WO1995006720A1 - Nouvelle lipase, micro-organisme la produisant, procede de production de cette lipase, et utilisation de ladite lipase - Google Patents

Description

明 細 書 新規リパーゼ、 そのリパーゼを生産する微生物、 そのリ パーゼの製造方法及び用途 技術分野

本発明は新規な リパーゼ、 それを生産する微生物、 そ のリパーゼの製造方法及びその用途に関する。 さ らに詳 しく 言元は'、 シユー ドモナス ( Ps eud om on as ) 属細菌の 生産する、 洗濯液中 （アルカ リ性域） で活性を有する リ パーゼ、 それを生産する微生物、 そのリパーゼの製造方 法及び洗濯液中で脂質を分解するこ との出来る酵素を含 有する洗剤組成物に関する。 背景技術

洗濯における洗浄効率の向上のために、 洗剤に酵素を 配合して利用することは従来より知られている。 例えば、 洗剤組成物にプロテアーゼを配合して被洗浄物に付着し たタ ンパク質その他の汚垢を分解除去すること、 また、 セルラーゼを配合してセルロース繊維被洗浄物に付着し た汚垢を除去すること、 あるいはア ミ ラーゼ等の多糖分 解酵素を配合して被洗浄物に付着した多糖その他汚垢を 分解除去することが知られている。 更に、 近年において は、 洗剤にリパーゼを配合して被洗浄物に付着した脂質 を分解除去し洗浄効率を向上出来ることが知られている。 この用途は、 アン ドレー （H. Andree) らによ る 「洗浄 剤成分と しての ーゼ」 （Lipase as detergent conip onents) と題する幸 K文 ( Journal of Applied Biochemis try. 2. 218-229 (1980)) 等に記載されている。

好ま しい洗剤配合用のリパーゼは、 洗濯液中で充分に リパーゼ活性が機能するものである。 通常の洗濯条件で は洗浄液の p Hがアル力 リ性領域にあるため、 アル力 リ 性 p H域で機能する リパーゼが求められる。 また、 一般 に脂質汚れは高温高アル力 条件下では比較的除去され やすいが、 低温 （60 °C以下） の洗浄では充分に脂質汚 れを除去出来ないことが知られている。 従来より主と し て低温で洗濯が行われているわが国はもとより、 欧米に おいても洗濯温度は低温化する傾向にあり、 従って、 好 ま しい洗剤配合用 リパーゼは、 低温でも充分に機能する ものである。 また、 好ま しい洗剤配合用 リパーゼは、 界 面活性剤等の洗剤成分や、 多く の洗剤に含有されている プロテアーゼゃ漂白剤存在下でも洗濯時に充分機能を発 揮しうる ものである。 さ らに、 好ま しい洗剤配合用リ ーゼは、 洗剤に配合した状態で保存する時にも共存する 洗剤含有成分に対して安定であるものである。 以上のよ うな好ま しい特性を有する リパーゼを配合してなる脂質 汚れに対して高い洗浄効果を有する洗剤組成物の開発が 望まれている。

微生物の生産する リパーゼは、 シユー ドモナス (Pseu domonas) 属、 アルカ リ ゲネス ( A 1 ca 1 igenes) 属、 ァク 口モノくクタ一 ( Achromobacter) 属、 ムコ一ノレ （Mucor) 属、 キャ ンディ ダ (Candida) 属、 フ ミ コーラ （ Humicol a) 属等に由来することが知られている。

しかしながら、 これらの菌株から得られる大部分のリ パーゼはその至適 p Hが中性から微ァルカ リ性にあるた め、 アルカ リ性の洗剤溶液中で充分に""リパーゼが機能せ ず、 また、 洗剤溶液中での安定性も低い。

さ らには、 ァク ロモノくクタ一 ( Achromobacter) 属、 キャ ンディ ダ （Candida) 属、 ムコール （Mucor) 属、 フ ミ コーラ (Humicola) 属由来の各リパーゼは、 ァニオ ン 性界面活性剤の共存下においてその活性を強く 阻害され る 0

また、 シュ一 ドモナス （Ps§^omonas) 属に属する微 生物がリパーゼを生産することは、 広く 知られている。 リ ノ、。ーゼを生産する シユー ドモナス ( Pseudomonas) 属 の菌株にはシユー ドモナス · フルォ レ ツセンス （ Ps . f 1 uorescens) 、 シユ ー ドモナス · セノヽ。シァ (Ps . cepacia) 、 シユー ドモナス · フラギ （ f ragi) 、 シユー ドモ ナス · ァソレカ リゲネス （Ps. a leal igenes) 、 シユ ー ド モナス · シユー ド'ァノレカ リゲネス （Ps. pseudoal cal ige nes) 、 シユー ドモナス - ァエノレギノサ （Ps. aeruginos a) がある。 しかし、 これらの菌株から得られる公知の リパーゼも前記の特性を満足する ものではない。 発明の目的

従って、 本発明の目的は洗濯液中で充分機能し、 共存 する洗剤含有成分により活性がほとんど阻害されること なく 、 かつ界面活性剤やプロテアーゼ等他の洗剤成分に 対する安定性が高いリパーゼ、 かかる リパーゼを生産す る微生物、 そのリパーゼの製造方法を提供することにあ な

また、 本発明の他の目的は前記リパーゼを洗浄補助剤 と して含有する洗剤組成物、 さ らには前記リパーゼの他 にプロテアーゼなど他の酵素を含んでなる酵素含有洗剤 組成物を提供することにある。 発明の開示

本発明者らは、 前記の性質を有する リパーゼを得るベ く 、 多数の微生物を分離し、 培養して検索した結果、 東 京都下の土壌より分離した菌株であるシユー ドモナス s p . (Pseudomonas sp.) S D 7 0 5株に代表される シ ユー ドモナス (Pseudomonas) 属に属する菌株が、 洗剤 配合用と して有効な新規なリパーゼを生産することを見 出し本発明を完成するに至った。

すなわち、 本発明はシユー ドモナス (Pseudomonas) 属に属する微生物あるいはその変異株が生産する、 p H 3.5 〜 1 2の作用 p H測定範囲全域で作用し、 至適温度 が 5 5〜 6 5 °C付近にある新規リパーゼに関する もので ある。 また、 本発明は、 前記リパーゼの製造方法、 そのリバ 一ゼを産生する新規微生物、 そのリパーゼを含有する洗 剤組成物に関する。 図面の簡単な説明

図 1は本発明の S D 70 5株の生産する リパーゼの反 応 p Hと相対活性との関係を示すグラフである。

図 2は本発明の S D 70 5株の生産する リパーゼの反 応温度と相対活性との関係を示すグラフである。

図 3は本発明の S D 70 5株の生産する リパーゼを種 々の温度にて P H 7で 1時間処理した場合の残存活性を 示すグラフである。

図 4は本発明の S D 70 5株の生産する リパーゼを種 々の p Hにて 37 °Cで 1時間保持した後の残存活性を示 すグラフである。 発明の詳細な説明

[生産菌]

本発明のリパーゼを製造するために使用する微生物は、 後記の性質を有する リパーゼを生産することができ、 か つ後記の分類学上の性質を有するシユー ドモナス (Pseu donionas) 属細菌であれば特に限定されない。 この様な 細菌は、 保存菌株中から、 または自然界から新たに分離 した微生物中から選択する ことができる。 またこれらの 細菌の自然または人工変異株であっても、 後記の性質を 有する リパーゼの生産能を有する限り、 当然包含される ものである。 かかる細菌菌株は土壌その他の分離源から 常法に従って分離する ことができる。 目的とする菌株の 選択は、 被検微生物を例えば通常の細菌用培地中で培養 し、 高 p H常温条件下での培養液のリパーゼ活性を常法 に従って測定することにより行なう ことができる。

本発明の新規な リパーゼを生産する シュ一 ドモナス (Pseudoinonas) 属に属する菌株の一例と して、 本発明 者らが東京都下の土より分離した S D 7 0 5株が挙げら れる。

この S D 7 0 5株の菌学的性質は表 1 に示す通りであ る。 なお、 表 1には、 バージーズ ' マニュアル ' ォブ · システマティ ッ ク くクテリオロジー （ Bergey' s Manua I of Systematic Bacteriology. 1984) を参考にして本 菌と比較的類似の菌学的性質をもつシ ドモナス · ァ ノレカ リ ゲネス （Pseudoinonas al acal igenes) 、 シユー ド モナス · シ ドアノレ力 リ ゲネス ( Pseudoinonas pseudo aicaligenes) の菌学的性質を併記した。

表 1

SD705株 シュート'モナス* シュ-ト'モナス' アルカリゲネス シユードアルカリケ'ネス

(1) 形態 桿 桿 菌 捍 菌

(2) グラム染色性 性 陰 性 陰 性

(3) 芽胞 な し な し な し

(4) 運動性 あ り あ り あ り

(5) 鞭毛 極単毛 極単毛 極単毛

(6) ォキシダ一ゼ 陽 性 陽 性 陽 性

(7) カタラーゼ 陽 性 陽 性 陽 性

(8) 蛍光色素の産生 な し な し な し

(9) P H Bの蓄積 性 陰 性 d

(10) アルギニンジ 陰 性 陽 性 d

ヒ ドロラーゼ

(11) 4 1 Cでの生育 可 可 可

(12) 脱窒反応 陰 性 陽 性 d

(13) p

ゼラチン液化 1 性 d d

(14) デンプン分解 陰 性 陰 性 陰 性

(15) グルコースの資化性 陰 性 陰 性 陰 性

(16) L—ァスパラギン 陰 性 陰 性 陰 性

酸塩の資化性

(17) L—グルタミン 性 陽 性 陽 性

酸塩の資化性

(18) D—ダルコン酸塩 陰 性 陰 性 d

の資化性 (つづき）

SD705株 シユードモナス' シュ-ト'モナス' アルが)ゲネス シュ-ト'アルカリゲネス

(19) L一ヒスチジン 陰 性 d d

の資化性

(20) エタノールァミン 陰 性 陰 性 陽 性

の資化性

(21) n—ブタノール 陽 性 d 陽 性

の資化性

(22) イソブタノール 陰 性 d 陰 性

の資化性

(23) グリセロール 陰 性 陰 性 d

の資化性

(24) ソルビトール 陰 性 陰 性 d

の資化性

(25) イタコン酸の資化性 陰 性 陰 性 d

(26) メサコン酸の資化性 陰 性 陰 性 陽 性

(27) ーヒドロキシ 陽 性 陰 性 陽 性

酪酸塩の資化性

(28) ベタインの資化性 陰 性 陰 性 陽 性

(29) フラクトース 陰 性 陰 性 陽 性

の資化性

(30) グリセリン酸塩 陰 性 陰 性 陽 性

の資化性

(31) G C含有 （％) 6 0 64-68 62-64 d ：該当する種に属する菌株の 1 1〜8 9 %が陽性 S D 7 0 5株は表 1 に示したように、 エタノールア ミ ン、 メ サコ ン酸、 ベタイン、 フラ ク トース、 グリ セ リ ン 酸塩の資化性がシユ ー ドモナス · シユ ー ドアルカ リゲネ スと異なり、 アルギニンジ ヒ ドロラーゼの有無、 脱窒反 応の有無、 /3 - ヒ ドロキシ酪酸塩の資化性がシユ ー ドモ ナス · アルカ リゲネスと異なっており、 さらに G C含量 は両菌株より も低かった。

更に、 定量的 D N Aのハイプリダイゼーシ ョ ンを日本 細菌学雑誌， ϋ(5). 1990 に基づいて、 シユー ドモナス ， アルカ リ ゲネスの基準株 A T C C 9 0 9 と シユー ドモ ナス · シユ ー ドアルカ リゲネスの基準株 A T C C 1 74 4 0 とに対して行なったと ころ、 両基準株に対して 3 0 %未満の相同性であった。 これらの結果より本菌株はシ ユ ー ドモナス属に属するシユー ドモナス · アル力 リ ゲネ スの近縁種の新種であると決定した。

本菌株は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究 所 ( National Institute of Bioscience and Human-Tec hnolog . Agency of Industrial Science and Technolo gy) に寄託され、 F E R M P — 1 3 7 8 1 という受託 番号が付与された。 そ して特許手続上の微生物の寄託の 国際的承認に関するブタぺス ト条約 （BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PR0CEDU RE) に基づく 国際寄託に移管され、 F E R M B P - 4 7 7 2という受託番号が付与された。 また、 上記菌株を原菌株と して自然または誘発突然変 異により得た変異株を本発明による リパーゼの生産菌と して用いることができる。

前記変異株の調製法と しては、 例えば慣用の方法と し て、 原菌株を紫外線照射処理あるいは N—メ チルー N ' 一二 トロ— N—二 トロソグァ二ジン （N T G ) 等の薬剤 による人工的突然変異処理を施さずに、 またはかかる処 理を施して、 ォリ ーブオイル等の油を含む寒天培地に広 げ、 生育してく る菌株の中からコロニーのまわりに形成 されるク リアゾーンの大きさが、 より大きいコロニーを 選抜し、 リパーゼ生産用培地にて培養して生産性の最も 優れた菌株を選抜する方法がある。

本発明のリパーゼ生産菌は、 好ま しく は S D 7 0 5株 と D N Aハイブリ ダィゼーショ ンにおいて 5 0 %以上の ホモロジ一を示す菌株、 より好ま しく は 7 0 %以上のホ モロジーを示す菌株である。

[製造方法]

本発明のリパーゼはシユー ドモナス （ Ps eudomonas ) 属に属する本リパーゼ生産菌を培養することにより、 主 と して菌体外 （培養液中） に産生される。

培地の栄養源と しては、 通常培養に用いられている も のが広く 利用できる。 炭素源と しては同化できる炭素化 合物またはこれを含有するものであればよく例えば油脂、 コーンスティ一プリカ一、 T w e e n系界面活性剤など が用いられる。 窒素源と しては同化可能な窒素化合物ま たはこれを含有する ものであればよ く 、 例えばア ンモニ ゥム塩、 硝酸塩、 大豆粉、 肉エキス、 コーンスティ ープ リカ一、 ファーマメディ アなどが用いられる。 また、 無 機塩類と してはリ ン酸水素アンモニゥム、 リ ン酸水素力 リ ウム等のリ ン酸塩、 マグネシウム塩、 カルシウム塩、 マンガン塩などの塩類を適宜添加するこ と もできる。 培養条件は培地組成により多少異なるが、 生産の目的 である本リパーゼの生産に適した条件であれば良いが、 通常は以下に示す条件を選択する。 すなわち、 培養温度 は 1 0〜4 0 °C、 より好ま しく は 2 0〜 3 7 °Cの範囲で あり、 培養時間は 8時間から 1 0 0時間程度であり、 本 リパーゼの生産が最高に達したときに培養を終了すれば よい。 培地の p Hは 5〜 1 2で行えば良いが、 特に 7〜 1 0が本リパーゼ生産に好適である。 この様な培養によ り、 目的とする リパーゼは主と して菌体外 （培養液中） に産生される。

[分離精製法]

この様にして得られた培養液からの本リパーゼの採取 は、 リパーゼを採取するための常法にしたがって分離、 精製することにより行なう ことが出来る。

すなわち、 培養液からろ過法や遠心分離法などの公知 の適当な方法により菌体ゃ培地固形物を分離して得られ る上清液またはろ液を分離し、 これらの分離液を濃縮し または濃縮することなく 、 可溶性塩類を添加して酵素を 沈澱させる塩析法、 親水性有機溶剤を添加し酵素あるい は夾雑物を沈澱させる有機溶剤沈澱法、 ィォン交換樹脂 等を用いた吸着脱離法、 ゲルろ過法、 安定補助剤を加え てまたは安定補助剤なしに噴霧乾燥する方法、 凍結乾燥 法等の分離も しく は精製手段を単独または複数組み合わ せて用いる ことにより、 本リパーゼを得ることができる。

[酵素力価の測定方法]

リパーゼ活性の測定は、 本発明においては、 ト リオレ イ ン一ポ リ ビニルアルコ一ノレ （ P V A ) ェマルジ ヨ ンを 基質とする測定法を用いて実施した。

この力価の測定は具体的には以下の方法で行なつた。 酵素液 0.1m 1、 1 mM 塩化カルシウムを含み、 1 O O mM ε —ア ミ ノ カプロ ン酸、 l O O mM ピス ト リ ス （ビス 〔 2— ヒ ドロキシェチル〕 イ ミ ノ ト リ ス 〔ヒ ドロキシメ チル〕 メ タ ン） 及び l O O mM T A P S (N— ト リ ス 〔ヒ ドロキシメ チル〕 メ チルー 3—ァ ミ ノ プロパンスルホン酸） からなる混合液を水酸化ナ ト リ ウ ムで p H調整した緩衝液 （p H10.0) 0.4 m 1、 及び 卜 リオレイ ンェマルジョ ン 0.5m 1からなる混合液を共栓 付き試験管中で 37 °Cにて 1 0分間加熱して反応させ、 反応停止液と して 1 N塩酸 0.2m 1 を用いて反応を停止 させた。 こ こで、 ト リオレイ ンェマルジ ヨ ンと しては、 ポ リ ビニルアルコール （ P V A ) 2 %水溶液 （ポバール P V A 1 1 7 (㈱クラ レ商品名） ： ポバール P VA 20 5 (㈱ク ラ レ商品名） = 9 : 1 (W/W) ) 1 0 m l に 2.5 gの ト リ オレイ ンを加え、 ホモジナイズしたものを 用いた。 反応停止後、 π—へキサン 2 m l 、 イ ソプロ ピ ルアルコール 2 m 1、 蒸留水 1 m 1を加え激しく撹袢し、 静置後へキサン層をサンプリ ングし、 T L C— F I D法 (Minagawaら， Lipids, 18. 732 (1983) )にてォ レイ ン酸 を定量した。 活性の単位は 1分間に 1マイ ク ロモルのォ レイ ン酸を生成する酵素量を 1ユニッ ト と （ 1 U) と し また、 後述の実施例で洗剤に配合したプロテアーゼ活 性の測定は、 特公昭 60-55118号に記載の力価測定法によ り行ない、 活性の単位は、 ナノ 力タール （nkatal = 1 0

— ⁹ katal, n k a t と略記する。 ） で表示した。

[酵素の性質]

本発明のリパーゼは下記の性質を有する。 すなわち本 発明のシユー ドモナス s p. ( Pseudonionas sp. ) S D 70 5株の生産する リパーゼについて、 以下にその性質 を言己載する。

( 1 ) 作用

ト リ グリセリ ドに作用し、 そのエステルを加水分解す 0

( 2 ) 基質特異性

各種グリセ リ ド、 エステルなどを広範囲にわたり加水 分解する。

グリセ リ ド基質と しては、 各グリセリ ドーアラ ビアゴ ムェマルジョ ンを用いた。 用いたェマルジョ ンはグリセ リ ド 1 0 gにァラ ビアゴム 1 0 g、 蒸留水 1 00 gを加 え、 ホモジナイズしたェマルジヨ ンを用いた。

前記ェマルジヨ ン 5 m l 、 l O O mM塩化ナ ト リ ウム 及び 25 mM塩化カルシウムを含む 1 O mM ト リ ス緩衝 液 （p HlO.O) 5 m l 、 蒸留水 4.5m l 、 酵素液 0.5m 1 の混合物を 30。C、 p H 1 0にて反応せしめたときの 脂肪酸生成速度を 0.05 N水酸化ナ ト リ ウム水溶液を用い た p Hスタ ツ 卜滴定法により求めた。 この脂肪酸生成速 度を各基質の分解力と した。

ト リオレイ ンの分解力を 1 00とすると ト リ ブチリ ン 1 2 5、 オ リープ油 5 5、 大豆油 7ひ、 綿実油 66の相 対活性を示す。

また、 エステルに対する分解力は、 p—ニ トロフヱニ ル脂肪酸エステルを基質と し、 ρ Η 8.0、 30 °Cでの加 水分解反応によ り生じる P —二 ト ロフ ヱ ノ ールの比色 (O D40 5) より求めた。

p N P P ( p—ニ ト ロフ ヱニルパルミ テー ト） の分解 力を 1 00と した場合、 p N P L ( P -ニ ト ロフエニル ラウ レー ト） 1 34、 ρ N P V (p—ニ ト ロフエ二ルノく レレー 卜） 34の相対活性を示す。

( 3 ) 作用 p H及び至適 p H

ト リオレイ ンェマルジヨ ンを基質と して、 前記の力価 測定法により測定した。 反応時の p Hは、 3.5 〜12.0の 範囲で異なる p Hにおいて測定した。 ただし緩衝液と し て l.O mMの塩化カルシウムを含み、 l O O mM ε — ア ミ ノ カプロ ン酸、 l O O mM ピス ト リ ス （ビス 〔 2 ー ヒ ドロキシェチル〕 イ ミ ノ ト リス 〔ヒ ドロキシメチル〕 メ タ ン） 及び l O O mM TA P S (N— ト リ ス 〔ヒ ド 口キシメ チル〕 メチルー 3—ア ミ ノプロパンスルホン酸） からなる混合緩衝液を塩酸または水酸化ナ ト リ ウムで p H調整したものを用いた。 反応 p Hと相対活性の関係は 図 1に示すとおりであり、 Ρ Η 3·5〜 1 2の範囲で測定 した場合、 作用 ρ Ηは 3.5〜 1 2であり、 至適 ρ Ηは 1 0〜 1 1である。

(4 ) 作用温度及び至適温度

ト リオレイ ンェマルジヨ ンを基質と して、 30〜80 °Cの範囲の異なる反応温度にて行なう こ と以外は、 前記 の力価測定法と同様の方法で測定した。 反応温度と相対 活性の関係は図 2に示すとおりであり、 30〜80。Cの 範囲で測定した場合の作用温度は 30〜 8 CTC、 至適温 度は 55〜65。Cである。 40°C及び 70。Cにおいては、 至適温度における活性の約 50 %の相対活性を示す。

(5) 温度安定性

20。 〜70での温度範囲の異なる温度で 7にて

1時間保温処理した後の残存活性を、 前記の力価測定法 で測定した。 この時の処理温度と残存活性の関係は図 3 に示すとおりであり、 60 °Cの処理で 80 %以上の活性 を有する。 処理時の緩衝液は、 50 mM ε —ァ ミ ノ 力 ブロ ン酸、 50 mM ピス ト リ ス （ビス 〔2— ヒ ドロキ シェチル〕 イ ミ ノ ト リ ス 〔ヒ ドロキシメ チル〕 メ タ ン） 及び 50 mM T A P S (N - 卜 リ ス 〔ヒ ドロキシメ チ ル〕 メチル一 3—ァ ミ ノプロパンスルホン酸） からなる 混合緩衝液を塩酸で P H 7に調整したものを用いた。

(6) p H安定性

ρ Η4〜 1 2の ρ Η範囲の異なる ρ Ηで 37。Cにて 1 時間処理した後の残存活性を前記の力価測定法で測定し た。 この時の処理 p Hと残存活性の関係は図 4に示すと おりであり、 p H 4〜 1 0で 50 %以上の残存活性を有 する。 処理時の緩衝液は 0.5 mMの塩化カルシウムを含 み、 50 mM ε —ア ミ ノカプロ ン酸、 50 mM ビス ト リス （ビス 〔 2— ヒ ドロキシェチル〕 ィ ミ ノ ト リ ス 〔ヒ ドロキシメ チル〕 メ タ ン） 、 5 0 mM T A P S (N— ト リス 〔ヒ ドロキシメチル〕 メチルー 3—ァ ミ ノ プロパンスルホン酸） 混合緩衝液を塩酸または水酸化ナ ト リ ウムで p H調整したものを用いた。

(7) 分子量

S D S -ポ リアク リルア ミ ドゲル電気泳動法 （分子量 標準 ： チ トクローム C (モノマー、 ダイマー、 ト リマー、 テ トラマー、 へキサマー） ） により得られた分子量は 3 1000± 2000である。

(8) 等電点

等電点ポリアク リルア ミ ドゲル電気泳動法により測定 した等電点は 5.2±0·5 である。

( ) 洗剤成分による影響

ト リオレイ ンェマルジョ ンを基質と して、 後記標準使 用濃度の各種市販洗剤 （4種） と代表的な洗剤用アル力 リプロテア一ゼである A P I - 21 (特公昭 60-55118号） を 0.3n k a t Zm l の濃度で添加し反応 p Hを 1 0、 反応時間を 30分と したこと以外は、 前記の力価測定法 と同様の方法により測定した。 市販洗剤及び A P I — 2 1を添加しない時の活性を 1 0 0と したときの相対活性 は表 2に示すとおりであり、 プロテアーゼを含む各種洗 剤溶液中で高い活性を有する。

上記の性質を有する リパーゼは、 低温 （60 °C以下） でも十:: に機能し、 洗剤溶液中でも安定にその活性を発 現することから洗剤配合用リパーゼと して好ま しい。

[洗剤組成物]

本発明によれば、 前記の性質を有する リパ―ゼを配合 した洗剤組成物が提供される。 本発明の洗剤組成物に配 合される リパーゼの量には特に限定はないが、 一般には 洗剤組成物 l g当たり 1 00〜10000 ュニッ ト、 好ま し く は 500〜4000ユニッ トの割合で配合する。 この配合 量が少なすぎると十分な洗浄効果の向上が.得られず、 ま た逆に多過ぎた場合には酵素配合量に比して洗浄効果の 向上が大き く なく 、 経済性の点で好ま し くない。

本発明に従えば、 前記リパーゼは従来公知の任意の洗 剤組成物に洗剤組成物の組成を何等変更することなく配 合することができ、 本発明の洗剤組成物の成分について は特に限定はない。 そのよ うな洗剤組成物の代表例をあ げれば、 洗剤組成物重量当たり 1 0 ~ 50重量％の界面 活性剤、 0〜 50重量％のビルダー、 1〜 50重量％の アルカ リ剤あるいは無機電解質、 0 . 1〜 5重量％の再汚 染防止剤、 酵素、 漂白剤、 蛍光染料、 ケーキング防止剤 及び酸化防止剤からなる群より選ばれる少なく と も 1種 以上の配合成分からなる洗剤組成物があげられる。

界面活性剤と しては石鹼、 例えば直鎖または分岐アル キルあるいはアルケニル硫酸塩、 ア ミ ド硫酸塩、 直鎖ま たは分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、 ェ チレンォキサイ ド、 プロピレンォキサイ ド及びプチレン ォキサイ ドのうちの単独あるいは複数成分が付加したァ ルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩のような脂肪族 硫酸化物、 アルキルスルホン酸塩、 アミ ドスルホン酸塩、 ジアルキルスルホコハク酸塩、 α —ォレフィ ン、 ビニリ デン型ォレフィ ン及び内部ォレフィ ンの各スルホン酸塩 のような脂肪族スルホン酸塩、 直鎖または分岐鎖のアル キルベンゼンスルホン酸塩のような芳香族スルホン酸塩、 直鎖または分岐鎮のアルキル基またはアルケニル基を有 し、 エチレンォキサイ ド、 プロ ピレンォキサイ ド及びプ チレンォキサイ ドのうちの単独あるいは複数成分が付加 したアルキルまたはアルケニルェ一テルカルボン酸塩ま たはア ミ ド、 α —スルホ脂肪酸塩またはエステル、 ア ミ ノ酸型界面活性剤、 アルキルまたはアルケニル酸性リ ン 酸エステル、 ァルキルまたはアルケニルリ ン酸塩の如き リ ン酸エステル系界面活性剤、 スルホン酸型両性界面活 性剤、 ベタイ ン型両性界面活性剤、 直鎖または分岐鎖の アルキル基またはアルケニル基を有し、 エチレンォキサ ィ ド、 プロピレンォキサイ ド及びプチレンォキサイ ドの うちの単独あるいは複数成分が付加したアルキルまたは アルケニルエーテルあるいはアルコール、 直鎖または分 岐鎖のアルキル基を有し、 エチレンォキサイ ド、 プロ ピ レンォキサイ ド及びブチレンォキサイ ドのうちの単独あ るいは複数成分が付加したポリオキシエチレンアルキル フヱニルエーテル、 高級脂肪酸アル力ノールア ミ ドまた はそのアルキレンオキサイ ド付加物、 ショ糖脂肪酸エス テル、 脂肪酸グリセリ ンモノエステル、 アルキルまたは アルケニルア ミ ンォキサイ ド、 テ トラアルキルアンモニ ゥム塩型カチォン界面活性剤など洗剤組成物と して通常 配合される界面活性剤であればいずれも使用可能である。 陰ィォン性界面活性剤の場合の対ィオンと してはナ ト リ ゥムイオンまたはカリウムイオンであることが好ましい。 これらの界面活性剤は、 単独または 2種以上の混合物と して使用される。

ビルダー及びアル力 リ剤あるいは無機電解質と しては オルソ リ ン酸塩、 ピロ リ ン酸塩、 ト リ ポ リ酸塩、 メ タ リ ン酸塩、 へキサメ タ リ ン酸塩、 フイ チン酸塩などのリ ン 酸塩、 エタンー 1 , 1 —ジホスホン酸、 エタンー 1 , 1 , 2— ト リ ホスホン酸、 ェタ ン一 1 — ヒ ドロキシ— 1 , 1 -ジホスホン酸及びその誘導体、 エタンヒ ドロキシー 1 , 1， 2— ト リ ホスホン酸、 エタ ンー 1 , 2—ジカルボキ シ一 1 , 2ジホスホン酸、 メ タ ンヒ ドロキシホスホン酸 などのホスホン酸塩、 2 -ホスホノ ブタ ン— 1 , 2 —ジ カルボン酸、 1一ホスホノ ブタ ン一 2 , 3 , 4 - ト リ 力 ルボン酸、 α—メ チルホスホノ コハク酸などのホスホノ カルボン酸塩、 ァスパラギン酸、 グルタ ミ ン酸などのァ ミ ノ酸塩、 二 ト リ 口三酢酸塩、 エチレンジァ ミ ン四酢酸 塩、 ジエチレン ト リ ア ミ ン五酢酸塩などのア ミ ノ ポ リ酢 酸塩、 ポ リ アク リ ル酸、 ポ リ イ タ コ ン酸、 ポ リ マレイ ン 酸、 無水マレイ ン酸共重合体、 カルボキシメ チルセル口 ース塩などの高分子電解質、 ポ リ エチレ ングリ コール、 ポ リ ピニルアルコールなどの非解離高分子、 ジグリ コ一 ル酸、 ォキシジコハク酸、 カルボキシメ チルォキシコハ ク酸、 クェン酸、 乳酸、 酒石酸、 シ ョ糖、 ラ ク トースな どのカルボキシメ チル化物、 ペンタエリ ス リ トールの力 ルボキシメ チル化物、 ダルコ ン酸の力ルボキシメ チル化 物、 ベンゼンポ リ カルボン酸、 シユ ウ酸、 リ ンゴ酸、 ォ キシジコハク酸、 ダルコ ン酸などの有機酸塩、 ゼォライ 卜などのアルミ ノ ゲイ酸塩、 炭酸塩、 セスキ炭酸塩、 硫 酸塩、 メ タケイ酸塩などの無機塩をアルカ リ金属塩と し て用いる こ とができ、 またデンプン、 尿素などの有機物 質及び塩化ナ ト リ ウム、 ベン トナイ トなどの無機化合物 を用いる ことができ、 更には有機アル力 リ剤と して ト リ エタ ノールァ ミ ン、 ジエタ ノ ールァ ミ ン、 モノエタノ ー ルア ミ ン、 ト リ イ ソプロパノールア ミ ンなどを用いる こ とができ る。

本発明の洗剤組成物は、 前述の如く 、 界面活性剤、 リ パーゼ、 アルカ リ剤または無機電解質を必須の構成成分 と して含むが、 その他必要に応じて両性界面活性剤、 例 えば過炭酸ソーダ、 過ホウ酸ソーダなどの漂白剤、 色素、 ピルダ一、 例えばポ リ エチ レングリ コール、 ポ リ ビ二ル アルコール、 ポ リ ビニルピロ リ ドン、 カルボキシメ チル セルロースなどの再汚染防止剤、 ケーキング防止剤、 酸 化防止剤、 プロテア一ゼなどのその他の酵素を必要に応 じて含ませることができる。

本発明の洗剤組成物にリパーゼあるいはプロテア一ゼ などのその他の酵素を配合するには如何なる方法をもつ て行なってもよいが、 微粉末状で配合することは、 洗剤 取扱い時の発塵による洗剤使用者や洗剤工業における作 業者の安全衛生上好ま しいこ とではなく 、 溶液状態ある いはあらかじめ発塵性をおさえた形状に賦形しておく こ とが好ま しい。 この賦形は通常良く用いられるマルメ造 粒、 押し出し造粒、 流動造粒、 遠心流動造粒やその他の 方法のいずれによるものであつても良いが、 本発明の洗 剤組成物に配合する リパーゼぁるいはプロテアーゼなど のその他の酵素の形状は特にこれらの方法によって賦形 されたものに限定されるものではない。 発明を実施するための最良の形態

次に本発明を実施例を挙げて説明するが、 本発明は下 記の実施例に限定されるものではない。 なお、 下記の説 明中、 特に記載がない限り％は重量を基準とする もので あ ^ )

実施例 1 ： リパーゼ生産菌 （S D 70 5株） の培養 大豆粉 2 %、 リ ン酸水素ニァンモニゥム 0.1%、 オ リ ーブオイル 1 %、 リ ン酸水素二力 リ ウム 0.5%、 硫酸マ グネシゥム · 7水和物 0.1%及び炭酸ナ ト リ ウム 0.3% 濃度の液体培地 2 m 1 を 1 8 m m径の試験管にとり、 1 2 1。C、 20分間高圧蒸気滅菌した後、 シユー ドモナス s ρ . (Pseudoionas sp.) 307 0 5株を 1 白金耳接 種し、 3 5。Cで 24時間、 1 30 r p mで培養した。 培 養後、 遠心分離により菌体を除去し リパーゼ液を得た。 この液の リパーゼ活性は 5 U Z m 1であった。

実施例 2 ： リパーゼ生産菌 （ S D 7 0 5株） の培養及び リパーゼの取得 大豆粉 2 %、 リ ン酸水素二アンモニゥ ム 0.1%、 リ ン酸水素二力 リ ウム 0.5%、 硫酸マグネシ ゥム · 7水和物 0.1%、 炭酸ナ ト リ ゥム 0.3%及び T w e e n 85 1.0%濃度の液体培地 2 リ ツ トルを 5 リ ツ ト ル培養槽にと り、 1 2 1で、 20分間高圧蒸気滅菌した 後、 シュ一 ドモナス s p. ( Pseudomonas sp.) S D 7 05株を接種し、 35 °Cで 24時間、 l O O O r p mで 通気撹拌培養した。 培養後、 遠心分離により菌体を除去 し リパーゼ液を得た。 この液の リパーゼ活性は 20 UZ m 1 であった。

このようにして得られたリパ一ゼ液から硫安沈澱法に て 2 0〜 4 0 %飽和画分の沈澱を得た。 これを常法によ り脱塩後、 凍結乾燥により リパーゼ原末を得た。

実施例 3 ： リパーゼの精製

実施例 2で得られたリパーゼ原末を 1 0 %飽和の硫酸 アンモニゥム溶液に溶解させ、 Buty卜 Toyopearl 6 5 0 M (商品名， 東ソ一㈱） での疎水ク ロマ トグラフィ ーを 行ない活性画分を得た。 この活性画分を 0.3mMの塩化 カルシゥムを含む 0 mM ト リス—塩酸緩衝液 （ p H 8) にて透析後、 同緩衝液で平衡化したイオ ン交換ク ロマ ト 樹脂 （DEAE-Cellulofine A-800, 商品名， 生化学工業㈱） に吸着させ、 塩化ナ ト リ ゥム濃度勾配にて溶出し活性画 分を得た。 これを脱塩後凍結乾燥により精製酵素を得た。

この凍結乾燥品は S D Sポリアク リルア ミ ドゲル電気 泳動法により単一であるこ とが確認された。

実施例 4 ： 本発明リパーゼと他の リパーゼの洗剤溶液中 の活性比較

実施例 2で得られたリパーゼ原末を用いて洗剤溶液中 の活性測定を行ない米国特許第 5069810 号に記載された、 シュ一 ドモナス · アル力 リ ゲネス （ Pseudomonas a lea genes) S D 2株 （ATCC 53877) の生産する リパーゼ S D 2、 欧州特許第 218272号に記載されたシユ ー ドモナス • シユー ド、ァノレカ リ ゲネス ( Pseudomonas pseudoal cal i genes) CBS 467.85株、 CBS 468.85株、 CBS 471.85株、 C BS 473.85株の生産する リパーゼの洗剤溶液中での活性 測定結果と比較した。 シユー ドモナス ' アルカ リゲネス (Pseudomonas alcal igenes) S D 2株の酵素は硫酸ァ ンモニゥム 0.5%、 リ ン酸水素二カ リ ウム 0.05%、 硫酸 マグネシウム · 7水和物 0.025%、 卜 リ プ ト ン 2.0%、 ポ リ オキシエチレン （ 2 0 ) セチルエーテル l.OmMの 培地で 3 0。Cで 1 6時間培養し、 また、 前記 4種のシュ ー ドモナス · シユー ドアノレカ リ ゲネス （ Pseudomonas ps eudoalcal igenes) 株の酵素は、 それぞれの株をスキム ミルク 1 0 %、 p H 7の培地で 20 °Cで 48時間培養し、 遠心分離で得られた培養上清を用いた。

ト リオレイ ンエマルジョ ンを基質と して、 標準使用濃 度の各種市販洗剤 （4種） と代表的な洗剤用アルカ リプ 口テアーゼである A P I - 2 1 (特公昭 60-55118号） を 0.3n k a t /m 1 の濃度で添加し反応 p Hを 1 0、 反 応時間を 3 0分と したこと以外は、 前記の力価測定法と 同様の方法により測定した。

こ こで使用した市販洗剤は、 アタ ッ ク （商品名， 花王

㈱製 ； 直鎖アルキルベンゼンスルホ ン酸ナ ト リ ゥム、 ァ ルキル硫酸エステルナ ト リ ゥム及びポ リ オキシエチレ ン アルキルエーテルを含有するァニォン系界面活性剤系洗 剤） 、 ウル トラアリエール （商品名， プロク ター ' ア ン ド · ギヤ ンブル . フ ァーイース ト㈱製 ； 直鎖アルキルべ ンゼンスルホン酸ナ ト リ ゥム、 アルキル硫酸エステルナ ト リ ウム、 アルカノ ィルォキシベンゼンスルホン酸ナ ト リ ゥム及びポ リオキシェチ レンアルキルエーテルを含有 するァニオ ン系界面活性剤系洗剤） 、 ウル ト ラ タイ ド (商品名， プロクター ' ア ン ド · ギャ ンブル㈱製 ； ァニ オン系界面活性剤系洗剤） 、 フ レ ッ シュスター ト （商品 名， コルゲー ト —パルモ リ ブ㈱製 ； ノニオン系界面活性 剤系洗剤） であり、 標準使用濃度と して、 それぞれ最終 濃度がァタ ッ ク 8 3 3 p p m、 ウル トラァ リ エール 1000 D p m、 ゥノレ トラ タイ ド 1000p p m、 フ レ ッ シュスター ト 6 24 p p mとなるよう添加した。

市販洗剤及び A P I - 2 1を添加しない時の活性を 1 0 0 と したときの相対活性を表 2に示した。

表 2 ： 洗剤溶液中の相対活性 （単位％)

洗 剤

洗剤なし アタック ウルトフ ウルトラ フレッシュ 酵素生産菌株

アリエ -ル 夕イド スタ-ト

S D 70 5 100 78 84 57 98

ATCC 53877 100 31 29 33 80

CBS 467.85 100 17 18 29 102

CBS 468.85 100 54 50 55 62

CBS 471.85 100 20 16 35 85

CBS 473.85 100 50 49 40 95

この表より、 本発明リパーゼは他のリパーゼに比べて 洗剤溶液中で高い活性を発揮することが分かる。

すなわち、 比較した他のリパーゼの中には、 洗剤によ つては本発明のリパーゼと同等レベルの相対活性を示す ものもあるが、 洗剤の種類が変わると相対活性が著しく 低下している （CBS 467.85及びじ83 468.85由来酵素） 。 これに対して本発明のリパーゼは、 洗剤の種類によらず に高い相対活性を示すという特徴を有している。

実施例 5 ： 洗剤組成物及び洗濯評価

市販洗剤であ る ア タ ッ ク に、 実施例 2で得られた リパーゼ原末を 2400ュニッ ト/ gとなるように配合して、 本発明によるリパーゼを含有する洗剤組成物を調製した。 洗濯評価は次のよう にして行なった。 すなわち、 汚染 布は、 脱脂した綿布 （ 1 5 c m x l 5 c m) に、 ベンゼ ンに溶解した ト リオレイ ン 70 m gを浸透させ 1夜室温 で乾燥したものを用い、 洗浄装置は、 Terg-0-Tonieter を用いた。 塩化カルシウムを終濃度 50 p p mとなるよ う添加した蒸留水 1 リ ッ トルに前記リパーゼ配合洗剤組 成物、 及び市販洗剤アタ ッ クをそれぞれ標準使用濃度で 溶解した。 前者の場合、 液中のリパーゼ濃度は 2ュニッ ト Zm lである。 更に、 プロテアーゼ A P I — 2 1 (特 公昭 60-55448号） を 0.3 n k a t Z m 1 になるように添 加した。 洗濯液 1 リ ツ トルあたり 6枚の前記 ト リオレイ ン汚染布を入れ、 30。Cの洗濯温度にて、 1 20 r p m で 30分間洗浄した。 洗浄後、 前記のカルシウム含有蒸 留水 1 リ ッ トルで 3分間ずつ 2回すすぎを行なった後室 温で乾燥した。 未洗浄と洗浄後の汚垢布の ト リオレイ ン 量は、 n—へキサンで抽出後前記 T L C— F I D法にて 定量し、 洗浄効率を以下の計算式により求めた。 洗浄効 率 （％) = { (未洗浄汚染布の ト リオレイ ン量—洗浄後 汚染布の ト リオレイ ン量） 未洗浄汚染布の ト リオレイ ン量） X 1 00

その結果を表 3に示す。 3 ： 洗濯評価 本発明リパ一ゼ添加 Uパ一ゼ無添加 洗浄効率（％) 78._4 68. 5 表 3に示したように本発明のリパーゼを添加した洗浄 では、 脂質汚れに対する洗浄効果がリパーゼ無添加に比 ベて高い。

実施例 6 ： 洗剤組成物及び洗濯評価

市販洗剤であるオール （レバーブラザーズ社， 商品名） に、 実施例 2で得られたリパーゼ原末を 2400ュニッ 卜 Z gとなるように配合したリパーゼ配合洗剤組成物及び、 オールにプロテアーゼ A P I - 21 (特公昭 60-55448号） 原末を 270 n k a t Zgとなるように配合したプロテ ァーゼ配合洗剤組成物、 及びオールに実施例 2で得られ たリパ一ゼ原末を 2400ュニッ ト g及びプロテアーゼ A P I — 2 1原末を 270 n k a t Z gとなるように配合 したリパーゼ Zプロテア一ゼ配合洗剤組成物の 3種類の 洗剤組成物を調製した。

洗濯評価は次のようにして行なった。 すなわち、 汚染 布は市販の汚染布 EMP A 1 1 2を用い、 洗浄装置は、 Terg-0-Tometerを用いた。 塩化力ルシゥムを終濃度 50 p p mとなるよう添加した蒸留水 1 リ ッ トルに前記の洗 剤組成物、 または、 市販洗剤であるオールをそれぞれ標 準使用濃度 （終濃度 llOOp p m) で溶解した。 リパーゼ 配合洗剤組成物の場合、 液中の リパーゼ濃度は 2 . 6ュニ ッ ト / m 1 であり、 プロテアーゼ配合洗剤組成物の場合、 液中のプロテア一ゼ濃度は 0 . 3 n k a t / m 1 である。 洗濯液 1 リ ッ トルあたり 6枚の前記汚染布を入れ、 3 0 での洗濯温度にて、 1 2 0 r p mで 3 0分間洗浄した。 洗浄後、 前記のカルシウム含有蒸留水 1 リ ッ トルで 3分 間ずつ 2回すすぎを行なった後室温で乾燥した。 洗浄後 の汚染布の反射率 （4 6 0 n m ) を測定した。 洗浄に対 する酵素の添加効果は、 酵素配合洗剤組成物で洗浄した 場合の反射率と酵素無配合の洗剤で洗浄した場合の反射 率の差で表わした。 その結果を表 4に示す。 表 4 ： 洗濯評価 洗剤組成物 酵素添加効果

リパーゼ配合 8 . 2

プロテア一ゼ配合 9, 8

リパーゼ プロテア一 _ゼ配合 _ 1 5 . 6 本発明による リパーゼを添加した洗浄では、 プロテア ーゼを添加した場合も添加しない場合も、 洗浄効果がリ パーゼ無添加に比べて高い。 発明の効果

本発明のリパーゼは各種の市販洗剤溶液中、 また、 界 面活性剤、 プロテアーゼ等の洗剤成分共存下で高い安定 性と活性を有するため、 洗濯条件下で油脂汚れを効率的 に分解除去でき、 洗剤に配合して洗浄力の増強を図る こ とが出来る。

また、 本発明のシユー ドモナス s p . ( Pseudomonas sp . ) S D 7 0 5株及びそれと菌学的に同等な菌株、 及 びその変異株は、 本発明のリパーゼを効率的に生産する ために有用である。

さ らにまた、 本発明の、 かかる菌株を用いる、 前記性 質を有する リパーゼの製造方法は該リパーゼの生産を効 率的に行なう ことができる利点を有する。

また、 本発明による リパーゼを洗剤に配合することに より、 洗浄特性に優れた洗剤組成物が提供される。

また、 本発明による リパーゼ及びその他の酵素を洗剤 に配合するこ とにより、 洗浄特性に優れた洗剤組成物が 提供される。

Claims

請求の範囲 1 ) 下記の性質を有する リパーゼ。

( 1 ) 作用 P H及び至適 p H

ト リオレイ ンェマルジヨ ンを基質と し、 p H 3.5- 1 2の範囲で測定した場合の作用 P Hが 3.5〜 1 2、 至適 p Hが 1 0〜 1 1である。

(2) 作用温度及び至適温度

ト リオレイ ンェマルジヨ ンを基質と し、 30〜80 °C の範囲で測定した場合の作用温度が 30〜 80 °C、 至適 温度が 5 5〜 65。Cである。

(3) 分子量

S D S —ポ リアク リ ルァ ミ ドゲル電気泳動法により測 定した分子量が 31000 ± 2000である。

(4 ) 等電点

等電点ポリアク リルア ミ ドゲル電気泳動法により測定 した等電点が 5.2± 0.5 である。

2 ) シュ一 ドモナス ( Pseudomonas) 属に属する細菌の 培養物より得られる請求の範囲第 1項記載のリパーゼ。

3 ) シユー ドモナス s p . (Pseudomonas sp. ) S D 7 0 5株 （ F E RM B P - 4 7 7 2 ) 、 それと菌学的に 同等な菌株またはそれらの変異株の培養物より得られる 請求の範囲 1記載のリパーゼ。

4 ) 請求の範囲第 1項記載のリパーゼを生産する シユ ー ドモナス （Pseudomonas) 属に属する細菌、 それと菌学 的に同等な菌株またはそれらの変異株。 5 ) 請求の範囲第 1項記載のリパーゼを生産する シユ ー ドモナス s p . ( Pseudomonas s p . ) S D 7 0 5株 （ F E R M B P— 4 7 7 2 ) 、 それと菌学的に同等な菌株 またはそれらの変異株。

6 ) 請求の範囲第 4項または請求の範囲第 5項記載の細 菌、 それと菌学的に同等な菌株またはそれらの変異株を 培養し、 培養液から請求の範囲第 1項記載のリパーゼを 回収することを特徴とする リパーゼの製造方法。

7 ) 請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれかの項に記 載のリパーゼを含有することを特徴とする洗剤組成物。 8 ) 請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれかの項に記 載のリパーゼと他の酵素を含有することを特徴とする洗 剤組成物。