NO179217B - Serinproteaser og preparater som omfatter disse, samt DNA-sekvenser, ekspresjonsvektorer og prokaryote eller eukaryote vertsceller for anvendelse ved fremstillingen av dem - Google Patents

Abstract

Ny klasse av serinproteaser isolert fra et dyrkningsmedium til soppen Tritirachium album. Serinproteasene har en høy grad av stabilitet i vaskemiddelblandinger. Fremgangsmåte for fremstilling av slike serinproteaser under anvendelse av rekombinante teknikker.

Description

Oppfinnelsen vedrører nye serinproteaser isolert fra et dyrkningsmedium av soppen Tritirachium album. Serinproteasene har aminosyresekvens som angitt i figur 3 eller figur 8. Serinproteasene ifølge foreliggende oppfinnelse har en høy

grad av stabilitet i vandige oppløsninger og tørre vaskemiddelpreparater. Oppfinnelsen vedrører videre detergentprepa-rater som inneholder slike proteaser, for anvendelse av proteasene i vaskemidler og rensemidler og flekkfjernere. I tillegg vedrører foreliggende oppfinnelse videre DNA-sekvenser som koder for proteasene, ekspresjonsvektorer og prokaryote eller eukaryote vertsceller.

Serinproteaser er proteolytiske enzymer med en serinrest i sitt aktive sete. Modifikasjon av serinresten i det aktive sete ved hjelp av slike midler som fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) inaktiverer disse enzymene. Det er to klasser av serinproteaser, kymotrypsin-lignende proteaser og subtilisin-lignende proteaser. Subtilisiner er serinproteaser som generelt virker ved å spalte interne peptidbindinger i proteiner eller peptider. Subtilisiner utskilles av en del Bacillus-arter og har en utstrakt bruk kommersielt

(se US patentskrift nr. 3 623 957, J. Miller, 1970, J. Appl. Bacteriol., 33, 207; Ward, O.P. 1983, s. 251-317, Enzymes

and Biotechnology, red., W.M. Fogarty, Applied Science Pub-lishers, London). Subtilisiner er blitt benyttet i en del vaskemiddelpreparater (se US patentskrifter nr. 1 240 058, 3 749 671, 3 790 482 og 4 266 031 og GB patentskrift nr. 1 315 937).

Anvendelsen av proteaser i industrielle prosesser som krever hydrolyse av protein, har vært begrenset på grunn av enzymustabiliteten under de temperatur- og pH-betingelser som er forbundet med slike prosesser. Selv om varmeinaktiv-ering av proteasen kan være den viktigste faktor for be-grensning av den industrielle bruk av en protease, kan også andre faktorer, slik som mangel på effektivitet over brede pH-områder og bruk av denatureringsmidler i vaskemiddelpreparater, ha en ødeleggende virkning når det gjelder bruken av proteaser i industrielle prosesser. De kjente subtilisiner som er utvunnet fra Bacillus, er ikke ideelle for alle an-vendelser som vaskemiddelenzymer, særlig anvendelse som krever større lagringsstabilitet og aktivitet i bredere pH- og tem-peraturområder. Det er derfor et behov for en klasse proteaser som er kjennetegnet ved høy stabilitet når det gjelder temperatur, pH, denatureringsmidler og lignende.

Det er også et behov for proteaser som er forenlige

med vaskemidler og har tilstrekkelig holdbarhet i flytende vaskemiddelpreparater til å være kommersielt praktiske. Varme-stabile serinproteaser fra sopp er blitt evaluert i vaske-, middelanvendelser, inkludert proteaser erholdt fra Tritirachium album (Ebeling, W. et al., 1971, German Offenbach, 1965,

281), Malbranchea pulchella (Ong, P.S. et al., Can. J. Micro-biol. 22, 165), Acremonium kiliense Fusarium og Gibberella spp (Isono, M., et al., 1972, US patentskrift nr. 3652399). Proteinase K (EC 3, 4, 21, 14) ble isolert fra Tritirachium album (Ebeling W. et al., 1974, Eur. J. Biochem. 47, 91-97)

og var blitt grundig undersøkt av forskjellige grupper

(Kraus, E. et al., 1976, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem.

357, 937-947, ibid. 357, 233-237, og Morihara, K. et al.,

1975, Agr. Biol. Chem. 39, 1489-1492). Den tredimensjonale struktur til proteinase K er lik med strukturen til subtilisiner (Paehler, A. et al., 1983, EMBO J. 3, 1311-1314) og det er omtrent 5% homologi mellom aminosyresekvensen til proteinase K og sekvensen til subtilisiner (Jany, K-D., et al.,

FEBS Letters, 199, 139-144). Vaskemiddelforenlighet for proteinase K er blitt foreslått ut fra dens aktivitet i nærvær av høy konsentrasjon av vaskemidler (Hilz, H. et al., 1975, Eur. J. Biochem., 56, 103-108).

Proteolytiske enzymer katalyserer generelt spaltingen av peptidbindinger bare innenfor et visst pH- og temperaturområde. Dessuten beholder et proteolytisk enzym, selv under optimale betingelser, sin aktivitet bare når dets polypeptid-kjede er i naturlig form. Utfolding av den naturlig forekommende struktur oppstår ofte når enzymet eksponeres mot ekstreme pH- eller temperaturverdier, eller overfor visse vaskemiddeladditiver, slik som overflateaktive midler og metallchelateringsmidler. De sistnevnte utøver sin virkning

2+ spesielt på enzymer som krever metallioner, slik som Ca ,

for stabilisering av sin naturlig forekommende struktur, dvs. bakteriell subtilisin. For proteaser kan delvis utfolding av den naturlige form til enzymet føre til fremskyndelse av selvoppløsning og derfor til irreversibel enzyminaktivering. Ettersom de fleste kommersielle tøyvaskemidler har en alkalisk pH, er det ønskelig at det benyttede enzym i slike vaskemidler er aktivt og stabilt i et pH-område mellom 7,5

og 13, og i et temperaturområde mellom 20 og 65°C. Dessuten er det ønskelig at aktiviteten til slike enzymer er forholds-vis uavhengig av kalsium- og magnesiumioner, og er forenlig med overflateaktive midler og sekvestreringsbyggere. Bakte-rielle serinproteaser av subtilisinfamilien oppfyller disse krav i en viss utstrekning, deres stabilitet i flytende vaskemiddelpreparat er imidlertid begrenset.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye serinproteaser som har forbedret stabilitet i vaskemiddelpreparater. I forbindelse med foreliggende oppfinnelse beskrives særlig isoleringen, rensingen og karakteriseringen av nye serinproteaser erholdt fra soppstammen Tritirachium album Limber (ATCC 22563). Serinproteasene ifølge foreliggende oppfinnelse er funnet å være utmerkede vaskemiddelenzymer og har en høy grad av varmestabilitet i vandige oppløsninger, særlig ved forhøyede temperaturer, noe som gjør proteasene egnet for anvendelse som additiver i kommersielle flytende vaskemiddelpreparater. I forbindelse med oppfinnelsen beskrives videre isoleringen og karakteriseringen av genene som koder for slike proteaser. Oppfinnelsen vedrører således også DNA-sekvenser, ekspresjonsvektorer og prokaryote eller eukaryote vertsceller for anvendelse ved fremstillingen av serinproteasene ifølge oppfinnelsen, og preparater som inneholder serinproteasene, og som kan anvendes i vaskemidler og rensemidler eller flekkfjernere.

I forbindelse med foreliggende oppfinnelse anvendes en oligonukleotidprobe som hybridiserer med komplementære DNA-sekvenser i genom- eller cDNA-klonene til serinproteasene som her er beskrevet. DNA-sekvensene kan anvendes for å sikre ekspresjon i en prokaryot eller eukaryot vertscelle av en' serinprotease isolert fra dyrkningsmedier som inneholder stammen av T. album Limber (ATCC 22563).

Foreliggende oppfinnelse vedrører således en serinprotease som er kjennetegnet ved at den har en aminosyresekvens som angitt i figur 3 eller figur 8. Videre vedrører oppfinnelsen en serinprotease som er kjennetegnet ved at den har en aminosyresekvens som angitt i figur 3 eller figur 8, og er produktet av prokaryot eller eukaryot ekspresjon av en eksogen DNA-sekvens.

Foreliggende oppfinnelse vedrører dessuten en DNA-sekvens for anvendelse ved sikring av ekspresjon i en prokaryot eller eukaryot vertscelle av en serinprotease, som er kjennetegnet ved at sekvensen er valgt fra gruppen bestående av: a) DNA-sekvensene angitt i figurene 1, 2 og 7, og b) redundante variasjoner av de nevnte DNA-sekvenser.

Videre vedrører oppfinnelsen et preparat som er kjennetegnet

ved at det omfatter en effektiv mengde av en serinprotease ifølge krav 1 i et detergentpreparat, en ekspresjonsvektor som er kjennetegnet ved at den inneholder en DNA-sekvens ifølge krav 3 i en transformert eller transfektert vertscelle og er i stand til å uttrykke DNA-sekvensen, og en prokaryot eller eukaryot vertscelle som er kjennetegnet ved at den er transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 5, og er i stand til å uttrykke en DNA-sekvens ifølge krav 3.

Fremstillingen av en serinprotease med strukturformen til en serinprotease isolert fra en kultur av Tritirachium album Limber stamme ATCC 22563 skjer ved en fremgangsmåte som omfatter å dyrke under passende næringsbetingelse prokaryote eller eukaryote vertceller transformert eller transfisert med en DNA-vektor som omfatter en DNA-sekvens som er anvendbar til å sikre ekspresjon i en prokaryot eller eukaryot vertcelle av den ønskede serinprotease, og isolere den ønskede serinprotease fra ekspresjonen av DNA-sekvenser i vektoren.

Her er også tilveiebragt oligonukleotidprober som er

i stand til å hybridisere med en DNA-sekvens med evne til å uttrykke i en prokaryot eller eukaryot vertcelle en serinprotease som har strukturformen til en serinprotease isolert fra dyrkningsmedium av Tritirachium album Limber stamme ATCC

22563.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser nukleotidsekvensen til genomklonen for protease TW7. Figur 2 viser nukleotidsekvensen til cDNA-klonen for protease TW7. Figur 3 viser nukleotidsekvensen til den kodende tråd, korrelert med aminosyresekvensen til proteasen TW7. Figur 4 viser en sammenligning av aminosyresekvensene til protease TW7 med sekvensene til proteinase K, subtilisin novo, subtilisin Carlsberg, subtilisin DY og thermitase.

Figur 5 viser pH-profilene til protease TW7.

Figur 6 viser temperaturprofilene til proteasen TW7. Figur 7 viser nukleotidsekvensen til cDNA-klonen for protease TW3. Figur 8 viser nukleotidsekvensen til den kodende tråd, korrelert med aminosyresekvensen til proteasen TW3. Figur 9 viser en sammenligning av aminosyresekvensene til protease TW3 med sekvensene til proteinase K, subtilisin novo, subtilisin Carlsberg, subtilisin DY og thermitase.

Figur 10 viser pH-profilene til protease TW3.

Figur 11 viser temperaturprofilene til proteasen TW3. Figur 12 viser et flytskjema som illustrerer bestanddelene benyttet i konstruksjon av pCFM 1156 TW7.

Nærmere beskrivelse

Ettersom T^ album Limber er en saktevoksende sopp med evne til å produsere proteaser bare i lave nivåmengder, er fremstilling av proteinase K eller hvilke som helst andre substilisinlignende enzymer i store kommersielle mengder ved å fermentere soppen, ikke praktisk. I tillegg er veksten til soppen T^ album samt fremstillingen av proteaser sen, noe som gjør kommersialisering av et subtilisinlignende enzym uøkono-misk.

Et aspekt i forbindelse med foreliggende oppfinnelse vedrører isoleringen av et gen som koder for de nye serinproteasene ifølge foreliggende oppfinnelse fra T\_ album Limber og klo-ningen og ekspresjonen av et slikt gen i en egnet mikroorga-nisme. Genet ble isolert ved å bruke en deoxyribonukleotid-oligomer som hybridiserer med et gen som har en DNA-sekvens som koder for aminosyrerestene rundt den aktive serinrest. Ved å bruke denne fremgangsmåten er mer enn ett gen blitt isolert fra genombibloteket. Dette antyder fremstillingen av mer enn én serinprotease fra Tj_ album Limber. Aminosyresekvensene til aminoendene i proteasene ble funnet å være forskjellige. De nye proteasene, protease TW7 og protease TW3 ble isolert og karakterisert.

Genet som koder for protease TW7, ble isolert fra et genombibliotek. Nærmere bestemt omfatter isoleringen av subtilisinlignende gener fra genombiblioteket til T^ album (1) konstruksjon av ett bibliotek fra den genomiske DNA til T. album Limber i et pBR322-plasmid, (2) screening av genombiblioteket med en merket oligonukleotidsøker som hybridiserer spesifikt med subtilisinlignende gener, (3) restriksjons-enzymanalyse av positive kloner etterfulgt av "Southern blot"-hybridisering med forskjellige restriksjonsfragmenter for identifiseringen av kloner som bærer hele genet, (4) underkloning av restriksjonsfragmenter som bærer hele genet i bakteriofag M13 for DNA-sekvensanalyse, (5) utforming av oligonukleotidprimere basert på tertielle DNA-sekvensdata for å fullføre DNA-sekvensering av genets begge tråder.

Sekvensering av begge tråder til genomgenet avslørte tilstedeværelsen av to introner. For å uttrykke gener som inneholder introner, i mikroorganismer som mangler skjøte-enzymer, f.eks. subtilis, E. coli, etc, er det nødven-dig å rekonstruere genet (dvs. benytte in vitro skjøting) eller erholde genet fra et cDNA-bibliotek. Genene som koder for protease TW7 og protease TW3, ble isolert fra et cDNA-bibliotek. Isoleringen av subtilisingener fra cDNA-biblioteket til album Limber omfatter (1) isolering av total DNA fra T\_ album Limber, (2) fraksjonering av RNA på en oligonukleotid dT cellulosekolonne og isolering av polyadenylert mRNA-fraksjon, (3) anvende en oligonukleotidsøker for "Northern blot"-analyse for å bekrefte tilstedeværelsen av subtilisinlignende mRNA, (4) cDNA-syntese og oppbygning av et cDNA-bibliotek i et pBR322-avledet plasmid, (5) screening av cDNA-biblioteket med en <32>p-merket oligonukleotidsøker som ble benyttet i trinn 3, (6) isolering og restriksjons-analyse av positive cDNA-kloner, (7) underkloner av restriksjonsfragmenter fra positive cDNA-kloner som bærer hele den proteinkodende sekvens i bakteriofag M13 for DNA-sekvensering, (8) anvendelse av oligonukleotidprimere for å fullføre DNA-sekvenseringen av genets begge tråder.

I overensstemmelse med fremgangsmåtene- ovenfor er det blitt identifisert to cDNA-gener med aminosyresekvenser som, slik som utledet fra DNA-sekvensene, indikerte at deres pro-dukter er subtilisinlignende enzymer. Ett av genproduktene har aminosyresekvensen som er vist i figur 3, og ble kalt protease TW7. Protease TW7 utviser omtrent 53% aminosyresekvenshomologi med proteinase K T^ album Limber. Den antatte aminosyresekvens til protease TW7 indikerte at denne proteasen, i motsetning til proteinase K, har en netto negativ ladning og derfor kan skilles fra de øvrige proteaser ved å bruke DEAE-sepharose- eller DEAE-cellulose-kromatografi. Det andre av antatte genprodukter ble kalt protease TW3. Graden av aminosyresekvenshomologi mellom denne protease og prote-nase K fra T_;_ album Limber, var omtrent 90%. Den antatte aminosyresekvens til protease TW3 indikerte at enzymet har en netto positiv ladning og derfor kan skilles fra de øvrige proteaser ved hjelp av CM-cellulose-kromatografi.

Serinproteasene ifølge foreliggende oppfinnelsen ble isolert fra dyrkningsvæsken til T^_ album Limber stamme (CBS 348.55) ATCC deponeringsnummer, 22563 på følgende måte: Den bestemte sopp T_;_ album stamme (ATCC 22563) ble dyrket i medier som bare inneholdt proteiner som nitrogen-kilder, f.eks. skummet melk, bovinserumalbumin eller soyamel. Dyrkningsmediene ble testet med hensyn på protelytisk aktivitet under anvendelse av azokasein som substrat. Når den proteolytiske aktivitet nådde et platå eller begynte å avta, ble dyrkningsvæsken adskilt fra soppmycelier ved sentrifugering. Proteiner i supernatanten ble utfelt ved å bruke ammoniumsulfat. Utfellingen ble oppløst i 20 mM natriumfosfat-buffer ved pH 6,0 og oppløsningen ble dialysert mot den samme buffer. Oppløsningen ble sendt gjennom en kolonne av CM-52 (Whatman) for å fange opp proteinase K-lignende enzymer, og så sendt gjennom en DE-52 (Whatman) kolonne. Protease.. TW7 ble eluert fra DE-52-kolonnen med 100 mM NaCl i 20 mM natriumfosfat ved pH 6,0. Den ble dialysert mot vann og så lyofilisert. Protease TW3 ble bundet til CM-52 hvorfra den ble eluert med 200 mM NaCl i 20 mM natriumfosfat ved pH 6,0.

Vaskemiddelforenlighetsegenskapene til serinproteasene ifølge foreliggende oppfinnelse er blitt karakterisert. Som vist i figurene 5 og 10, er protease TW7 og protease TW3 aktive over et bredt pH-område. Selv om den maksimale aktivitet fremkommer omtrent ved pH 10, har protease TW7 betydelig aktivitet innenfor pH-område 9-13. I tillegg beholder protease TW7 minst 45% av sin maksimale aktivitet når den er til stede i en buffer med pH på 6,0. Som vist i figur 6, har protease TW7 enzymatisk aktivitet over et bredt temperaturområde. Den maksimale aktivitet er mellom 60 og 65°C, selv om protease TW7 beholder minst 25% av sin opprinnelige aktivitet ved 20°C. Protease TW7 er stabil ved 52°C i buffere med forskjellige pH-verdier. Etter inkubasjon i et tidsrom på 1 time ved pH 8 og

10,3, er omtrent 100% av den opprinnelige aktivitet i behold, mens en kommersiell subtilisin under lignende betingelser bare beholdt opp til 30% av sin opprinnelige aktivitet. I nærvær av 0,5% SDS beholder protease TW7 100% av sin aktivitet etter 1 times inkubasjon ved 52°C og pH 8,0, mens den kommersielle subtilisin beholder bare ca. 5 - 6% av sin opprinnelige aktivitet.

Som vist i figur 10, er protease TW3 også aktiv overfor et bredt pH-område. F.eks. har protease TW3 sin høyeste enzymatiske aktivitet ved pH 9, selv om det er betydelig aktivitet innenfor et pH-område fra 7 til 10. Som vist i figur 11, er temperaturområdet for enzymatisk aktivitet av protease TW3 også bredt. Den maksimale aktivitet er mellom 55 og 65°C, selv om protease TW3 beholder minst 32% av sin aktivitet ved 25°C. Dette gjør det mulig for protease TW3 å være aktiv i et bredt vasketemperaturområde. I tillegg er protease TW3 svært stabil ved 50°C i buffere med forskjellige pH-verdier. Etter 1 time med inkubasjon ved pH 4,0, 8 og 10,0, er 50 - 90% av den opprinnelige aktivitet av protease TW3 i behold,

mens et kommersielt subtilisin bare beholder minimal aktivi-

tet under lignende betingelser.

Stabiliteten til serinproteasene ifølge foreliggende oppfinnelse er blitt evaluert i forskjellige tøyvaskemiddel-preparater. Eventuelt endogent enzym som var til stede, ble inaktivert før evaluering ved å varme opp vaskemiddelprepa-ratet ved 65°C i 1 time.

I tillegg til enzymet vil den kommersielle vaskepulver-blanding ifølge foreliggende oppfinnelse generelt inneholde: (a) Minst ett overflateaktivt middel som kan være anionisk, ikke-ionisk eller amfotært, eller en vannoppløse-lig såpe. Typisk anvendes et anionisk overflateaktivt middel (f.eks. et rettkjedet alkylarylsulfonat) i blanding med et ikke-ionisk (f.eks. en alkylfenylpolyglycolether) i mengder på henholdsvis 5-30 og 1-5 vekt% av vaskeblandingen. (b) Én eller flere byggere, fortrinnsvis med en led-sagende sekvestringsfunksjon. Natriumtripolyfosfat, natrium-citrat, natriumsilikat og zeolitter er eksempler på slike forbindelser som vanligvis utgjør fra 10 til 70 vekt% av vaskemiddelblandingen. (c) Et blekemiddel, fortrinnsvis en peroxyforbindelse, slik som natriumperborat, typisk inkorporert i en mengde på

opp til 30 vekt% av blandingen.

(d) hjelpemidler, slik som carboxymethylcellulose, optiske lysgjøringsmidler og parfymer. Dersom det er påkrevet, tilsettes et pH-regulerende middel, hvorved det fåes en pH

i tøyvaskemediet i området fra 8,0 til 10,5.

Det partikulære proteasepreparat ifølge oppfinnelsen tilsettes i en mengde som er beregnet å gi en proteaseaktivitet på minst 0,1 Anson-enheter (AU, se nedenunder), fortrinnsvis 0,5 - 2,5 AU pr. 100 g vaskeblanding. Om påkrevet kan utjevning til 100% opprettes med et uorganisk fyllstoff, fortrinnsvis natriumsulfat.

Flytende vaskemiddelblandinger kan fremstilles fra enzymoppslemminger, fortrinnsvis i ikke-vandige medier. Typisk kan slike oppslemminger bestå av en suspensjon av fint oppmalt proteasekonsentrat i et flytende, ikke-ionisk overflateaktivt middel, f.eks. Tergitol<®> 15 s 9 eller en blanding av slike overflateaktive midler. Vanligvis vil oppslemmingen også inneholde ett eller flere uorganiske fyllstoffer, slik som fint oppmalt natriumklorid, eventuelt i blanding med et stabiliseringsmiddel for suspensjoner, f.eks. avdampet silika (Aerosil<®> 200). Tergitol<®> og Aerosil<®> er varemerker.

Proteaseoppslemmingen ifølge oppfinnelsen tilsettes

i en mengde som er beregnet å gi en proteaseaktivitet på minst 0,1 AU, fortrinnsvis 0,5 - 2,5 AU, pr. 10 0 g flytende vaskemiddelblanding.

Vaskeblandingene kan fremstilles på den vanlige måte, f.eks. ved å blande sammen bestanddelene. Alternativt lages en forblanding som så blandes med de gjenværende bestanddeler.

De følgende eksempler vil ytterligere tjene til å illustrere oppfinnelsen.

På grunn av de gode stabilitets- og aktivitetsegen-skaper som er beskrevet, kan det proteolytiske enzym ifølge oppfinnelsen anvendes innen alle felter hvor proteolytiske enzymer brukes generelt. Særlig kan det anvendes til vaskemidler og rensemidler eller flekkfjernere, som et hårfjern-ingsmiddel ved garving, og også i matvareindustrien til fremstillingen av proteinhydrolysater og i serologi for påvisning av ufullstendige antistoffer. Det er særlig fordelaktig for bruk i matvareindustrien og i serologi at enzymet ifølge oppfinnelsen har en slik utmerket stabilitet i den faste eller oppløste form slik at fysiologisk akseptable mengder av kalsiumioner ikke behøver å være nødvendig for å stabili-sere enzymet i vandige oppløsninger, i motsetning til det som er tilfelle for andre enzympreparater.

Eksempel 1

Fremstilling av serinprotease fra Tritirachium album Limber

Soppen Tritirachium album Limber (CBS348.55, ATCC 22563) ble erholdt fra American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD. Soppen tilhører familien Moniliaceae (Limber, 1940, Mycologia, 32, 23-30). Typiske trekk ved soppen omfatter hyalint mycelium, sparsomt for-grenede hyaline konidier, rent hvit tett mycelmatte som danner lav kuppel eller halvkule. Ifølge Céntralbureau voor Schimmelcultures (Oosterstraat 1, Baarn, P.O. Box 273, 3740 Ag Baarn, Nederland, ref. MAAS/tvs/714, datert 4. oktober 1985) ble stammen opprinnelig isolert fra død hud. Denne stamme er ikke den samme stamme (CBS 747.69) hvorfra proteinase K ble isolert. Tritirachium album ble formert på malt-pepton-agar-plater som inneholdt 3% maltekstrakt, 0,3% kase-inpepton og 2% bactoagar. Soppen fikk sporulere ved værelsetemperatur i 7 - 8 dager. Sporene ble samlet opp i 15 - 2 0

ml sterilt destillert vann og ble holdt ved værelsetemperatur i minst 30 minutter før inokulering i et flytende medium. •

Sammensetningen av det flytende medium for fremstillingen av proteaser var enten 2% skummet melk og 0,17% gjærnitrogenbase (katalog nr. 0335-15, erholdt fra Difco Labo-ratories, Detroit, MI) eller 1% bovinserumalbumin (BSA), 1% glucose og 0,17% gjærnitrogenbase. Det BSA-holdige medium ble sterilisert ved å sende det gjennom et 0,45 ym filter, mens mediet som inneholdt skummet melk, ble autoklavert i 30 minutter.

500 ml av hvert medium ble inokulert med sporesuspen-sjonen og den resulterende blanding ble rystet. Fire til fem dråper aritiskum ble brukt til å undertrykke skumming under rysting. Fremstillingen av ekstramyceale proteaser ble over-våket under anvendelse av enten N-succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-fenylalanin-nitroanilid (Delmar et al., Anal Biochem. 99, 316) eller azokasein (Charney, J. et al. 1947, J. Biol. Chem. 177, 501) som substrat. Det ble funnet at fremstillingen av protease var mediumavhengig. I medium med skummet melk ble den største mengde protease fremstilt innen 8-9 dager med dyrking, mens den maksimale produksjon av protease i BSA-medium ikke inntrådte før etter 14 - 15 dager med dyrking. I begge mediene avtok proteaseaktivitet etter at maksi-malt produksjonsnivå var nådd.

Eksempel 2

Utforming og syntese av en probe for påvisning av subtilisin-lignende gener

Subtilinsinlignende enzymer har til felles en høy grad av sekvenshomologi rundt serinresten i det aktive sete. Ser in i posisjon 221 har tidligere blitt identifisert som det reak-tive serin i serinproteaser. Videre er henføringen av en serinprotease til substilisinfamilien basert på aminosyresekvensen

Aminosyresekvenssammenligning av flere subtilisinlignende enzymer avslørte at homologien strekker seg utover denne sekvensen på følgende måte:

(Stahl, M.L. et al., 1984, supra; Wells, J.A. et al., 1983, supra;Vasantha, N. et al., 1984, supra; Svendsen, I., et al., 1986, FEBS Letters 196, 228-232; Koide, Y. et al., 1986,

J. Bacteriol. 167, 110-116; Kaneda, M. et al., 1984; J. Biochem. 95, 825-825; Jany, K.-D. et al., 1985, Biol. Chem. Hoppe Seyler 366, 485-492). Analyse av DNA-sekvenser som koder for aminosyrene i subtilisiner, viste også høy grad av konser-vering. Basert på disse observasjoner ble det følgende deoxy-oligonukleotid (41-mer) utformet for å sondere gener som inneholder lignende kodende sekvenser:

Proben ble syntetisert under anvendelse av fosfotriester-metoden til Beaucage et al. (1981, Tetrahedron Letters 22, 1859-1862).

Denne oligonukleotidprobe hybridiserer med komplementære DNA-sekvenser i genomklonen eller cDNA-klonen til serin-proteasen i et temperaturområde fra 50 til 78°C, avhengig av antallet umaker. Når denne probe anvendes, er det derfor nød-r vendig å inkludere hybridisering og vasking ved flere temperaturer og saltkonsentrasjoner for tilstrekkelig nøyaktig-het. 41-mer-oligonukleotiden kan anvendes til sondering av gener som koder for subtilisinlignende enzymer i genom- og cDNA-biblioteker, samt mRNA som koder for subtilisinlignende enzymer.

Eksempel 3

Konstruksjon av genombiblioteket og isolering av genet for protease TW7

Mycelier ble samlet opp på miraklede, som tidligere beskrevet etter 9-15 dager med soppvekst. Mycelier ble veid og hurtig nedfryst i tørris og isopropanol. Til 10 g nedfryste mycelier ble det tilsatt 10 g autoklavert alumina og 20 ml lysebuffer (4% SDS, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,15M NaCl). Den resulterende blanding ble oppmalt i 5 minutter i en steril morter under anvendelse av en støter. Ytterligere 20 ml buffer og 40 ml fenol/klorofom/isoamylalkohol (25:24:1) ble tilsatt til den oppmalte blanding, og lysatet ble ristet i 20 - 30 minutter ved væreIsetemperatur og sentrifugert i 10 minutter. Vannfasen ble ekstrahert med fenol og kloroform. Ribonuklease A og proteinase K ble tilsatt til lysatet for

å fjerne henholdsvis RNA og protein fra DNA-preparatet. Ethanol ble tilsatt til lysatet og DNA ble spolet, oppslemmet i TE (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) og lagret ved 4°C.

En fullstendig oppløsning av den genom-DNA som ble isolert fra T\_ album, ble utført ved å bruke restriksjonsenzymene Ecorl og BamHI til å konstruere et bibliotek i plasmid-vektor pBR322. Vektoren pBR322 ble også oppløst med de samme enzymer og så behandlet med alkalisk fosfatase. Etter lige-ring av T. album DNA-fragmenter med pBR322-vektoren, ble trans-formasjon av kompetente HBlOl-celler utført i overensstemmelse med fremgangsmåtene til Mandel et al., 1970, J. Mol. Biol.

63, 159-162. Ampicillin-resistente kolonier ble sondert med hensyn på tilstedeværelsen av subtilisinlignende gener under anvendelse av den 41-mere oligonukleotidprobe ifølge eksempel 2. Koloniøkning og hybridisering ble utført ifølge fremgangsmåtene til Grunstein et al., 1975, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3961-3965, bortsett fra at genscreenmembran (NEF-972,

New England Nuclear) ble brukt i stedet for nitrocellulose. Filteret ble bearbeidet for DNA-denaturering in situ, etterfulgt av nøytralisering, tørking og oppvarming ved 80°C i vakuum. Forhybridisering ble utført ved 55°C i 3 - 4 timer i 5X Denhardfs oppløsning inneholdende 200 yg tRNA/ml. Hybridisering ble utført ved 55°C i 20 timer i 5X SSC, 1% SDS,

IX Denhardt.1 s oppløsning og 200 yg tRNA/ml. Filtrene ble vasket ved strenge betingelser, 2X SSC ved 55°C inntil bak-grunnsreaktivitet var neglisjerbar. En andre runde med screening av antatt positive kolonier med 41-mer-oligonukleotid-søkeren ble utført ved å reinokulere de antatt positive kloner på L-agar-plater inneholdende 50 yg ampicillin/ml, og gjen-tagelse av screeningtrinnene beskrevet ovenfor. Etter den andre screeningrunde ble bare én positiv klon erholdt. Den positive koloni ble dyrket i Luria-næringsvæske inneholdende 50 yg ampicillin/ml. Fra kulturen som var dyrket over natten, ble et plasmid inneholdende genet for protease TW7 isolert ved å bruke fremgangsmåtene beskrevet av Birnboim, Methods in Enzymol. 100, 243-154, (1983). Med tanke på "Southern blotting" og grundig restriksjonskartlegging, ble plasmidet renset under anvendelse av cesiumklorid-ethidiumbromid-gradi-enter og ultrasentrifugering. Et 2,8 kb fragment av T\_ album DNA ble funnet å inneholde genet for protease TW7.

Restriksjonsfragmenter av dette plasmid frembragt av forskjellige enzymer ble oppløst på agarosegeler ved hjelp av elektroforese, overført til genscreen pluss-membraner, og så sondert med 41-mer-oligonukleotidproben ifølge eksempel 2 for å identifisere fragmentet som inneholder det fullstendige gen for protease TW7. Fra dette ble det bestemt at et EcoRi-Clal-fragment som inneholder 1056 nukleotider, inneholdt genet. Dette fragmentet ble så subklonet i bakterifagen Ml2mpl8 og Ml3mpl9 for éntråd-DNA-sekvensering under anvendelse av universalprimeren (Messings, J. 1983; Methods in Enzymol-. 101C, 20-75). Dideoxykjede-termineringsfremgangsmåten beskrevet av Sanger, F. et al., (1977), Proe. National. Acad. Sei. USA, 74. 54 63 ble brukt til DNA-sekvensering Så snart

en eller annen partiell DNA-sekvens var erholdt, ble ytterligere oligonukleotidprimere brukt til å fullføre sekvenseringen av de to trådene til genet. Den derved karakteriserte polypeptid-sekvens til genet er vist i figur 1. Genet inneholder 1056 nukleotider og er definert ved hjelp av et sted for restrik-sjonsenzym EcoRI på 5'enden og et Clal på 3'-enden. Restriksjonskartlegging av fragmentet avslører tilstedeværelsen av unike steder for restriksjonsenzymene Hindlll, Kpnl og Bgll.

Den antatte protease kodet for av dette genet ble kalt protease TW7.

Det isolerte gen for protease TW7 kodet for den fullstendige aminosyresekvens til det fullt ferdige protein og 12 aminosyrer i et antatt "pro"-område. Genet som koder for den fullt ferdige protease TW7 er avbrudt av to introner. Disse intronene er 54 og 84 nukleotider lange. Den nøyaktige posisjon til intronene ble bestemt ved å sammenligne nukleo-tidsekvensene til genom-DNA-en med sekvensene til cDNA-en for protease TW7. De to intronene begynner ved nukleotidsekvensen GT og ender ved sekvensen AG. TAG brukes som termi-neringskodonet som etterfølges av en annen TG i et 8-kodon-intervall. Den antatte bearbeiding av mRNA oppstår mellom sekvenser som koder for serin (den siste aminosyre i den mulige pre-pro-sekvens) og alanin (den første aminosyre) i den fullt ferdige protease TW7.

Eksempel 4

Konstruksjon av cDNA- biblioteket og isolering av cDNA- genet for protease TW7.

Selv om det fullstendige gen som koder for den fullt ferdige protease TW7, ble erholdt fra genombiblioteket, kan dette genet ikke anvendes til ekspresjonen av det proteolytiske enzym i slike mikroorganismer som B^ subtilis og E^ coli fordi disse organismene mangler enzymene for å fjerne intronsek-vensene fra den begynnende RNA for dannelse av den funksjon-elle budbringer-RNA. Isoleringen av funksjonell budbringer-RNA fra soppen T_j_ album Limber ble forsøkt for å oppnå et komplementært DNA-gen, som kan uttrykkes i mikroorganismer egnet for fremstillingen av protease TW7.

T. album Limber ble dyrket i skummetmelkmediet beskrevet i eksempel 1 i 9 dager, hvoretter mycelier ble samlet opp på et lag av miraklede. Til ca. 2 0 g nyinnhøstede mycelier ble det tilsatt 100 g steril alumina, 45 ml lysebuffer (4% SDS,

1 mM EDTA, 100 mM Na-acetat, pH 5,0) og 20 ml fenol:kloroform: isoamylalkohol (25:24:1), myceliene ble så oppmalt i en steril morter med en støter i 20 minutter. Etter tilsetning av 50 ml buffer og 50 ml fenol:kloroform:isoamylalkohol, ble lysatet ristet ved væreIsetemperatur i 30 minutter før sentrifugering ved 5000 x g i 15 minutter. Etter fenol:kloroform-ekstraksjon, ble 0,1 volumdel 3M ammoniumacetat og 2,5 volumdeler ethanol tilsatt og nukleinsyrene fikk utfelles ved -20°C over natten. De polyadenylerte RNA-arter ble isolert ved å bruke oligo-dT-cellulose i henhold til fremgangsmåtene beskrevet av Maniatis et al. (1982, supra). For å forhindre RNA-oppbrytning under håndteringen av prøver, ble alle buffere behandlet med 0,1% diethylpyrocarbonat og så autoklavert i 60 minutter. Den isolerte mRNA-populasjon ble utfelt med 2,5 volumdeler' ethanol etterfulgt av tilsetning av 0,1 volumdel 3M ammoniumacetat . "Northern blot"-analyse av mRNA-populasjonen ble utført ved å følge glyoxal-DMSO-fremgangsmåten beskrevet av Maniatis et al. (1982). mRNA-artene ble separert på en 1,1% agarosegel, overført på en "gencreen pluss"-membran (NEF-976) og hybridisert med en kinasebehandlet oligomerprobe som har aminoenden til protease TW7 og den følgende nukleotidsekvens:

Forhybridiseringen og hybridiseringen ble utført ved 55°C etterfulgt av nøye vasking ved 55°C og 60°C. Etter eksponering av filteret mot røntgenfilm, ble en enkel mRNA-art med ca. 2000 nukleotidbasers lengde i en mRNA-populasjon identifisert til å inneholde sekvensen som koder for protease TW7.

Dobbeltrådet cDNA ble syntetisert på polyA+-mRNA-templat ved å følge fremgangsmåtene beskrevet av Okayama et al., (1982), Mol. Cell. Biol. 2, 161-170. Kompetente E. coli HBlOl-celler ble transformert med plasmidvektorene som inneholder cDNA-innføyelsene (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). Transformerte kolonier på nitrocellulosefiltere ble replikaplatet over på et andre sett av nitrocellulosefiltere. Master- og replikafiltrene ble inkubert ved 77°C på L-agar-plater som inneholdt 59 ug ampicillin/ml, inntil koloniene vokste opp (vanligvis 2- 4 timer for masterplater og 5 - 6 timer for replika) . Masterfiltrene ble lagret ved 4°C mens replikafiltrene ble inkubert over natten på L-agar-plater som inneholdt 100 yg kloramfenicol/ml for økning av antallet plasmidkopier. Replikafiltrer ble bearbeidet for DNA-denaturering, renaturering, oppvarming, forhybridisering etterfulgt av hybridisering med den oligomere probe som an-vendt for mRNA-påvisningen for "Northern blot". Ved å følge en andre serie av screening hvor de isolerte enkeltstående positive kolonier ble identifisert, ble plasmid-DNA fremstilt i overensstemmelse med fremgangsmåtene til Birnboim (1983, supra). Nukleotidsekvensering av de positive klonene ble utført hovedsakelig som beskrevet for genomklonen i henhold til eksempel 3.

Eksempel 5

Karakterisering av cDNA- genet for protease TW7

Nukleotidsekvensen til cDNA-klonen er blitt bestemt

ut fra éntrådet og dobbeltrådet DNA. Figur 2 viser nukleotidsekvensen til cDNA-en for protease TW7. Sekvensen er 1016 baser lang og ender med en polyA-hale. Restriksjonskartet til klonen avslører tilstedeværelsen av et EcoRI-sete prok-simalt til 5'-enden til sekvensen som koder for den fullt ferdige, utskilte form av genproduktet.

Nukleotidsekvensen til cDNA-klonen for genet til protease TW7 er identisk med genomklonen, bortsett fra mangelen på introner i cDNA-klonen.

Eksempel 6

Konstruksjon av cDNA- biblioteket og isolering av cDNA- genet for protease TW3

Isoleringen av funksjonell budbringer-RNA fra soppen T. album ble forsøkt for å oppnå et komplementært DNA-gen som til sist kunne uttrykkes i industrielle mikroorganismer for storskalaproduksjon av protease TW3.

T. album ble dyrket i et BSA-medium i 15 dager hvoretter mycelier ble samlet opp på et lag av miraklede. Til ca.

20 g nyinnhøstede mycelier bie 100 g steril alumina og 45 ml lysebuffer (4%SDS, 1 mM EDTA, 100 mM Na-acetat, pH 5,0), 20 ml fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1) tilsatt, så ble mycelier oppmalt i en steril morter med en støter i 20 minutter. Etter tilsetning av 50 ml buffer og 50 ml fenolkloro-form: isoamylalkohol, ble lysatet ristet ved værelsetemperatur i 30 minutter før sentrifugering ved 5000 x g i 15 minutter. Etter ekstraksjon med fenol:kloroform, ble 0,1 volumdel

3M ammoniumacetat og 2,5 volumdeler ethanol tilsatt og nukleinsyrene fikk utfelles ved -20°C over natten.

Isoleringen av polyadenylerte RNA-arter ble utført ved

å bruke oligo-dT-cellulose i overensstemmelse med fremgangsmåtene beskrevet av Maniatis et al. (1982, supra). Den isolerte mRNA-populasjon ble utfelt med 2,5 volumdeler ethanol etterfulgt av tilsetning av 0,1 volumdel 3M ammoniumsacetat.

"Northern blot"-analyse av mRNA-populasjonen ble ut-ført ved å følge glyoxal-DMSO-fremgangsmåten beskrevet av Maniatis et al. (1982). mRNA-arter ble separert på en 1,1% agarosegel, overført på en "genscreen pluss"-membran (NEN-

976) og hybridisert med kinasebehandlede oligomerprober fremstilt i eksempel 2. Forhybridiseringen og hybridiseringen ble utført ved 55°C etterfulgt av nøye vasking ved 55°C og 60°C. Etter eksponering av filteret mot røntgenfilm, ble en enkelt mRNA med en lengde på ca. 2000 nukleotidbaser i mRNA-populasjonen identifisert til å inneholde sekvensen som koder for protease TW3.

For å forhindre RNA-oppbrytning ble alle buffere an— . vendt i disse eksemplene behandlet med 0,1% diethylpyrocarbonat og autoklavert i 6 0 minutter. Dobbeltrådet cDNA ble syntetisert på polyA+-mRNA-templat ved å følge fremgangsmåten til Okayama et al. (1982) Mol. Cell. Biol., 2, 161-170. Kompetente coli HBlOl-celler ble transformert med plasmidvektorene som inneholder cDNA-innføyelsene (Hanahan, 1983,

J. Mol. Biol. 166, 557-580). Transformerte kolonier på nitrocellulosefiltere ble replikaplatet over på et andre sett av nitrocellulosefiltere. Master- og replikafiltrene ble inkubert ved 37°C på L-agar-plater inneholdende 50 yg ampicillin/ ml, inntil koloniene vokste opp (vanligvis 2- 3 timer for masterplater og 5 - 6 timer for replika). Masterfiltere ble lagret ved 4°C, mens replikafiltrere ble inkubert over natten på L-agar-plater inneholdende 100 yg kloramfenicol/ml for økning av antallet plasmidkopier.

Replikafiltere ble bearbeidet for DNA-denaturering, renaturering, oppvarming, forhybridisering etterfulgt av hybridisering med oligomersøkeren brukt til mRNA-påvisningen for "Northern blot". Etter en andre serie med screening hvor de isolerte enkeltstående positive kolonier ble identifisert, ble plasmid-DNA fremstilt (Birnboim, 1983, Methods of Enzymol. 101C, 20-75). Nukleotidsekvensering av de positive kloner ble utført på følgende måte: En fullstendig restriksjonsana-lyse av klonen ble etterfulgt av underkloning av forskjellige fragmenter i Ml3mll8 og mpl9 for enkelttråd-DNA-sekvensering. Dobbeltrådsekvensering ble utført ved anvendelse av sekvens-spesifikke primere. Fremgangsmåten med dideoxykjedeterminering (Sanger, F. et al., 1988, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74: 5463) ble brukt til DNA-sekvensering.

Eksempel 7

Karakterisering av cDNA- genet for protease TW3

En cDNA-klon i full lengde ble erholdt for protease TW3. Klonen koder for den fullt ferdige protease samt det antatte pre-pro-område til proteasen. Det er fire ATG i den åpne leseramme som kommer forut for sekvensen som koder for det fullt ferdige protein. Mest sannsynlig koder den første ATG for det første methionin ettersom den etterfølges av et område anriket på hydrofobe aminosyrer (Von Heijne, G. 1986, Nucleic Acids Res. 14, 4683-4690). Det antatte pro-område består av ca. 100 aminosyrer, en situasjon som er svært lik med subtilisin (Stahl et al., 1984, supra).

Aminosyresekvensen til det fullt ferdige protein bestemt ut fra nukleotidsekvensen har en høy homologiprosent med sekvensen til proteinase K. Det er omtrent 90% homologi mellom disse to proteasene. Det er visse posisjoner hvor aminosyren ligner svært på aminosyren i subtilisiner, men ikke i proteinase K. F.eks. opptrer en methioninrest i posisjon 143 i alle subtilisiner samt i protease TW3, mens en leucinrest er til stede i denne posisjonen i proteinase K. Likeledes er en alaninrest til stede i posisjon 219 i protease TW3 og i subtilisiner, men ikke i proteinase K. I tillegg er aminosyrefragmentet Ser-Thr- fraværende i proteinase K, mens det er til stede i alle andre i figur 9 i posisjon 226 og 227.

Eksempel 8

Bestemmelse av proteolytisk aktivitet

Den proteolytiske aktivitet til serinproteaser i eksemplene nedenunder ble bestemt ved å bruke azoalbumin som substrat. Aliquoter (20 yl) av enzymoppløsning eller enzymbuffer (for kontroller) ble blandet med 1 ml 0,6% azoalbumin i 0,05M Tris-HCl, pH 8,2 ( med mindre annet er nevnt), og hydro-lysereaksjonen ble utført ved værelsetemperatur. Reaksjonen ble avsluttet etter 20 minutter ved tilsetning av 10% trikloreddiksyre (400 yl). Hydrolysatet ble skilt fra det ut-felte protein ved sentrifugering og dens optiske tetthet ved 410 nm ble målt i forhold til kontrollen.

Proteaseaktivitet ble også analysert ved å bruke azokasein som substrat. Til et sluttvolum på 500 yl ble 20 yl azokasein (5% oppløsning i 0,2M Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM CaCl2), 20 yl enzym (1 -10 yg) og 460 yl 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 tilsatt. Prøvene ble inkubert ved 37°C i 30 minutter. Etter inkubasjon ble 500 yl 10% TCA tilsatt til prøvene og prøvene ble inkubert på is i 15 minutter. Etter sentrifugering i 2 minutter ble 800 yl supernatant tilsatt til et rør som inneholdt 200 yl av 1,8M NaOH. Den optiske tetthet til prøven ble så målt ved 420 nm mot kontrollen.

Eksempel 9

Isolering og rensing av protease TW7 fra dyrkningsvæsken til Tritirachium album Limber

Protease TW7 ble adskilt og renset fra det ekstracellu-løre medium i kulturen T_^ album. En 0,5 liter aliquot av dyrkningsvæsken til T_^ album erholdt etter 15 dager med fermentering i BSA-glucose-mediet beskrevet i eksempel 1, ble sentrifugert i 10 minutter. Proteiner i den klare supernatant ble utfelt ved å bruke ammoniumsulfat (180 g) og samlet opp ved sentrifugering. Utfellingen ble oppslemmet i 0,02M natriumfosfat, pH 6,0 (50 ml) og uoppløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering. Proteinene i supernatanten ble på nytt utfelt med aceton (2,5 volumdeler). Utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering og samlet på en trakt av sintret glass. Utfellingen ble så oppløst i vann (40 ml) og den resulterende oppløsning dialysert ved 4°C mot 0,02M natriumfosfat ved pH 6,0. Den dialyserte oppløsning ble klaret ved sentrifugering og så sendt gjennom en kolonne (2,5 x 10 cm) carboxymethylcellulose (CM-52, Whatman) ved en hastighet på 2 ml pr. minutt, etterfulgt av vasking av kolonnen med 0,02M natriumfosfat, pH 6,0 (30 ml). Gjennomstrøm-nings- og vaskeoppløsningene ble slått sammen og proteinene ble utfelt ved å tilsette 2,5 volumdeler aceton. Utfellingen ble fraskilt ved sentrifugering, filtrert og tørket under vakuum. Acetonpulveret (185 mg) ble oppløst i 0,02M natriumacetat, pH 5,0 (2 ml) og fylt på en Sephadex G-75 molekyl-siktkolonne (2,5 x 90 cm). Fraksjonering på molekylsikt-kolonnen ble utført med 0,02M natriumacetat, pH 5,0, ved en strømningshastighet på 6 ml pr. time. Fraksjoner å 2 ml ble samlet opp og kontrollert med hensyn på UV-absorbans ved 275 nm. Av de tre hovedtoppene som ble eluert fra kolonnen, oppviste bare én proteolytisk aktivitet når det gjelder å hydrolysére det kromogene proteinsubstrat azoalbumin. Enzymet i denne toppen (mellom 102 og 110 ml) ble utfelt med aceton (2,5 volumdeler) og samlet opp ved sentrifugering. Utfellingen ble oppløst i 2 mM kalsiumacetat (20 ml) og opp-løsningen ble dialysert ved 4°C mot vann, og så lyofilisert. SDS-PAGE av redusert prøve viste protease TW7 som et hovedbånd (mer enn 95%) med en tilsynelatende molekylvekt på 35.000 dalton.

Eksempel 10

Aminoendeanalyse av protease TW7

Protease TW7 ble renset fra kultursupernatanten som beskrevet i eksempel 9. Det rensede protein ble så ianktivert med PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid) og ytterligere renset under anvendelse av HPLC. Aminoenden ble bestemt ved å rekonstruere proteinet i 50% trifluoreddiksyre (TFA) inneholdende 1 mM PMSF. Automatisert Edman-nedbrytning i gassfase ble utført for aminoendeanalysen og aminoenden ble bestemt å være Ala -Thr-Gln-Glu-Asp-Ala-Pro-Trp-Leu-Ala-Arg-

Ile-Ser-Ser.

Eksempel 11

pH- profil til proteinase TW7

pH-profilen til proteinase TW7 ved 25°C ble bestemt ved å bruke azoalbumin som substrat. Substratoppløsninger inneholdende 0,6% azoalbumin i natriumfosfat-natriumborat-buffere som dekker pH-området mellom 0,5 og 12,75, ble fremstilt. Til azoalbuminoppløsningene ble det tilsatt enten 10 yl av en 1 mg/ml oppløsning av proteinase TW7 i vann,

eller 10 yl vann (kontroll) og den proteolytiske aktivitet til hver oppløsning ble bestemt som beskrevet i eksempel 8. pH-profilen til proteinase TW7 er vist i figur 5, hvor prosentandelen av maksimal proteolytisk aktivitet er blitt plottet mot pH. Det optimale pH-område for proteinase TW7 er blitt bestemt til å være mellom pH-området mellom 9 og 11.

Eksempel 12

Temperaturprofil til proteinase TW7

Temperaturprofilen til proteinase TW7 i 0,05% natriumfosfat ved pH 8,5 ble bestemt ved å måle den proteolytiske aktivitet over et temperaturområde mellom 2 0°C og 70°C. Aliquoter (1 ml) av 0,6% azoalbumin i 0,05M natriumfosfat, pH 8,5, ble inkubert ved forskjellige temperaturer og etter tilsetning av enzymoppløsningen (20 yl av 0,5 mg proteinase TW7 pr. ml av den samme buffer) eller 20 yl buffer (kontroll), reaksjonen fikk fortsette i 10 minutter og ble så avsluttet etter tilsetning av 10% trikloreddiksyre (400 yl). Temperaturprofilen til proteinase TW7 er vist i figur 6 hvor prosentandelen av maksimal enzymaktivitet er blitt plottet mot temperatur. Som vist i figur 6, varierer den foretrukne temperatur for proteinase TW7 mellom 57°C og 62°C.

Eksempel 13

Bestemmelse av proteasestabilitet i nærvær av vaskemiddel

Stabiliteten av protease TW7 ble sammenlignet både i oppløsninger med vaskemiddel og oppløsninger uten vaskemiddel med stabiliteten til subtilisin Carlsberg og stabiliteten til proteinase K. Oppløsninger av enzymene som skulle evalueres, ble fremstilt i passende buffere, slik at de proteolytiske startaktiviteter i de forskjellige enzymoppløsninger var like, målt ved hjelp av azoalbuminanalysen beskrevet i eksempel 8. Oppløsningene ble inkubert ved 52°C og aliquoter ble tatt ut og målt med hensyn på gjenværende enzymaktivitet. Resultatene som ble oppnådd er vist i tabellene 1 og 2. Den gjenværende enzymaktivitet er uttrykt som en prosent av den opprinnelige enzymaktivitet.

Eksempel 14

Stabilitet til protease TW7 i vaskemiddelblandinger

Stabiliteten til protease TW7 og proteinase K ble evaluert i tre enzymholdige kommersielle tøyvaskemidler, "Era Plus" , "Tide" og "Dynamo". De konsentrerte råvaskemidler ble fortynnet 10 ganger i avionisert vann. Den endogene protease ble inaktivert ved inkubering av det fortynnede vaskemiddel ved 65°C i 1 time før tilsetning av proteasen som skulle evalueres. Den relative aktivitet til proteasen som skulle evalueres i hver vaskemiddelblanding ble regulert slik at den var lik med den enzymatiske aktivitet som er til stede i den opprinnelige vaskemiddelblanding.

Deaktivert vaskemiddel inneholdende proteasene som skulle evalueres, ble inkubert ved 52°C sammen med det vaske-middelholdige aktive endogene enzym. Den gjenværende proteolytiske aktivitet etter forskjellige inkubasjonsperioder ble kvantifisert ved å ta ut prøver og analysere i overensstemmelse med fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 8.

Protease TW7 ble funnet å være stabil i alle vaskemiddelblandinger som ble testet. I f.eks. en blanding som inneholder deaktivert "Era Plus", bibeholder protease TW7 100% av enzymaktiviteten etter 6 timer med inkubering, sammenlignet med bare 12% av det endogene enzym. I en blanding som inneholder deaktivert "Dynamo", bibeholdt protease TW7 76% av enzymaktiviteten etter 29 timer med inkubering.

Stabiliteten til proteasen TW7 ble også testet i et preparat som inneholdt tøyvaskemidlet "Wisk" som ikke inneholder enzymer i blandingen. Etter en 1:10 fortynning av råvaskemidlet i avionisert vann, ble proteinase K eller protease TW7 tilsatt og den resulterende blanding ble inkubert ved 52°C i forskjellige- tidsrom. Den gjenværende aktivitet ble analysert ved å bruke fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 8. Protease TW7 var mer stabil enn proteinase K, som vist i tabell 4, hvor proteinase K etter 3,5 timer med inkubering beholdt bare 2 0,1% av den opprinnelige aktivitet, mens protease TW7 beholdt omtrent 90% av sin opprinnelige enzymaktivitet.

Forsøk ble utført som beskrevet i eksempel 14. Prosentandel av den opprinnelige aktivitet som var tilbake på forskjellige tidspunkter, er vist.

Eksempel 15

Ekspresjon av proteinase TW7

En oligonukleotidmellomstykke ble syntetisert for å innføye genet som koder for den fullt ferdige protease TW7 i ekspresjonsvektoren pCFM 1156 for uttrykking i E^_ coli. Mellomstykket har følgende sekvens:

Konstruksjonen av det rekombinante plasmid for ekspresjon i E. coli omfattet følgende trinn: (1) Konstruksjon av et dobbeltrådet oligonukleotid som inneholder delen av ekspresjonsvektoren pCFM 1156 fra Xbal-stedet og opp til Ndel-stedet, inkludert ATG-sekvensen, etterfulgt av den aminoterminale sekvens til genet for den fullt ferdige protease TW7, fra GCC opp til det første Ncol-sted. Ytterligere nukleotider ble addert på 5<1->enden for å oppnå et ekstra EcoRI-sted som vil lette konstruksjonen. (2) Som illustrert i figur 12, ble cDNA-en for protease TW7 oppløst fullstendig med restriksjonsenzymet EcoRI og delvis med Ncol for å oppnå det store EcoRI-Ncol-fragment, til hvilket kinasebehandlet EcoRI-Ncol mellomstykke ble ligert, hvorved man fikk et cDNA-gen for protease TW7 med mellomstykket. (3) Den rekonstruerte cDNA for protease TW7 ble så oppløst med EcoRI og Cia, hvorved man fikk genet for proteasen TW7, som ble innføyet i Ml3mpl8 som allerede var oppløst med EcoRI og Accl. (4) Ml3mpl8 inneholdende genet for protease TW7 ble oppløst med restriksjonsenzymet Xbal og Hindlll for å befri genet for protease TW7. (5) Ekspresjonsvektoren pCFM 1156 ble også oppløst med re-striks jonsenzymene Xbal og Hindlll for å innføye genet for protease TW7 erholdt fra M13mpl8 som et Xbal- og Hindlll-fragment.

Det resulterende rekombinante ekspresjonsplasmid som derved ble konstruert, inneholdt en .pL-promoter, en Shine Dalgarno sekvens, en ATG etterfulgt av nukleotidsekvensen som koder for det fullt ferdige protease TW7-protein.

Kompetente E^ coli FMII-celler (ln , ptr3~) ble transformert med dette rekombinante plasmid.

Plasmid DNA ble isolert fra de transformerte celler, og de positive kloner ble identifisert ved oppløsning av plasmid-DNA-en med Xbal og Hindlll. En av de positive klonene ble dyrket over natten for å inokulere et medium med Luria-næringsvæske inneholdende 2 0 yg kanamycin/ml. Celler ble dyrket ved 30°C opp til en optisk tetthet på 0,25 ved 600 nm. Temperaturen ved inkubasjonen ble så endret til 42°C i 2 timer for induksjon av plasmidbårne genprodukter.

E. coli-celler ble samlet opp ved sentrifugering ved lav hastighet. Pelleten ble veid og oppslemmet i 10 volumdeler 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Cellene ble lyset ved hjelp av tre passeringer gjennom en French-presse. Pelletfrak-sjonen erholdt etter en annen sentrifugering ble ekstrahert med 5M urea, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. De urea-oppløselige proteiner ble analysert ved å bruke forskjellige teknikker.

Proteinene ble redusert med 3-mercaptoethanol og underkastet elektroforese i en 10% polyacrylamidgel i nærvær av SDS. Et unikt 35.000 dalton protein var hovedbåndet som var til stede i den ureaoppløselige fraksjon utvunnet fra E. coli som inneholder det rekombinante plasmid men ikke vektoren alene. Det comigrerte med proteasen TW7 utrenset fra T. album. Dette proteinet reagerte også spesifikt med anti-stoffet fremkalt mot sopproteasen TW7 i en "Western blot"-analyse. Dette proteinet ble isolert fra polyacrylamidgel for å identifisere sekvensene i det aminoterminale område, som passet med området i sopproteasen TW7.

Den rekombinante protease TW7 er enzymatisk inaktiv når den isoleres fra E_^_ coli før ref olding. For reaktive-ring ble proteinet oppslemmet i 8M urea, 10 mM DTT, 25 mM tris-HCl, pH 8,5, i en sluttkonsentrasjon på 1 mg protein pr. ml, og så bundet til det DE52-harpiks forekvilibrert med 25 mM Tris-HCl, pH 8,5, ved værelsetemperatur. Urea ble fjernet ved vasking av harpiksen med den samme buffer uten og så med 4 mM glutathion (redusert) og 0,4 mM glutathion (oxydert). Etter inkubering over natten av harpiksene i nærvær av reagensene ovenfor, dvs. 25 mM Tris-HCl, pH 8,5, 4 mM glutathion (redusert) og 0,4 mM glutathion (oxydert), ble proteinet eluert fra kolonnen med 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, inneholdende 0,3m NaCl og utfelt med 3 volumdeler aceton. Dette renaturerte protein hadde proteaseaktivitet mot det kromogene substrat (eksempel 1) og kasein.

Eksempel 16

Isolering og rensing av proteinase TW3 fra dyrkningsvæsken til Tritirachium album Limber

0,5 liter Tritirachium album Limber dyrkningsvæske erholdt etter 15 dagers fermentering i BSA-glucose-mediet beskrevet i eksempel 1, ble sentrifugert ved 15.000 g i 10 minutter. Proteiner i den klare supernatant ble utfelt med ammoniumsulfat (180 g) og samlet opp ved sentrifugering. Utfellingen ble oppslemmet i 0,02M natriumfosfat, pH 6,0 (50 ml) og etter fjerning av det uoppløselige materiale ved sentrifugering, ble proteinene i supernatanten på nytt utfelt med aceton (2,5 volumdeler). Utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering og samlet opp på en trakt av sintret glass. Utfellingen ble oppløst i vann (40 ml) og oppløsningen ble dialysert ved 4°C mot 0,02M natriumfosfat ved pH 6,0. Den dialyserte oppløsning ble klaret ved sentrifugering og sendt gjennom en kolonne (2,5 x 10 cm) carboxymethylcellulose (CM-52, Whatman) ved en hastighet på 2 ml pr. minutt, etterfulgt av vasking av kolonnen med 0,02M natriumfosfat, pH 6,0 (30 ml). Gjennomstrømnings- og vaskeoppløsningene ble slått sammen og proteinene ble utfelt ved å tilsette 2,5 volumdeler aceton.

Eluering fra CM-52-kolonnen ble utført med en lineær gradient av 0 - 0,4M NaCl i natriumfosfat, pH 6,0. Fraksjoner ble analysert spektrofotometrisk (ved 420 nm) med hensyn på proteolytisk aktivitet ved pH 8,2 som beskrevet i eksempel 8. Toppfraksjoner inneholdende enzymaktiviteten ble slått sammen, dialysert ved 4°C mot vann og så lyofilisert. SDS-PAGE av 2-mercaptoethanol-behandlet prøve viste protease TW3 som et hovedbånd (mer enn 96% basert på farging med Coomassie-blått) med en tilsynelatende molekylvekt på 31.000 dalton.

Eksempel 17

Aminoendeanalyse av protease TW3

Protease TW3 ble renset fra kultursupernatanten som beskrevet i eksempel 16. Renset protein ble så inaktivert med PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid) og ytterligere renset under anvendelse av HPLC. Aminoenden ble bestemt ved rekonstruk-sjon av proteinet i 50% trifluoreddiksyre (TFA) inneholdende 1 mM PMSF. Automatisert Edman-nedbrytning i gassfase ble ut-ført for aminoendeanalysen. Aminoenden ble funnet å være Ala-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Pro-Trp-Gly-Leu-Ala-Arg-Ile-Ser-Ser-Thr.

Eksempel 18

pH- profil til proteinase TW3

pH-profilen til protease TW3 ved 25°C ble bestemt under anvendelse av azokasein som substrat. Substratoppløsningen (0,6%) M-buffere som dekker pH-området mellom 5,0 og 10, ble laget. Til disse azokasein-oppløsninger ble enten 20 yl av en 1 mg/ml oppløsning av protease TW3 i vann, eller 2 0 yl vann (kontroll) tilsatt og den proteolytiske aktivitet ble bestemt som beskrevet i eksempel 8.

pH-profilen til proteinase TW3 er vist i figur 10 hvor prosentandelen av maksimal aktivitet er plottet mot pH. pH-optimumet for protease TW3 ble bestemt til å være pH 9.

Eksempel 19

Temperaturprofil til proteinase TW3

Temperaturprofilen til protease TW3 i 0,05 natriumfosfat ved pH 8,5 ble bestemt ut fra den proteolytiske aktivitet (azokasein-analyse) i temperaturområdet mellom 4°C og 65°C. For disse målingene ble aliquoter (1 ml) av 0,6% azokasein i 0,05M natriumfosfat, pH 8,5, inkubert ved forskjellige temperaturer, og etter tilsetning av enzymoppløsningen

(20 yl 0,5 mg proteinase TW3 pr. ml av den samme buffer)

eller 20 yl buffer alene (kontroll), fikk omsetningen fortsette i 10 minutter og ble så avsluttet etter tilsetning av 10% trikloreddiksyre (400 yl). Temperaturprofilen til protease TW3 er vist i figur 11 hvor prosentandelen av maksi-

mal proteolytisk aktivitet er blitt plottet mot temperatur. Som vist i figur 5, varierer den optimale temperatur til protease TW3 mellom 55°C og 60°C.

Eksempel 20

Sammenlignende stabilitetsundersøkelse av proteasen TW3 og subtilisin

Protease TW3 og et kommersielt subtilisin (Sigma, protease VII, kat. nr. 5255) ble testet med hensyn på stabilitet ved 52°C i fravær av substrater. Tester ble utført ved tre forskjellige pH-verdier (4,0, 8,0 og 10,0).

Omtrent 0,2 mg enzym/ml ble inkubert ved 50°C. Den gjenværende aktivitet etter et bestemt tidsrom ble kvantifisert ved å ta ut 10 yl prøve og analysere den proteolytiske aktivitet som redegjort for i eksempel 8. Tabell 4 viser resultatene som ble oppnådd. Dataene viser den bibeholdte enzymatiske aktivitet som en prosent av den opprinnelige enzymatiske aktivitet. Protease TW3 oppviste den beste stabilitet. F.eks. ble 90% av den opprinnelige aktivitet av protease TW3 bibeholdt etter 1 times inkubering ved 50°C ved pH 8,0, mens bare 2% av den opprinnelige aktivitet av subtilisin ble bibeholdt. Etter 2 timer med inkubering var 96% av protease TW3-aktivitet tilbake, sammenlignet med 0,6% av aktiviteten til subtilisinet. Protease TW3 var også mer stabilt enn subtilisin ved pH 4,0 og 10,0.

Eksempel 21

Stabilitet til protease TW3 i kommersielle tøyvaskemidler

Stabiliteten til protease TW3, samt til subtilisin, ble testet i tre enzym-holdige kommersielle tøyvaskemidler. Disse var "Era-Plus", "Tide" og "Dynamo". De konsentrerte råvaskemidler ble fortynnet 200 ganger i avionisert vann. Den endogene protease ble inaktivert ved å inkubere det fortynnede vaskemiddel ved 65°C i 1 time før tilsetning av enten protease TW3, protease TW7, proteinase K eller subtilisin får å oppnå den enzymaktivitet som er til stede i den opprinnelige vaskemiddelblanding.

Inaktivert vaskemiddel med tilsatte proteaser ble inkubert ved 50°C i forskjellige tidsrom sammen med vaske-midlet inneholdende aktivt endogent enzym. Den gjenværende proteolytiske aktivitet som ble tilbake etter forskjellige inkubasjonsperioder, ble kvantifisert ved å ta ut prøver og analysere i overensstemmelse med fremgangsmåtene beskrevet i

eksempel 8.

Som vist i tabell 5, er protease TW3 svært stabil i alle vaskemiddelblandinger som ble testet. F.eks. i en blanding som inneholder "Era Plus", ble 94% av aktiviteten beholdt etter 1 times inkubasjon, mens blandingen som inneholdt endogent enzym, var fullstendig inaktivert. I en blanding inneholdende "Dynamo", var 80% av aktiviteten til protease TW3 tilbake etter 1 times inkubasjon, sammenlignet med bare et ikke-påvisbart nivå av aktivitet i en blanding som inneholdt endogent enzym. I en blanding inneholdende "Tide" var 48% av den opprinnelige aktivitet til TW3 beholdt, mens 23% av aktiviteten i blandingen som inneholdt endogent enzym, var tilbake etter 1 time. I alle tilfeller ble subtilisin inaktivert innen 1 time.

Stabiliteten til proteasen TW3 ble også testet i tøy-vaskemidlet "Wisk" som ikke inneholder enzym i sin blanding. Etter en 1:200-fortynning av råvaskemidlet i avionisert vann, ble subtilisin eller protease TW3 tilsatt til det fortynnede vaskemiddel og prøvene ble inkubert ved 50°C. Den proteolytiske aktivitet ble analysert under anvendelse av fremgangsmåten redegjort for i eksempel 8. De oppnådde resultater er vist i tabell 5.

Claims (15)

1. Serinprotease, karakterisert ved at den har en aminosyresekvens som angitt i figur 3 eller figur 8.

2. Serinprotease ifølge krav 1, karakterisert ved at den har en aminoenderest i Ala<1>.

3. DNA-sekvens for anvendelse ved sikring av ekspresjon i en prokaryot eller eukaryot vertscelle av en serinprotease, karakterisert ved at sekvensen er valgt fra gruppen bestående av: a) DNA-sekvensene angitt i figurene 1, 2 og 7, og b) redundante variasjoner av de nevnte DNA-sekvenser.

4. Preparat, karakterisert ved at det omfatter en effektiv mengde av en serinprotease ifølge krav 1 i et detergentpreparat.

5. Ekspresj onsvektor, karakterisert ved at den inneholder en DNA-sekvens ifølge krav 3 i en transformert eller transfektert vertscelle og er i stand til å uttrykke DNA-sekvensen.

6. Prokaryot eller eukaryot vertscelle, karakterisert ved at den er transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 5, og er i stand til å uttrykke en DNA-sekvens ifølge krav 3.

7. Vertscelle ifølge krav 6, karakterisert ved at den er erholdt ved å transformere en E. coli-stamme.

8. E. coli-stamme ifølge krav 6, karakterisert ved at den er i stand til å produsere en serinprotease med en aminosyresekvens som angitt i figur 3.

9. E. coli-stamme ifølge krav 6, karakterisert ved at den er i stand til å produsere en serinprotease med en aminosyresekvens som angitt i figur 8.

10. Serinprotease, karakterisert ved at den har en aminosyresekvens som angitt i figur 3 eller figur 8, og er produktet av prokaryot eller eukaryot ekspresjon av en eksogen DNA-sekvens.

11. Serinprotease ifølge krav 10, karakterisert ved at den eksogene DNA-sekvens er en cDNA-sekvens.

12. Serinprotease ifølge krav 10, karakterisert ved at den eksogene DNA-sekvens er en genom-DNA-sekvens.

13. Serinprotease ifølge krav 10, karakterisert ved at den eksogene DNA-sekvens er en fremstilt DNA-sekvens.

14. Serinprotease ifølge krav 10, karakterisert ved at den er produktet av E. coli-ekspresj on.

15. Serinprotease ifølge krav 10, karakterisert ved at den har en aminoende-metioninrest i stilling -1.