所示：

atgcggctcttcttgcgctgtctcattgccgtgctggcggcaaccatggcccagcctgcctgcggtctcagcgcggcagaatggcgccagcagtccatctaccaggtcatgacggaccgcttcgcacggacggacctgtccaccacggccacgtgcagcacctccgcggcgatatactgcggcgggacataccagggcctcatcgcgaagctagactacatccagggcatgggcttcaccgcgatctggatatcgcccgtggttgcgcagatgagcggcaacactgccgacgggtcttcgtaccacggctactgggcgcaggacatctatagcctgaacccctcgtttggcaccgctgatgatctcctcagcctgtcggtcgcgctgcacgcgaggggtatgtacctcatggtcgacgtcgtgacgaaccacttcgcctacgacgggtgcggcgactgcgtcgactacagcatcttcgacccgttcaactcgtcgtcgttcttccaccccttctgtctgatcgactacaacaaccagacgtccatcgagcagtgctgggagggcgacaacatcgtcagcctaccggatttgaggacggaggccagcaatgtgcgggctatctggaataagtggattacgaacctggtggcgcagtaccagatcgacggcctgcgcatcgacagcgtcagaaacatggagacgtccttctgggcggggtttgggtccgccgcgggggtgttcatgatcggcgaggtagacgacggcgacccgacggtgctggccccctaccaggagtacctgccgggagtgctggactatgcgagctgctactggatcacgcaggccttccagtccagctctggcagcatcagcaatctggcctctggcatcaacacgctgaagagcattgcgatagacaccagcctgtacgggtcctttctagagaaccacgaccagccgcggttcccgtcgctcacttccgacgtcgcccaggccaagaacgcgatcgcgttcacgatgctgaaggacgggatcccgatcgtgtatcaaggccaagagcagtattatgccggaggagcggtgcccgccgaccgcgaggccatctggctgtcgggctacccgacgtccgcgacgctgtacagctggattgcggcgctaaacgagatccgctcgacggctattgcgcaggacagcagttatctgacctaccaggcgtggccggtgtacacggacggcaacaacatcgctatgcggaagggcagcgatgggtaccaggtggtcgggctgttcacgaacacgggatctagcgggtcgcctagcgtcactctcactgcgtcgatgaccgggttcacggctggcgaggcggtcgtggacgtcatgagctgcactacgttcatcacgaactcggatggcagcctccgccacgcagactgggacgatgacatctacctccgtgacgagtacgttttaccatcatacgacttttgtctcgttgtcactgacagttccgcagccagcagttcctgcaccgccaccgcggtagccactaacccttcgaccgcagctcggctgaccacctcttacggcgagacagtcaagctcgctggcaatgtcgcggccctaggcaattgggacacggacgacgcggtcagcctcagcgcatcgcagtacacgagcagcaagccgctgtggtcgggcaccgtctcgctgacccccggcaccgaggtgcagtacaagttcatgcaggtcgacagttcgggagccgtgacctgggaggcggacccgaaccacacgtactctgtgccgtgcgcggctgctactgttagcagtagttggcagagctga

本发明通过PCR的方法分离克隆了淀粉酶基因amy-8，cDNA全序列分析结果表明，淀粉酶AMY-8结构基因amy-8全长1845bp。其中，信号肽的碱基序列为：

ATGCGGCTCTTCTTGCGCTGTCTCATTGCCGTGCTGGCGGCAACCATGGCCCAGCCTGCCTGCGGT(SEQ ID NO.6)。

成熟的淀粉酶AMY-8的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ IDNO.5

ctcagcgcggcagaatggcgccagcagtccatctaccaggtcatgacggaccgcttcgcacggacggacctgtccaccacggccacgtgcagcacctccgcggcgatatactgcggcgggacataccagggcctcatcgcgaagctagactacatccagggcatgggcttcaccgcgatctggatatcgcccgtggttgcgcagatgagcggcaacactgccgacgggtcttcgtaccacggctactgggcgcaggacatctatagcctgaacccctcgtttggcaccgctgatgatctcctcagcctgtcggtcgcgctgcacgcgaggggtatgtacctcatggtcgacgtcgtgacgaaccacttcgcctacgacgggtgcggcgactgcgtcgactacagcatcttcgacccgttcaactcgtcgtcgttcttccaccccttctgtctgatcgactacaacaaccagacgtccatcgagcagtgctgggagggcgacaacatcgtcagcctaccggatttgaggacggaggccagcaatgtgcgggctatctggaataagtggattacgaacctggtggcgcagtaccagatcgacggcctgcgcatcgacagcgtcagaaacatggagacgtccttctgggcggggtttgggtccgccgcgggggtgttcatgatcggcgaggtagacgacggcgacccgacggtgctggccccctaccaggagtacctgccgggagtgctggactatgcgagctgctactggatcacgcaggccttccagtccagctctggcagcatcagcaatctggcctctggcatcaacacgctgaagagcattgcgatagacaccagcctgtacgggtcctttctagagaaccacgaccagccgcggttcccgtcgctcacttccgacgtcgcccaggccaagaacgcgatcgcgttcacgatgctgaaggacgggatcccgatcgtgtatcaaggccaagagcagtattatgccggaggagcggtgcccgccgaccgcgaggccatctggctgtcgggctacccgacgtccgcgacgctgtacagctggattgcggcgctaaacgagatccgctcgacggctattgcgcaggacagcagttatctgacctaccaggcgtggccggtgtacacggacggcaacaacatcgctatgcggaagggcagcgatgggtaccaggtggtcgggctgttcacgaacacgggatctagcgggtcgcctagcgtcactctcactgcgtcgatgaccgggttcacggctggcgaggcggtcgtggacgtcatgagctgcactacgttcatcacgaactcggatggcagcctccgccacgcagactgggacgatgacatctacctccgtgacgagtacgttttaccatcatacgacttttgtctcgttgtcactgacagttccgcagccagcagttcctgcaccgccaccgcggtagccactaacccttcgaccgcagctcggctgaccacctcttacggcgagacagtcaagctcgctggcaatgtcgcggccctaggcaattgggacacggacgacgcggtcagcctcagcgcatcgcagtacacgagcagcaagccgctgtggtcgggcaccgtctcgctgacccccggcaccgaggtgcagtacaagttcatgcaggtcgacagttcgggagccgtgacctgggaggcggacccgaaccacacgtactctgtgccgtgcgcggctgctactgttagcagtagttggcagagctga

成熟蛋白理论分子量为64.1kDa，将淀粉酶基因amy-8序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对显示AMY-8是一种新的淀粉酶。

本发明还提供了包含上述中温酸性淀粉酶基因AMY-8的重组载体，优选为pPIC-amy-8。将本发明的淀粉酶基因去掉信号肽后插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的淀粉酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组红冬孢酵母表达质粒pPIC9-amy-8。

本发明还提供了包含上述中温酸性淀粉酶基因amy-8的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、红冬孢酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/amy-8。

本发明还提供了一种制备中温酸性淀粉酶AMY-8的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组淀粉酶表达；

3)回收并纯化所表达的淀粉酶AMY-8。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤红冬孢酵母细胞、啤酒红冬孢酵母细胞或多型逊红冬孢酵母细胞，优选将重组红冬孢酵母表达质粒转化毕赤红冬孢酵母细胞(Pichiapastoris)GS115，得到重组菌株GS115/amy-8。

本发明还提供了上述中温酸性淀粉酶AMY-8的应用，优选上述中温酸性淀粉酶AMY-8用于降解淀粉，进而应用于啤酒酿造工业、面包制作。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、能源工业中应用新的淀粉酶。本发明的淀粉酶最适pH为4.5，在pH3.5～5.5都有较高的酶活性；pH稳定性好。其中温特性，可使其满足在淀粉处理工业的需求。本淀粉酶可应用于麦芽糖浆的生产，工业生产中往往与脱枝酶配合使用，用以生产超高麦芽糖浆，其麦芽糖含量可达70%以上；在啤酒酿造工业，淀粉酶能提高麦芽汁的可发酵型，有利于对糖化醪中淀粉进行低温液化，改善酒质，提高出酒率；对于焙烤制品，真菌α-淀粉酶的添加，不仅可以加快生面团的发酵速率、改善面包的结构和体积，同时其产生的糖类物质对面包的口感、色泽及品质等都具有明显的促进作用。另外，其与商业化的糖化酶协同作用一步法处理玉米生淀粉有效提高葡萄糖的产生量。

附图说明

图1重组淀粉酶的最适pH。

图2重组淀粉酶的pH稳定性。

图3重组淀粉酶的最适温度。

图4重组淀粉酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从红冬孢酵母菌Rhodosporidium sp.S8中分离得到一种新的中温酸性淀粉酶AMY-8。毕赤红冬孢酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。可溶性淀粉购自Sigma公司，其它均为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

（1）Rhodosporidium sp.S8培养基为PDB培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH自然。

（2）大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH自然)。

（3）BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004%Biotin，1%甘油(V/V)。

（4）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1红冬孢Rhodosporidium sp.S8淀粉酶编码基因AMY-8的克隆

提取红冬孢Rhodosporidium sp.S8基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中,液氮研磨，加入5mL裂解液，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解120min，每隔10min混匀一次,在4℃下12000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于-20℃下静置20min后,4℃下12000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70%的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量TE溶解,置于-20℃备用。

根据第十三家族淀粉酶基因的保守（DVVANH）和NDY(F)NL(I)EY)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1:5'-GMTKCCTWCCAYGGNTAYTGG-3'；

P2:5'-GTGTCGATNCGNAGNCCRTC-3'。

以Rhodosporidiumsp.S8总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约158bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1,usp2,usp3(上游特异性引物),dsp1,dsp2,dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.淀粉酶AMY-8TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送博迈德生物技术有限公司测序。拼接后AMY-8淀粉酶基因全长1845bp（SEQ ID NO.4），编码614个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明N端22个氨基酸为信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为64.1kDa。

实施例2重组淀粉酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码淀粉酶的基因amy-8双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟淀粉酶的基因片段（SEQ ID NO.5）与表达载体pPIC9连接，获得含有Rhodosporidium sp.S8淀粉酶基因amy-8的重组质粒pPIC-amy-8并转化毕赤红冬孢酵母GS115，获得重组毕赤红冬孢酵母菌株GS115/amy-8。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定淀粉酶的活力。重组淀粉酶的表达量为36.6U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组淀粉酶在毕赤红冬孢酵母中得到了表达。重组淀粉酶的比活为128.6U/mg。

按照同样的方法将含信号肽的基因片段（SEQ ID NO.4）在毕赤红冬孢酵母中得到了表达，检测到淀粉酶比活略低。

实施例3重组淀粉酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH4.5，55℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例4重组淀粉酶AMY-8的性质测定

实施例2纯化的重组淀粉酶AMY-8的性质测定如下：

1、重组淀粉酶AMY-8的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例2纯化的重组淀粉酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中55℃下进行淀粉酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶AMY-8的最适pH为4.5，在pH4.0~5.0有50%以上的相对酶活性。淀粉酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH5.5缓冲液体系中55℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明淀粉酶在pH4.0-7.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在70%以上，这说明此酶在中温酸性和中性范围内具有较好的pH稳定性。

2、淀粉酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

淀粉酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为淀粉酶在不同温度下处理不同时间，再在55℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为55℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，AMY-8有良好的热稳定性，在50℃下温育1h，能保持80%以上的酶活。

3、淀粉酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的可溶性淀粉为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.5)缓冲液体系中，55℃下测定酶活性，计算出其在55℃下的K_m值。经测定，以可溶性淀粉为底物时的K_m、V_max分别为2.9和265.3mg/mL。

4、不同金属离子化学试剂对AMY-8酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/L。在55℃、pH4.5条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂在浓度为1mmol时重组淀粉酶的活力没有明显变化，只有SDS微弱抑制其活力。当Cu²⁺,Ag⁺,和β-巯基乙醇浓度为5mmol时可以部分抑制AMY-8酶活力，5mmol SDS使其活力全部丧失。

5、重组淀粉酶的底物特异性

该酶除可作用于可溶性淀粉外，对于土豆淀粉、红薯淀粉有一定的降解作用（表2）。

表2.淀粉酶AMY-8底物特异性分析

6、淀粉酶和糖化酶协同酶解马铃薯淀粉的正交试验

本试验对淀粉酶AMY8和商业化糖化酶对马铃薯淀粉进行协同酶解，选取反应温度、底物浓度、酶量、反应时间4个主要影响因素,进行正交优化试验,以确定酶水解的最佳工艺条件。实验结果表明：最佳酶解工艺条件为:反应温度50℃、底物质量浓度0.1g/mL、加酶量为底物淀粉质量的0.5%、反应时间2h，pH4.5，在此条件下,马铃薯淀粉水解液中葡萄糖含量最高。

Claims (9)

1.一种中温酸性淀粉酶AMY-8，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种中温酸性淀粉酶基因amy-8，其特征在于，编码权利要求1所述的中温酸性淀粉酶AMY-8。

3.如权利要求2所述的中温酸性淀粉酶基因amy-8，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

4.包含权利要求2所述中温酸性淀粉酶基因amy-8的重组载体。

5.包含权利要求2所述中温酸性淀粉酶基因amy-8的重组载体pPIC-amy-8。

6.包含权利要求2所述中温酸性淀粉酶基因amy-8的重组菌株。

7.一种制备中温酸性淀粉酶AMY-8的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组淀粉酶表达；

3)回收并纯化所表达的淀粉酶AMY-8。

8.权利要求1所述中温酸性淀粉酶AMY-8用于降解淀粉的应用。

9.权利要求1所述中温酸性淀粉酶AMY-8用于啤酒酿造工业、面包制作的应用。