CN103740673B - 一种低温酸性α-淀粉酶AMY-L27及其基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体地，一种低温酸性α-淀粉酶AMY-L27及其基因和应用。本发明的低温酸性α-淀粉酶AMY-L27，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1或2所示。本发明的低温酸性α-淀粉酶基因amy-L27，编码权利要求1所述的α-淀粉酶AMY-L27，其碱基序列如SEQ？ID？NO.4或5所示。本发明的低温酸性α-淀粉酶的低温特性，可使其满足在饲料、食品和洗涤行业的需求，提高饲料的利用率和洗涤剂的使用效果。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种低温酸性α-淀粉酶AMY-L27及其基因和应用。
背景技术
淀粉是一种碳水化合物，几乎完全是以α-D-葡萄糖为单位聚合组成的，链的平均长度为500-1000个葡萄糖残基。淀粉中能溶于热水的一部分叫直链淀粉，不能溶解的叫支链淀粉，这两种成分是淀粉颗粒的主要成分，含量可以达到75-80%。淀粉几乎存在于所有绿色植物多数组织中，是植物营养物质的一种储存形式，在显微镜下以颗粒形状存在于植物有机体中。当前，能够作为淀粉原料的主要作物是玉米，其次是薯类、稻谷和小麦。淀粉酶是可以水解淀粉的一类酶的总称，广泛存在于植物和微生物中。根据淀粉降解酶的作用方式主要分为三类：外切淀粉酶、内切淀粉酶和分支淀粉酶。在实际生产中最常使用的主要是α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、支链淀粉酶。其中，α-淀粉酶是从淀粉内部任意水解α-1,4-D葡萄糖苷键，导致淀粉部分解聚，是内切酶。根据α-淀粉酶的热稳定性和最适反应温度，通常把α-淀粉酶分成高温α-淀粉酶、中温耐热型α-淀粉酶、非耐热性α-淀粉酶和低温α-淀粉酶。高温α-淀粉酶作用最适温度90-100℃，95-105℃耐热性好，中温耐热型α-淀粉酶作用最适温度70-80℃，90℃以上处理一般会失活，非耐热性α-淀粉酶作用最适温度50℃左右，低温α-淀粉酶则一般在10-20℃还能表现出活性。根据α-淀粉酶作用的最适pH和对酸碱的稳定性，把α-淀粉酶分成酸性α-淀粉酶、中性α-淀粉酶和碱性α-淀粉酶。大多数α-淀粉酶都属于中性α-淀粉酶，一般最适pH6.0-7.0，酸性α-淀粉酶最适pH<5.5，碱性α-淀粉酶最适pH>8.0。
对淀粉酶的研究已有半个世纪，主要研究集中在适合于麦芽糖浆、食品烘培、纺织退浆工业等方面的淀粉酶，已经从不同来源的植物与微生物中分离到大量的不同类型不同功能的淀粉酶，并分离出多种淀粉酶基因，现已工业化生产多种淀粉酶产品。近年来，低温淀粉酶已经引起研究人员的广泛关注，在洗涤剂中添加淀粉酶已经很普遍了，但是目前许多洗涤剂用淀粉酶最适温度要40℃左右甚至更高，在10-20℃水温下水解淀粉的性能不佳，多年来传统的洗涤习惯已开始朝更多地使用酶促成分及使用更低的洗涤温度转变，这应归于能量耗费的增高以及合成纤维使用程度的提高（合成纤维只能经受温和的温度），所以急需开发在低温条件下，对生淀粉也能发挥显著水解作用的洗涤剂高效淀粉酶。此外，在动物饲料行业添加耐酸性的淀粉酶更有利于在动物胃肠的酸性环境中发挥水解作用，有助于营养物质的吸收。本研究中，来源于苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisL27的α-淀粉酶AMY-L27最适pH5.5，在pH4.5-7.5条件下仍具有60%以上的活性，并且在pH4.0-8.0具有良好的稳定性；最适温度45℃，在20-35℃条件下仍具有65%以上的活性。该酶在洗涤业和饲料行业具有非常广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够应用的低温酸性α-淀粉酶AMY-L27。
本发明的再一目的是提供编码上述低温酸性α-淀粉酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述低温酸性α-淀粉酶的基因工程方法。
本发明的另一目的提供上述低温酸性α-淀粉酶的应用。
本发明提供了一种低温酸性α-淀粉酶AMY-L27，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：
其中，该酶基因编码566个氨基酸，N端24个氨基酸为其预测的信号肽序列“MLLWDGGCHLKEKDKLKVNRNNVN”(SEQIDNO.3)。
因此，成熟的低温酸性α-淀粉酶AMY-L27的理论分子量为62.4kDa，其成熟的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示：
本发明的的低温酸性α-淀粉酶AMY-L27最适pH5.5，在pH4.5-7.5条件下仍具有60%以上的活性，并且在pH4.0-8.0具有良好的稳定性；最适温度45℃，在20-35℃条件下仍具有65%以上的活性。
本发明提供了编码上述低温酸性α-淀粉酶基因amy-L27。具体地，该基因的基因组序列如SEQIDNO.4所示：
本发明通过PCR的方法分离克隆了低温酸性α-淀粉酶基因amy-L27，DNA全序列分析结果表明，低温酸性α-淀粉酶AMY-L27的编码基因amy-L27全长1698bp。其中，信号肽的碱基序列为：“atgttattatgggatggaggatgtcatttaaaagaaaaagataaattaaaagtaaatcgtaataatgtaaat”(SEQIDNO.5)。成熟的α-淀粉酶AMY-L27的编码基因amy-L27的序列如SEQIDNO.6所示：
将上述α-淀粉酶基因amy-L27序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于BacillusthuringiensisHD-771的α-淀粉酶氨基酸序列一致性为89%，说明AMY-L27是一种新的α-淀粉酶。
本发明还提供了包含上述低温酸性α-淀粉酶基因amy-L27的重组载体，优选为pPIC-amy-L27。将本发明的α-淀粉酶基因去掉信号肽后插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的α-淀粉酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-amy-L27。
本发明还提供了包含上述低温酸性淀粉酶基因amy-L27的重组菌株，所述菌株优选为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，最优选为重组菌株GS115/amy-L27。
本发明还提供了一种制备低温酸性α-淀粉酶AMY-L27的方法，包括以下步骤：
1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2）培养重组菌株，诱导重组淀粉酶表达；
3）回收并纯化所表达的淀粉酶AMY-L27。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多形汉逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞（Pichiapastoris）GS115，得到重组菌株GS115/amy-L27。
本发明还提供了上述低温酸性α-淀粉酶AMY-L27的应用，优选其在饲料、洗涤、食品、能源工业中对于降解淀粉或其它淀粉类物质的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、洗涤、食品、能源工业中应用新的α-淀粉酶。本发明的α-淀粉酶最适pH为5.5，在pH4.5-7.5条件下仍具有60%以上的活性，并且在pH4.0-8.0具有良好的稳定性；最适温度45℃，在20-35℃条件下仍具有65%以上的活性。其低温特性，可使其满足在饲料、食品和洗涤行业的需求，提高饲料的利用率和洗涤剂的使用效果。
附图说明
图1为本发明的重组低温酸性α-淀粉酶的最适pH。
图2为本发明的重组低温酸性α-淀粉酶的pH稳定性。
图3为本发明的重组低温酸性α-淀粉酶的最适温度。
图4为本发明的重组低温酸性α-淀粉酶的热稳定性。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体
毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂
限制性内切酶和T4DNA连接酶购自Fermentas公司。可溶性淀粉购自Sigma公司，其它均为国产试剂，可从普通生化试剂公司购买得到。
3、培养基
（1）大肠杆菌培养基LB（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH自然）。
（2）BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004%Biotin，1%甘油(V/V)。
（3）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH自然。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisL27α-淀粉酶基因amy-L27的克隆
提取苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisL27基因组DNA：
（1）取0.5-2mL培养菌液，10000rpm，离心30s，尽可能的吸取上清，收集菌体；
（2）EP管中加200μL缓冲液RB重悬，10000rpm离心30s，弃上清；
（3）对于革兰氏阳性菌：加入120μL溶菌酶，颠倒混匀，37℃水浴30-60min；
（4）12000rpm离心2min，弃上清后将细胞振荡或者吹打重悬于180μL缓冲液RB中；
（5）加RNaseA（25mg/mL）溶液20μL，振荡混匀，室温放置5-10min；
（6）加结合液CB800μL，再加入100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能出现絮状沉淀；
（7）将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中，13000rpm离心30-60s，弃掉废液；
（8）加抑制物去除液IR500μL，12000rpm离心30s，弃废液；
（9）加入700μL漂洗液WB，12000rpm，离心30s，弃掉废液；
（10）加入500μL漂洗液WB，12000rpm，离心30s，弃掉废液；
（11）将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，一面漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
（12）取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min；
（13）得到的DNA于-20℃保存。
从NCB基因数据库中获取芽孢杆菌来源α-淀粉酶基因序列进行序列比对分析，设计合成简并引物P1，P2：
P1:5'-GTNGTNYAAGRGTGGCAYGA-3'；
P2:5'-ATRTTAWRYTCTARTCTTRTG-3'。
以苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisL27总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环后72℃保温10min，获得一条约1700bp大小的片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体进行连接转化后送北京睿博新科生物技术有限公司测序。通过基因测序得到1698bp的基因片段，编码565个氨基酸和一个终止密码子，预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为62.4kDa。
实施例2重组α-淀粉酶AMY-L27的制备
根据获得的α-淀粉酶AMY-L27的基因序列设计合成表达引物：
P3:5'-CGGAATTCTTTTCTAAAGATGTAATTT-3'；
P4:5'-CTGCGGCCGCTGGTCCTGCATTTGTT-3'。
重新以苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisL27总DNA为模板进行PCR扩增，获得带有重组酶切位点的α-淀粉酶AMY-L27基因序列。将表达载体pPIC9进行双酶切（EcoRI+NotI），同时将编码α-淀粉酶的基因amy-L27双酶切（EcoRI+NotI），酶切出编码成熟α-淀粉酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisL27α-淀粉酶基因amy-L27的重组质粒pPIC-amy-L27并电击转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/amy-L27。
将含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mLBMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后利用200mLBMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定α-淀粉酶的活力，重组α-淀粉酶的表达量为510.3U/mL。
实施例3重组α-淀粉酶的活性分析
DNS法：具体方法如下：在pH5.5，45℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位（U）定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。
实施例4重组α-淀粉酶AMY-L27的性质测定
1、重组α-淀粉酶AMY-L27的最适pH和pH稳定性的测定
将实施例4的重组淀粉酶在不同的pH条件下进行酶促反应以测定其最适pH。底物用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中45℃下进行α-淀粉酶活力测定。结果（图1）表明，重组酶AMY-L27的最适pH为5.5，在pH3.0-6.5条件下有60%以上的相对酶活性。α-淀粉酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH5.5缓冲液体系中45℃条件下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果（图2）表明淀粉酶在pH2.0-7.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在75%以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。
2、α-淀粉酶的最适温度及热稳定性测定
α-淀粉酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH5.5）缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为淀粉酶在不同温度下处理不同时间，再在45℃下进行酶活性测定。α-淀粉酶反应最适温度测定结果（图3）表明其最适温度为45℃，在20-35℃条件下仍具有65%以上的活性。酶的热稳定性性试验表明（图4），AMY-L27具有良好的热稳定性，在75℃下温育10min，能保持60%以上的酶活。
3、α-淀粉酶的Km值测定
用不同浓度的可溶性淀粉为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH5.5）缓冲液体系中，45℃条件下测定酶活性，计算出其在45℃下的Km值。经测定，以可溶性淀粉为底物时的Km、Vmax分别为5.8和530.3mg/mL。
4、不同金属离子化学试剂对AMY-L27酶活的影响
在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/L。在45℃、pH5.5条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂在浓度为1mmol时重组α-淀粉酶的活力没有明显变化，只有SDS微弱抑制其活力。当Cu2+和β-巯基乙醇浓度为5mmol时可以部分抑制AMY-L27酶活力，5mmolSDS使其活力全部丧失。
5、重组α-淀粉酶的底物特异性
该酶除可作用于可溶性淀粉外，对于土豆淀粉、红薯淀粉有一定的降解作用（表1）。
表1.淀粉酶AMY-L27底物特异性分析
Claims (8)
1.一种低温酸性α-淀粉酶AMY-L27，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1或2所示。
2.一种低温酸性α-淀粉酶基因amy-L27，其特征在于，编码权利要求1所述的α-淀粉酶AMY-L27。
3.如权利要求2所述的低温酸性α-淀粉酶基因amy-L27，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO.4或5所示。
4.包含权利要求2或3所述低温酸性α-淀粉酶基因amy-L27的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC-amy-L27。
6.包含权利要求2或3所述低温酸性α-淀粉酶基因amy-L27的重组菌株。
7.一种制备低温酸性α-淀粉酶AMY-L27的方法，包括以下步骤：
1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组耐低温酸性α-淀粉酶表达；
3)回收并纯化所表达的低温酸性α-淀粉酶AMY-L27。
8.权利要求1所述低温酸性α-淀粉酶AMY-L27在饲料、洗涤、食品和能源工业中对于降解淀粉的应用。
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