CN103740682A

CN103740682A - 一种耐高温酸性β-甘露聚糖酶Man-L30及其基因和应用

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Publication number: CN103740682A
Application number: CN201410023196.6A
Authority: CN
Inventors: 吴培均; 李富伟; 罗建杰; 李兆勇
Original assignee: BEIJING CREATE VALUE BIOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING CREATE VALUE BIOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2034-01-17
Also published as: CN103740682B

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温酸性β-甘露聚糖酶Man-L30及其基因和应用。本发明的耐高温酸性β-甘露聚糖酶Man-L30，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。本发明的耐高温酸性β-甘露聚糖酶基因man-L30，编码权利要求1所述的耐高温酸性β-甘露聚糖酶Man-L30，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示。本发明的β-甘露聚糖酶Man-L30同时具有耐高温、良好的pH稳定性和蛋白酶抗性等特点。最适pH为5.5，在pH2.5-pH6.5范围内，该酶能够维持其65%以上的酶活力；最适温度50℃，具有极好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶处理能力。可应用于饲料、食品、医药等工业领域。

Description

一种耐高温酸性β-甘露聚糖酶Man-L30及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温酸性β-甘露聚糖酶Man-L30及其基因和应用。

背景技术

β-甘露聚糖酶（β-mannanase EC3.2.1.78）是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β-1,4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等。β-甘露聚糖酶的来源非常广泛，包括植物、细菌、真菌、放线菌甚至软体动物。甘露聚糖是植物性饲料原料中除纤维素、木聚糖之外，分布最广泛、含量最高的一类半纤维素，而且在许多植物中有淀粉样的大量积累。畜禽和鱼类的消化酶系不含甘露聚糖酶，对这类物质的转化需要添加外源酶。饲料中添加甘露聚糖酶可消除和降解饲料原料中的抗营养因子，促进畜禽生长，减少养殖污染。甘露聚糖类物质作为半纤维素的第二大组分，广泛分布于自然界中。它是所有豆科植物细胞壁的主要组成成分，在其他植物性饲料原料中含量也很高，如豆粕、小麦、菜籽粕、麸皮中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖的含量分别为22.7%、11.9%、19.6%和33.7%，在一些植物胶、椰子、莴苣、合欢、魔芋以及针叶树中也都含有丰富的甘露聚糖和异甘露聚糖。这使得β-甘露聚糖酶的开发和利用具有重要的意义。

β-甘露聚糖酶和甘露寡糖的推广应用，符合生态养殖业的需要。它们还可广泛应用于食品、纺织、石油等工业领域，如甘露寡糖是最有效的双岐因子之一，可以口服，国内外已经广泛地用于保健食品中。β-甘露聚糖酶还可用于从豆类植物中提炼植物油，降低咖啡、巧克力、可可液的粘性。β-甘露聚糖酶和木聚糖酶协同作用可用于造纸工业。β-甘露聚糖酶还可作为石油压裂液的破胶剂具有效力高、成本低、对地层伤害小等优点。特别是利用该酶来水解魔芋以制备高纯度的甘露寡糖，其市场前景十分广阔。作为生产原料的魔芋广泛的分布于四川、云南、贵州、湖北西部等欠发达的山区，该酶的大规模生产对于科技扶贫也有着重要的推动作用。因而，近年来β-甘露聚糖酶的研究逐渐成为了国内外的研究热点。但是国内各有关科研单位的研究大多限于实验室阶段，所报道的发酵酶活性低，酶解产物组成不稳定，生产成本较高，难以取得竞争优势。筛选高比活酶基因，应用基因工程技术构建高效产酶的微生物，进行分子育种改良酶的性质，优化寡糖的酶解制备工艺，是国际上的研究热点和方向，也具有很好的科学意义和应用前景。

本发明从Bacillus licheniformis CRVAB001菌株中得到了一个新的β-甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有以下几个优点：耐高温、酸性、良好的pH稳定性和蛋白酶抗性。作为一种新的β-甘露聚糖酶，在饲料、食品、医药等行业中将会具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐高温酸性β-甘露聚糖酶。

本发明的另一目的是提供上述β-甘露聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述β-甘露聚糖酶的方法。

本发明的另一目的是提供上述β-甘露聚糖酶的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的耐高温酸性β-甘露聚糖酶。本发明的耐高温酸性β-甘露聚糖酶Man-L30，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MKKNIVCSIF ALLLAFAVSQ PSYAHTVSPV NPNAQPTTKA VMNWLAHLPN

RTESRVMSGA 60

FGGYSLDTFS TAEADRIKQA TGQLPAIYGC DYARGWLEPE KIADITDTID

YSCNSSLISY 120

WKSGGLPQVS LHLANPAFPS GNYKTAISNS QYKNILDPST VEGKRLEALL

SKIADGLTQL 180

KNQGVTVLFR PLHEMNGEWF WWGLTGYNQK DTERISLYKE

LYKKIYRYMT ETRGLDNLLW 240

VYSPDANRDF KTDFYPGSSY VDIVGLDAYF SDAYSIKGYD ELTALNKPFA

FTEVGPQTTN 300

GSLDYSQFIN AVKQKYPKTI YFLAWDEGWS PAANQGASNL YNDSWTLNKG

EIWGGSSLTP 360

IAE 363

其中，该酶全长363个氨基酸，N端24个氨基酸为信号肽序列“MKKNIVCSIFALLLAFAVSQ PSYA”（SEQ ID NO.3）。

因此，成熟的β-甘露聚糖酶Man-L30的理论分子量为37.8kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

HTVSPVNPNA QPTTKAVMNW LAHLPNRTES RVMSGAFGGY SLDTFSTAEA

DRIKQATGQL 60

PAIYGCDYAR GWLEPEKIAD ITDTIDYSCN SSLISYWKSG GLPQVSLHLA

NPAFPSGNYK 120

TAISNSQYKN ILDPSTVEGK RLEALLSKIA DGLTQLKNQG VTVLFRPLHE

MNGEWFWWGL 180

TGYNQKDTER ISLYKELYKK IYRYMTETRG LDNLLWVYSP DANRDFKTDF

YPGSSYVDIV 240

GLDAYFSDAY SIKGYDELTA LNKPFAFTEV GPQTTNGSLD YSQFINAVKQ

KYPKTIYFLA 300

WDEGWSPAAN QGASNLYNDS WTLNKGEIWG GSSLTPIAE 339

该β-甘露聚糖酶Man-L30同时具有耐高温、良好的pH稳定性和蛋白酶抗性等特点。最适pH为5.5，在pH2.5-6.5范围内，该酶能够维持其65%以上的酶活力；最适温度50℃，具有极好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶处理能力。

本发明还提供了编码上述β-甘露聚糖酶的基因man-L30。该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

atgaaaaaaa atattgtatg ttctattttt gcattattat tagcatttgc agtatctcaa 60

ccatcttatg cacatacagt atctccagta aatccaaatg cacaaccaac aacaaaagca 120

gtaatgaatt ggttagcaca tttaccaaat cgtacagaat ctcgtgtaat gtctggagca 180

tttggaggat attctttaga tacattttct acagcagaag cagatcgtat taaacaagca 240

acaggacaat taccagcaat ttatggatgt gattatgcac gtggatggtt agaaccagaa 300

aaaattgcag atattacaga tacaattgat tattcttgta attcttcttt aatttcttat 360

tggaaatctg gaggattacc acaagtatct ttacatttag caaatccagc atttccatct 420

ggaaattata aaacagcaat ttctaattct caatataaaa atattttaga tccatctaca 480

gtagaaggaa aacgtttaga agcattatta tctaaaattg cagatggatt aacacaatta 540

aaaaatcaag gagtaacagt attatttcgt ccattacatg aaatgaatgg agaatggttt 600

tggtggggat taacaggata taatcaaaaa gatacagaac gtatttcttt atataaagaa 660

ttatataaaa aaatttatcg ttatatgaca gaaacacgtg gattagataa tttattatgg 720

gtatattctc cagatgcaaa tcgtgatttt aaaacagatt tttatccagg atcttcttat 780

gtagatattg taggattaga tgcatatttt tctgatgcat attctattaa aggatatgat 840

gaattaacag cattaaataa accatttgca tttacagaag taggaccaca aacaacaaat 900

ggatctttag attattctca atttattaat gcagtaaaac aaaaatatcc aaaaacaatt 960

tattttttag catgggatga aggatggtct ccagcagcaa atcaaggagc atctaattta 1020

tataatgatt cttggacatt aaataaagga gaaatttggg gaggatcttc tttaacacca 1080

attgcagaa 1089

本发明通过PCR的方法分离克隆了这β-甘露聚糖酶基因man-L30，DNA全序列分析结果表明，β-甘露聚糖酶Man-L30基因全长1089bp，其中，信号肽的碱基序列为：“atgaaaaaaa atattgtatg ttctattttt gcattattat tagcatttgc agtatctcaa ccatcttatg ca”(SEQ IDNO.5)，因此，成熟基因的编码序列为SEQ ID NO.4所示：

catacagtat ctccagtaaa tccaaatgca caaccaacaa caaaagcagt aatgaattgg 60

ttagcacatt taccaaatcg tacagaatct cgtgtaatgt ctggagcatt tggaggatat 120

tctttagata cattttctac agcagaagca gatcgtatta aacaagcaac aggacaatta 180

ccagcaattt atggatgtga ttatgcacgt ggatggttag aaccagaaaa aattgcagat 240

attacagata caattgatta ttcttgtaat tcttctttaa tttcttattg gaaatctgga 300

ggattaccac aagtatcttt acatttagca aatccagcat ttccatctgg aaattataaa 360

acagcaattt ctaattctca atataaaaat attttagatc catctacagt agaaggaaaa 420

cgtttagaag cattattatc taaaattgca gatggattaa cacaattaaa aaatcaagga 480

gtaacagtat tatttcgtcc attacatgaa atgaatggag aatggttttg gtggggatta 540

acaggatata atcaaaaaga tacagaacgt atttctttat ataaagaatt atataaaaaa 600

atttatcgtt atatgacaga aacacgtgga ttagataatt tattatgggt atattctcca 660

gatgcaaatc gtgattttaa aacagatttt tatccaggat cttcttatgt agatattgta 720

ggattagatg catatttttc tgatgcatat tctattaaag gatatgatga attaacagca 780

ttaaataaac catttgcatt tacagaagta ggaccacaaa caacaaatgg atctttagat 840

tattctcaat ttattaatgc agtaaaacaa aaatatccaa aaacaattta ttttttagca 900

tgggatgaag gatggtctcc agcagcaaat caaggagcat ctaatttata taatgattct 960

tggacattaa ataaaggaga aatttgggga ggatcttctt taacaccaat tgcagaa 1017

将β-甘露聚糖酶基因man-L30序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Bacillus licheniformis DSM13的β-甘露聚糖酶氨基酸序列一致性为84%，说明Man-L30是一种新的β-甘露聚糖酶。

本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组载体，优选为pPIC9-man-L30。将本发明的β-甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将β-甘露聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-man-L30。

本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/man-L30。

本发明还提供了一种制备耐高温酸性β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：

1）用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组β-甘露聚糖酶的表达；

3）回收并纯化所表达的β-甘露聚糖酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母（Hansenula polymorpha）细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞（Pichic pastoris）GS115，得到重组菌株GS115/man5A。

本发明还提供了上述β-甘露聚糖酶的应用。优选其在饲料、食品、医药等工业领域降解甘露聚糖的应用。

本发明的β-甘露聚糖酶Man-L30同时具有耐高温、良好的pH稳定性和蛋白酶抗性等特点。最适pH为5.5，在pH2.5-6.5范围内，该酶能够维持其65%以上的酶活力；最适温度50℃，具有极好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶处理能力。可应用于饲料、食品、医药等工业领域。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的甘露聚糖酶。

附图说明

图1为本发明重组耐高温酸性β-甘露聚糖酶的最适pH值。

图2为本发明重组耐高温酸性β-甘露聚糖酶的pH稳定性。

图3为本发明重组耐高温酸性β-甘露聚糖酶最适反应温度。

图4为本发明重组耐高温酸性β-甘露聚糖酶热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体

毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂

限制性内切酶和T4DNA连接酶购自Fermentas公司。槐豆胶、魔芋粉、瓜尔豆胶和桦木木聚糖购自Sigma公司，其它均为国产试剂，可从普通生化试剂公司购买得到。

3、培养基

（1）大肠杆菌培养基LB（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH自然）。

（2）BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004%Biotin，1%甘油(V/V)。

（3）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH自然。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CRVAB001β-甘露聚糖酶编码基因man-L30的克隆

提取地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CRVAB001基因组DNA：

（1）取0.5-2mL培养菌液，10000rpm，离心30s，尽可能的吸取上清，收集菌体；

（2）EP管中加200μL缓冲液RB重悬，10000rpm离心30s，弃上清；

（3）对于革兰氏阳性菌：加入120μL溶菌酶，颠倒混匀，37℃水浴30-60min；

（4）12000rpm离心2min，弃上清后将细胞振荡或者吹打重悬于180μL缓冲液RB中；

（5）加RNase A（25mg/mL）溶液20μL，振荡混匀，室温放置5-10min；

（6）加结合液CB800μL，再加入100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能出现絮状沉淀；

（7）将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中，13000rpm离心30-60s，弃掉废液；

（8）加抑制物去除液IR500μL，12000rpm离心30s，弃废液；

（9）加入700μL漂洗液WB，12000rpm，离心30s，弃掉废液；

（10）加入500μL漂洗液WB，12000rpm，离心30s，弃掉废液；

（11）将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，一面漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；

（12）取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min；

（13）得到的DNA于-20℃保存。

从NCB基因数据库中获取芽孢杆菌来源β-甘露聚糖酶基因序列进行序列比对分析，设计合成简并引物P1，P2：

P1:5′-GTGRGCANAATNYTGGYGGA-3′；

P2:5′-TRTCRYTAWACTARTTRTTTG-3′。

以地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CRVAB001总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环后72℃保温10min，获得一条约1100bp大小的片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体进行连接转化后送北京睿博新科生物技术有限公司测序。通过基因测序得到1089bp的基因片段，编码362个氨基酸和一个终止密码子，预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为37.8kDa。

实施例2重组β-甘露聚糖酶Man-L30的制备

根据获得的β-甘露聚糖酶Man-L30的基因序列设计合成表达引物：

P3:5′-CGGAATTCCATACAGTATCTCCAGTAAAT-3′；

P4:5′-CTGCGGCCGCTTCTGCAATTGGTGTTAAA-3′。

重新以地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CRVAB001总DNA为模板进行PCR扩增，获得带有重组酶切位点的β-甘露聚糖酶Man-L30基因。将表达载体pPIC9进行双酶切（EcoR I+Not I），同时将编码β-甘露聚糖酶的基因man-L30双酶切（EcoRI+Not I），酶切出编码成熟β-甘露聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CRVAB001基因man-L30的重组质粒pPIC-man-L30并电击转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/man-L30。

将含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后利用200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定β-甘露聚糖酶的活力。

实施例3重组β-甘露聚糖酶酶学性质分析

采用DNS法对本发明的β-甘露聚糖酶进行活性分析。具体方法如下：在pH4.5，55℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应l0rnin，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5mn。冷却后540nm测定OD值。β-甘露聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解β-甘露聚糖生成lμmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(U)。

（1）β-甘露聚糖酶Man-L30的最适pH及pH稳定性

将重组表达的β-甘露聚糖酶Man-L30在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH0.5-2.2KCI-HCl缓冲液，pH2.2-8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液及pH8.0-10.0Tris-HCl系列缓冲液。β-甘露聚糖酶Man-L30在不同pH的缓冲体系.37℃下测定的pH适性结果（图1）表明：Man-L30的最适pH为5.5，在pH3.3-6.5范围内，该酶能够维持其80%以上的酶活力。将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明（图2），分析结果表明pH2.0-7.0之间能够维持80%以上的酶活力，说明该酶具有优良的pH稳定性。

（2）β-甘露聚糖酶Man-L30反应最适温度及热稳定性

纯化的甘露聚糖酶在pH5.5条件下，测定不同温度（20-70℃）下的酶活性，分析实验结果表明显示，该酶的最适反应温度为50℃（图3）。耐温性测定为β-甘露聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在50℃下进行酶活性测定。热稳定性实验表明：该β-甘露聚糖酶在75℃下处理10min，剩余酶活在80%以上，这表明该酶在75℃以下具有很好的热稳定性（图4）。

（3）β-甘露聚糖酶Man-L30的抗胰蛋白酶和胃蛋白酶能力检测

用pH2.0KCl-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCI缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH2.0KCl-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胃蛋白酶.pH7.0Tris-HCI缓冲液稀释后的0.6mL纯化的酶液加入0.6mL蛋白酶混合，蛋白酶／甘露聚糖酶(w/w)≈0.1，37℃保温，60min取样，在pH5.5及50℃条件下测定酶活性。实验结果表明β-甘露聚糖酶Man-L30用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理60min后，用胰蛋白酶处理后酶活为原来的90.5%；用胃蛋白酶处理后酶活提高为原来的92.9%。说明β-甘露聚糖酶Man-L30具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力。

（4）β-甘露聚糖酶Man-L30的底物特异性

该酶除可作用于槐豆胶外，对于魔芋粉、瓜尔豆胶和桦木木聚糖也有一定的降解作用（表1）。

表1.β-甘露聚糖酶Man-L30底物特异性分析