ES2695327A1 - Sintesis de biodiesel catalizada por un crudo enzimatico inmovilizado sobre particulas magneticas - Google Patents

Abstract

Síntesis de biodiesel catalizada por un crudo enzimático inmovilizado sobre partículas magnéticas. La presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis enzimática de ésteres de alquilo de ácidos grasos de cadena larga en presencia de un alcohol y de una preparación enzimática que comprende una esterol esterasa/lipasa inmovilizada covalentemente sobre partículas magnéticas funcionalizadas en su superficie. La inmovilización de la lipasa versátil mediante el procedimiento descrito es capaz de incrementar el rendimiento del proceso de síntesis de ésteres de alquilo, así como de permitir una recuperación del catalizador para futuras reacciones, sencilla y eficiente, sin que la actividad y velocidad de la esterol esterasa/lipasa se vea disminuida notablemente a lo largo de al menos 10 ciclos de reacción consecutivos.

Description

DESCRIPCION

SINTESIS DE BIODIESEL CATALIZADA POR UN CRUDO ^{e n zim} A^{tic o}

INMOVILIZADO SOBRE PARTICULAS MAGNETICAS

La presente invencion se refiere a un procedimiento para la slntesis enzimatica de esteres metllicos de acidos grasos de cadena larga, para su uso, preferentemente como biocombustible, a partir de un alcohol de cadena corta, preferentemente metanol como sustrato, y donde la enzima, preferentemente una glicoprotelna, se encuentra inmovilizada mediante la union covalente de sus cadenas glucldicas a partlculas magneticas amino-funcionalizadas.

ESTADO DE LA TECNICA

El biodiesel es un biocombustible compuesto por mezclas de esteres monoalqullicos de acidos grasos de cadena larga derivados de fuentes renovables. La slntesis industrial de estos compuestos se realiza mediante esterificacion o transesterificacion de los acidos grasos, mono-, di-, y trigliceridos presentes en aceites vegetales o grasas, empleando generalmente residuos lipldicos para su reciclado, como aceites de fritura o aceites no comestibles. La reaccion entre los llpidos y un alcohol de cadena corta (C1 a C6) puede estar mediada por catalizadores qulmicos (bases, acidos, catalizadores heterogeneos) o por enzimas.

La slntesis de biodiesel mediante catalisis qulmica es rapida y muy productiva, ademas de ser los catalizadores muy baratos, aunque no todo son ventajas en este tipo de reacciones. Las temperaturas de reaccion suelen ser altas lo que implica un coste energetico muy elevado, los catalizadores se recuperan con dificultad, la separacion de los productos es mas complicada y el glicerol que se genera como subproducto del proceso qulmico tiene diflcil aprovechamiento porque su refinado resulta muy costoso. Este subproducto puede utilizarse puro en los sectores alimentario, farmaceutico y cosmetico, pero se sigue investigando en darle usos alternativos a los mencionados. Por otro lado, es interesante senalar que los catalizadores qulmicos son en la mayorla de las ocasiones acidos o bases, por lo que su manejo y almacenamiento debe realizarse con cautela, y los efluentes o desechos del proceso son contaminantes y precisan un tratamiento previo a su eliminacion.

En cambio, aunque la slntesis de biodiesel mediante catalisis enzimatica es considerablemente mas lenta que la catalisis qulmica y el precio de las enzimas utilizadas como catalizadores es elevado, las ventajas de la slntesis de biodiesel mediante dicho procedimiento son muchas. Entre las mas importantes ventajas, destacan que las condiciones en las que se lleva a cabo la catalisis enzimatica son mas suaves, las enzimas son mas especlficas que los catalizadores qulmicos, la presencia de acidos grasos libres no interfiere en la catalisis, sino que estos tambien son esterificados, y la mezcla de reaccion es mucho mas limpia, lo que facilita la recuperacion de los productos y no genera residuos toxicos.

Hasta la fecha, los aspectos principales que mantienen la slntesis enzimatica de biodiesel lejos de su aplicacion industrial son principalmente dos: (1) el coste del catalizador y (2) la inhibition de muchos catalizadores por metanol. Respecto al coste derivado del empleo de catalizadores enzimaticos, este puede reducirse mediante el reciclado de los mismos, y esto es posible cuando el catalizador esta inmovilizado y puede llevar a cabo ciclos sucesivos de reaccion sin perdidas relevantes de actividad. Sin embargo, el problema que genera el uso de metanol como sustrato de la reaccion enzimatica es mas diflcil de resolver, ya que este alcohol produce la desestabilizacion y/o inactivation de la mayorla de las enzimas conocidas, incluyendo las hidrolasas de esteres carboxllicos (EC 3.1.1), grupo en el que se encuentran las enzimas que catalizan esta reaccion. Por dicho motivo, en el estado de la tecnica se describe la slntesis de biodiesel mediante catalisis enzimatica utilizando como sustratos preferentemente etanol, propanol o butanol cuando el biocatalizador no es estable a metanol. Sin embargo, aunque la toxicidad del metanol es superior a la del resto de los sustratos utilizados, dicho alcohol es el mas utilizado en la industria debido a otras ventajas tales como su bajo coste, su bajo punto de ebullition y que, ademas, no forma mezclas azeotropas con el agua, facilitando as! su posterior reciclado. Otra de las ventajas de utilizar el metanol como sustrato es que sus esteres metllicos son menos viscosos que los esteres de alcoholes de mayor longitud de cadena, y ademas, tienen mejores propiedades como biocombustible.

El interes de este tipo de reacciones enzimaticas para la slntesis de biocombustibles se ha incrementado en los ultimos anos. Es conocido el uso de una o varias lipasas microbianas comerciales inmovilizadas de forma no covalente sobre soportes porosos hidrofobicos y macrorreticulares empleando etanol, metanol u otros dadores de alcohol como sustratos de la slntesis de biodiesel, as! como una solution alcalina para mantener la estabilidad y efectividad de las enzimas (EP2542685 B1). Uno de los principales problemas que presenta la inmovilizacion de enzimas mediante, por ejemplo, el metodo CLEAs (Cross-Linked Enzyme Aggregates), en presencia o no de soporte, es que puede producir alteraciones y modificaciones en la estructura de la protelna, comprometiendo su actividad o dificultando el acceso de los sustratos al centro activo o la evacuacion de los productos de reaccion, lo que conlleva una baja eficacia en la slntesis de biodiesel.

Otros metodos utilizados en el estado de la tecnica describen el uso de nanopartlculas magneticas funcionalizadas en superficie, sobre las que se inmoviliza mediante interacciones hidrofobicas la enzima utilizada para la slntesis de biodiesel (El Batal et al. Bioengineering 2016, 3:14). En este caso, al no existir una union covalente entre la enzima y el soporte, se observa una perdida de actividad del 66% al cabo de pocos ciclos de slntesis, debido principalmente al lixiviado de la propia enzima.

Por otro lado, tambien es conocido que la slntesis enzimatica de biodiesel con una lipasa comercial inmovilizada sobre un soporte microporoso, mantiene la actividad durante 10 ciclos de slntesis de 24 h. Sin embargo, esta reaccion tiene lugar a 50 °C o 65 °C, segun el tipo de aceite utilizado como sustrato, con agitacion de 250 rpm y un exceso molar de metanol de 6:1, lo que implicarla la retirada del metanol excedente y la peor recuperacion del glicerol producido (Dizge et al. Bioresource Technology 2009, 100:1983-1991; Dizge et al. Biochemical Engineering Journal 2009, 44:220-225). Por otra parte, varios grupos de investigation (Cruz-Izquierdo et al. PLoS ONE 2014, 9:e115202; Lopez et al. Frontiers in Chemistry 2014, 2:72) inmovilizaron la enzima comercial Cal B en forma de CLEAs y mCLEAs (sobre un soporte magnetico funcionalizado con grupos amino) para la produccion de biodiesel. En estos casos, los autores sintetizaron esteres etllicos de acidos grasos vegetales utilizando grandes excesos molares de alcohol, alcanzando conversiones maximas en 24 h del 90% con una proportion de etanol:aceite 30:1 y del 82% empleando propanol (proportion 6:1). Como ya se ha comentado, estos esteres de alcoholes de cadena mas larga presentan desventajas frente a los esteres metllicos de cara a la production de biodiesel y los excesos molares de alcohol empleados requerirlan su reciclado, aumentando los costes del proceso. Otros procedimientos de inmovilizacion covalente se basan tambien en el uso de nanopartlculas magneticas, a las que se une la lipasa comercial Lipozyme-TL empleando glutaraldehldo (Xie et al. Energy & Fuels 2009, 23:1347-1353) o una carbodiimida (Xie et al. Biomass and Bioenergy 2010, 34:890896) para la slntesis de FAMEs (esteres metllicos de acidos grasos, del ingles Fatty Acid Methyl Esters), alcanzando una conversion en 24 h de entre el 75% (a 50 °C) y el 94% (a 45 °C). Aunque estos rendimientos no son malos, la reciclabilidad de las enzimas esta lejos de ser optima, ya que no admiten mas de 3 o 4 ciclos catallticos consecutivos. Estos mismos autores, inmovilizaron la lipasa comercial de Candida rugosa sobre microesferas magneticas de quitosano activadas con glutaraldehldo. Mediante dicho procedimiento, los autores sintetizaron FAMEs a partir de aceite de soja, con un rendimiento del 87% en reacciones de 30 h a 35 °C. El maximo numero de reciclados sin una perdida excesiva de actividad fue de cuatro (Xie et al. Biomass and Bioenergy 2012, 36:373-380).

En vista de lo expuesto en los parrafos anteriores, existe en el estado de la tecnica la necesidad de proporcionar catalizadores y metodos alternativos de slntesis enzimatica de biodiesel capaces de incrementar el rendimiento del proceso, as! como de permitir una recuperacion sencilla y eficiente de la enzima para futuras reacciones, sin que la actividad y velocidad de la misma se vea disminuida a lo largo de los ciclos de reaccion consecutivos a los que se puede someter a dicha enzima.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a una glicoprotelna inmovilizada covalentemente mediante la formacion de una amina secundaria sobre partlculas magneticas funcionalizadas, que preferiblemente se lleva a cabo mediante la oxidacion de las cadenas glucldicas de las glicoprotelnas. Las glicoprotelnas preferidas inmovilizadas covalentemente sobre partlculas magneticas segun la presente invencion, son glicoprotelnas del grupo de las hidrolasas de esteres carboxllicos (EC 3.1.1) capaces de sintetizar biodiesel, preferentemente con actividad triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3), conocidas generalmente como lipasas. Dentro del grupo de enzimas denominadas generalmente lipasas, existe un grupo conocido como "lipasas estrictas” que son enzimas que solo actuan sobre gliceridos, y otro grupo conocido como "lipasas versatiles” que ademas de actuar sobre gliceridos, tambien actuan frente a esteres diferentes a los gliceridos (Barriuso et al. Biotechnology Advances 2016, 34:874-885). Del mismo modo, algunas carboxil esterasas (EC 3.1.1.1) y esterol esterasas (EC 3.1.1.13) tienen una amplia especificidad de sustrato y presentan tambien actividad lipasa (Whiteley et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2013, 97:156-168; Vaquero et al. Applied Microbiology and Biotechnology 2016, 100:2047-2061), pudiendo catalizar la slntesis de biodiesel gracias a su actividad frente a gliceridos. En el caso particular de las esterol esterasas con actividad lipasa, se ha propuesto recientemente que pasen a denominarse "lipasas versatiles” ya que algunas de ellas incluso tienen mas actividad sobre gliceridos que sobre esteres de esterol (Barriuso et al. Biotechnology Advances 2016, 34:874-885).

Segun se demuestra en los ejemplos incluidos en el presente documento, las glicoprotelnas, preferentemente glicoprotelnas con actividad lipasa, inmovilizadas covalentemente mediante la formacion de una amina secundaria sobre partlculas magneticas funcionalizadas, segun se describe aqul, muestran un incremento en el rendimiento del proceso de slntesis de biodiesel y permiten la recuperacion de la enzima unida covalentemente a las partlculas magneticas de forma sencilla y eficiente, simplemente mediante la aplicacion de un campo magnetico.

Otra de las ventajas mostradas en los ejemplos incluidos en el presente documento para las glicoprotelnas, preferentemente glicoprotelnas con actividad lipasa, inmovilizadas covalentemente sobre partlculas magneticas segun se describe en el presente documento, es que la actividad de dichas enzimas en la slntesis de biodiesel no disminuye a lo largo del tiempo, durante 5 ciclos de reaccion consecutivos, y mantiene una elevada actividad durante al menos 10 ciclos. Adicionalmente, el proceso de obtencion del biodiesel catalizado por dichas enzimas unidas covalentemente a las partlculas magneticas no requiere la adicion de cosolventes, aunque pueden utilizarse si se desea.

As! en un primer aspecto, la presente invencion se refiere a una glicoprotelna inmovilizada covalentemente mediante la formacion de una amina secundaria sobre partlculas magneticas. En una realization preferida, la glicoprotelna es preferentemente cualquier enzima con actividad lipasa, mas preferentemente es una lipasa, tanto estricta como versatil, y/o una esterol esterasa.

Las glicoprotelnas son protelnas que, de forma natural, contienen una o mas cadenas glucldicas que se unen covalentemente a ciertas asparaginas, serinas y treoninas durante la bioslntesis proteica. En el caso de su union a asparagina, el grupo amino de la cadena lateral se asocia al carbohidrato mediante enlace W-glicosldico, mientras que con serina y treonina se establece un enlace O-glicosldico al condensarse el hidroxilo de sus cadenas laterales con otro del monosacarido. La portion glucldica de las glicoprotelnas es muy variable, pudiendo encontrarse desde monosacaridos hasta largas y complejas cadenas de diferente composition, estructura, y grado de ramification. En esta invention se describen preferentemente glicoprotelnas con actividad lipasa, inmovilizadas covalentemente mediante la formation de una amina secundaria sobre partlculas magneticas, as! como su uso especlfico segun se describe en la presente invencion. Las lipasas, sobre todo aquellas producidas por microorganismos, son las principales enzimas empleadas con fines biotecnologicos en la production de biodiesel. Algunas enzimas producidas por hongos tienen una amplia versatilidad de sustrato y combinan la actividad lipasa con una importante actividad esterol esterasa, que tal y como se ha mencionado anteriormente se denominan lipasas versatiles, por lo que dichas enzimas, pese a encontrarse descritas como esterol esterasas, tambien son capaces de sintetizar biodiesel en las condiciones adecuadas.

En una realization mas preferida la glicoprotelna, preferentemente una glicoprotelna con actividad lipasa, mas preferentemente la esterol esterasa/lipasa inmovilizada covalentemente sobre las partlculas magneticas segun la presente invencion es una lipasa versatil, segun se ha definido anteriormente, sintetizada de forma natural por el hongo filamentoso dimorfico Ophiostoma piceae. Dicha esterol esterasa/lipasa o lipasa versatil nativa es una glicoprotelna de masa molecular 66 kDa que comprende un 8% de glicosilacion (Calero-Rueda et al. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Proteins and Proteomics 2002, 1599:28-35).

En la presente invencion, el termino "gen esterol esterasa" se refiere a una secuencia nucleotldica que codifica la esterol esterasa/lipasa o lipasa versatil de O. piceae y se identifica por la SEQ. ID NO: 1.

A efectos de la presente invencion, los terminos, glicoprotelna con actividad lipasa, esterol esterasa/lipasa y lipasa versatil, se utilizan indistintamente a lo largo del presente documento y se refieren al grupo de protelnas que presentan actividad lipasa, pudiendo ser lipasas estrictas y/o lipasas versatiles. La forma nativa de la esterol esterasa/lipasa o lipasa versatil de la presente invencion comprende la secuencia aminoacldica completa de la protelna codificada por el gen esterol esterasa de O. piceae, incluyendo el peptido senal (SEQ. ID NO: 2). La forma madura de dicha enzima comprende la secuencia aminoacldica codificada por el gen esterol esterasa, sin incluir el peptido senal y se identifica con la SEQ ID NO: 3. En adelante se hablara de enzima nativa como la forma madura, sin peptido senal, para diferenciarla de las formas recombinantes.

En la presente invention las expresiones "expresion heterologa" y "gen heterologo" se refieren a la introduction de un gen extrano (heterologo) en un organismo con el fin de modificar su material genetico y los productos de expresion. A efectos de la presente invencion, dicho organismo es una levadura metilotrofica, preferentemente Pichia pastoris.

En una realization particular, la secuencia aminoacldica madura codificada por el gen esterol esterasa, se expresa en la levadura P. pastoris, empleando como peptido senal el pre-propeptido del factor a de Saccharomyces cerevisiae, segun se describe en el documento Barba-Cedillo et al. (Microbial Cell Factories 2012, 11:73) dando lugar a la esterol esterasa/lipasa o lipasa versatil recombinante descrita en la presente invencion. Esta lipasa versatil recombinante presenta modificaciones en su secuencia aminoacldica, que comprende entre 6-8 aminoacidos nuevos en el extremo N-terminal, anadidos sobre la secuencia aminoacldica de la protelna nativa madura. En una realizacion mas preferida, la lipasa versatil recombinante procedente de O. piceae y expresada en la levadura P. pastoris (OPEr), comprende la secuencia SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.

En la presente invencion, los terminos “lipasa versatil”, “esterol esterasa/lipasa” se utilizan indistintamente a lo largo del presente documento y se refieren a una secuencia aminoacldica de la enzima con actividad esterol esterasa y lipasa codificada por el gen esterol esterasa de Ophiostoma piceae. Dicha enzima es extracelular y puede ser nativa cuando se expresa en el organismo original (aunque al ser extracelular haya perdido el peptido senal y se hable de protelna madura) o recombinante si la secuencia completa de la protelna o la secuencia de la protelna madura se expresa en otro organismo.

En otra realizacion preferida, la lipasa versatil de la presente invencion se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. En una realizacion mas preferida, la enzima lipasa versatil se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

A efectos de la presente invention, ademas de las lipasas versatiles de SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, cualquier experto en la materia puede utilizar cualquier glicoprotema nativa o recombinante de cualquier origen biologico con actividad lipasa conocida, tales como las lipasas nativas o recombinantes producidas por otros hongos distintos a O. piceae, por ej.: Candida sp., Candida rugosa, Melanocarpus albomyces, Candida antarctica (Cal A, Cal B), Thermomyces lanuginosus, Rhizopus oryzae, Mucor miehei, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Nectria haematococca, o Plicaturiopsis crispa.

En una realization mas preferida, la glicoprotema, preferentemente la lipasa versatil, inmovilizada sobre partmulas magneticas segun se describe en la presente invencion, es preferentemente la lipasa versatil que comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, inmovilizada sobre la partmula magnetica Fe3O4.

A efectos de la presente invencion se entiende por particula magnetica o particula con propiedades magneticas a aquella partmula que, siendo o no siendo intrinsecamente magnetica, se ve atraida hacia un campo o fuerza magnetica cuando se la expone a este. Preferentemente, las partmulas tienen propiedades magneticas del tipo superparamagneticas o ferromagneticas. En una realizacion preferida, la partmula magnetica es partmula de metal, oxido de metal, mezcla de oxidos metalicos, aleaciones metalicas o mezcla de ellas que tengan propiedades magneticas. Son preferidas las particulas magneticas que se seleccionan de la lista que consiste en: oxidos de hierro, metales, materiales ferromagneticos y aleaciones. Mas preferentemente, las partmulas magneticas preferidas se seleccionan de la lista que consiste en: magnetita (Fe3O4), maghemita, (yFe2O3); partmulas magneticas a base de metales, tales como hierro, cobalto y niquel, partmulas magneticas a base de materiales ferromagneticos de tipo espinela tales como, MgFe2O4, MnFe2O4 y CoFe2O4; y partmulas magneticas a base de aleaciones tales como CoPt3 y FePt. El nucleo magnetico de la nanopartmula puede estar protegido por una cubierta inorganica (por ejemplo de sflice, carbono o metales preciosos), organica (por ejemplo de surfactantes o polimeros), o de oxidos. La presencia de esta cubierta facilita su funcionalizacion. En la presente invencion se prefieren particulas magneticas de oxido de hierro, especialmente particulas de magnetita (Fe3O4) o maghemita (yFe2O3). Preferentemente, en la invencion se emplean particulas magneticas de tamanos comprendidos entre 0,001-100 p,m. En otra realizacion preferida, las particulas magneticas son preferentemente micropartlculas magneticas o nanopartlcuias magneticas, preferentemente nanopartlcuias magneticas de entre 1-130 nm y mas preferentemente entre 10-30 nm.

Una realization particularmente preferida de la presente invention se refiere a cualquiera de las glicoprotelnas, mas preferentemente a las glicoprotelnas de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5, inmovilizada covalentemente segun se describe en la presente invencion, sobre la partlcula magnetica Fe3O4.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para la obtencion de las partlculas magneticas descritas anteriormente. Cualquiera de los metodos conocidos por un experto en el campo tecnico de las partlculas magneticas puede utilizarse en la presente invencion. Asl, metodos conocidos para la slntesis de partlculas magneticas se seleccionan de la lista que consiste en: co-precipitacion, micro-emulsion, descomposicion termica, ruta solvo-termica, ruta sono-qulmica, proceso asistido por microondas, proceso Laux, tratamiento de minerales de oxido de hierro, pirolisis laser, deposition de vapor, descarga en arco, slntesis en fase gaseosa, slntesis en fase solida, reduction qulmica u otros. Preferentemente, el proceso para dar lugar a la partlcula magnetica de la invencion, es la co-precipitacion.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un procedimiento de slntesis de la glicoprotelna inmovilizada covalentemente mediante la formation de una amina secundaria sobre partlculas magneticas segun se ha descrito previamente en el presente documento, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) generar grupos aldehldo en las cadenas glucldicas de la glicoprotelna, b) funcionalizar las partlculas magneticas, preferentemente con grupos amino en su superficie,

c) incubar la glicoprotelna de la etapa a) con un agente reductor, preferentemente suave y con la partlcula magnetica amino funcionalizada de la etapa b), y d) estabilizar la union de la glicoprotelna inmovilizada sobre las partlculas magneticas obtenidas en la etapa c).

En una realizacion preferida, el procedimiento de slntesis de la glicoprotelna inmovilizada covalentemente sobre las partlculas magneticas mediante la formacion de una amina secundaria, se caracteriza por que la generation de grupos aldehldo en las cadenas glucldicas de la glicoprotelna de la etapa a) se lleva a cabo mediante un proceso de oxidacion, preferentemente en presencia de un agente oxidante.

A efectos de la presente invention, se entiende por agente oxidante cualquier compuesto conocido en la tecnica capaz de oxidar a otro en contacto con el. Preferiblemente el agente oxidante se selecciona entre aquellos capaces de generar grupos aldehldo en cadenas glucldicas. En otra realization mas preferida aun, el agente oxidante capaz de generar grupos aldehldo en cadenas glucldicas se selecciona de la lista que consiste en: enzimas, que se seleccionan de la lista que consiste en oxidorreductasas, aldosa oxidasas, alcohol deshidrogenasas y oxidasas, y agentes qulmicos oxidantes. En la presente invencion los agentes qulmicos oxidantes se seleccionan de entre 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy radical (TEMPO), periodinato Dess-Martin, tetraacetato de plomo Pb-(O2CCH3)4, bismutato sodico (NaBiO3), acido periodico o periodatos. Son particularmente preferidos los periodatos y mas preferentemente el periodato sodico (NaIO4) y potasico (KIO4).

De acuerdo con una realizacion preferida, el agente qulmico oxidante se aplica en forma llquida, generalmente disuelto en solvente acuoso, lo cual facilita y potencia su action oxidativa. Segun una realizacion preferida, la concentration de la solution del agente oxidante esta comprendida entre 5 a 50 mM, mas preferentemente 10 mM.

En otra realizacion preferida del procedimiento de slntesis de la glicoprotelna inmovilizada sobre partlculas magneticas de la invencion se caracteriza por que la funcionalizacion de la etapa b) se lleva a cabo mediante la union de grupos amino a su superficie, preferentemente mediante cualquiera de los procedimientos seleccionados de la lista que consiste en: silanizacion, recubrimiento con sustancias organicas tales como por ejemplo pollmeros, surfactantes, etc, o con sustancias inorganicas tales como carbono, metales preciosos u oxidos, entre otros.

En otra realizacion preferida, la funcionalizacion de la etapa b) es preferiblemente la union de grupos amino mediante silanizacion de la superficie de la partlcula magnetica.

A efectos de la presente invencion, las partlculas magneticas se recubren de una capa de silicio mediante un procedimiento denominado silanizacion, y se funcionalizan con grupos amino en su superficie. Los grupos amino pueden estar unidos directamente o mediante un espaciador al grupo silano. A efectos de la presente invention, el termino espaciador se refiere a un grupo capaz de unir el grupo sililo con el grupo amino terminal. Preferentemente, el espaciador es un grupo alquilo, mas preferentemente un grupo alquilo C1-C10. A efectos de la presente invencion el termino "alquilo C1-C10” se refiere en la presente invencion a cadenas alifaticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 atomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, nbutilo, tert-butilo, sec-butilo, n-pentilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 8 atomos de carbono y mas preferiblemente de 1 a 4 atomos de carbono. Mas preferiblemente, las partlculas magneticas de la invencion se silanizan y funcionalizan mediante grupos alquil-amino.

La silanizacion, as! como cualquiera de los otros metodos descritos anteriormente, y la funcionalizacion se pueden realizar en una unica etapa, utilizando un unico reactivo que cumpla las dos funciones, o bien empleando dos reactivos, siendo uno de ellos un agente exclusivamente silanizante para lograr una cubierta de un grupo que comprende silicio mas gruesa sobre la nanopartlcula, donde dicho agente es preferentemente el tetraetoxisilano (TEOS), y otro agente silanizante que ademas comprende el grupo funcional deseado para funcionalizar la partlcula magnetica.

En una realization mas preferida, la silanizacion y la funcionalizacion tienen lugar con un solo reactivo y en una unica etapa. A efectos de la presente invencion, los agentes silanizantes capaces de incorporar grupos amino funcionales en la superficie de la partlcula magnetica se seleccionan de la lista que consiste en (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES), (3-aminopropil)trimetoxisilano, 3[2-(2-aminoetilamino)etilamino] propiltrimetoxisilano, 3-(2-aminoetilamino)-propildimetoximetilsilano, [3-(2-aminoetilamino)propil] trimetoxisilano, 3-aminopropildimetilmetoxisilano, 3-aminopropil(dietoxi)metilsilano. En una realizacion preferida, la silanizacion y funcionalizacion de la partlcula magnetica se lleva a cabo con 3-aminopropil trietoxisilano (APTES).

En otra realizacion preferida, la concentration de 3-aminopropil trietoxisilano esta comprendida entre 5 a 150 mM, mas preferentemente de entre 100 a 130 mM. En otra realizacion preferida, una vez finalizado el proceso, la concentracion de grupos amino accesibles en la superficie de la partlcula magnetica esta comprendida entre 5 a 100 ^moles/g partlcula magnetica, mas preferentemente entre 5 a 40 p,moles/g partlcula magnetica.

En otra realization preferida, las partlcuias magneticas de la invention, previamente silanizadas o recubiertas de materiales polimericos tales como por ejemplo el aminopolivinil alcohol pueden incorporar grupos hidrazida sobre su superficie.

En otra realization preferida del procedimiento de obtencion de la glicoprotrelna inmovilizada covalentemente segun se describe en la presente invention, este se caracteriza por que la glicoprotelna que comprende grupos aldehldo en su sus cadenas glucldicas, preferentemente obtenidos mediante oxidation, segun se indica en la etapa a), se mantiene en incubation con la partlcula magnetica amino funcionalizada de la etapa b) en presencia de un agente reductor, durante un tiempo de entre 1 a 20 h, mas preferentemente durante al menos 2 h, y a una temperatura de entre 4 a 37 °C, mas preferentemente a 28 °C, con una concentration de protelna de entre 0,01 a 1 mg de protelna por mg de nanopartlculas, mas preferentemente de entre 0,02 a 0,04 mg de protelna por mg de nanopartlculas.

A efectos de la presente invention se entiende por agente reductor o donador de protones, a cualquier compuesto capaz de ceder electrones a un agente oxidante. Preferiblemente el agente reductor es un agente reductor suave, y mas preferentemente se selecciona de la lista que consiste en hidruros metalicos como borohidruro de sodio (NaBH4), hidruro de litio, hidruro de litio y alumninio, cianoborohidruro de sodio, cianoborohidruro de litio, boranos como el trimetil amino borano (TMAB) o el a-picolino borano, triacetoxiborohidruro sodico, o borohidruro de sodio modificado con sales metalicas polivalentes o activado por acidos. En una realization mas preferida, el agente reductor es el TMAB. De acuerdo con una realization preferida, el agente reductor utilizado se aplica en forma llquida, lo cual facilita y potencia la action reductora del mismo. Segun una realization preferida, la concentration de la solution del agente reductor esta comprendida entre 100 y 300 mM, mas preferentemente 150 mM.

En otra realization preferida del procedimiento de obtencion de la glicoprotelna inmovilizada covalentemente segun se describe en la presente invencion, este se caracteriza por que la estabilizacion de la etapa d) se produce mediante aminacion reductiva para dar lugar a una amina secundaria estable. Segun una realizacion preferida, la concentration de la solution del agente reductor utilizado en esta etapa esta comprendida entre 0,5 a 5 mg/mL, mas preferentemente 1 mg/mL.

A efectos de la presente invention, la inmovilizacion covalente entre la partlcula magnetica amino funcionalizada en su superficie con la glicoprotelna, preferentemente con la enzima con actividad lipasa, preferentemente con la lipasa versatil descrita en la invencion, se produce mediante la formation de una amina secundaria tal y como se ha comentado previamente. Dicho tipo de inmovilizacion se lleva a cabo especlficamente a traves de las cadenas glucldicas oxidadas de la enzima con actividad lipasa, preferentemente con la lipasa versatil sobre la superficie de la partlcula magnetica amino funcionalizada, preferentemente amino-alquil funcionalizada, mediante la reaction de los aldehldos previamente generados via oxidation en las cadenas glucldicas de la esterol esterasa/lipasa, formando una imina (base de Schiff) con los grupos amino de las partlculas magneticas, y donde dicha imina se estabiliza mediante aminacion reductiva para dar lugar a una amina secundaria estable. Dicho procedimiento de inmovilizacion covalente entre los grupos amino de la partlcula magnetica funcionalizada y los azucares oxidados de la glicoprotelna, mantiene la integridad estructural de la enzima, cuya secuencia proteica no interviene en la interaction con la partlcula magnetica. Ademas, la inmovilizacion a traves de las cadenas glucldicas de la enzima aporta una union al soporte por multiples puntos haciendola muy estable, mientras que permite que se mantenga un cierto grado de flexibilidad en la preparation, lo que facilita el acceso de los sustratos al centro activo y la evacuation de los productos sintetizados. Adicionalmente, la inmovilizacion covalente de la enzima con actividad lipasa, preferentemente de la lipasa versatil de la invencion mediante la formacion de una amina secundaria con la partlcula magnetica amino-funcionalizada incrementa la estabilidad y eficiencia de dicho catalizador, especlficamente en su uso para la slntesis de biodiesel, as! como la reciclabilidad de la enzima inmovilizada.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un procedimiento de slntesis de esteres de alquilo que comprende la transesterificacion y/o esterification de una fuente de acidos grasos con un alcohol, en presencia de una preparacion enzimatica o crudo que comprende un catalizador (enzima), preferentemente una glicoprotelna con actividad lipasa, inmovilizada covalentemente mediante la formacion de una amina secundaria sobre partlculas magneticas, segun se describe en la presente invencion.

La preparacion enzimatica que comprende un catalizador o enzima con actividad lipasa inmovilizada covalentemente mediante un grupo amino secundario sobre partlcuias magneticas segun se describe en la presente invention, mantiene su actividad en una mezcla de alcohol de cadena corta, preferentemente metanol, y de gliceridos, preferentemente de acidos grasos de cadena larga, con o sin acidos grasos libres, sin necesidad de cosolventes. Las reacciones de transesterificacion y/o esterification catalizadas por la glicoprotelna con actividad lipasa, preferentemente la lipasa versatil procedente del hongo O. piceae, no necesitan ningun tipo de aditivo o cosolvente para llevar a cabo la transesterificacion de mono- di- y trigliceridos dando lugar a esteres metllicos y glicerol y la esterificacion de los acidos grasos libres que los acompanan para producir los correspondientes esteres metllicos y agua como productos.

Asl, el procedimiento de slntesis de esteres de alquilo que comprende la transesterificacion y/o esterificacion de una fuente de acidos grasos con un alcohol, en presencia de una preparation que comprende una glicoprotelna, preferentemente una glicoprotelna con actividad lipasa, inmovilizada covalentemente mediante la formation de una amina secundaria sobre partlculas magneticas segun se describe en la presente invencion, ha producido los mejores rendimientos en comparacion con otros procedimientos de inmovilizacion enzimatica de dicha enzima e incluso otras enzimas comerciales con actividad lipasa. Ademas, tal y como se observa en los ejemplos incluidos en la presente invencion, la enzima o catalizador se recupera de forma sencilla y eficiente, simplemente mediante la aplicacion de un campo magnetico. Adicionalmente, se ha puesto tambien de manifiesto que la actividad de la enzima de la presente invencion no disminuye significativamente a lo largo del tiempo, y que tras al menos 10 ciclos de reaction consecutivos mantiene mas del 70% de dicha actividad. La enzima inmovilizada tambien cataliza esta reaccion en presencia de cosolventes como hexano, tolueno o isooctano, mas preferentemente en isooctano, aunque en estas condiciones la reaccion transcurre mas lentamente.

Los terminos "esterificacion" y "transesterificacion" tal y como se usan en la presente invencion, se refieren respectivamente a la reaccion que se produce entre un acido graso y un alcohol, o un mono, di o triglicerido de acidos grasos y un alcohol. Los sustratos empleados pueden comprender mezclas de acidos grasos y gliceridos, por lo que al mezclarse con un alcohol tendrlan lugar ambos tipos de reacciones. En los dos casos se sintetizan esteres de acidos grasos, pero en la esterificacion se libera agua como subproducto mientras que en la transesterificacion se libera glicerol. La transesterificacion puede ser catalizada por bases, acidos o enzimas. A efectos de la presente invention, el procedimiento de transesterificacion se lleva a cabo en presencia de enzimas, preferentemente glicoprotemas con actividad lipasa como por ejemplo las lipasas estrictas, versatiles, o esterol esterasas con actividad lipasa, o de microorganismos que las producen. En una forma de realization, los esteres de alquilo se obtienen a partir de la preparation lipidica de acuerdo a la invencion mediante la transesterificacion o esterification de los gliceridos o acidos grasos que forman parte de la preparacion lipidica.

El termino "biodiesel" segun se usa en la presente invencion, se refiere a una composition quimica compuesta fundamentalmente por esteres monoalquflicos o alquflicos de acidos grasos de cadena larga. Los esteres que forman parte del biodiesel son esteres metilo, etilo, propilo o butilo y los acidos grasos proceden de la composicion lipidica de acuerdo a la presente invencion. En formas preferidas de realizacion, el biodiesel de acuerdo a la presente invencion comprende uno o varios de los siguiente esteres alquflicos de acidos grasos: esteres metflicos de acidos grasos (FAME o fatty acid methyl ester), esteres etflicos de acidos grasos (FAEE o fatty acid ethyl esters), esteres propflicos de acidos grasos (FAPE o fatty acid propyl esters), esteres butflicos de acidos grasos (FABE o fatty acid butyl esters). En una forma preferida de la invencion, el biodiesel es un combustible que esta compuesto en su totalidad por esteres de origen biologico que no contienen diesel procedente del petroleo y que comprende monoalquil esteres de acidos grasos de cadena larga. Este tipo de biodiesel se conoce como B100 e indica que el 100% del combustible es biodiesel.

A efectos de la presente invencion se consideran acidos grasos de cadena larga los que contienen un numero de atomos de carbono comprendido entre 14 y 22. Los acidos grasos de cadena larga se seleccionan de la lista que consiste en: acido miristico o tetradecanoico (14:0), acido miristoleico o cis-9-tetradecenoico (14:1), acido pentadecflico o pentadecanoico (15:0), acido pentadecenoico (15:1), acido palmrtico o hexadecanoico (16:0), acido palmitoleico o hexadecenoico (16:1), acido hexadecadienoico (16:2), acido hexadecatrienoico (16:3), acido margarico o heptadecanoico (17:0), acido heptadecenoico (17:1), acido estearico u octadecanoico (18:0), acido oleico u octadecenoico (18:1), acido linoleico u octadecadienoico (18:2), acido linoleico u octadecatrienoico (18:3), acido estearidonico u octadecatetraoico (18:4), acido araquidico o eicosanoico (20:0), acido eicosenoico (20:1), acido eicosadienoico (20:2), acido eicosatrienoico (20:3), acido araquidonico o eicosatetraenoico (20:4), acido eicosapentaenoico (20:5), acido behenico o docosanoico (22:0), acido docosenoico (22:1), acido docosatetraenoico (22:4), acido docosapentaenoico (22:5) y acido docosahexaenoico (22:6). Aunque en general un biodiesel concreto contiene una especie molecular predominante, las materias primas empleadas para su produccion suelen ser mezclas que contienen tambien acidos grasos de cadena corta, media o muy larga, que se transforman igualmente en esteres monoalqullicos durante el proceso y forman parte de la mezcla final de biodiesel. El documento de Hoekman et al. (Renewable and Sustainable Energy Reviews 2012, 16:143-169), recoge un listado de los acidos grasos mas frecuentemente encontrados en el biodiesel y la description del perfil de acidos grasos del biodiesel (esteres metllicos) obtenido a partir de diferentes aceites y grasas.

En todas las realizaciones y aspectos de la invencion, el alcohol puede ser un alcohol de cadena corta, por ejemplo, alcohol de alquilo C1-C6, mas especlficamente alcohol de alquilo C1-C4, particularmente metanol o etanol, mas preferiblemente metanol. Cuando dicho alcohol es metanol, dichos esteres de acidos grasos resultantes son esteres de metilo de acidos grasos (FAME - Biodiesel). Cuando dicho alcohol es etanol, dichos esteres de acidos grasos resultantes son esteres de etllicos de acidos grasos. Cuando dicho alcohol es propanol, dichos esteres de acidos grasos resultantes son esteres de propilo de acidos grasos. Cuando dicho alcohol es butanol, dichos esteres de acidos grasos resultantes son esteres de butilo de acidos grasos. El alcohol tambien puede ser un alcohol graso de cadena media (C6-C10) o alcoholes grasos de cadena larga (C12-C22). El dador de alcohol puede ser un ester de monoalquilo o un carbonato de dialquilo, tal como carbonato de dimetilo o carbonato de dietilo.

En una realization preferida, el procedimiento de slntesis de esteres de alquilo descrito en la presente invencion se caracteriza porque la preparacion o crudo enzimatico comprende la lipasa versatil recombinante (OPEr) de la presente invention, preferentemente la OPEr que comprende las secuencias SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, a una concentration de protelnas entre 1 a 20 mg/mL, preferentemente entre 2 a 10 mg/mL, mas preferentemente entre 3 a 4 mg/mL, donde dicha concentracion de protelnas comprende entre 100 y 450 unidades de actividad lipasa versatil (OPEr) por mililitro medida frente a p-nitrofenil butirato, mas preferentemente entre 150-300 unidades de actividad por mililitro.

A efectos de la presente invention los terminos preparation enzimatica o crudo, utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, se refieren al liquido y/o sobrenadante obtenido del cultivo del microorganismo empleado para la production de la enzima lipasa versatil nativa (OPE), donde dicho liquido y/o sobrenadante comprende las secuencias SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, o recombinante (OPEr) que comprende las secuencias SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.

En otra realization preferida, la preparacion enzimatica de la invencion o crudo que comprende la lipasa versatil nativa (OPE) que comprende las secuencias SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y/o recombinante (OPEr) que comprende las secuencias SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, puede concentrarse, preferentemente mediante ultrafiltracion a traves de membranas de entre 3 y 50 kDa de poro, mas preferiblemente de entre 10 y 50 kDa. Cualquier metodo conocido por un experto en la materia puede ser utilizado para concentrar el crudo utilizado en el presente procedimiento de la invencion. En otra realizacion preferida, la preparacion enzimatica de la invencion tambien puede ser una preparacion enzimatica o crudo purificado. Cualquier metodo conocido en la tecnica para la purification enzimatica puede ser utilizado en la presente invencion.

En otra realizacion preferida, el procedimiento de smtesis de esteres de alquilo descrito en la presente invencion se caracteriza porque la reaction de transesterificacion y/o esterification transcurre a una temperatura de entre 20 y 60 °C, preferentemente entre 25 y 50 °C, mas preferentemente de entre 25 y 35 °C. El hecho de que este catalizador, tanto libre como inmovilizado, lleve a cabo una smtesis eficiente de FAMEs a temperaturas inferiores a las descritas en otros procedimientos, generalmente entre 35-60 °C, segun se describe en el documento de Gumba et al. (Biofuel Research Journal 2016, 3:431-447), representa una considerable reduction del coste energetico asociado al proceso de smtesis de biodiesel.

En otra realizacion preferida, el procedimiento de smtesis de esteres de alquilo descrito en la presente invencion se caracteriza porque la reaccion se lleva a cabo a un pH de entre 2 a 10, preferentemente a un pH acido de 2 a 5.

En otra realizacion preferida, el procedimiento de smtesis de esteres de alquilo descrito en la presente invencion se caracteriza porque la reaccion puede tener lugar en un medio con hasta 30% de agua, preferentemente con menos del 10% y mas preferentemente en ausencia de agua. El hecho de que la lipasa versatil inmovilizada segun se describe en la presente invention catalice la slntesis de biodiesel tanto en ausencia como en presencia de cierta cantidad de agua hace esta enzima particularmente interesante, ya que por una parte no requiere la adicion de agua para su actividad, y por otra parte es tolerante a la presencia de agua en la materia prima empleada como sustrato y al agua producida por la esterification de los acidos grasos libres que pudiera contener dicho sustrato. Otros procedimientos descritos en el estado de la tecnica no son compatibles con la presencia de agua en la mezcla de reaction y requieren el empleo de sistemas de elimination del agua (Mehrasbi et al. Renewable Energy 2017, 101:593-602).

En otra realization preferida, el procedimiento de slntesis de esteres de alquilo descrito en la presente invencion se caracteriza porque la reaccion se lleva a cabo en presencia o ausencia de un cosolvente. A efectos de la presente invencion los cosolventes preferidos se seleccionan de la lista que consiste en hexano, tolueno e isooctano. En una realizacion aun mas preferida, la reaccion se lleva a cabo sin anadir ningun cosolvente.

A efectos de la presente invencion, la fuente de acidos grasos usada en el proceso de la invencion puede comprender al menos uno de entre cualquiera de los siguientes: aceite vegetal, preferentemente aceite de semillas de soja, aceite de canola, aceite de algas, aceite de colza, aceite de oliva, aceite de ricino, aceite de palma, aceite de girasol, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de Jatropha, aceite de Camelina, aceite de malz crudo; grasa animal, preferentemente, aceite de pescado; grasa derivada de animales; aceite usado; grasa quemada; trigliceridos de aceite derivados de fuentes vegetales no comestibles; gliceridos parciales y acidos grasos libres derivados de esos aceites; o cualquier mezcla de al menos dos de los mismos, en cualquier relation deseada. En otra realizacion mas preferida del procedimiento de la presente invencion, la fuente de acidos grasos comprende acidos grasos libres, mono-, di- o trigliceridos, sus mezclas en cualquier relacion, esteres de acidos grasos y amidas, en ausencia o presencia de otros derivados de acidos grasos secundarios tales como fosfollpidos y esteres de esterol, dicha fuente de acidos grasos esta sin refinar, refinada, blanqueada, desodorizada o cualquiera de sus combinaciones.

A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invention se desprenderan en parte de la description y en parte de la practica de la invention. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Comparacion de la estabilidad a temperatura (A) y pH (B) de OPEr libre e inmovilizada covalentemente a traves de sus cadenas glucldicas sobre partlculas magneticas amino funcionalizadas (AMNP-CH-OPEr).

Fig. 2. Comparacion de la eficiencia en slntesis de biodiesel y la estabilidad operacional de las lipasas Cal A (barra blanca), Cal B (barra gris claro) y OPEr (barra gris oscuro), inmovilizadas covalentemente sobre nanopartlculas magneticas aminofuncionalizadas a traves de sus cadenas glucldicas (AMNP-CH), y de la preparation comercial de Cal B inmovilizada por adsorcion Novozym 435 (N 435) (barra negra). La reaction se produjo a partir de aceite domestico reciclado y metanol (relation molar 1:4) a 28 °C y con agitation orbital de 100 rpm. C1, C2, C3, C4 y C5 hace referencia a cada uno de los ciclos de reaccion llevados a cabo por las mismas enzimas ensayadas en las mismas condiciones cada ciclo.

Fig. 3. Comparacion de la eficiencia y estabilidad operacional de OPEr inmovilizada covalentemente mediante AMNP-CH (barra gris oscura) y mediante interaction hidrofobica sobre partlculas comerciales SiMag-Octyl (barra gris clara). Se ha asignado el 100% al valor obtenido para el primer ciclo de reaccion con AMNP-CH-OPEr. C1, C2, C3, C4 y C5 hace referencia a cada uno de los ciclos de reaccion llevados a cabo por las mismas enzimas ensayadas en las mismas condiciones cada ciclo.

Fig. 4. Cromatogramas comparando la slntesis de oleato de metilo a partir de triolelna y metanol (relacion molar 1:4) en reacciones de 72 h sin cosolvente, a 28 °C y 200 rpm. Las reacciones fueron catalizadas por: a) Novozym 435, b) OPE inmovilizada sobre Sepabeads, y c) OPE inmovilizada sobre Eupergit.

EJEMPLOS

A continuation se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invencion.

Materiales y metodos

Las partlculas de magnetita desnuda (MNPs) utilizadas en los ejemplos incluidos en la presente description tienen un tamano de entre 20-30 nm y proceden de lolitec GmbH (Heilbronn, Alemania). Dichas partlculas magneticas se amino-funcionalizaron en el laboratorio con 3-aminopropil trietoxisilano (APTES, Sigma). Para los ensayos comparativos se adquirieron nanopartlculas de magnetita comerciales ya funcionalizadas y listas para la inmovilizacion de la enzima lipasa versatil utilizada en la invention. Dichas nanopartlculas de magnetita comerciales son: SiMAG-Amine que presenta grupos amino (estas nanopartlculas son el analogo comercial de las utilizadas en la presente invencion) y SiMAG-Octyl-C8 que comprenden grupos octilo, ambas de Chemicell. Las nanopartlculas SiMAG-Octyl-C8 se utilizan para comparar el procedimiento de inmovilizacion descrito en la presente invencion con otro procedimiento no covalente, aunque si apto para la inmovilizacion de protelnas hidrofobicas sobre partlculas magneticas.

La enzima con actividad lipasa versatil utilizada es la lipasa versatil presente en cualquier crudo producido por cualquier microorganismo que comprenda el gen de la esterol esterasa del hongo Ophiostoma piceae (OPE). Para los diferentes ensayos comparativos tambien se utilizaron las lipasas comerciales Cal A (NS 40020) y Cal B (Lipozyme L) ambas de Novozymes. Dichas enzimas comerciales de Novozymes, al ser tambien glicoprotelnas, se inmovilizaron mediante el procedimiento descrito en la invencion, es decir, se inmovilizaron covalentemente sobre partlculas magneticas amino-funcionalizadas en su superficie, para as! comparar la validez de dicho metodo de inmovilizacion y su efecto sobre la eficiencia y reciclabilidad de lipasas comerciales, muchas de ellas con propiedades catallticas mejoradas, cuando son inmovilizadas mediante dicho procedimiento. Tambien se comparo la actividad en la slntesis de biodiesel de la enzima Novozym 435 (Novozymes), la forma comercial de la enzima Cal B inmovilizada por adsorcion sobre Lewatit VP OC 1600, una resina acrllica macroporosa.

La medida de la actividad lipasa en las preparaciones enzimaticas o crudos que comprenden la enzima libre y en los sobrenadantes tras la inmovilizacion (actividad residual) se valoro espectrofotometricamente (A410 nm) mediante la liberation de p-nitrofenol a partir de palmitato de p-nitrofenilo (p-NPP) y/o butirato de p-nitrofenilo (pNPB), segun se describe en Gutierrez-Fernandez et al. (Journal of Structural Biology 2014, 187:215-222). El p-NPP es un sustrato tipico para evaluar la actividad lipasa, ya que es un aril-ester de acido graso de cadena larga, mientras que el p-NPB es el sustrato mas apropiado para la medida de actividad esterol esterasa al ser un arilester de un acido graso de cadena corta. La actividad lipasa de las enzimas OPEr y Cal A pudo ser determinada utilizando p-NPP como sustrato, sin embargo la enzima Cal B se inactivo en las condiciones de reaccion ensayadas. Para lograr una suspension homogenea del sustrato p-NPP, que es insoluble en agua, es preciso anadir un detergente en el medio de reaccion y probablemente la enzima Cal B resulta inactivada debido a la accion de dicho detergente. Por esta razon, se determino tambien la actividad de las tres enzimas frente a p-NPB, ya que este sustrato es soluble y no es necesario anadir detergente. En el caso de las enzimas Cal A y OPEr, sus actividades lipasa y esterol esterasa resultaron ser similares en las condiciones del ensayo.

Ejemplo 1. Inmovilizacion de lipasas, a traves de sus propias cadenas gluddicas, sobre nanopartlculas de magnetita (Fe3O4) amino-funcionalizadas (AMNP-CH).

Para que una enzima pueda ser inmovilizada a traves de sus propias cadenas gluddicas es necesario que dicha enzima sea de naturaleza glicoproteica, ya que este tipo de inmovilizacion covalente de dicho tipo de enzimas sobre partmulas magneticas amino-funcionalizadas en su superficie se basa en la generacion de grupos aldeddo a partir de las cadenas gluddicas de la enzima a inmovilizar, que reaccionan con los grupos amino presentes en la superficie de las particulas magneticas aminofuncionalizadas. Las cadenas gluddicas de la protema son superficiales y la inmovilizacion de la enzima por dichas cadenas no modifica la estructura de la protema ni afecta a la accesibilidad de los sustratos al centro activo de la misma. Entre las enzimas con actividad lipasa inmovilizadas segun el procedimiento de la presente invencion estan OPEr, Cal A y Cal B, todas ellas de naturaleza glicoproteica. Para llevar a cabo la inmovilizacion de dichas enzimas mediante el procedimiento descrito en la presente invencion se realiza un tratamiento de la enzima con NaIO4, que produce la rotura del enlace carbono-carbono (C-C) de los monosacaridos cuando dos carbonos adyacentes presentan grupos hidroxilo vecinales (dioles vecinales), oxidando dichos alcoholes a aldeddos. Una vez oxidadas, las enzimas OPEr, Cal A y Cal B se inmovilizan covalentemente sobre las MNPs amino-funcionalizadas (AMNPs) al reaccionar los grupos amino de dichas AMNPs con los aidehldos generados en la glicoprotelna via oxidacion, formando una imina (base de Schiff) que se estabiliza mediante aminacion reductiva para dar lugar a una amina secundaria estable.

1.1. Preparation de nanoparticulas de magnetita (Fe3O4) funcionalizadas con grupos amino (AMNPs).

Las nanoparticulas de Fe3O4 (lolitec GmbH) fueron silanizadas y funcionalizadas con 3-aminopropil trietoxisilano (APTES, Sigma), compuesto que incorpora grupos amino reactivos en la superficie de la nanopartlcula. Basandonos en el metodo descrito por Chen et al. (International Journal of Molecular Sciences 2013, 14:4613-4628), se mezcla 1 g de las nanoparticulas magneticas, especlficamente de las nanoparticulas Fe3O4, con 9,7 mL de etanol en un bano de ultrasonidos durante 20 min. Se anaden 300 p,L de APTES, sonicando durante 10 min. Se agita en un mezclador a 80 rpm y 28 °C durante 16 h. Una vez transcurrido este tiempo se separan las nanoparticulas con ayuda de un iman y se retira el llquido de reaccion, lavando las MNPs funcionalizadas con los grupos amino en la superficie de las mismas con 300 mL de etanol al 50% en agua tres veces, sonicando entre lavados. Finalmente, las MNPs aminofuncionalizadas se secan en una estufa de aireacion a 65 °C. Se valora la densidad de grupos amino accesibles en las partlculas mediante el procedimiento descrito por del Campo et al. (Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2005, 293:33-40), poniendo de manifiesto que presentan grupos amino accesibles en superficie en el rango de 5-15 p,moles/g soporte, algo inferior al descrito para preparaciones comerciales.

1.2. Oxidacion de las cadenas glutidicas de las esterol esterasas/lipasas.

Para que las lipasas se unan covalentemente a las partlculas magneticas aminofuncionalizadas en su superficie segun se describe en la presente invencion, es necesario oxidar las cadenas glucldicas de dichas enzimas. En los ejemplos mostrados en la presente invencion, las lipasas se someten a dicho pre-tratamiento de oxidacion, para que las diferencias mostradas en los ensayos comparativos de la slntesis de biodiesel utilizando dichos catalizadores, se deban exclusivamente al tipo de inmovilizacion realizada, y no al pre-tratamiento oxidativo al que se ha sometido previamente a la enzima.

Se han oxidado las preparaciones enzimaticas o los crudos que contienen la enzima OPEr, asi como las diferentes preparaciones de enzimas comerciales (Cal A y Cal B). Brevemente, a una solucion de lipasa con 20 mg/mL de protemas totales se le anade NaIO4 en Tris-HCl 5 mM pH 7, a concentration final 10 mM. Se mantiene la reaction durante 3 h a 4 °C, en oscuridad y sin agitation, y se dializa frente a Tris-HCl 20 mM pH 7 para eliminar los reactivos y subproductos de baja masa molecular. La oxidation de las cadenas gluddicas de las lipasas se lleva a cabo para generar grupos aldehido en los azucares de dichas enzimas, y posteriormente, durante el proceso de inmovilizacion sobre las MNPs amino-funcionalizadas, unir covalentemente estos grupos reactivos a los grupos amino de las nanoparticulas. Antes de su uso para la inmovilizacion, se ajustan las soluciones de cada una de las enzimas con actividad lipasa para que contengan alrededor de 0,5 U de actividad medida frente a butirato de p-nitrofenilo (p-NPB) por mg de la preparation de particulas magneticas funcionalizadas.

1.3. Inmovilizacion de lipasas.

Brevemente, se parte de 1 g de AMNPs al que se le anade Tris-HCl 20 mM pH 7 que posteriormente se retira con la ayuda de un iman. En ese mismo vial, se anade tampon Tris-HCl 100 mM pH 8, se agita y a continuation se anade el volumen de la preparacion de la lipasa equivalente a una actividad de 0,5 U de actividad por mg de AMNP, y trimetil amino borano (TMAB) a una concentracion final de 150 mM. Se agita y se mantiene en agitacion a 80 rpm y 28 °C durante 16 h. Posteriormente se retira el sobrenadante, midiendo su actividad residual. Se anaden 30 mL de NaBH4 (1 mg/mL) a las nanoparticulas magneticas con la lipasa inmovilizada y se deja reaccionar durante 1 h. Finalmente se lava la preparacion de AMNP-CH-OPEr secuencialmente con Tris-HCl 100 mM pH 7 y Tris-HCl 20 mM pH 7, resuspendiendolas en este ultimo solvente para su almacenamiento a 4 °C.

1.4. Estabilidad a p H y temperatura de las nanoparticulas magneticas con OPEr inmovilizada a traves de la union de sus cadenas glucidicas a MNPs aminofuncionalizadas (AMNP-CH-OPEr).

Se comparo la estabilidad de la enzima OPEr en los crudos antes (OPEr libre) y despues de su inmovilizacion mediante AMNP-CH (AMNP-CH-OPEr). La estabilidad frente a la temperatura se evaluo en un rango comprendido entre 25 y 70 °C, con el catalizador libre (disuelto) o inmovilizado (resuspendido) en tampon Tris-HCl 20 mM, pH 7. La estabilidad de la enzima OPEr a diferentes pHs se determino a 4 °C poniendo la muestra de catalizador libre o inmovilizado en tampon Britton & Robinson ajustado a valores de pH comprendidos entre 2 y 10.

Se tomaron 500 p,L del crudo o de la suspension de AMNP-CH-OPEr conteniendo aproximadamente la misma actividad frente a p-NPB, manteniendolos durante 24 h en agitacion (1200 rpm) en un termobloque a cada una de las temperaturas y pHs ensayados. Tras el tratamiento se midio actividad residual frente a p-NPB, considerando como el 100% el valor obtenido a 25 °C y pH 7, respectivamente. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

La enzima AMNP-CH-OPEr es mas estable a altas temperaturas que la OPEr libre (Fig. 1A). La enzima AMNP-CH-OPEr mantiene un 80% de su actividad hasta los 50 °C, mientras que la enzima OPEr libre conserva solo un 32% de su actividad a la temperatura de 40 °C, y ademas, se inactiva por encima de esta temperatura.

Con respecto al pH, la enzima AMNP-CH-OPEr muestra una estabilidad igual o mayor que la OPEr libre en todo el rango de pH analizado (pH de 2 a 10). Es interesante destacar la mejora de la actividad a pHs alcalinos (8 y 9) y muy especialmente a pH acido, donde la actividad llega a duplicarse a pH 2 y 3 (Fig. 1B).

El documento Torres et al. (Catalysis Communications 2008, 9:539-545) describe la inmovilizacion de la enzima OPE nativa sobre Dilbeads, un soporte macroporoso, y su efecto sobre la estabilidad termica y de pH en un periodo de 24 h. En este caso se observo un efecto estabilizador frente al incremento de temperatura, y respecto a la estabilidad frente a pH, los autores solo indican un efecto destacable a pH 8.

1.5. Sintesis de biodiesel con lipasas inmovilizadas sobre particulas magneticas a traves de sus cadenas glucidicas.

El analisis de la production de biodiesel utilizando la lipasa versatil OPEr inmovilizada sobre AMNP-CH segun se describe en la presente invention, y comparando dicha production con la obtenida utilizando otras lipasas comerciales inmovilizadas sobre diferentes sustratos, segun se describe en los ejemplos incluidos en el presente documento, se llevo a cabo con 500 pL de aceite reciclado y metanol (proportion molar 1:3), y 50 mg de la enzima ensayada (0,3 mg de protelna), sin utilizar cosolventes. Las reacciones se mantuvieron a 28 °C y con agitation rotacional (360°) a 80-100 rpm en un mezclador durante 24 h. Para evaluar la estabilidad de las lipasas ensayadas en estas condiciones de reaction (estabilidad operacional), a las 24 h de reaction se separaron la fase llquida y el catalizador con la ayuda de un iman externo, se lavo el catalizador con Tris-HCl 20 mM pH 7 y se volvio a poner la reaction en las mismas condiciones.

Se realizo un seguimiento de la slntesis de biodiesel a lo largo del tiempo. Las muestras tomadas a las 24 h de reaction fueron analizadas mediante cromatografla de gases, determinando la production de esteres metllicos. El oleato de metilo sintetizado se cuantifico utilizando una recta patron de este compuesto construida empleando colestenona como patron interno.

Los resultados obtenidos para la slntesis de biodiesel catalizada por OPEr, Cal A y Cal B inmovilizadas covalentemente sobre AMNP-CH se presentan en la Fig. 2. Los resultados ponen de manifiesto que las preparaciones de OPEr y Cal A inmovilizadas segun se describe en el presente documento, tienen una eficiencia similar, siendo ambas mas eficientes que la enzima Cal B tambien inmovilizada segun la presente invention. La estabilidad operacional de AMNP-CH-OPEr y AMNP-CH-Cal A es excelente, ya que aunque en la Fig. 2 solo se muestran los resultados hasta el quinto ciclo de slntesis de biodiesel (24 h cada uno), esta preparation se ha reciclado mas de diez veces, con baja perdida de actividad (se mantiene mas del 70% de la actividad inicial en el 10° ciclo). En las mismas condiciones ensayadas, la lipasa Cal B es menos eficiente que la enzima OPEr, tanto en su forma libre como tras su inmovilizacion como AMNP-CH-Cal B. Aunque en esta forma la enzima AMNP-CH-Cal B mantuvo estable su actividad en los cinco ciclos, dicha actividad es muy escasa comparada con la actividad mostrada por la enzima OPEr inmovilizada sobre AMNP-CH, o por la enzima AMNP-CH-Cal A. Por el contrario, la enzima Novozym 435 (N 435) produjo un rendimiento muy bajo en la slntesis de esteres metllicos, y la actividad de dicha enzima desparecio tras el segundo ciclo.

Estos resultados ponen de manifiesto que el procedimiento de inmovilizacion sobre partlcuias magneticas amino-funcionalizadas en su superficie, a traves de los carbohidratos oxidados presentes en las glicoprotelnas, permite la eficaz recuperacion y reciclado de la enzima.

Ejemplo 2. Sintesis de biodiesel con OPEr inmovilizada sobre nanoparticulas comerciales de magnetita (Fe3O4) funcionalizada con grupos octilo (MNP-Octil-OPEr).

Para comparar la eficiencia del proceso de sintesis de biodiesel mediante la enzima OPEr inmovilizada covalentemente sobre nanoparticulas magneticas aminofuncionalizadas en su superficie (AMNP-CH-OPEr) respecto de otros procedimientos de inmovilizacion, se utilizo la misma enzima OPEr pero inmovilizada sobre nanoparticulas magneticas funcionalizadas con grupos octilo en su superficie (MNP-Octil-OPEr). La inmovilizacion de la enzima OPEr sobre nanoparticulas magneticas funcionalizadas con grupos octilo en su superficie tiene lugar por interaction hidrofobica de la enzima con las cadenas alqullicas de ocho carbonos disponibles en las nanoparticulas magneticas.

Brevemente, la solution comercial de MNP-Octil (Chemicell) contiene 50 mg de nanoparticulas por mL de H2O. Se retira el agua con la ayuda de un iman y se anade el volumen de crudo equivalente a 0,5 U de actividad (medida frente a p-nitrofenil butirato, p-NPB) por mg de soporte y se completa hasta 1 mL con Tris 100 mM pH 8. Se mezcla suavemente con una pipeta durante 2 min tras los cuales se retira el sobrenadante utilizando el iman, y a continuacion se mide la actividad residual tras la inmovilizacion. El catalizador inmovilizado se resuspende en Tris-HCl 20 mM pH 7 para su almacenamiento a 4 °C.

La Fig. 3 muestra que en el primer ciclo la lipasa OPEr inmovilizada sobre Octil-MNP (MNP-Octil-OPEr) funciono de forma similar a la enzima inmovilizada sobre AMNP-CH, pero luego la actividad enzimatica comenzo a disminuir y en el quinto ciclo casi habla desaparecido completamente. Estos resultados ponen de manifiesto la mayor eficiencia y rendimiento en la sintesis enzimatica de biodiesel, asl como un reciclado de la enzima para futuras reacciones, sencillo y eficiente, sin que la actividad y velocidad de la misma se vea disminuida a lo largo de los ciclos de reaction consecutivos, cuando dicha enzima, preferentemente la enzima OPEr se inmoviliza covalentemente sobre particulas magneticas amino-funcionalizadas en su superficie, segun se describe en la presente invention.

Ejemplo 3. Sintesis de biodiesel con esterol esterasas/lipasas inmovilizadas covalentemente sobre soportes microporosos funcionalizados.

Se inmovilizaron crudos que comprenden la enzima OPE sobre dos soportes microporosos epoxi comerciales: Eupergit (Rohm Inc.) y Sepabeads (Resindion). Dichos soportes microporosos difieren en su geometria interna. Para la inmovilizacion sobre ambos soportes se anadieron 180 U de enzimas esterol esterasa/lipasas (Novozym 435, OPE inmovilizada sobre Sepabeads y OPE inmovilizada sobre Eupergit) en 1 mL de H2O. Las inmovilizaciones se realizaron a 4 °C en un mezclador de rodillos durante 48 h.

Para la inmovilizacion sobre el soporte Eupergit, se usaron 100 mg de soporte, 1 mL del crudo disuelto en agua y 1,5 mL de tampon fosfato 0,5 M pH 8. Para la inmovilizacion en Sepabeads se partio de 200 mg de soporte (puesto que este material tiene un alto grado de humedad) anadiendo 1 mL del crudo disuelto en agua y 500 pL de tampon fosfato 1,25 mM pH 8. En ambos casos, se enraso hasta 3 mL con agua. Se realizo un seguimiento de la inmovilizacion en los dos soportes, tomando muestras a diferentes tiempos. Las muestras se centrifugaron, evaluando la actividad residual tras la inmovilizacion.

Las enzimas asi inmovilizadas, Novozym 435, OPE inmovilizada sobre Sepabeads y OPE inmovilizada sobre Eupergit, se ensayaron en reacciones de sintesis de biodiesel a 28 °C y agitation orbital a 200 rpm, en ausencia de cosolvente, utilizando triolema comercial y metanol (relation molar 1:4) como sustratos y comparando el resultado obtenido con la enzima OPE inmovilizada sobre Sepabeads o Eupergit, con el obtenido empleando Novozym 435 como catalizador. El seguimiento de estas reacciones se realizo por cromatografia de gases. Las reacciones catalizadas por la enzima OPE inmovilizada sobre ambos soportes transformaron casi totalmente los sustratos aunque mas lentamente (72-96 h), mientras que Novozym 435 apenas produjo esteres metflicos en las condiciones ensayadas (Fig.4).

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Glicoprotelna inmovilizada covalentemente mediante la formacion de una amina secundaria sobre partlculas magneticas.

2. Glicoprotelna segun la reivindicacion 1 donde la glicoprotelna es una lipasa y/o una esterol esterasa con actividad lipasa.

3. Glicoprotelna segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde la glicoprotelna se selecciona de entre cualquiera de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.

4. Glicoprotelna segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la partlcula magnetica tiene un tamano de entre 1 a 130 nm.

5. Glicoprotelna segun la reivindicacion 4 donde la partlcula magnetica tiene un tamano de entre 10 a 30 nm.

6. Glicoprotelna segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la partlcula magnetica se selecciona de la lista que consiste en: magnetita (Fe3O4), maghemita (yFe2O3), partlculas metalicas de hierro, partlculas metalicas de cobalto, partlculas metalicas de nlquel, partlculas metalicas de tipo espinela que se seleccionan de la lista que consiste en: MgFe2O4, MnFe2O4 y CoFe2O4, y partlculas metalicas a base de aleaciones tales como CoPt3 y FePt.

7. Glicoprotelna segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizada por que comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 inmovilizada sobre la partlcula magnetica Fe3O4.

8. Procedimiento de slntesis de glicoprotelnas inmovilizadas covalentemente sobre partlculas magneticas mediante la formacion de un grupo amino secundario segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) generar grupos aldehldo en las cadenas glucldicas de la glicoprotelna, b) funcionalizar las partlculas magneticas con grupos amino en su superficie,

c) incubar la glicoprotelna de la etapa a) con un agente reductor en presencia de la partlcula magnetica amino funcionalizada de la etapa b), y

d) estabilizar la union de la glicoprotelna inmovilizada sobre la partlcula magnetica obtenida en la etapa c).

9. Procedimiento segun la reivindicacion 8 donde la oxidacion de la etapa a) se lleva a cabo en presencia de un agente oxidante que se selecciona de la lista que consiste en: 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy radical (TEMPO), periodinato Dess-Martin, tetraacetato de plomo Pb-(O2CCH3)4, bismutato sodico (NaBiO3), acido periodico, periodato sodico (NaIO4) y periodato potasico (KIO4).

10. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9 donde la funcionalizacion de la etapa b) se lleva a cabo mediante silanizacion.

11. Procedimiento segun la reivindicacion 10 donde la funcionalizacion de la etapa b) y la silanizacion se llevan a cabo simultaneamente.

12. Procedimiento segun la reivindicacion 11 donde la funcionalizacion y silanizacion se lleva a cabo mediante un compuesto que se selecciona de la lista que consiste en: 3-aminopropil trietoxisilano (APTES), (3-aminopropil)trimetoxisilano, 3[2-(2-aminoetilamino)etilamino] propiltrimetoxlsilano, 3-(2-aminoetilamino)-propildimetoximetilsilano,[3-(2-aminoetilamino)propil]trimeto-xisilano, 3-aminopropildimetilmetoxisilano y 3-aminopropil(dietoxi)metilsilano.

13. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 donde el agente reductor de la etapa c) se selecciona de la lista que consiste en: borohidruro de sodio (NaBH4), cianoborohidruro de sodio, cianoborohidruro de litio, trimetil amino borano (TMAB) o triacetoxiborohidruro.

14. Procedimiento de slntesis de esteres de alquilo que comprende la transesterificacion y/o esterificacion de una fuente de acidos grasos con un alcohol, en presencia de una preparation enzimatica que comprende una glicoprotelna segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.

15. Procedimiento segun la reivindicacion 14 donde el alcohol es un alcohol de cadena corta.

16. Procedimiento segun la reivindicacion 15 donde el alcohol de cadena corta es metanol.

17. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 donde la fuente de acidos grasos se selecciona de la lista que consiste en aceite vegetal, grasa animal, aceite de algas, aceite de pescado, aceite usado, grasa quemada y/o cualquier combinacion de los mismos.

18. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 donde los esteres de alquilo se seleccionan de la lista que consiste en: esteres de metilo, etilo, propilo o butilo.

19. Procedimiento segun la reivindicacion 18 donde los esteres de metilo son esteres de metilo de acidos grasos, los esteres etllicos son esteres etllicos de acidos grasos, los esteres propllicos son esteres propllicos de acidos grasos y los esteres butllicos son esteres butllicos de acidos grasos.

20. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19 donde la concentracion de la glicoprotema varia entre 1-20 mg/mL o la actividad de la glicoprotema varia entre 100-450 U/mL.

21. Procedimiento segun la reivindicacion 20 donde la concentracion de la glicoprotema varia entre 2 a 10 mg/mL o la actividad de la glicoprotema varia entre 150-300 U/mL.

22. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21 donde la reaccion de transesterificacion y/o esterificacion se lleva a cabo a una temperatura de entre 20 a 60 °C y a un pH de entre 2 a 10.

23. Procedimiento segun la reivindicacion 22 donde la temperatura varia de entre 25 a 50 °C y el pH de 2 a 5.

24. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 22 a 23 donde la temperatura varia entre 25 a 35 °C.