FI100602B - Uusia proteolyyttisiä entsyymejä - Google Patents

Description

100602

Uusia proteolyyttisiä entsyymejä Tämä keksintö koskee uusia seriiniproteaaseja, jotka on eristetty sienen Tritirachium album viljelyaineesta.

5 Tämän keksinnön mukaisilla seriiniproteaaseilla on suuri stabiilius vesiliuoksissa ja kuivissa pesuainevalmisteissa. Keksintö koskee lisäksi pesuainekoostumuksia, jotka sisältävät näitä proteaaseja, ja proteaasien käyttöä pesuaineissa ja puhdistusaineissa tai tahranpoistoaineissa. Lisäksi 10 tämä keksintö koskee myös DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat kyseisiä proteaaseja, ja menetelmää proteaasien tuottamiseksi .

Seriiniproteaasit ovat proteolyyttisiä entsyymejä, joissa on seriinitähde aktiivisessa kohdassa. Aktiivisen 15 kohdan seriinitähteen muuntaminen sellaisilla aineilla kuin esimerkiksi fenyylimetyylisulfonyylifluoridilla (PMSF) inaktivoi nämä entsyymit. Seriiniproteaaseja on kaksi luokkaa, kymotrypsiinin kaltaiset proteaasit ja subtilisiinin kaltaiset proteaasit. Subtilisiinit ovat seriiniproteaase-20 ja, jotka yleensä vaikuttavat katkaisemalla proteiinien tai peptidien sisäisiä peptidisidoksia. Subtilisiineja erittävät muutamat Bacillus-lajit, ja niitä käytetään laajasti kaupallisesti [katso US-patentti nro 3 623 957, J. Miller, J. Appi. Bacteriol. 33 (1970) 207; Ward, O. P., Enzymes and 25 Biotechnology, 1983, s. 251 - 317, toim. W. M. Fogarty, Applied Science Publishers, Lontoo] . Subtilisiineja on käy tetty lukuisissa pesuainevalmisteissa (katso US-patentit nrot 1 240 058, 3 749 671, 3 790 482 ja 4 266 031; GB-pa-tentti nro 1 315 937).

30 Proteaasien käyttö teollisuusprosesseissa, joissa vaaditaan proteiinin hydrolyysiä, on ollut rajoittunutta johtuen entsyymien epästabiiliudesta sellaisiin prosesseihin liittyvissä lämpötila- ja pH-olosuhteissa. Vaikka pro-teaasin lämpöinaktivaatio voi olla tärkein proteaasin teol-35 lisuuskäyttöä rajoittava tekijä, voi myös muilla teki- 100602 2 jöillä, kuten esimerkiksi tehokkuuden puuttumisella laajoilla pH-alueilla ja denaturoivien aineiden käytöllä pesu-ainevalmisteissa, olla proteaasien käyttöä teollisuusprosesseissa haittaava vaikutus. Tunnetut Bacilluksesta pe-5 räisin olevat subtilisiinit eivät ole ihanteellisia kaikkia pesuaine-entsyymeinä käyttämisen muotoja varten, etenkään sovellutuksessa, joka vaatii suurempaa säilytyskestävyyttä ja aktiivisuutta laajemmilla pH- ja lämpötila-alueilla. Sen vuoksi tarvitaan proteaasien luokkaa, jolle on ominaista 10 suuri stabiilius lämpötilan, pH:n, denaturoivien aineiden ja vastaavien seikkojen suhteen.

Tarvitaan myös proteaaseja, jotka sopivat yhteen pesuaineiden kanssa ja joilla on riittävä varastokestävyys nestemäisissä pesuainevalmisteissa ollakseen kaupallisesti 15 käyttökelpoisia. Lämmönkestäviä sienten seriiniproteaaseja on arvioitu pesuainekäyttösovellutuksissa, mukaan lukien proteaaseja, jotka on saatu sienistä Tritirachium album (Ebeling, W. et ai., 1971, German Offenbach, 1965, 281),

Malbranchea pulchella (Ong, P. S. et ai., Can. J. Micro-20 biol. 22, 165), Acremonium kiliense, Fusarium- ja Gibberel-la-lajeista (Isono, M. et ai., 1972, US-patentti nro 3 652 399). Proteinaasi K (EC 3, 4, 21, 14) on eristetty lajista Tritirachium album [Ebeling, W. et ai., Eur. J. Biochem. 47 (1974) 91 - 97], ja sitä ovat eri ryhmät tutkineet laajasti 25 [Kraus, E. et ai., Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 357 (1976) 937 - 947, ibid. 357, 233 - 237, ja Morihara, K. et ai., Agr. Biol. Chem. 39 (1975) 1 489 - 1 492]. Proteinaasi K:n avaruusrakenne on samantapainen kuin subtilisiinien [Paehler, A. et ai., EMBO J. 3 (1983) 1 311 - 1 314) ja 30 proteinaasi K: n ja subtilisiinien aminohapposekvenssien välillä on noin 35 %:n homologia [Jany, K-D. et ai., FEBS Letters 199, 139 - 144) . Proteinaasi K:n aktiivisuuden suurten konsentraatioiden pesuaineita läsnä ollessa on katsottu osoittavan sen sopivan yhteen pesuaineiden kanssa 35 [Hilz, H. et ai., Eur. J. Biochem. 56 (1975) 103 - 108].

3 100602

Proteolyyttiset entsyymit katalysoivat peptidisidos-ten katkeamista yleensä ainoastaan tietyllä pH- ja lämpötila-alueella. Lisäksi proteolyyttinen entsyymi säilyttää optimaalisissakin olosuhteissa aktiivisuutensa ainoastaan 5 sen polypeptidiketjun ollessa natiivissa konformaatiossa. Natiivin rakenteen avautumista tapahtuu usein, kun entsyymi joutuu äärimmäisten pH- tai lämpötilaolosuhteiden tai pesuaineiden eräiden lisäaineiden, kuten esimerkiksi pinta-ak-tiivisten aineiden ja metallin kanssa kelaatin muodostavien 10 aineiden, vaikutuksen alaiseksi. Viimeksi mainittujen vaikutus kohdistuu erityisesti entsyymeihin, jotka vaativat sellaisia metalli-ioneja kuin Ca2+ stabiloimaan niiden na-tiivia rakennetta, so. bakteerien subtilisiiniin. Pro-teaaseilla entsyymin natiivin konformaation osittainen 15 avautuminen voi johtaa itsehajottamisen nopeutumiseen ja siten entsyymin palautumattomaan inaktivoitumiseen. Koska useimpien kaupallisten pyykinpesuaineiden pH on alkalinen, on toivottavaa, että sellaisissa pesuaineissa käytettävä entsyymi on aktiivinen ja stabiili pH-alueella 7,5 - 13 ja 20 lämpötila-alueella 20 - 65 C. Lisäksi on toivottavaa, että sellaisten entsyymien aktiivisuus on suhteellisen riippumaton kalsium- ja magnesiumioneista ja sopii yhteen pinta-aktiivisten aineiden ja sekvestraustehoaineiden kanssa. Subtilisiinien ryhmään kuuluvat bakteerien seriiniproteaa-25 sit täyttävät nämä vaatimukset jossain määrin, mutta niiden stabiilius nestemäisissä pesuainevalmisteissa on kuitenkin rajoittunut.

Tämä keksintö koskee uusia seriiniproteaaseja, joille on tunnusomaista parantunut stabiilius pesuainevalmis-30 teissä. Erityisesti tässä keksinnössä kuvataan sellaisten uusien seriiniproteaasien eristäminen, puhdistaminen ja karakterisoiminen, jotka on saatu sieni-kannasta Triti-rachium album Limber (ATCC 22563). Tämän keksinnön mukaisten seriiniproteaasien on todettu olevan erinomaisia pesu-35 aine-entsyymejä ja omaavan suuren lämmönkestävyyden vesi- 4 100602 liuoksissa erityisesti kohotetuissa lämpötiloissa, minkä johdosta proteaasit ovat sopivia käytettäviksi lisäaineina kaupallisissa nestemäisissä pesuainevalmisteissa. Tämä keksintö koskee lisäksi sellaisia proteaaseja koodaavien gee-5 nien eristämistä ja karakterisointia. Keksintö koskee lisäksi tämän keksinnön mukaisten seriiniproteaasien käyttöä pesuaineissa ja puhdistusaineissa tai tahranpoistoaineissa ja koostumuksia, jotka sisältävät kyseisiä seriinipro-teaaseja.

10 Lisäksi tämä keksintö koskee sellaisen oligonukle- otidikoettimen käyttöä, joka hybridisoituu tässä esitettyjen seriiniproteaasien genomi- tai cDNA-klooneissa olevien komplementaaristen DNA-sekvenssien kanssa. Lopuksi tämä keksintö koskee DNA-sekvenssejä, jotka sopivat käytettävik-15 si sellaisen seriiniproteaasin, joka on eristetty kantaa T. album Limber (ATCC 22563) sisältävistä viljelyaineista, ilmentämiseen prokaryootti- tai eukaryootti-isäntäsolussa, ja sellaisten proteaasien eristämismenetelmää.

Tämä keksintö koskee lisäksi puhdistettua ja eris-20 tettyä seriiniproteaasia, jolla Tritirachium album Limber - kannan ATCC 22563 viljelmästä eristetyn seriiniproteaasin rakenteellinen konformaatio (so. yhtä jaksoinen aminohappotähteiden sekvenssi) ja jolle on tunnusomaista, että se on ulkopuolelta peräisin olevan DNA-sekvenssin prokaryootti-25 tai eukaryoottisolussa ilmentämisen tuote.

Tämä keksintö tarjoaa käyttöön myös menetelmän sellaisen seriiniproteaasin tuottamiseksi, jolla on Tritirachium album Limber -kannan ATCC 22563 viljelmästä eristetyn seriiniproteaasin rakenteellinen konformaatio, jossa 30 menetelmässä kasvatetaan sopivissa ravinto-olosuhteissa prokaryootti- tai eukaryootti-isäntäsoluja, jotka on transformoitu tai transfektoitu DNA-vektorilla, joka sisältää sellaisen DNA-sekvenssin, joka sopii käytettäväksi halutun seriiniproteaasin ilmentämiseen prokaryootti- tai euka-35 ryootti-isäntäsolussa, ja eristetään mainitussa vektorissa 5 100602 olevien DNA-sekvenssien ilmentymisen tuottama haluttu se-riiniproteaasi.

Tässä tarjotaan käyttöön myös oligonukleotidikoetti-mia, jotka kykenevät hybridisoitumaan sellaisen DNA-sek-5 venssin kanssa, joka kykenee ilmentämään prokaryootti- tai eukaryootti-isäntäsolussa seriiniproteaasia, jolla on Tri-tirachium album Limber -kannan ATCC 22563 viljelyaineesta eristetyn seriiniproteaasin rakenteellinen konformaatio.

Kuvio 1 esittää proteaasi TW7:n genomikloonin nuk- 10 leotidisekvenssiä.

Kuvio 2 esittää proteaasi TW7:n cDNA-kloonin nuk-leotidisekvenssiä.

Kuvio 3 esittää koodaavan säikeen nukleotidisekvens-siä korreloituna proteaasi TW7:n aminohapposekvenssiin.

15 Kuvio 4 esittää proteaasi TW7:n aminohapposekvenssin vertailun proteinaasi K:n, subtilisiini novon, subtilisiini Carlsbergin, subtilisiini DY:n ja termitaasin aminohapposekvenssin kanssa.

Kuvio 5 esittää proteaasi TW7:n pH-profiileja.

20 Kuvio 6 esittää proteaasi TW7:n lämpötilaprofiileja.

Kuvio 7 esittää proteaasi TW3:n cDNA-kloonin nuk-leotidisekvenssiä.

Kuvio 8 esittää koodaavan säikeen nukleotidisekvens-siä korreloituna proteaasi TW3:n aminohapposekvenssiin.

25 Kuvio 9 esittää proteaasi TW3:n aminohapposekvenssin vertailua proteinaasi K:n, subtilisiini novon, subtilisiini Carlsbergin, subtilisiini DY:n ja termitaasin sekvenssin kanssa.

Kuvio 10 esittää proteaasi TW3:n pH-profiileja.

30 Kuvio 11 esittää proteaasi TW3:n lämpötilaprofii- leja.

Kuvio 12 esittää kaaviota, jossa on kuvattu pCFM 1156 TW7:n konstruoimisessa käytetyt komponentit.

Koska T. album Limber on hitaasti kasvava sieni, 6 100602 joka kykenee tuottamaan proteaaseja ainoastaan pieniä määriä, ei proteinaasi K:n tai minkään muiden subtilisiinin kaltaisten entsyymien tuottaminen suurina, kaupallisina määrinä sienen fermentoinnin avulla ole käytännöllistä.

5 Lisäksi sienen T. album kasvu samoin kuin proteaasien tuottaminen ovat hitaita, minkä johdosta subtilisiinin kaltaisen entsyymin kaupallistaminen on epätaloudellista.

Yksi tämän keksinnön puoli koskee tämän keksinnön mukaisia uusia seriiniproteaaseja koodaavan geenin eristä-10 mistä T. album Limberistä ja sellaisen geenin kloonaamista ja ilmentämistä sopivassa mikro-organismissa. Geeni eristettiin käyttäen deoksiribonukleotidioligomeeria, joka hyb-ridisoituu geenin kanssa, jolla on aktiivisen seriinitäh-teen ympärillä olevia aminohappotähteitä koodaava DNA-sek-15 venssi. Tätä lähestymistapaa käyttäen on eristetty useampia kuin yksi geeni genomikirjastosta. Tämä viittaa siihen, että T. album Limber tuottaa useampaa kuin yhtä seriinipro-teaasia. Proteaasien aminopäiden aminohapposekvenssien todettiin olevan erilaiset. Uudet proteaasit, proteaasi TW7 20 ja proteaasi TW3, eristettiin ja karakterisoitiin.

Proteaasia TW7 koodaava geeni eristettiin genomikir-jastosta. Tarkemmin kuvaten subtilisiinin kaltaisten geenien eristäminen sienen T. album genomikirjastosta käsittää (1) kirjaston konstruoimisen T. album Limberin genomisesta 25 DNA:sta pBR322-plasmidiin; (2) genomikirjaston seulomisen merkityllä oligonukleotidikoettimella, joka hybridisoituu spesifisesti subtilisiinin kaltaisten geenien kanssa; (3) positiivisten kloonien restriktioentsyymianalyysi, jota seuraa Southern blot -hybridisaatio erilaisten restrik-30 tiofragmenttien kanssa sellaisten kloonien identifioimisek si, joissa on koko geeni; (4) koko geenin omaavien restrik-tiofragmenttien jatkokloonaaminen bakteriofagiin M13 DNA-sekvenssianalyysiä varten; (5) osittaisiin DNA-sekvenssi-tietoihin perustuvien oligonukleotidialukkeiden suunnitte-35 lu geenin kummankin säikeen DNA-sekvenssoinnin loppuun suorittamiseksi .

7 100602

Genomin geenin kummankin säikeen sekvenssointi paljasti kahden intronin läsnäolon. Introneja sisältävien geenien ilmentämiseksi mikro-organismeissa, joista puuttuvat silmukoivat entsyymit, esim. B. subtilis, E. coli jne., on 5 tarpeellista uudelleenkonstruoida geeni (so. käyttäen in vitro -silmukoimista) tai hankkia geeni cDNA-kirjastosta. Eristettiin proteaasi TW7:ää ja proteaasi TW3:a koodaavat geenit cDNA-kirjastosta. Subtilisiinigeenien eristäminen T. album Limberin cDNA-kirjastosta käsittää (1) T. album Lim-10 berin kaiken RNA:n eristämisen; (2) RNA:n fraktioinnin oli-gonukleotidi-dT-selluloosa-pylvään avulla ja poly-adenyloidun mRNA-fraktion eristämisen; (3) oligonukleotidi-koettimen käytön Northern blot -analyysissä subtilisiinin kaltaisen mRNA:n läsnäolon varmistamiseksi; (4) cDNA:n syn-15 teesin ja cDNA-kirjaston konstruoimisen pBR322:sta saatuun plasmidiin; (5) cDNA-kirjaston seulomisen 32P:lla merkityllä oligonukleotidikoettimella, jota käytettiin vaiheessa 3; (6) positiivisten cDNA-kloonien eristämisen ja restriktio-analyysin; (7) koko proteiinia koodaavan sekvenssin sisäl-20 tävistä positiivisista cDNA-klooneista saatujen restrik- tiofragmenttien jatkokloonaamisen bakteriofagiin M13 DNA-sekvenssointia varten; (8) oligonukleotidialukkeiden käytön geenin kummankin säikeen DNA-sekvenssoinnin loppuun saattamiseksi .

25 Yllä olevien menetelmien mukaisesti on identifioitu kaksi cDNA-geeniä, joiden DNA-sekvensseistä päätellyt aminohapposekvenssit osoittivat niiden tuotteiden olevan subtilisiinin kaltaisia entsyymejä. Yhdellä geenien tuotteista on kuviossa 3 esitetty aminohapposekvenssi, ja sille 30 annettiin nimitys proteaasi TW7. Proteaasi TW7 osoittaa suunnilleen 53 %:n aminohapposekvenssihomologiaa T. album Limberin proteinaasi K:n kanssa. Proteaasi TW7:n oletettu aminohapposekvenssi osoitti, että, toisin kuin proteinaasi K:11a, tällä proteaasilla on negatiivinen kokonaisvaraus, 35 ja se voidaan sen vuoksi erottaa muista proteaaseista käyt- 8 100602 täen DEAE-sefaroosi- tai DEAEselluloosakromatografiaa. Toiselle oletetuista geenien tuotteista annettiin nimitys pro-teaasi TW3. Tämän proteaasin ja T. album Limberin pro-teinaasi K:n aminohapposekvenssihomologian aste oli suun-5 nilleen 90 %. Proteaasi TW3:n oletettu aminohapposekvenssi osoitti, että entsyymillä on positiivinen kokonaisvaraus, ja se voidaan sen vuoksi erottaa muista proteaaseista CM-selluloosakromatografian avulla.

Tämän keksinnön mukaiset seriiniproteaasit eristet-10 tiin T. album Limber -kannan (CBS 348.55) ATCC-talletusnu-mero 22563 kasvuliemestä seuraavasti:

Nimenomaista sienen T. album kantaa (ATCC 22563) kasvatettiin viljelyaineissa, jotka sisälsivät ainoastaan proteiineja typen lähteinä, esim. kuorittua maitoa, naudan 15 seerumin albumiinia tai soijajauhoa. Kasvuliuoksia tutkittiin proteolyyttisen aktiivisuuden suhteen käyttäen atso-kaseiinia substraattina. Kun proteolyyttinen aktiivisuus saavutti tasanteen tai alkoi vähentyä, kasvuliemi erotettiin sienten huovastoista sentrifugoimalla. Supernatantissa 20 olevat proteiinit saostettiin käyttäen ammoniumsulfaattia. Sakka liuotettiin 20 mM natriumfosfaattipuskuriliuokseen, jonka pH oli 6,0, ja liuosta dialysoitiin samaa puskuri-liuosta vastaan. Liuoksen annettiin kulkea CM-52 (Whatman) -pylvään lävitse proteinaasi K:n kaltaisten entsyymien 25 sieppaamiseksi, ja sen annettiin sitten kulkea DE-52 (Whatman) -pylvään lävitse. Proteinaasi TW7 eluoitui DE-52-pylväästä liuoksella, jossa oli 100 mM NaCl:a 20 mM nat-riumfosfaatissa pH:ssa 6,0. Sitä dialysoitiin vettä vastaan ja sitten lyofilisoitiin. Proteaasi TW3 sitoutui CM-52:een, 30 josta se eluoitiin liuoksella, jossa oli 200 mM NaCl:a 20 » mM natriumfosfaatissa pH:ssa 6,0.

On karakterisoitu tämän keksinnön mukaisten serii-niproteaasien detergenttien kanssa yhteensoveltuvuusominai-suuksia. Kuten on esitetty kuvioissa 5 ja 10, proteaasi TW7 35 ja proteaasi TW3 ovat aktiivisia laajalla pH-alueella.

9 100602

Vaikka maksimiaktiivisuus esiintyy suunnilleen pH:ssa 10, proteaasi TW7:llä on huomattavaa aktiivisuutta pH-alueella 9-13. Lisäksi proteaasi TW7:lla on jäljellä vähintään 45 % sen maksimiaktiivisuudesta puskuriliuoksessa, jonka pH on 5 6,0. Kuten on esitetty kuviossa 6, proteaasi TW7:llä on entsymaattista aktiivisuutta laajalla lämpötila-alueella. Maksimiaktiivisuus esiintyy välillä 60 - 65 °C, vaikka proteaasi TW7:llä on 20 °C:ssa jäljellä vähintään 25 % sen alkuperäisestä aktiivisuudesta. Proteaasi TW7 on stabiili 10 52 °C:ssa eri pH-arvoja omaavissa puskuriliuoksissa. Sen jälkeen kun on inkuboitu yhden tunnin ajan pH:issa 8 ja 10,3, suunnilleen 100 % alkuperäisestä aktiivisuudesta on tallella, kun sen sijaan samankaltaisissa olosuhteissa kaupallinen subtilisiini säilytti vain korkeintaan 30 % alku-15 peräisestä aktiivisuudestaan. 0,5 % SDS:n läsnä ollessa pH: ssa 8,0 proteaasi TW7:llä on säilynyt 100 % sen aktiivisuudesta, kun on inkuboitu yhden tunnin ajan 52 °C:ssa, kun taas kaupallisella subtilisiinilla on säilynyt vain noin 5 - 6 % sen alkuperäisestä aktiivisuudesta.

20 Kuten on esitetty kuviossa 10, myös proteaasi TW3 on aktiivinen laajalla pH-alueella. Proteaasi TW3:lla on esimerkiksi suurin entsymaattinen aktiivisuus pH:ssa 9, vaikka huomattavaa aktiivisuutta esiintyy pH-alueella 7-0. Kuten on esitetty kuviossa 11, proteaasi TW3:n entsymaattisen 25 aktiivisuuden lämpötila-alue on myös laaja. Maksimiaktiivisuus esiintyy välillä 55 - 65 °C, vaikka 25 °C:ssa proteaasi TW3:lla on jäljellä vähintään 32 % aktiivisuudestaan. Tämän johdosta proteaasi TW3 kykenee olemaan aktiivinen laajalla pesulämpötilojen alueella. Lisäksi proteaasi TW3 on hyvin 30 stabiili 50 °C:ssa eri pH-arvoja omaavissa puskuriliuoksis sa. Sen jälkeen kun on inkuboitu yhden tunnin ajan pH:issa 4,0, 8 ja 10,0, 50 - 90 % proteaasi TW3:n alkuperäisestä aktiivisuudesta on tallella, kun taas samankaltaisissa olosuhteissa kaupallinen subtilisiini säilyttää ainoastaan mi-35 nimaalisen aktiivisuuden.

10 100602 Tämän keksinnön mukaisten seriiniproteaasien stabiiliutta on arvioitu erilaisissa pyykinpesuainevalmisteissa. Kaikki läsnä olleet endogeeniset entsyymit inaktivoitiin ennen arviointia kuumentamalla pesuainevalmistetta 65 5 °C:ssa yhden tunnin ajan.

Entsyymin lisäksi tämän keksinnön mukainen kaupallinen pesujauhevalmiste sisältää yleensä: (a) Vähintään yhtä pinta-aktiivista ainetta, joka voi olla anioninen, ioniton tai amfoteerinen tai veteen 10 liukeneva saippua. Tyypillisesti käytetään anionista pinta-aktiivista ainetta (esim. lineaarista alkyyliaryylisul-fonaattia) sekoitettuna ionittoman (esim. alkyylifenyylipo-lyglykolieetteri) kanssa määrinä 5 - 30 ja vastaavasti 1 -5 painoprosenttia pesujauhevalmisteesta.

15 (b) Yhtä tai useampaa tehoainetta, jolla mieluimmin on samanaikaisesti sekvenstrausvaikutus. Natriumtripolyfos-faatti, natriumsitraatti, natriumsilikaatti ja zeoliitit ovat esimerkkejä sellaisista yhdisteistä, jotka käsittävät yleensä 10 - 70 painoprosenttia pesuainevalmisteesta.

20 (c) Valkaisuainetta, mieluimmin peroksiyhdistettä, kuten esimerkiksi natriumperboraattia, jota on tyypillisesti lisätty korkeintaan 30 painoprosenttia valmisteesta käsittävänä määränä.

(d) Apuaineita, kuten esimerkiksi karuboksimetyy-25 liselluloosaa, optisia kirkastaja- aineita ja hajusteita. Tarvittaessa lisätään pH:n säätävää ainetta antamaan pesu-liuokselle pH-arvo 8,0 - 10,5.

Keksinnön mukaista hiukkasmaista proteaasivalmistet-ta lisätään määränä, jonka on laskettu antavan vähintään 30 proteaasiaktiivisuus o,l Anson-yksikköä (AU, vide infra), edullisesti 0,5 - 2,5 AU 100 g:a kohden pesuainevalmistetta. Tarvittaessa voidaan tasata 100 prosentiksi epäorgaanisen täyteaineen, edullisesti natriumsulfaatin, avulla.

Voidaan valmistaa nestemäisiä pesuainevalmisteita 35 entsyymilietteitä, edullisesti ei-vesiväliaineissa. Tyypil- 11 100602 lisesti sellaiset lietteet voivat käsittää suspension, jossa on hienoksi jauhettua proteaasitiivistettä nestemäisessä ionittomassa pinta-aktiivisessa aineessa, esimerkiksi Ter-gitol 15 S 9:ssä, tai sellaisten pinta-aktiivisten aineiden 5 seoksessa. Yleensä liete sisältää myös yhtä tai useampaa epäorgaanista täyteainetta, kuten esimerkiksi hienoksi jauhettua natriumkloridia, haluttaessa sekoitettuna suspension stabiloimisaineen, esimerkiksi savutetun (fumed) piidioksidin (Aerosil 200) kanssa. Tergitol ja Aerosil ovat tavara-10 merkkejä.

Keksinnön mukaista proteaasilietettä lisätään määränä, jonka on laskettu antavan vähintään proteaasiaktii-visuuden 0,1 AU, edullisesti 0,5 - 2,5 AU 100 g:a kohden nestemäistä pesuainevalmistetta.

15 Pesuainevalmisteet voidaan valmistaa tavanomaisesti, esimerkiksi sekoittamalla aineosat yhteen. Vaihtoehtoisesti tehdään esisekoitus, joka sekoitetaan sitten jäljellä olevien aineosien kanssa.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä lisää, 20 vaikka on selvää, ettei keksintö rajoitu näihin erityisiin esimerkkeihin.

Kuvattujen hyvien stabiilius- ja aktiivisuusominai-suuksien johdosta keksinnön mukaista proteolyyttistä entsyymiä voidaan käyttää kaikilla aloilla, joilla yleensä 25 käytetään proteolyyttisiä entsyymejä. Erityisesti sitä voi daan käyttää pesuaineisiin ja puhdistusaineisiin tai tah-ranpoistoaineisiin, karvanpoistoaineena parkituksessa ja myös elintarviketeollisuudessa proteiinihydrolysaattien valmistukseen ja serologiassa epätäydellisten vasta-ainei-30 den osoittamiseen. On erityisen edullista elintarviketeol lisuudessa ja serologiassa käyttöä varten, että keksinnön mukaisen entsyymin stabiilius kiinteässä ja liuotetussa muodossa on niin erinomainen, ettei mahdollisesti tarvita fysiologisesti hyväksyttäviä määriä kalsiumioneja stabiloi-35 maan entsyymiä vesiliuoksissa, toisin kuin muiden entsyymi-valmisteiden tapauksessa.

12 100602

Esimerkki 1

Seriiniproteaasin tuottaminen Tritirachium album Limberistä

Sieni Tritirachium album Limber (CBS348.55, ATCC 5 22563) hankittiin the American Type Culture Collection - talletuslaitoksesta, 912301 Parklawn Dr., Rockville, MD. Sieni kuuluu heimoon Moniliaceae (Limber, 1940, Mycologia, 32, 23 - 30). Sienen tyypillisiä piirteitä ovat läpinäkyvä huovasto, vähäisessä määrin haarautuneet läpinäkyvät koni-10 diot, puhtaan valkea tiivis huovastomatto, joka muodostaa matalan kuvun eli puolipallon. Centralbureau voor Schimmel-cultures (Oosterstraat 1, Baarn, P.O. Box 273, 3740 Ag

Baarn, Alankomaat, ref. MAAS/tvs/714, päivätty 4.10.1985) -laitoksen mukaan kanta on alunperin eristetty kuolleelta 15 iholta. Tämä kanta ei ole sama kanta kuin se (CBS 747.69), jolta proteinaasi K on eristetty.

Sientä Tritirachium album kasvatettiin mallas-pep-toni-agarlevyillä, jotka sisälsivät 3 % mallasuutetta, 0,3 % kaseiinipeptonia ja 2 % baktoagaria. Sienen annettiin 20 muodostaa itiöitä huoneen lämpötilassa 7-8 päivän ajan. Itiöitä koottiin 15 - 20 ml:aan steriiliä tislattua vettä ja pidettiin huoneen lämpötilassa vähintään 30 minuutin ajan ennen siirrostusta nestemäiseen elatusaineeseen.

Proteaasien tuottamiseen käytetyn nestemäisen ela-25 tusaineen koostumus oli joko 2 % kuorittua maitoa ja 0,17 % hiivan typpiperusainesta (luettelon nro 0335-15, Difco

Laboratories, Detroit, MI) tai 1 % naudan seerumin albumiinia (BSA), 1 % glukoosia ja 0,17 % hiivan typpiperusainesta. BSA:ta sisältävä elatusaine steriloitiin johtamalla 30 0,45 pm: n suodattimen lävitse, kun taas kuorittua maitoa sisältävää elatusainetta autoklavoitiin 30 minuutin ajan.

500 ml:aan kutakin elatusainetta siirrostettiin itiösuspensiota, ja saatua seosta ravistettiin. Käytettiin neljästä viiteen tippaa vaahtoamisen estoainetta estämään 35 vaahtoamista ravistamisen aikana. Huovaston ulkopuolisten 13 100602 proteaasien tuottamista tarkkailtiin käyttäen substraattina joko N-sukkinyylialanyylialanyyliprolyylifenyy-lialaniininitroanilidia (Delmar et ai., Anal. Biochem. 99, 316) tai atsokaseiinia (Charney, J. et ai., J. Biol. Chem.

5 177 (1947) 501). Todettiin, että proteaasin tuottaminen oli riippuvaista elatusaineesta. Kuorittua maitoa sisältävissä elatusaineissa suurin määrä proteaasia valmistui 8-9 vil-jelypäivän aikana, kun taas BSA-elatusaineissa proteaasin maksimituotantoa ei esiintynyt ennen kuin 14 15 viljelypäi-10 vän jälkeen. Kummassakin elatusaineessa proteaasiaktiivi- suus laski sen jälkeen kun maksimituotantotaso oli saavutettu.

Esimerkki 2

Subtilisiinin kaltaisten geenien osoittamiseen tar-15 koitetun koettimen suunnittelu ja synteesi

Subtilisiinin kaltaisilla entsyymeillä on yhteistä suuri sekvenssihomologian aste niiden aktiivisen kohdan seriinitähteen ympärillä. Asemassa 221 oleva seriini on aikaisemmin tunnistettu seriiniproteaasien reaktiiviseksi 20 seriiniksi. Sen lisäksi seriiniproteaasin sijoittaminen subtilisiiniryhmään perustuu aminohapposekvenssiin

GLY-THR-SER-MET-ALA

25 Useiden subtilisiinin kaltaisten entsyymien aminohapposekvenssin tarkistaminen on paljastanut, että homologia ulottuu tämän sekvenssin yli seuraavasti:

SER LEU

30 GLY-THR-SER-MET-ALA-THR-PHE-HIS-VAL-ALA-GLY-ALA-ALA-ALA

[Stahl, M. L. et ai., 1984, supra; Wells, J. A. et ai., 1983, supra; Vasantha, N. et ai., 1984, supra; Svendsen, I. et ai.,FEBS Letters 196 (1986) 228 - 232; Koide, Y. et ai., 14 100602 J. Bacteriol. 167 (1986) 110 - 116; Kaneda, M. et al., J.

Biochem. 95 (1984) 825 - 825; Jany, K.-D. et al., Biol.

Chem. Hoppe Seyler 366 (1985) 485 - 492] . Subtilisiineissa olevia aminohappoja koodaavien DNA-sekvenssien analyysi 5 osoitti myös suurta säilymisastetta. Näiden havaintojen perusteella suunniteltiin seuraava deoksioligonukleotidi (41-meeri) koettimeksi samankaltaisia koodaavia sekvenssejä sisältävien geenien tutkimiseksi:

10 5' GCT GCT AIT CCG GCA ACG TGA GGA GTC GCC AT G GAC GTT CC

3'

Koetin syntetisoitiin käyttäen Beaucagen et al. fosfotries-terimenetelmää [Tetrahedron Letters 22 (1981) 1 859 - 1 15 862].

Tämä oligonukleotidikoetin hybridisoituu seriiniproteaasin genomikloonissa tai cDNA-kloonissa olevien komplementaaristen DNA-sekvenssien kanssa lämpötila-alueella 50 - 78 °C riippuen väärien parinmuodostusten lukumäärästä. Sen vuoksi 20 tätä koetinta käytettäessä on tarpeellista suorittaa hybri disaatio ja pesu useissa lämpötiloissa ja suolakonsentraa-tioissa riittävän vakuuttavuuden saavuttamiseksi. 41-merin oligonukleotidia voidaan käyttää koettimena genomi- ja cDNA-kirjastoissa olevien subtilisiinin kaltaisia entsyyme-25 jä koodaavien geenien sekä subtilisiinin kaltaisia entsyy mejä koodaavan mRNA:n tutkimiseen.

Esimerkki 3

Genomin kirjaston valmistaminen ja proteaasi TW7:n geenin eristäminen 30 Huovastot koottiin miracloth-kankaalle kuten aikaisemmin on kuvattu sen jälkeen, kun sienet olivat kasvaneet 9-15 päivää. Huovastot punnittiin ja jäädytettiin nopeasti hii-lihappojäässä ja isopropanolissa. 10 g:n joukkoon jäädytettyjä huovastoja lisättiin 10 g autoklavoitua alumiinioksi-35 dia ja 20 ml lyysipuskuriliuosta (4 % SDS, 20 mM Tris-HCl, 15 100602 pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Saatua seosta jauhettiin viiden minuutin ajan steriilissä huhmaressa käyttäen petkelettä. Lisättiin vielä 20 ml puskuriliuosta ja 40 ml feno- li-kloroformi-isoamyylialkoholia (25:24:1) jauhettuun seok-5 seen, ja lysaattia ravistettiin 20 - 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa ja sentrifugoitiin 10 minuutin ajan. Ve-sifaasia uutettiin fenolilla ja kloroformilla. Lysaattiin lisättiin ribonukleaasi A:ta ja proteinaasi K:ta poistamaan vastaavasti RNA ja proteiini DNA-valmisteesta. Lysaattiin 10 lisättiin etanolia ja DNA puolattiin, suspendoitiin TE:hen (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) ja sitä säilytettiin 4 °C:ssa.

Suoritettiin sienestä T. album eristetyn genomisen -DNA:n täydellinen pilkkominen käyttäen restriktioentsyymejä 15 EcoRI ja BamHI kirjaston valmistamiseksi plasmidivektoriin pBR322. Vektoria pBR322 pilkottiin myös samoilla entsyymeillä ja käsiteltiin sitten alkalisella fosfataasilla. Sen jälkeen kun T. album -DNA-fragmentit oli ligoitu pBR322-vektoriin, suoritettiin kompetenttien HBlOl-solujen trans-20 formaatio käyttäen Mandelin et ai. menettelytapoja, [J.

Mol. Biol. 53 (1970) 159 - 162). Ampisilliinille resistenttejä pesäkkeitä tutkittiin subtilisiinin kaltaisten geenien läsnäolon suhteen käyttäen esimerkin 2 41-meerin oligonuk-leotidikoetinta. Pesäkkeiden nostaminen ja hybridisaatio 25 suoritettiin Grunsteinin et ai. menetelmien mukaan, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72 (1975) 3 961 - 3 965, paitsi että käytettiin geenienseulontakalvoa (NEF-972, New England Nuclear) nitroselluloosan asemesta. Suodattimia käsiteltiin DNA:n denaturoimiseksi in situ, mitä seurasi neutralisoin-30 ti, kuivaaminen ja kuivattaminen 80 °C:ssa tyhjössä. Esi- hybridisaatio suoritettiin 55 °C:ssa 3-4 tunnin aikana 5X Denhardtin liuoksessa, joka sisälsi 200 pg tRNA:ta/ml. Hybridisaatio suoritettiin 55 °C:ssa 20 tunnin aikana liuoksessa, jossa oli 5X SSC, 1 % SDS, IX Denhardtin liuos ja 35 200 pg tRNA/ml. Suodattimia pestiin ankarissa olosuhteissa 16 100602 2X SSC:ssä 55 °C:ssa, kunnes taustan radioaktiivisuus oli merkityksetöntä. Suoritettiin oletettujen positiivisten pesäkkeiden toinen seulontakierros käyttäen 41-meerin oli-gonukleotidikoetinta uudelleensiirrostamalla oletetut posi-5 tiiviset kloonit L-agar-levyille, jotka sisälsivät 50 pg ampisilliinia/ml, ja toistamalla yllä kuvatut seulontavai-heet. Toisen seulontakierroksen seurauksena saatiin vain yksi positiivinen klooni. Positiivista pesäkettä kasvatettiin Luria-liemessä, joka sisälsi 50 pg ampisilliinia/ml. 10 Yli yön kasvatetusta viljelmästä eristettiin plasmidi, joka sisälsi proteaasi TW7:n geenin, käyttäen menetelmiä, jotka on kuvannut Birnboim, Methods in Enzymol. 100 (1983) 243 -154. Southern-blottausta ja laajaa restriktiokartoitusta varten plasmidi puhdistettiin käyttäen cesiumkloridi-eti-15 diumbromidigradientteja ja ultrasentrifugointia. T. album -DNA:n 2,8 kiloemäksen (kb) fragmentin todettiin sisältävän proteaasi TW7:n geenin.

Tämän plasmidin restriktiofragmentit, jotka oli aikaansaatu eri entsyymien avulla, eroteltiin suorittamalla 20 elektroforeesi agaroosigeeleissä, siirrettiin gene screen plus® -kalvoille ja tutkittiin sitten esimerkin 2 41-meerin oligonukleotidikoettimen avulla proteaasi TW7:n täydellisen geenin sisältävän fragmentin identifioimiseksi. Tämän perusteella pääteltiin, että 1 056 nukleotidia sisältävä Eco-25 RI-ClaI-fragmentti sisälsi geenin. Tämä fragmentti jatko-kloonattiin sitten bakteriofagiin M13mpl8 ja M13mpl9 yk-sisäikeisen DNA:n sekvenssointia varten, jos käytettiin yleistä alukefragmenttia [Messings, J., Methods in Enzymol. 101C (1983) 20 - 75] . DNA:n sekvenssoinnissa käytettiin 30 dideoksi-ketjunlopetusmenetelmää, jonka ovat kuvanneet San ger, F. et ai., Proc. National Acad. Sei. USA, 74 (1977) 5 463. Kun oli saatu jokin DNA:n osasekvenssi, käytettiin lisä-oligonukleotidialukkeita geenin kahden säikeen sek-venssoinnin loppuun suorittamiseksi. Näin karakterisoitu 35 geenin nukleotidisekvenssi on esitetty kuviossa 1. Geeni 17 100602 sisältää 1 056 nukleotidia, ja sen rajaavat 5'-päässä olevat restriktioentsyymin EcoRI-kohta ja 3'-päässä oleva Clal-kohta. Fragmentin restriktiokartoitus paljastaa rest-riktioentsyymien Hindlll, Kpnl ja Bgll ainoina esiintyvien 5 kohtien läsnäolon. Tämän geenin koodaamalle oletetulle pro-teaasille annettiin nimitys proteaasi TW7.

Eristetty proteaasi TW7:n geeni koodasi valmiin proteiinin koko aminohapposekvenssin ja oletetun "pro^lueen 12 aminohappoa. Valmiin proteaasi TW7:n koodaavan geenin 10 katkaisee kaksi intronia. Nämä intronit ovat pituudeltaan 54 ja 84 nukleotidia. Intronien tarkka asema määritettiin vertaamalla genomi-DNA:n nukleotidisekvenssejä proteaasi TW7:n cDNArn sekvenssiin. Kyseiset kaksi intronia alkavat nukleotidisekvenssillä GT ja päättyvät sekvenssiin AG.

15 TAG:tä käytetään loppukodonina, jota seuraa toinen TAG kahdeksan kodonin päässä. mRNA:n oletettu käsittely tapahtuu seriinin (mahdollisen pre-prosekvenssin viimeinen aminohappo) ja alaniinin (valmiin proteaasi TW7:n ensimmäinen aminohappo) koodaavien sekvenssien välissä.

20 Esimerkki 4 cDNA-kirjaston valmistaminen ja proteaasi TW7:n cDNA-geenin eristäminen

Vaikka valmiin proteaasi TW7:n koodaava täydellinen geeni saatiin genomikirjastosta, tätä geeniä ei voida käyt-25 tää proteolyyttisen entsyymin ilmentämiseen sellaisissa mikro-organismeissa kuin B. subtilis ja E. coli, koska näistä organismeista puuttuvat entsyymit intronisekvenssien poistamiseksi syntyvästä RNArsta funktionaalisen mRNA:n muodostamiseksi. Yritettiin eristää funktionaalinen mRNA T.

30 album Limber -sienestä, jotta saataisiin komplementaarinen DNA-geeni, jota voidaan ilmentää proteaasi TW7:n tuottamiseen sopivissa mikro-organismeissa.

T. album Limberiä kasvatettiin esimerkissä 1 kuvatussa kuorittu maito -elatusaineessa yhdeksän päivän ajan, 18 100602 mikä jälkeen huovastot koottiin yhdelle kerrokselle mira-cloth-kangasta. Noin 20 g:n joukkoon juuri koottuja huovas-toja lisättiin 100 g steriiliä alumiinioksidia, 45 ml lyy-sipuskuriliuosta (4 % SDS, 1 mM EDTA, 100 mM Na-asetaatti, 5 pH 5,0) ja 20 ml fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholia (25:24:1), huovastoja jauhettiin sitten steriilissä huhmaressa petkelellä 20 minuutin ajan. Sen jälkeen kun oli lisätty 50 ml puskuriliuosta ja 50 ml fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholia, lysaattia ravistettiin huoneen lämpötilas-10 sa 30 minuutin ajan ennen sentrifugointia nopeudella 5 000 x g 15 minuutin ajan. Sen jälkeen kun oli uutettu fenoli: kloroformilla, lisättiin 0,1 tilavuutta 3 M am-moniumasetaattia ja 2,5 tilavuutta etanolia, ja nukleiinihappojen annettiin saostua -20 °C:ssa yön ajan. Eristettiin 15 polyadenyloitu RNA-laji käyttäen oligo-dT-selluloosaa nii den menetelmien mukaan, joita ovat kuvanneet Maniatis et ai. (1982, supra). Jotta estettäisiin RNA:n hajaantuminen näytteiden käsittelyn aikana, kaikkia puskuriliuoksia käsiteltiin 0,1 % dietyylipyrokarbonaatilla ja autoklavoitiin 20 sitten 60 minuutin ajan. Eristetty mRNA-populaatio seostettiin 2,5 tilavuudella etanolia sen jälkeen, kun oli lisätty 0,1 tilavuutta 3 M ammoniumasetaattia.

mRNA-joukon Northern blot -analyysi suoritettiin noudattaen glyoksaali-DMSO-menetelmää, jonka ovat kuvanneet 25 Maniatis et ai. (1982). mRNA-lajit eroteltiin l,l-%:isessa agaroosigeelissä, blotattiin gene screen plus -kalvolle (NEF-976, New England Nuclear) ja hybridisoitiin kinaasilla käsiteltyyn oligomeerikoettimeen, joka edusti proteaasi TW7:n aminopäätä ja jonka nukleotidisekvenssi oli: 30 5' TGGGGCGTCTTCCTGGGTGGC 3'

Esihybridisaatio ja hybridisaatio suoritettiin 55 °C:ssa ja niitä seurasi tarkka pesu 55 °C:ssa ja 60 °C:ssa. 35 Kun suodattimena oli säteilytetty röntgenfilmiä, identi- 19 100602 fioitiin mRNA-populaatiosta yksi ainoa noin 2 000 nukleoti-diemäksen pituinen mRNA-laji, joka sisälsi proteaasi TW7:n koodaavan sekvenssin.

Syntetisoitiin kaksisäikeinen cDNA polyA+ -mRNA-5 templaatin avulla noudattaen menetelmiä, jotka ovat kuvanneet Okayama et ai., Mol. Cell Biol. 2 (1982) 161 - 170.

Kompetentteja E. coli HB101 -soluja transformoitiin plasmi-divektoreilla, jotka sisälsivät cDNAinsertit [Hanahan, J. Mol. Biol. 166 (1983) 557 - 580]. Nitroselluloosasuodatti-10 millä olevista transformoiduista pesäkkeistä tehtiin jäl-jennösviljelmät toiselle sarjalle nitroselluloosasuodatti-mia. Pää- ja jäijennössuodattimia inkuboitiin 37 °C:ssa L-agar-levyillä, jotka sisälsivät 50 μς ampisilliinia/ml, kunnes pesäkkeet olivat kehittyneet (yleensä 2-3 tuntia 15 päälevyjen ja 5 - 6 tuntia jäljennösten tapauksessa). Pää-suodattimia säilytettiin 4 °C:ssa sillä aikaa, kun jäljen-nössuodattimia inkuboitiin yön ajan L-agar-levyillä, jotka sisälsivät 100 pg kloramfenikolia/ml plasmidien lisäämiseksi. Jäljennössuodattimia käsiteltiin DNA:n denaturoimisek-20 si, renaturoimiseksi, lämpökuivattamiseksi, esihybridisoi-miseksi, jota seurasi hybridisaatio sellaisen oligomeerisen koettimen kanssa, jota käytettiin mRNA:n osoittamiseen Northern blot -analyysissä. Sen jälkeen kun oli suoritettu toinen seulontasarja, jossa identifioitiin eristetyt yksit-25 täiset positiiviset pesäkkeet, plasmidi-DNA eristettiin käyttäen Birnboimin menetelmiä (1983, supra). Positiivisten kloonien nukleotidisekvenssointi suoritettiin oleellisesti kuten on kuvattu genomin kloonia varten esimerkin 3 mukaan. Esimerkki 5 30 Proteaasi TW7:n cDNA-geenin karakterisointi cDNA-kloonin nukleotidisekvenssi on määritetty yk-sisäikeisestä ja kaksisäikeisestä DNA:sta. Kuvio 2 esittää proteaasi TW7:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä. Sekvenssin pituus on 1 016 emästä ja se päättyy polyA-häntään. Kloonin 20 100602 restriktiokartasta käy ilmi EcoRI-kohdan läsnäolo lähinnä geenin tuotteen valmiin, eritetyn muodon koodaavan sekvenssin 5'-päätä.

Proteaasi TW7 -geenin cDNA-kloonin nukleotidisek-5 venssi on identtinen genomin kloonin kanssa, paitsi että cDNA-kloonista puuttuvat intronit.

Esimerkki 6 cDNA-kirjaston valmistaminen ja proteaasi TW3:n cDNA-geenin eristäminen 10 Yritettiin eristää funktionaalinen mRNA T. album - sienestä, jotta saataisiin komplementaarinen DNA-geeni, jota voitaisiin lopulta ilmentää teollisuusmikro-organis-meissa proteaasi TW3:n tuottamiseksi suuressa mitassa. T. album -sientä kasvatettiin BSA-elatusaineessa 15 päivän 15 ajan, minkä jälkeen huovastot koottiin yhdelle kerrokselle miracloth-kangasta. Noin 20 g:n joukkoon juuri koottuja huovastoja lisättiin 100 g steriiliä alumiinioksidia ja 45 ml lyysipuskuriliuosta (4 % SDS, 1 mM EDTA, 100 mM Na-ase-taatti, pH 5,0), 20 ml fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholia 20 (25:24:1), ja huovastoja jauhettiin sitten steriilissä huh maressa petkeleellä 20 minuutin ajan. Sen jälkeen kun oli lisätty 50 ml puskuriliuosta ja 50 ml fenoli:kloroformi: -isoamyylialkoholia, sentrifugoitiin 5 000 x g 15 minuutin ajan. Sen jälkeen kun oli uutettu fenoli:kloroformilla, 25 lisättiin 0,1 tilavuutta 3 M ammoniumasetaattia ja 2,5 tilavuutta etanolia, ja nukleiinihappojen annettiin saostua -20 °C:ssa yön ajan.

Polyadenyloidun RNA-lajin eristäminen suoritettiin käyttäen oligo-dT-selluloosaa Maniatiksen et ai. (1982, 30 supra) kuvaamien menetelmien mukaan. Eristetty mRNA-popu-laatio saostettiin 2,5 tilavuudella etanolia sen jälkeen, kun oli lisätty 0,1 tilavuutta 3 M ammoniumasetaattia.

mRNA-populaation Northern blot -analyysi suoritettiin noudattaen glyoksaali-DMSO-menetelmää, jonka ovat ku- 21 100602 vanneet Maniatis et ai. (1982). mRNA-lajit eroteltiin 1,1-%:isessa agaroosigeelissä, blotattiin gene screen plus® kalvolle (NE-976, New England Nuclear) ja hybridisoitiin kinaasilla käsiteltyihin oligomeerikoettimiin, jotka val-5 niistettiin esimerkissä 2. Esihybridisaatio ja hybridisaatio suoritettiin 55 °C:ssa, ja niitä seurasi tarkka pesu 55 °C:ssa ja 60 °C:ssa. Kun suodattimena oli säteilytetty röntgenfilmiä, identifioitiin mRNA-populaatiosta yksi ainoa sellainen noin 2 000 nukleotidiemäksen pituinen mRNA, joka 10 sisälsi proteaasi TW3:n koodaavan sekvenssin.

Jotta estettäisiin RNA:n hajoaminen, kaikkia näissä esimerkeissä käytettyjä puskuriliuoksia käsiteltiin 0,1-%:isella dietyylipyrokarbonaatilla ja autoklavoitiin 60 minuutin ajan. Kaksisäikeinen cDNA syntetisoitiin käyttäen 15 polyA+ -mRNA-templaattia Okayaman et ai. menetelmän mukaan [Mol. Cell Biol. 2 (1982) 161 - 170]. Kompetentteja E. coli HB101 -soluja transformoitiin plasmidivektoreilla, jotka sisälsivät cDNA-insertit [Hanahan, J. Mol. Biol. 166 (1983) 557 - 580]. Nitroselluloosasuodattimilla olevista transfor-20 moiduista pesäkkeistä tehtiin jäijennösviljelmät toiselle sarjalle nitroselluloosasuodattimia. Pää- ja jäljennös-suodattimia inkuboitiin 37 °C:ssa L-agar-levyillä, jotka sisälsivät 50 pg ampisilliinia/ml, kunnes pesäkkeet olivat kehittyneet (yleensä 2-3 tuntia päälevyjen tapauksessa ja 25 5-6 tuntia jäljennösten tapauksessa. Pääsuodattimia säi lytettiin 4 °C:ssa sillä aikaa, kun jäijennössuodattimia inkuboitiin yön ajan L-agar-levyillä, jotka sisälsivät 100 pg kloramfenikolia/ml plasmidien lisäämiseksi.

Jäijennössuodattimia käsiteltiin DNA:n denaturoimi-30 seksi, renaturoimiseksi, lämpökuivaamiseksi, esihybridisoi-

miseksi, mitä seurasi hybridisaatio sellaisen oligomeerisen koettimen kanssa, jota käytettiin mRNA:n osoittamiseen Northern blot -analyysissä. Sen jälkeen kun oli suoritettu toinen seulontasarja, jossa identifiointiin eristetyt yk-35 sittäiset positiiviset pesäkkeet, eristettiin plasmidi-DNA

22 100602 [Birnboim, Methods in Enzymol. 101C (1983) 20 - 75). Positiivisten kloonien nukleotidisekvenssointi suoritettiin seuraavasti: Kloonin täydellistä restriktioanalyysiä seu rasi eri fragmenttien jatkokloonaaminen M13mpl8:aan ja 5 mpl9:ään yksisäikeisen DNA:n sekvenssointia varten. Kak-sisäikeisen DNA:n sekvenssointi suoritettiin käyttäen sek-venssispesifisiä alukkeita. DNA:n sekvenssoinnissa käytettiin dideoksi-ketjunlopetusmenetelmää [Sanger, F. et ai., Proc. Natl. Acad. Science USA, 74 (1977) 5 463].

10 Esimerkki 7

Proteaasi TW3:n cDNA-geenin karakterisointi Saatiin proteaasi TW3:n täysipitkä cDNA-klooni. Klooni koodaa valmiin proteaasin sekä proteaasin oletetun prepro-alueen. Valmiin proteiinin koodaavaa sekvenssiä 15 edeltävässä avoimessa lukuraamissa on neljä ATG:tä. Ensimmäinen AT G koodaa todennäköisimmin alkumetioniinin, koska sitä seuraa alue, jossa on runsaasti hydrofobisia aminohappoja [Von Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 4 683 -4 690]. Oletettu pro-alue käsittää noin 100 aminohappoa, 20 mikä tilanne on hyvin samankaltainen kuin subtilisiinilla (Stahl et ai., 1984 supra).

Valmiin proteiinin nukleotidisekvenssistä määritetyn aminohapposekvenssin prosenttinen homologia proteinaasi K:n sekvenssin kanssa on suuri. Näiden kahden proteaasin välil-25 lä on suunnilleen 90 %:n homologia. On eräitä asemia, joiden aminohappo muistuttaa subtilisiineissa olevaa, mutta ei proteinaasi K:ssa esiintyvää. Esimerkiksi asemassa 143 esiintyy metioniinitähde kaikissa subtilisiineissa samoin kuin proteaasi TW3:ssa, kun sen sijaan proteinaasi K:ssa on 30 siinä asemassa läsnä leusiinitähde. Samalla tavoin asemassa 219 on läsnä alaniinitähde proteaasi TW3:ssa ja subtilisiineissa, mutta ei proteinaasi K:ssa. Lisäksi aminohappojakso Ser-Thr- puuttuu proteinaasi K:sta, mutta on läsnä kaikissa muissa kuviossa 9 asemissa 226 ja 227.

23 100602

Esimerkki 8

Proteolyyttisen aktiivisuuden määrittäminen

Seriiniproteaasien proteolyyttinen aktiivisuus määritettiin seuraavissa esimerkeissä käyttäen substraattina 5 atsoalbumiinia. Entsyymiliuoksen tai entsyymin puskuriliuoksen (kontrollien tapauksessa) näytteitä (20 μΐ) sekoitettiin 1 ml:n kanssa liuosta, jossa oli 0,6 % atsoalbumiinia 0,05 M Tris-HCl:ssa, pH 8,2, (ellei toisin ole mainittu) ja hydrolyyttisen reaktion annettiin tapahtua huoneen 10 lämpötilassa. Reaktio päätettiin 20 minuutin kuluttua lisäämällä 10-%:ista trikloorietikkahappoa (400 μΐ). Hydro-lysaatti erotettiin saostuneesta proteiinista sentrifugoi-malla ja sen optinen tiheys mitattiin aallonpituudella 410 nm verrattuna kontrolliin.

15 Proteaasiaktiivisuus määritettiin myös käyttäen substraattina atsokaseiinia. 500 μ1:η lopullista tilavuutta varten lisättiin 20 μΐ atsokaseiinia (5-%:inen liuos 0,2 M Tris-HCl: ssa, pH 7,5, jossa oli 1 mM CaCl2:a) . 20 μΐ entsyymiä (1 - 10 μς) ja 460 μΐ 50 mM Tris-HCl:a, pH 7,5. 20 Näytteitä inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. Inkuboin-nin jälkeen lisättiin näytteisiin 500 μΐ 10-%:ista TCA:ta, ja näytteitä inkuboitiin jään päällä 15 minuutin ajan. Sen jälkeen kun oli sentrifugoitu kahden minuutin ajan, lisättiin 800 μΐ supernatanttia putkeen, joka sisälsi 200 μΐ 1,8 25 N NaOHra. Sitten mitattiin näytteen optinen tiheys aallonpituudella 420 nm kontrollia vastaan.

Esimerkki 9

Proteaasi TW7:n eristäminen ja puhdistaminen Triti-rachium album Limberin kasvuliemestä 30 Proteaasi TW7 erotettiin ja puhdistettiin T. album - viljelmän solun ulkopuolisesta kasvuliuoksesta. 0, 5 litran osaa T. albumin kasvuliemestä, joka oli saatu esimerkissä 1 kuvatussa BSA-glukoosielatusaineessa suoritetun 15 päivän fermentoinnin jälkeen, sentrifugoitiin kymmenen minuutin 35 ajan. Kirkkaassa supernatantissa olevat proteiinit saostet- 24 100602 tiin käyttämällä ammoniumsulfaattia (180 g) ja koottiin sentrifugoimalla. Saostuma suspendoitiin 0,02 M natriumfos-faattiin, pH 6,0 (50 ml), ja liukenematon materiaali poistettiin sentrifugoimalla. Supernatantissa olevat proteiinit 5 uudelleensaostettiin asetonilla ( 2,5 tilavuutta). Saostuma koottiin sentrifugoimalla ja kerättiin lasisintterisuppi-loon. Saostuma liuotettiin sitten veteen (40 ml), ja saatua liuosta dialysoitiin 4 °C:ssa 0,02 M natriumfosfaattia vastaan, jonka pH oli 6,0. Dialysoitu liuos kirkastettiin 10 sentrifugoimalla, ja sen annettiin sitten kulkea karboksyy-limetyyliselluloosa (CM-52, Whatman) -pylvään ( 2,5 x 10 cm) lävitse nopeudella 2 ml minuutissa, minkä jälkeen pylvästä pestiin 0,02 M natriumfosfaatilla, pH 6,0 (30 ml).

Läpi virrannut liuos ja pesuliuos yhdistettiin, ja pro-15 teiinit saostettiin lisäämällä 2,5 tilavuutta asetonia. Saostuma erotettiin sentrifugoimalla, suodatettiin ja kuivattiin tyhjössä. Asetonijauhe (185 mg) liuotettiin 0,02 M natriumasetaattiin, pH 5,0 (2 ml), ja lisättiin Sephadex G-75 -molekyyliseulapylvääseen (2,5 x 90 cm). Fraktiointi 20 molekyyliseulapylväässä suoritettiin 0,02 M natriumasetaa-tilla, pH 5,0 , käyttäen virtausnopeutta 6 ml tunnissa.

Koottiin 2 ml:n fraktioita ja niistä tarkastettiin UV-ab-sorbanssi aallonpituudella 275 nm. Pylväästä eluoituneesta kolmesta pääpiikistä ainoastaan yksi osoitti proteolyyttis-25 tä aktiivisuutta kromogeenisen proteiinisubstraatin atsoal-bumiini hydrolysoinnissa. Tässä piikissä (välillä 102 - 110 ml) oleva entsyymi saostettiin asetonilla (2,5 tilavuutta) ja koottiin sentrifugoimalla. Saostuma liuotettiin 2 mM kalsiumasetaattiin (20 ml), ja liuosta dialysoitiin 4 30 °C:ssa vettä vastaan ja sitten lyofilisoitiin. Pelkistetyn ‘ näytteen SDS-PAGE:ssa tuli esille proteaasi TW7 yhtenä pää- vyöhykkeenä (>95 %), jonka näennäinen molekyylipaino oli 35 000 daltonia.

25 100602

Esimerkki 10

Proteaasi TW7:n aminopään analyysi

Proteaasi TW7 puhdistettiin viljelmän supernatantis-ta, kuten on kuvattu esimerkissä 9. Puhdistettu proteiini 5 inaktivoitiin sitten PMSFrllä (fenyylimetyylisulfonyyli- fluoridi) ja puhdistettiin lisäksi käyttäen HPLC:a. Ami-nopää määritettiin liuottamalla proteiini uudelleen 50-%:iseen trifluorietikkahappoon (TFA), joka sisälsi 1 mM PMSFra. Suoritettiin automatisoitu kaasufaasi-Edman-hajoi-10 tus aminopään analysoimiseksi, ja aminopään määritettiin olevan Ala-Thr-Gln-Glu-Asp-Ala-Pro-Trp-Leu-Ala-Arg-Ile-Ser-Ser.

Esimerkki 11

Proteinaasi TW7:n pH-profiili 15 Määritettiin proteinaasi TW7:n pH-profiili 25 °C:ssa käyttäen substraattina atsoalbumiinia. Valmistettiin subst-raattiliuoksia, jotka sisälsivät 0,6 % atsoalbumiinia nat-riumfosfaatti-natriumboraattipuskuriliuoksissa, joiden pH:t kattoivat alueen väliltä 5,0 - 12,75. Atsoalbumiiniliuok-20 siin lisättiin joko 10 μΐ liuosta, jossa oli pitoisuutena 1 mg/ml proteinaasi TW7:ä vedessä, tai 10 μΐ vettä (kontrolli) , ja kunkin liuoksen proteolyyttinen aktiivisuus määritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 8. Proteinaasi TW7:n pH-profiili on esitetty kuviossa 5, jossa on esitetty 25 graafisesti prosenttimäärä maksimaalisesta proteolyyttises-tä aktiivisuudesta pH:ta vastaan. Proteinaasi TW7:n optimi-pH-alueen on määritetty olevan pH-alueella 9-11.

Esimerkki 12

Proteinaasi TW7:n lämpötilaprofiili 30 Määritettiin proteinaasi TW7:n lämpötilaprofiili 0,05 M natriumfosfaatissa pHrssa 8,5 mittaamalla proteolyyttinen aktiivisuus lämpötila-alueella 20 - 70 °C. Osia (1 ml) liuoksesta, jossa oli 0,6 % atsoalbumiinia 0,05 M natriumfosfaatissa, pH 8,5, inkuboitiin eri lämpötiloissa, 35 ja sen jälkeen kun oli lisätty entsyymiliuos (20 μΐ, liuos- 26 100602 ta, jossa oli 0,5 mg proteinaasi TW7:ä ml:aa kohden samaa puskuriliuosta), tai 20 μΐ puskuriliuosta (kontrolli), reaktion annettiin tapahtua 10 minuutin ajan, ja se päätettiin sitten lisäämällä 10-%:ista trikloorietikkahappoa (400 5 μΐ) . Proteinaasi TW7:n lämpötilaprofiili on esitetty kuviossa 6, jossa on esitetty graafisesti prosenttimäärä mak-simiaalisesta entsyymiaktiivisuudesta lämpötilaa vastaan. Kuten kuviossa 6 on havainnollistettu, proteinaasi TW7:n paras lämpötila on väliltä 57 - 62 °C.

10 Esimerkki 13

Proteaasin stabiiliuden määrittäminen pesuaineen läsnäollessa

Proteaasi TW7:n stabiiliutta pesuaineliuoksissa sekä pesuainetta sisältämättömissä liuoksissa verrattiin subti-15 lisiini Carlsbergin ja proteinaasi K:n stabiiliuteen. Valmistettiin liuoksia, joissa oli arvioitavia entsyymejä sopivissa puskuriliuoksissa siten, että eri entsyymiliuosten alkuperäinen proteolyyttinen aktiivisuus oli samankaltainen mitattuna esimerkissä 8 kuvatun atsoalbumiinimäärityksen 20 avulla. Liuoksia inkuboitiin 52 °C:ssa, ja niistä otettiin näytteitä, ja näistä määritettiin jäljellä oleva entsyymiaktiivisuus. Saadut tulokset on esitetty taulukoissa 1 ja 2. Jäljellä oleva entsyymiaktiivisuus on ilmaistu prosentteina alkuperäisestä entsyymiaktiivisuudesta.

27 100602

Taulukko 1

Proteaasi TW7:n stabiilius verrattuna proteinaasi K:n ja subtilisiini Carlsbergin stabiiliuteen 0,1 M nat-riumfosfaatissa, pH 8,0, jossa on tai ei ole SDS:a.

5 Ilman SDS:a:

Proteaasi 0 tuntia 1 tunti 2 tuntia proteaasi TW7 100 % 106 % 102 % 10 proteinaasi K 100 % 67 % 43 % subtilisiini

Carlsberg 100 % 29 % 8 % 0,5-%:inen SDS: 15

Proteaasi 0 tuntia 1 tunti 2 tuntia 4 tuntia proteinaasi TW7 100 % 99 % 99 % 92 % proteinaasi K 100 % 32 % 9,5 % 0 % 20 subtilisiini

Carlsberg 100 % 5 % 0 % 0 %

Taulukko 2 25 Proteaasi TW7:n stabiilius verrattuna subtilisiini

Carlsbergin stabiiliuteen 0,1 M natriumglysinaatissa, pH 10,30, joka sisältää 0,5 % SDS:a

Proteaasi t = 0 t = 1 tunti t = 18 30 tuntia proteaasi TW7 100 % 105 % 80 % 5,6 tuntia subtilisiini

Carlsberg 100 % 11,3 % 0 % 0,3 tuntia subtilisiini 35 BPN 100 % 6,6 % 0 % 0,25 tuntia 28 100602

Esimerkki 14

Proteaasi TW7:n stabiilius pesuainevalmisteissa

Arvioitiin proteaasi TW7:n ja proteinaasi K:n stabiiliutta kolmessa entsyymiä sisältävässä kaupallisessa 5 pyykinpesuaineessa, Era Plus® (valmistanut Procter & Gamble) , Tide® (valmistanut Procter & Gamble) ja Dynamo® (valmistanut Colgate-Palmolive). Väkevät varastopesuaineet laimennettiin kymmenkertaisesti deionisoidulla vedellä. Endo-geeninen proteaasi inaktivoitiin inkuboimalla laimennettua 10 pesuainetta 65 °C:ssa yhden tunnin ajan ennen arvioitavan proteaasin lisäämistä. Arvioitavan proteaasin suhteellinen aktiivisuus kussakin pesuainevalmisteessa säädettiin suunnilleen samaksi kuin alkuperäisessä pesuainevalmisteessa läsnä ollut entsymaattinen aktiivisuus.

15 Arvioitavia proteaaseja sisältävää deaktivoitua pe suainetta inkuboitiin 52 °C:ssa yhdessä aktiivista endo-geenista entsyymiä sisältävän pesuaineen kanssa. Eri inku-baatioaikojen jälkeen jäljellä oleva proteolyyttisen aktiivisuuden määrä määritettiin ottamalla näytteitä ja ana-20 lysoimalla esimerkissä 8 kuvattujen menetelmien mukaan.

Proteaasi TW7:n todettiin olevan stabiili kaikissa testatuissa pesuainevalmisteissa. Esimerkiksi seoksessa, joka sisältää deaktivoitua Era Plus® -pesuainetta, proteaasi TW7:llä on jäljellä 100 % entsyymiaktiivisuudesta kuuden 25 tunnin inkuboinnin jälkeen, verrattuna endogeenisella entsyymillä jäljellä olevaan vain 12 %:iin. Seoksessa, joka sisälsi deaktivoitua Dynamo® -pesuainetta, proteaasi TW7:lla oli jäljellä 76 % entsyymiaktiivisuudesta 29 tunnin inkuboinnin jälkeen.

30 Proteaasi TW7:n stabiiliutta tutkittiin myös pyykin- ‘ pesuainetta Wisk® sisältävässä seoksessa, jonka pesuaineen koostumukseen ei sisälly entsyymejä. Sen jälkeen kun varas-topesuaine oli laimennettu 1:10 deionisoidulla vedellä, lisättiin proteinaasi K:ta tai proteaasi TW7:ä, ja saatua 35 seosta inkuboitiin 52 °C:ssa eri pituisia aikoja. Jäljellä oleva aktiivisuus määritettiin käyttäen esimerkissä 8 ku- 29 100602 vattuja menetelmiä. Proteaasi TW7 oli stabiilimpi kuin pro-teinaasi K, kuten on esitetty taulukossa 4, jossa 3,5 tunnin inkuboinnin jälkeen proteinaasi K:lla oli jäljellä vain 20,1 % alkuperäisestä aktiivisuudesta, kun taas proteaasi 5 TW7:llä oli jäljellä suunnilleen 90 % sen alkuperäisestä entsymaattisesta aktiivisuudesta.

Taulukko 3

Pesuainevalmiste 10 (entsyymi)

Aika

Era Plus® 3 tuntia 6 tuntia (proteaasi TW7) 95 90 (proteinaasi K) 79 64 15 (endogeeninen entsyymi) 36 11

Tide® 1 tunti 2 tuntia 24 tuntia (proteaasi TW7) 107 104 64 (proteinaasi K) 58 23 0 20

Dynamo® 29 tuntia (proteaasi TW7) 76 (proteinaasi K) 34,4 (endogeeninen entsyymi) 22 ; 25

Wisk® 1,3 tuntia 3,5 tuntia (proteaasi TW7) 95,7 89,5 (proteinaasi K) 44,3 20,1 30 Kokeet suoritettiin kuten on kuvattu esimerkissä 14.

On ilmoitettu eri ajankohtien jälkeen jäljellä oleva prosenttimäärä alkuperäisestä aktiivisuudesta.

» 100602

Esimerkki 15

Proteinaasi TW7:n ilmentäminen

Syntetisoitiin oligonukleotidiadaptori valmiin pro-teaasi TW7:n koodaavan geenin liittämiseksi ilmentämisvek-5 toriin pCFM 1156 E. colissa ilmentämistä varten. Adaptorin sekvenssi on seuraavanlainen:

AATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGCCACCCAGGAAGACGCCC

GATCTTCCTCCTTATTGTATACCGGTGGGTCCTTCTGCGGGGTAC

10

Rekombinanttiplasmidin konstruoiminen E. colissa ilmentämistä varten käsitti seuraavat vaiheet: (1) Sellaisen kaksisäikeisen oligonukleotidin konstruoimisen, joka sisältää ilmentämisvektorin pCFM 1156 Xbal- 15 kohdasta Ndel-kohtaan ulottuvan osan, mukaan lukien ATG-sekvenssi, jota seuraa valmiin proteaasi TW7:n geenin aminoterminaalinen sekvenssi lähtien GCC:sta ensimmäiseen NCoI-kohtaan asti. 5'-päähän lisättiin lisänukleotideja, jotta saataisiin ylimääräinen EcoRI-kohta, joka helpottaa 20 konstruoimista.

(2) Kuten on havainnollistettu kuviossa 12, proteaasi TW7:n cDNA pilkottiin täydellisesti restriktioentsyymil-lä EcoRI ja osittain NcoI:llä suuren EcoRI-NcoI-palasen saamiseksi, johon kinaasilla käsiteltyyn EcoRI-NcoI:een 25 ligoitiin adapteri, jotta saataisiin proteaasi TW7:n cDNA- geeni, jossa on adaptori.

(3) Proteaasi TW7:n uudelleenkonstruoitua cDNA:a pilkottiin sitten EcoRI:llä ja Cla:lla, jotta saataisiin proteaasi TW7:n geeni, joka liitettiin Ml3mpl8:aan, jota 30 oli jo pilkottu EcoRI:llä ja Accl:llä.

(4) Proteaasi TW7:n geenin sisältävää M13mpl8:a pilkottiin restriktioentsyymeillä Xbal ja Hindlll proteaasi TW7 -geenin pelastamiseksi.

(5) Ilmentämisvektoria pCFM 1156 pilkottiin myös 35 restriktioentsyymeillä Xbal ja Hindlll M13mpl8:sta saadun 31 100602 proteaasi TW7 -geenin liittämiseksi Xbal - Hindlll-frag-menttina.

Täten rakentaen tulokseksi saatu rekombinanttiilmen-tämisplasmidi sisälsi pL-promoottorin, Shine Dalgarno -sek-5 venssin, ATG:n, jota seurasi valmiin proteaasi TW7 -proteiinin koodaava nukleotidisekvenssi.

Kompetentteja E. coli FMII -soluja (ln‘, ptr3") transformoitiin tällä rekombinanttiplasmidilla.

Transformoiduista soluista eristettiin plasmidi-DNA, 10 ja positiiviset kloonit identifioitiin pilkkomalla plasmi-di-DNA:ta Xbalrllä ja HindIII:lla. Yhtä positiivisista klooneista kasvatettiin yön ajan 20 pg kanamysiiniä/ml sisältävään Luria-liemielatusaineeseen siirrostusta varten. Soluja kasvatettiin 30 °C:ssa, kunnes saavutettiin optinen 15 tiheys 0,25 aallonpituudella 600 nm. Inkubaatiolämpötila muutettiin sitten 42 °C:ksi kahden tunnin ajaksi plasmidis-ta syntyvien geenituotteiden indusoimiseksi.

E. coli -solut koottiin sentrifugoimalla alhaisella nopeudella. Pelletti punnittiin ja suspendoitiin sitten 10 20 tilavuuteen 50 mM Tris-HCl:a, pH 7,5. Solut hajoitettiin johtamalla ne kolme kertaa ranskalaisen puristimen (French press) lävitse. Toisen sentrifugoinnin jälkeen saatua pel-lettifraktiota uutettiin liuoksella, jossa oli 5 M ureaa, 50 mM Tris-HCl:a, pH 8,0. Ureaan liukenevia proteiineja 25 analysoitiin käyttäen erilaisia tekniikkoja.

Proteiinit pelkistettiin β-merkaptoetanolilla, ja niille suoritettiin elektroforeesi 10-%:isessa polyakryy-liamidigeelissä SDS:n läsnä ollessa. Laatuaan ainoa 35 000 daltonin proteiini oli huomattavin vyöhyke, joka oli läsnä 30 rekombinanttiplasmidin sisältävästä E. colista, mutta ei pelkän vektorin sisältävästä E. colista, saadussa ureaan liukenevassa fraktiossa. Se liikkui yhdessä T. albumista puhdistetun proteaasi TW7:n kanssa. Tämä proteiini reagoi myös spesifisesti sienen proteaasi TW7:ä vastaan tuotetun 35 vasta-aineen kanssa Western blot -analyysissä. Tämä pro- 32 100602 teiini eristettiin polyakryyliamidigeelistä aminoterminaa-lisen alueen sekvenssien identifioimiseksi, joka alue vastasi sienen proteaasi TW7:n aluetta.

Rekombinanttiproteaasi TW7 on entsyyminä inaktiivi-5 nen, kun se on eristetty E. colista, ennen uudelleenlaskos-tumista. Uudelleenaktivointia varten proteiini suspendoi-tiin liuokseen, jossa oli 8 M ureaa, 10 mM DTTrtä, 2S mM Tris-HCl:a, pH 8,5, lopulliseksi konsentraatioksi 1 mg proteiinia ml:a kohden ja sidottiin sitten DE52-hartsiin, joka 10 oli etukäteen tasapainotettu 25 mM Tris-HCl:lla, pH 8,5, huoneen lämpötilassa. Urea poistettiin pesemällä hartsia samalla puskuriliuoksella, jossa ei ollut glutationia, ja sitten sellaisella, jossa oli 4 mM glutationia (pelkistettyä) ja 0,4 mM glutationia (hapetettua). Sen jälkeen kun 15 hartseja oli inkuboitu yön ajan yllä olevien reagenssien, so. 25 mM Tris-HCl, pH 8,5, 4 mM glutationi (pelkistetty) ja 0,4 mM glutationi (hapetettu), läsnä ollessa, proteiini eluoitiin pylväässä 50 mM Tris-HCl:11a, pH 7,5, joka sisälsi 0,3 M NaCl:a, ja saostettiin kolmella tilavuudella ase-20 töniä. Tällä renaturoidulla proteiinilla oli proteaasiak- tiivisuus kromogeenistä substraattia (esimerkki 1) ja kaseiinia kohtaan.

Esimerkki 16

Proteinaasi TW3:n eristäminen ja puhdistaminen Tri-25 tirachium album Limberin kasvuliemestä 0,5 litraa Tritirachium album Limberin kasvulientä, joka oli saatu esimerkissä 1 kuvatussa BSA-glukoosielatus-aineessa suoritetun 15 päivän fermentoinnin jälkeen, sent-rifugoitiin nopeudella 15 000 x g 10 minuutin ajan. Kirk-30 kaassa supernatantissa olevat proteiinit saostettiin ammoniumsulfaatilla (180 g) ja koottiin sentrifugoimalla. Saostuma suspendoitiin 0,02 M natriumfosfaattiin, pH 6,0 (50 ml), ja sen jälkeen kun liukenematon materiaali oli poistettu sentrifugoimalla, supernatantissa olevat pro-35 teiinit uudelleensaostettiin asetonilla (2,5 tilavuutta).

33 100602

Saostuma koottiin sentrifugoimalla ja kerättiin lasisintte-risuppiloon. Saostuma liuotettiin veteen (40 ml), ja liuosta dialysoitiin 4 °C:ssa 0,02 M natriumfosfaattia vastaan, jonka pH oli 6,0. Dialysoitu liuos kirkastettiin sentrifu-5 goimalla ja sen annettiin kulkea karboksyylimetyylisellu-loosa (CM-52, Whatman) -pylvään (2,5 x 10 cm) lävitse nopeudella 2 ml minuutissa, minkä jälkeen pylvästä pestiin 0,02 M natriumfosfaatilla, pH 6,0, (30 ml). Läpi virrannut liuos ja pesuliuos yhdistettiin, ja proteiinit saostettiin 10 lisäämällä 2,5 tilavuutta asetonia.

Eluointi CM-52-pylväästä suoritettiin käyttäen lineaarista gradienttia, jonka muodosti 0 - 0,4 M NaCl nat-riumfosfaatissa, pH 6,0. Fraktiot tutkittiin spektrofoto-metrisesti (aallonpituudella 420 nm) proteolyyttisen aktii-15 visuuden suhteen pH:ssa 8,2, kuten on kuvattu esimerkissä 8. Entsyymiaktiivisuuden sisältävät piikin fraktiot yhdistettiin, dialysoitiin 4 °C:ssa vettä vastaan ja sitten lyo-filisoitiin. 2-merkaptoetanolilla käsitellyn näytteen SDS-PAGE:ssa näkyi proteaasi TW3 huomattavana vyöhykkeenä 20 (Coomassie blue -värjäyksen perusteella >96 %), jonka näennäinen molekyylipaino oli 31 000 daltonia.

Esimerkki 17

Proteaasi TW3:n aminopään analyysi

Proteaasi TW3 puhdistettiin viljelmän supernatantis-25 ta, kuten on kuvattu esimerkissä 16. Puhdistettu proteiini inaktivoitiin sitten PMSF:lla (fenyylimetyylisulfonyyli-fluoridi) ja puhdistettiin lisäksi käyttäen HPLC:a. Aminopää määritettiin liuottamalla proteiini uudelleen 50-%:iseen trifluorietikkahappoon (TFA), joka sisälsi 1 % 30 PMSF:a. Suoritettiin automatisoitu kaasufaasi-Edman-hajoi-tus aminopään analysoimiseksi. Aminopään todettiin olevan Ala-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Pro-Trp-Gly-Leu-Ala-Arg-Ile-Ser-Ser-Thr.

34 100602

Esimerkki 18

Proteinaasi TW3:n pH-profiili Määritettiin proteaasi TW3:n pH-profiili 25 °C:ssa käyttäen substraattina atsokaseiinia. Valmistettiin subst-5 raattiliuosta (0,6 %) M puskureihin, joiden pH:t kattoivat alueen 5,0 - 10. Näihin atsokaseiinin liuoksiin lisättiin joko 20 μΐ pitoisuuden 1 mg/ml omaavaa proteaasi TW3:n vesiliuosta tai 20 μΐ vettä (kontrolli), ja proteolyyttinen aktiivisuus määritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 8. 10 Proteinaasi TW3:n pH-profiili on esitetty kuviossa 10, jossa on esitetty graafisesti prosenttimäärä maksimiaktiivi-suudesta pH:ta vastaan. Proteaasi TW3:n pH-optimin määrittäminen olevan pH 9.

Esimerkki 19 15 Proteinaasi TW3:n lämpötilaprofiili

Proteaasi TW3:n lämpötilaprofiili määritettiin 0,05 M natriumfosfaatissa pH:ssa 8,5 lämpötila-alueella 4-65 °C todetun proteolyyttisen aktiivisuuden perusteella (atso-kaseiinimääritys). Näitä mittauksia varten osia (1 ml) li-20 uoksesta, jossa oli 0,6 % atsokaseiinia 0,05 M natriumfos-faatissa, pH 8,5, inkuboitiin eri lämpötiloissa, ja sen jälkeen kun oli lisätty entsyymiliuos (20 μΐ liuosta, jossa oli 0,5 mg proteinaasi TW3:a ml:a kohden samaa puskuriliuosta) tai 20 μΐ pelkkää puskuria (kontrolli), reaktion 25 annettiin tapahtua 10 minuutin ajan, ja se päätettiin sitten lisäämällä 10-%:ista trikloorietikkahappoa ( 400 μΐ ). Proteaasi TW3:n lämpötilaprofiili on esitetty kuviossa 11, jossa on esitetty graafisesti prosenttimäärä maksimaalisesta proteolyyttisestä aktiivisuudesta lämpötilaa vastaan. 30 Kuten kuviossa 5 on esitetty, proteaasi TW3:n optimilämpö-tila on väliltä 55 - 60 °C.

35 100602

Esimerkki 20

Proteaasi TW3:n ja subtilisiinin stabiiliuden vertaileva tutkimus

Tutkittiin proteaasi TW3:n ja kaupallisen subtili-5 siinin (Sigma, proteaasi VII, luettelon nro 5 255) stabiiliutta 52 °C:ssa substraattien poissa ollessa. Kokeet suoritettiin kolmessa eri pH:ssa (4,0, 8,0 ja 10,0). Inkuboi-tiin suunnilleen 0,2 mg entsyymiä/ml 50 °C:ssa. Määrätyn aikavälin jälkeen jäljellä oleva aktiivisuuden määrä mitat-10 tiin ottamalla 10 μ1:η näyte ja määrittämällä proteolyytti-nen aktiivisuus, kuten on esitetty pääpiirteittäin esimerkissä 8. Taulukossa 4 on esitetty saadut tulokset. Tulos esittää säilynyttä entsymaattista aktiivisuutta prosentteina alkuperäisestä entsymaattisesta aktiivisuudesta. Pro-15 teaasi TW3 osoitti parasta stabiiliutta. Esimerkiksi pH:ssa 8,0 sen jälkeen kun oli inkuboitu yksi tunti 50 °C:ssa, proteaasi TW3:n alkuperäisestä aktiivisuudesta oli 90 % jälj ellä, kun sen sijaan subtilisiinin alkuperäisestä aktiivisuudesta oli jäljellä ainoastaan 2 %. Kahden tunnin 20 inkuboinnin jälkeen oli proteaasi TW3:n aktiivisuudesta 96 % jäljellä, verrattuna 0,6 %:iin subtilisiinin aktiivisuudesta. Proteaasi TW3 oli myös stabiilimpi kuin subtilisiini pHiissa 4,0 ja 10,0.

Taulukko 4 25 pH 8,0: Aika

Entsyymi 1 tunti 2 tuntia 3 tuntia TW3 89,5 97,3 87,4 subtilisiini 2,1 0,6 0,8 30 pH 10,0:

Entsyymi 1 tunti 2 tuntia 3 tuntia TW3 96,8 82,7 74 substilisiini 30,5 9,8 3,5 35 ,β 100602 36 pH 4,0:

Entsyymi 1 tunti 2 tuntia 3 tuntia TW3 49,3 36 20,5 subtilisiini 00 0 5

Esimerkki 21

Proteaasi TW3:n stabiilius kaupallisessa pyykinpesu-aineissa

Tutkittiin proteaasi TW3:n samoin kuin myös subtilisiinin 10 stabiiliutta kolmessa entsyymiä sisältävässä kaupallisessa pyykinpesuaineessa. Nämä olivat Era Plus® (valmistanut Procter & Gamble), Tide® (valmistanut Procter & Gamble) ja Dynamo® (valmistanut Colgate-Palmolive). Väkevät varasto-pesuaineet laimennettiin 200-kertaisesti deionisoidulla 15 vedellä. Endogeeninen proteaasi inaktivoitiin inkuboimalla laimennettua pesuainetta 65 °C:ssa yhden tunnin ajan ennen kuin lisättiin joko proteaasi TW3:a, proteaasi TW7:ä, pro-teinaasi K: ta tai subtilisiinia siten, että saavutettiin alkuperäisessä pesuainevalmisteessa läsnä ollut entsyymiak-20 tiivisuus.

Inaktivoitua pesuainetta, johon oli lisätty pro-teaaseja, inkuboitiin 50 C:ssa eri pituisia aikoja yhdessä pesuaineen kanssa, joka sisälsi aktiivista endogeenista entsyymiä. Eri inkubointiaikojen jälkeen jäljellä oleva 25 proteolyyttisen aktiivisuuden määrä määritettiin ottamalla näytteitä ja suorittamalla määritys esimerkissä 8 kuvattujen menetelmien mukaan.

Kuten on esitetty taulukossa 5, proteaasi TW3 on hyvin stabiili kaikissa testatuissa pesuainevalmisteissa. 30 Esimerkiksi seoksessa, joka sisälsi pesuainetta Era Plus® 94 % sen aktiivisuudesta oli jäljellä yhden tunnin inku- boinnin jälkeen, kun sen sijaan endogeenista entsyymiä sisältävä laimennos oli täydellisesti inaktivoitunut. Seoksessa, joka sisälsi Dynamoa, oli proteaasi TW3:n aktiivi-35 suudesta 80 % jäljellä yhden tunnin inkuboinnin jälkeen, 37 100602 verrattuna vain ei todettavissa olevaan aktiivisuuden määrään laimennoksessa, joka sisälsi endogeenistä entsyymiä. Pesuainetta Tide® sisältävässä seoksessa oli TW3:n alkuperäisestä aktiivisuudesta 48 % jäljellä, kun sen Sijaan en-5 dogeenistä entsyymiä sisältävässä laimennoksessa oli jäljellä 23 % aktiivisuudesta yhden tunnin jälkeen. Subti- lisiini inaktivoitu! kaikissa tapauksissa yhden tunnin kuluessa .

Proteaasi TW3:n stabiiliutta tutkittiin myös pyykin-10 pesuaineessa Wisk®, jonka koostumukseen ei sisälly entsyymiä. Sen jälkeen kun varastopesuaine oli laimennettu 1:200 deionisoidulla vedellä, lisättiin laimennettuun pesuaineeseen subtilisiinia tai proteaasi TW3:a, ja näytteitä inku-boitiin 50 °C:ssa. Proteolyyttinen aktiivisuus määritettiin 15 käyttäen esimerkissä 8 pääpiirteittäin esitettyä menetel mää. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 5.

Taulukko 5

Pesuainevalmiste 20 (Entsyymi) Aika 10' 20' 30' 60' ERA Plus® (TW7) 83,4 94,5 87,7 89 25 (TW3) 87,7 89,1 92,2 94,8 (subtilisiini) 3,9 1,3 1,5 1,8 (endogeeninen entsyymi) 50,0 37,7 24,7 0 (proteinaasi K) 83,2 84,1 86,7 79,7 30 Tide® (TW7) 103,5 111 99,6 110 (TW3) 78 55,7 68 48 (subtilisiini) 1,8 0,8 0,74 0,5 (endogeeninen entsyymi) 22,6 22 21,9 23,5 35 (proteinaasi K) 83 75 62 35,4 38 100602

Dynamo® (TW7) 84,9 90 85,9 89,3 (TW3) 83 90,8 82 87,5 (subtilisiini) 30 10,8 3,6 0,5 5 (endogeeninen entsyymi) 52 32,5 15,1 0 (proteinaasi K) 81,3 83 79,9 87,4

Wisk® (TW7) 89,1 87,1 90,8 90 10 (TW3) 58,3 43,5 28,2 6 (subtilisiini) 21 36 0,7 0,5 (endogeeninen entsyymi) 0 000 (proteinaasi K) 57,6 39,7 19,7 2,8 15 Monenlaiset muut esimerkit ja yllä olevien kuvauksen ja esimerkkien muunnokset tulevat olemaan alan asiantuntijalle ilmeisen selviä tämän esityksen lukemisen jälkeen ilman että poiketaan keksinnön hengestä ja piiristä, ja on tarkoitus, että kaikki sellaiset esimerkit tai muunnokset 20 sisältyvät liitteenä olevien patenttihakemusten suojapii-riin.

Claims (16)

39 100602

1. Seriiniproteaasi, tunnettu siitä, että se on TW7, jolla on kuviossa 3 esitetty aminohapposekvens- 5 si, tai TW3, jolla on kuviossa 8 esitetty aminohapposekvenssi .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seriiniproteaasi, tunnettu siitä, että sillä on aminoterminaalinen ryhmä kohdassa Ala1.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seriiniproteaasi, tunnettu siitä, että se on eksogeenisen DNA-sekvenssin prokaryoottisen tai eukaryoottisen ilmentämisen tuote.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen seriiniproteaasi, 15 tunnettu siitä, että eksogeeninen DNA-sekvenssi on cDNA-sekvenssi.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen seriiniproteaasi, tunnettu siitä, että eksogeeninen DNA-sekvenssi on genomin DNA-sekvenssi.

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen seriiniproteaasi, tunnettu siitä, että eksogeeninen DNA-sekvenssi on synteettinen DNA-sekvenssi.

7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen seriiniproteaasi, tunnettu siitä, että se on E. colin ilmentämisen 25 tuote.

8. Patenttivaatimuksen 3 mukainen seriiniproteaasi, tunnettu siitä, että sillä on aminoterminaalinen metioniiniryhmä kohdassa -1.

9. DNA-sekvenssi käytettäväksi seriiniproteaasin 30 ilmentämiseen prokaryoottisessa tai eukaryoottisessa isäntäsolussa, tunnettu siitä, että se on a) kuviossa 1, 2 tai 7 esitetty DNA-sekvenssi; tai b) DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu kohdan a) sekvenssin kanssa ja koodaa sekvenssin a) koodaamaa seriini- 35 proteaasia. 100602

10. Pesuaineena käytettävä koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää tehokkaan määrän patenttivaatimuksen 1 mukaista seriiniproteaasia.

11. Ilmentämisvektori, tunnettu siitä, 5 että se käsittää patenttivaatimuksen 9 mukaisen DNA-sekvenssin.

12. Soluviljelmä, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 11 mukaisella ilmen-tämisvektorilla.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen soluviljelmä, tunnettu siitä, että se on saatu transformoimalla E. coli -kanta.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen soluviljelmä, tunnettu siitä, että se on E. coli -kanta, joka 15 pystyy tuottamaan seriiniproteaasia, jolla on kuviossa 3 esitetty aminohapposekvenssi.

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen soluviljelmä, tunnettu siitä, että se on E. coli -kanta, joka pystyy tuottamaan seriiniproteaasia, jolla on kuviossa 8 20 esitetty aminohapposekvenssi.

16. Menetelmä seriiniproteaasin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa a) sopivissa ravinto-olosuhteissa viljellään proka-ryoottisia tai eukaryoottisia isäntä-soluja, jotka on 25 transformoitu tai transfektoitu DNA-vektorilla, joka si sältää patenttivaatimuksen 9 mukaisen DNA-sekvenssin, joka on käyttökelpoinen halutun seriiniproteaasin ilmentämiseksi prokaryoottisessa tai eukaryoottisessa isäntä-solussa; ja 30 b) eristetään haluttu seriiniproteaasi, joka on DNA-sekvenssin ilmentämisen tuote isäntäsolussa. 100602