ES2909496T3

ES2909496T3 - Producción de estólidos de ácidos grasos

Info

Publication number: ES2909496T3
Application number: ES16711679T
Authority: ES
Inventors: Carmen Gabriela Boeriu; Anamaria Todea; Isabella Wilhelmina Christina Everdina Arends; Ludwina Gerharda Otten
Original assignee: Technische Universiteit Delft; Stichting Wageningen Research
Current assignee: Technische Universiteit Delft; Stichting Wageningen Research
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2016-03-24
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2036-03-24
Also published as: WO2016151115A1; EP3274463B1; GB201505178D0; US11512330B2; US11414684B2; US20210207179A1; EP3274463A1; US10920252B2; US20210207180A1; US20180073046A1

Abstract

Un método de un recipiente para producir uno o más ésteres de uno o más ácidos grasos hidroxi que comprende: (a) proporcionar un ácido graso insaturado con un enlace doble cis C9-C10 en un medio de reacción tamponado acuoso; (b) hacer reaccionar dicho ácido graso insaturado con una oleato hidratasa aislada en el medio de reacción tamponado acuoso para producir al menos un ácido graso hidroxi; y (c) esterificación de dicho al menos un hidroxiácido graso mediante una lipasa en el medio de reacción tamponado acuoso.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de estólidos de ácidos grasos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la producción de estólidos de ácidos grasos, más particularmente estólidos derivados del ácido oleico y otros sustratos de ácidos grasos insaturados para oleato hidratasa (OHasa) que tienen un enlace doble cis entre C9 y C10. La oleato hidratasa convierte dichos sustratos en ácidos grasos 10-hidroxi. Así, el ácido oleico, uno de los ácidos grasos insaturados naturales más abundantes, se convierte por acción de la oleato hidratasa en ácido 10-hidroxiesteárico (10-HSA); ver la figura 1. Los ácidos grasos 10-hidroxi resultantes se pueden usar para formar estólidos en los que la funcionalidad de ácido carboxílico de una cadena de ácido graso forma un enlace éster secundario con el esqueleto alquílico de otra. Por ejemplo, la 10-HSA puede formar un monoestólido con ácido oleico y ésteres consigo mismo.

Ahora se ha descubierto que la formación de tales estólidos empleando 10-HSA y otros 10-hidroxiácidos grasos puede catalizarse mediante una lipasa en condiciones acuosas adecuadas para la actividad de la oleato hidratasa, es decir, por ejemplo, en una solución acuosa tamponada a un pH de aproximadamente 6-6.5 y a baja temperatura, por ejemplo, 30 °C. Además, se ha demostrado que, en consecuencia, es factible acoplar la formación de estólidos de ácidos grasos con la actividad de oleato hidratasa en un sustrato de ácido graso insaturado, por ejemplo, ácido oleico, o la actividad de oleato hidratasa en dicho sustrato e hidrólisis de lipasa de un triglicérido, por ejemplo, trioleína, en una mezcla de reacción única en la que se proporcionan los monómeros para la formación de estólidos in situ en la mezcla de reacción. Esto abre por primera vez la posibilidad de un proceso enzimático simple en un solo recipiente para producir ésteres de 10-hidroxi-ácidos grasos a partir de aceites naturales o una preparación de triglicéridos purificados utilizando dos enzimas para catalizar tres reacciones consecutivas: una sola lipasa para catalizar ambas. la hidrólisis de un sustrato de triglicéridos (primera reacción) y la síntesis de ésteres (tercera reacción) junto con una OHasa. Los estólidos de ácidos grasos pueden proporcionarse ventajosamente a partir de materias primas de base biológica, por ejemplo, aceites vegetales naturales, para muchas aplicaciones industriales, incluido el uso como lubricantes y recubrimientos biodegradables y para su uso en las industrias alimentaria y cosmética (Cermak & Isabell (2009) Ind. Crops Products 29, 205-212).

Antecedentes de la invención

La síntesis química convencional de estólidos de ácidos grasos a partir de ácidos grasos insaturados utiliza altas temperaturas, generalmente por encima de los 200 °C, y un catalizador inorgánico como el estaño, el titanio o el ácido sulfúrico, normalmente en medios orgánicos secos. Dichos procesos pueden conducir a la degradación del éster y reacciones secundarias no deseadas. Además, los costes de energía resultantes son altos. Con el fin de superar tales problemas, la atención de los investigadores se ha desplazado hacia el uso de lipasas como biocatalizadores para la esterificación de ácidos grasos hidroxilados (Martin-Arjol et al. (2013) Process Biochemistry 48, 224-230).

Las lipasas se conocen desde hace mucho tiempo por hidrolizar los componentes triglicéridos de los aceites para liberar el(los) componente(s) de ácido graso, por ejemplo, liberar ácido oleico a partir de trioleína en la que el glicerol se esterifica con tres cadenas de ácido oleico. Tal hidrólisis enzimática generalmente se realiza en una solución acuosa que se pone en contacto con el aceite formando una dispersión líquido-líquido en condiciones ambientales (típicamente 35 °C y presión atmosférica). La lipasa cataliza la hidrólisis de los componentes de triglicéridos en la interfase entre los dos líquidos. La reacción es reversible por lo que la composición final de los productos y la velocidad de hidrólisis depende de la concentración de ácidos grasos en la fase oleosa y de la concentración de glicerol en la fase acuosa. También se conoce el uso de lipasa inmovilizada para este propósito (Ramachandra et al. (2002) Biotechnol. Bioprocess Eng. 7, 57-66). Los principales constituyentes de los aceites vegetales son los triacilgliceroles y, por lo tanto, se reconocen como una importante fuente renovable de ácidos grasos para varios usos sintéticos a través de la acción de la lipasa (De Espinosa & Meier (2011) European Polymer J. 47, 837-852: 'Plant oils: The perfect renewable resource for polymer science?!').

Aunque diseñadas por la naturaleza para efectuar la hidrólisis de los triglicéridos, también se ha reconocido desde hace mucho tiempo que las lipasas pueden, en condiciones apropiadas, promover la esterificación necesaria para la formación de estólidos (F.D. Gunstone (1999) J. Sci. Food Agric. 79, 1535-1549). Gran parte de la investigación en relación con dicho uso de lipasa se ha centrado en la formación de estólidos a partir de ácidos monohidroxigrasos naturales como el ácido ricinoleico (ácido 12(R)-hidroxi-9(Z)-octadecanoico). El aceite de ricino tiene un alto porcentaje de triglicéridos que contienen ácido ricinoleico y, por lo tanto, es bien conocido como fuente de ácido ricinoleico comercialmente disponible obtenido por saponificación convencional.

En 1989, Yamaguchi et al. informaron de la producción directa de estólido de ácido graso a partir de aceite de ricino mediante el suministro de una lipasa en una dispersión acuosa de aceite de ricino al 30-65 % en peso. Se obtuvo un buen rendimiento de estólido con el uso de una lipasa capaz de hidrolizarse en el sitio beta del glicérido o una lipasa que tuviera selectividad parcial por el glicérido, pero no con una lipasa que tuviera selectividad por el sitio alfa del glicérido. Los estudios relevantes se informan en las solicitudes de patentes japonesas publicadas JPS64-16591 y JPS64-16592. Sin embargo, dicha formación de estólidos que depende del grupo hidroxi C12 del ácido ricinoleico natural no sugiere la formación de estólidos catalizada por lipasa a partir de cualquier ácido graso hidroxi C10 en condiciones compatibles con la función de una oleato hidratasa para proporcionar el hidroxi-FA in situ. Yamaguchi et al. no tenían necesidad de considerar el mantenimiento de la actividad de una oleato hidratasa y se limitaron a la consideración de aceites que contienen una alta cantidad de ácido ricinoleico. Además, el trabajo posterior del mismo grupo se centró en el uso de lipasa inmovilizada para la formación de estólidos a partir del mismo hidroxi-FA; sugirieron como uso preferible de lipasa de Candida rugosa inmovilizada sobre un soporte cerámico con eliminación de agua para controlar cuidadosamente el contenido de agua en el entorno de reacción; ver Patente Japonesa No. 3157028 y Yoshida et al. (1997) JAOCS 74, 261-267.

Más recientemente, Solicitud de Patente Europea No. 2757158 publicado (Petroleo Brasileiro SA) y la solicitud de patente de EE. UU. US2013102041A publicada equivalente, propusieron la síntesis enzimática de estólidos grasos utilizando una lipasa microbiana inmovilizada no específica para las posiciones 1.3 de un triglicérido, como la lipasa de Candida rugosa o derivado de una especie Pseudomonas, en un medio libre de disolventes a 70-90 °C y manteniendo una concentración de agua muy baja. Se emplearon ácido esteárico y metilricinoleato (biodiesel de aceite de ricino) para la formación de estólidos utilizando la forma inmovilizada de la lipasa B recombinante de Candida antarctica comercialmente disponible como Novozyme 435. Estudios similares realizados por el mismo grupo que analizan la formación de estólidos por lipasa inmovilizada a partir de ácido oleico y metilricinoleato se discuten en Aguierias et al. (2011) Enzyme Research, Article ID. 432746.

Otros también han analizado varias condiciones operativas para mejorar la formación de estólido ricinoleico usando lipasa inmovilizada en sistemas sin solventes con énfasis en el control de la concentración de agua, por ejemplo, uso de tamices moleculares para adsorber agua y reacción al vacío con secado al aire (ver por ejemplo Bódalo et al. (2009) Biochem. Eng. J. 44, 214-219; Horchani et al. J. Mol. Catal B: Enzima (2012) 75, 35-42). Más recientemente, se ha propuesto la síntesis de lipasa de ésteres de ácidos grasos hidroxilados en disolventes orgánicos secos como el nhexano (Martin-Arjol et al. (2013) ibid). Dichos sistemas no son compatibles con ninguna consideración del acoplamiento de la síntesis de lipasa de estólidos de ácidos grasos con la producción de hidroxi-FA por oleato hidratasa en el mismo medio de reacción.

Hayes y Kleinman (1995) JAOCS 72 ,1309-1316 informa de la detección de una serie de lipasas microbianas para la capacidad de formar estólidos a partir de hidroxi-FA cis insaturados naturales conocidos como ácido lesquerólico (ácido 14(R)-hidroxi-11(Z)- eicosenoico) y ácido oleico en diferentes sistemas de reacción: lipasas nativas en medio bifásico acuoso-orgánico empleando isooctano, lipasa inmovilizada y micelas inversas. Los resultados respaldan además que las lipasas aleatorias, es decir, las lipasas que carecen de especificidad en la posición 1.3 con respecto a los triglicéridos (por ejemplo, las lipasas de Candida rugosa, Chromobacterium viscosum, Geotrichum candidum y especies Pseudomonas) son eficaces para catalizar la formación de estólidos. Por el contrario, las lipasas específicas de posición 1.3 probadas fueron ineficaces (con la excepción de Aspergillus niger lipasa que proporcionó una pequeña cantidad de estólido). Esto concuerda con tales lipasas que no utilizan, o utilizan pobremente, alcoholes secundarios como sustrato. También se encontró que la distribución del producto dependía de la fuente de lipasa. Uso de Candida rugosa lipasa o Geotrichum la lipasa dio formación de estólido, siendo más del 80 % del estólido el monoestólido formado a partir de un grupo acilo lesquerólico y un grupo acilo octadecanoico. La lipasa Pseudomonas sp. dio una mezcla de productos muy diferente que incluía una cantidad significativa de monoestólido con dos grupos acilo lesquerólicos y algo de diestólido. Sin embargo, de nuevo no se proporciona información relevante para acoplar la esterificación de la lipasa con la formación de un hidroxi-FA por el oleato hidratasa.

Todea et al (2015) Pure Appl. Chem. 87, 51-58 informaron sobre la detección de varias lipasas libres e inmovilizadas y una proteasa inmovilizada por su capacidad para sintetizar estólidos a partir de hidroxiácidos con grupos hidroxilo primarios y secundarios, es decir, ácido 16-hidroxihexadecanoico (16-HHDA), ácido 12-hidroxi-9-cis-hexadecenoico (ácido ricinoleico, RCA) y ácido 12-hidroxi-octadecanoico (12-HSA), en disolventes orgánicos secos a 60 °C. Los resultados mostraron que las lipasas no regioespecíficas son capaces de catalizar la síntesis de estólidos a partir de hidroxiácidos grasos primarios y secundarios; la reactividad de las lipasas para los sustratos probados disminuyó en el orden: C16(16OH) > C18(12OH:9) > C18(12OH). Se encontró que las más eficientes eran las lipasas de Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas. stutzeri, C. antarctica B, C. rugosa, especies Alcaligenes y Thermomyces lanuginosus. La distribución del producto dependió del tipo de sustrato y del tipo de lipasa, pero el producto principal en todos los casos fue el monoestólido, representando el 60-80 % del producto formado. Las lipasas B de lipasas Pseudomonas y C. antarctica produjeron estólidos de cadena más larga, incluidos di-, tri- y tetrámeros, mientras que se obtuvieron pequeñas cantidades de monolactonas (es decir, ésteres cíclicos derivados del ácido hidroxigraso por cierre del anillo) solo con lipasa de P. fluorescente y P. stutzeri.

Como parte de los mismos estudios, varias lipasas inmovilizadas (lipasas como agregados enzimáticos reticulados (CLEA) de P. stutzeri (CLEA-P. stutzeri) y C. antarctica B (CLeA CaIB) y CLEA Alcalase, T. lanuginosus lipasa inmovilizada sobre sílice granulada (Lipozyme TL) y C. antárctica. Se descubrió que la lipasa inmovilizada en resina acrílica (Novozyme 435) lograba altos rendimientos de estólidos, cuando se incubaba con los mismos hidroxiácidos grasos a 75 °C durante 24 horas en tolueno. El principal producto obtenido fue el monoestólido. Mientras que se obtuvieron estólidos más largos con todas las enzimas y 16-HHDA que contenían un grupo hidroxilo primario, las enzimas inmovilizadas produjeron solo el monoestólido de 12-HSA y ácido ricinoleico con la excepción de CLEA- P.

lipasa de stutzeri que produjo una mezcla de poliestólidos hasta heptámeros para 12-HSA y decámeros para ácido ricinoleico.

Se ha descubierto que los estólidos son detectables en cultivos sumergidos de Pseudomonas aeruginosa 42A2 cuando se cultiva con ácido oleico o cuando el ácido oleico se incuba con lipasa parcialmente purificada obtenida del mismo Pseudomonas durante 72 horas a 30 °C en un medio tampón Tris que contiene desoxicolato de sodio y CaCh en 9.2. Sin embargo, la formación de estólidos por tales cultivos Pseudomonas se han relacionado únicamente con la biotransformación del ácido oleico en dos derivados de hidroxiácidos grasos insaturados trans mediante un mecanismo de reacción no relacionado con el oleato hidratasa (Peláez et al. (2003) JAOCS 80, 859-866; Guerrero et al. (1997) Biochem. Biophys. Acta 1347, 75-81; Martinez et al. (2010) J. Biol. Chem. 285, 9339-9345; Martin-Arjol et al. (2013) Ibíd).

La biotransformación del ácido oleico en ácido 10-hidroxiesteárico se identificó por primera vez en una presunta cepa Pseudomonas, designada como cepa 3266 hace más de medio siglo (Wallen et al. (1962) Arch. Biochem. Biophys.

99, 249-25). Debido a sus propiedades, como buena fluidez a baja temperatura y buena estabilidad oxidativa, el ácido oleico fue posteriormente probado con éxito como sustrato para la hidratación microbiana por una variedad de microorganismos, incluidas otras cepas Pseudomonas sp. y especies de Nocardia (Rhodococcus), Corynebacterium, Sphingobacterium, Micrococcus, Macrococcus, Aspergillus, Candida, Mycobacterium y Schizosaccharomyces. La estereoespecificidad del producto depende del microorganismo. Por ejemplo, se obtuvieron mezclas de enantiómeros utilizando Rhodococcus rodochrous ATCC 12674 y Sphingobacterium, mientras que la 10(R)-HSA ópticamente pura resultó usando Pseudomonas sp. NRRL B-3266 (Ver Hou (2009) New Biotechnology 26, 2-10, Biotechnology for fats and oils: new oxygenated fatty acids').

En 2009, Bevers et al. primer informe de aislamiento y caracterización bioquímica de la oleato hidratasa de la cepa Pseudomonas 3266, reclasificada sobre la base de la información de la secuencia como Elizabethkingia meningoseptica. La secuencia de codificación de la OHasa se clonó (número de acceso de GenBank GQ144652) y se expresó en E. coli como una proteína de cola His de terminal N para investigar la actividad de la OHasa en diferentes tampones de pH. Se observó que el pH óptimo para la actividad estaba alrededor de pH 6; a pH 9 no se observó actividad significativa. También se demostró que la presencia de sal (NaCl) influye en la actividad. Con el método empleado para la producción de OHasa recombinante, se encontró una concentración óptima de NaCl 50 mM en tampón Tris 20 mM (pH 8) a 22 °C. También se observó que la actividad específica de la enzima no cambió significativamente en presencia de alcohol isopropílico al 2.5 % o al 5 %. Sin embargo, disminuyó a concentraciones de isopropilo superiores al 10 % (Bevers et al. (2009) J. Bacteriol. 191, 5010-5012).

Una hidratasa de ácido graso producida recombinantemente de Streptococcus pirogenes notificado en la solicitud internacional publicada en el documento WO2008/119735 (Georg-August-Universitat) fue identificado posteriormente como un homólogo del E. meningoseptica OHasa (Bevers et al. (2009) ibid). En tampón de fosfato de sodio 0.1 M a pH 7.1 que contenía NaCl 0.1 M, a 37 °C se demostró que actúa preferentemente en el enlace doble cis-9 del ácido oleico sino también para poder convertir otros ácidos grasos insaturados con enlace doble cis C9-C10 (ácido palmitoleico, ácido linoleico y ácido a-linolénico) en el hidroxiácido 10 graso correspondiente.

Desde entonces, se han estudiado varias otras oleato hidratasas microbianas como enzimas funcionales recombinantes. Por ejemplo, Kim et al. (2012) Appl. Microbiol. Biotechnol. 95, 929-937 informa de estudios sobre la producción de 10-HSA a partir de ácido oleico e hidrolizado de aceite de oliva utilizando una oleato hidratasa de Lysinibacillus fusiformis expresado en E. coli. Se encontró que las condiciones de reacción óptimas para producir 10-HSA eran tampón acuoso a pH 6.5, 35 °C, etanol al 4 % (v/v). Se demostró que la actividad de hidratación es más alta para el ácido oleico, pero también se mostró actividad frente a una serie de otros ácidos grasos insaturados de longitud C14 a C18 con un enlace doble cis C9-C10: ácido miristoleico (C14), ácido palmitoleico (C16), ácido linoleico (C18), ácido a-linolénico (C18) y ácido Y-linolénico (estructuras mostradas en la Figura 2). Posteriormente se demostró que la misma OHasa actúa también en el enlace doble cis C9-C10 del ácido ricinoleico en condiciones similares (pH 6.5, 30 °C, metanol al 4 % (v/v)) para dar el ácido graso dihidroxiácido 10,12-dihidroxiesteárico (Seo et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2013) 97, 8987-8995).

También se ha reportado la conversión de ácido oleico a 10-HSA usando células completas E. coli recombinante que expresan una OHasa microbiana. Por lo tanto, Joo et al. (2012) J. Biotechnol. 158, 17-23 informa la conversión de ácido oleico a 10-HSA por E. coli recombinante expresando la OHasa de Stenotrophomonas maltophilia a pH 6.5 y 35 °C con Tween 40 al 0.5 % (p/v).

El mismo grupo también ha estudiado el oleato hidratasa de Macrococcus caseolyticus obtenidos por expresión recombinante en E. coli (Joo et al. (2012) Biochemie 94, 907-915). La actividad máxima frente al ácido oleico se observó a pH 6.5 y 25 °C con etanol al 2 % (v/v) y FAD 0.2 mM. Se demostró que la hidratasa es dependiente de FAD; en ausencia de FAD no se observó actividad catalítica. Además de la actividad frente al ácido oleico, también se descubrió que la misma hidratasa convierte el ácido miristoleico en ácido 10-hidroxitetradecanoico y el ácido palmitoleico en ácido 10-hidroxihexadecanoico, respectivamente, sin subproductos. Se observaron dos reacciones cuando se usaron como sustratos ácido linoleico, ácido a-linolénico y ácido Y-linolénico debido a la hidratación adicional en el enlace doble cis-12 disponible para dar un ácido graso dihidroxi. Así, el ácido linoleico dio tanto ácido 10-hidroxi-12(Z)-octadecanoico como ácido 10,13-dihidroxi-octadecanoico. El ácido a-linolénico dio tanto el ácido 10-hidroxi-12(Z),15(Z)-octadecadienoico como el ácido 10,13-dihidroxi-15(Z)-octadecenoico y el ácido Y-linolénico dio ambos, ácido 10-hidroxi-6(Z),12(Z)-octadecadienoico y ácido 10,13-dihidroxi-6(Z)-octadecanoico.

Más recientemente, los inventores de la presente solicitud han informado sobre la demostración de la conversión total de ácido oleico en 10-HSA utilizando oleato hidratasa recombinante de Elizabethkingia meningoseptica producido por E. coli como enzima libre o inmovilizada (presentación de póster en Biotrans 2013). Se reconoce que la OHasa purificada es una enzima muy inestable; con almacenamiento simple en tampón a 4 °C, oleato hidratasa recombinante de E. meningoseptica los inventores han descubierto que pierde aproximadamente el 60 % de su actividad en 7 días. Sin embargo, también se demostró que tanto la estabilidad térmica como la estabilidad con reutilización (estabilidad operativa) pueden mejorar significativamente mediante la inmovilización. De especial interés fue el hallazgo de que, entre varios métodos de inmovilización investigados, el enlace covalente en partículas compuestas de quitosano magnético da como resultado una estabilización particularmente efectiva durante múltiples reutilizaciones con recuperación de enzimas por separación magnética; la enzima unida covalentemente conservó el 75 % de su actividad inicial después de cinco reutilizaciones a 30 °C durante 2 horas por ciclo. Además, la misma OHasa inmovilizada mostró una estabilidad térmica mejorada; retuvo más del 65 % de su actividad original después de la incubación a 50 °C (informado por presentación oral en ProtStab 2014 and Netherlands Chemistry and Catalysis Conference NCCC 2015).

Heo et al. investigó la capacidad de cepa Flavobacterium sp DS5 (NRRL B-14859) para convertir directamente el aceite de oliva y el aceite de soja en ácidos grasos oxigenados como el ácido 10-cetoesteárico y 10-HSA. Se requirió la adición de lipasa al medio de cultivo ya que no se indujo lipasa en las células bacterianas. Sin embargo, no se observó producción de estólidos (Heo et al. (2009) New Biotechnology 26, 105-108).

Por lo tanto, en resumen, anteriormente se ha estudiado mucho la conversión enzimática con respecto a cada paso individual requerido para convertir un triglicérido como la trioleína en uno o más estólidos de ácidos grasos: (i) hidrólisis de triglicéridos por lipasa para producir uno o más ácidos grasos insaturados (ii) hidroxilación de ácido(s) graso(s) insaturado(s) por oleato hidratasa y (iii) esterificación de ácido(s) hidroxigraso(s), de nuevo por acción de lipasa. Sin embargo, no se ha enseñado previamente cómo combinar el uso de una lipasa con la etapa (ii) para permitir la conversión de trioleína o cualquier otro triglicérido que contenga ácido oleico en ácido 10-hidroxiesteárico y ésteres del mismo en un proceso de reacción en un solo recipiente.

Resumen de la invención

Como se indicó anteriormente, ahora se ha encontrado que, al llevar a cabo la etapa de esterificación mencionado anteriormente con una lipasa en una solución acuosa tamponada, es posible integrar esta etapa con la acción de una oleato hidratasa sobre un ácido graso insaturado y la hidrólisis de la lipasa de triglicérido para proporcionar ese sustrato de ácido graso en un solo medio de reacción con conversión alta o total de triglicérido y de hidroxiácido graso en éster. Esto significa llevar a cabo la etapa de esterificación de la lipasa en condiciones muy diferentes a las sugeridas actualmente como preferibles para dicha esterificación, como el uso de una lipasa inmovilizada en un medio de reacción apolar.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un método de un solo recipiente para producir uno o más ésteres de uno o más hidroxiácidos grasos que comprende (a) proporcionar un ácido graso insaturado con un enlace doble cis C9-C10 en una reacción tamponada acuosa medio; (b) hacer reaccionar dicho ácido graso insaturado con una oleato hidratasa aislada en el medio de reacción acuoso tamponado para producir al menos un ácido hidroxigraso y (c) esterificación de dicho al menos un ácido hidroxigraso mediante una lipasa en el medio de reacción tamponado acuoso.

Se entenderá que dicho protocolo no excluye un aumento de la temperatura y/o variación del pH después de un período de actividad de la oleato hidratasa en el mismo medio de reacción y por lo que el uso de la lipasa puede ocurrir en condiciones que no son óptimas o incluso favorables para la actividad de la oleato hidratasa. Cuando se proporcionan juntas una oleato hidratasa y una lipasa en el mismo medio de reacción acuoso, entonces puede preferirse no variar la temperatura o el pH sino proporcionar condiciones acuosas constantes para que ambas actividades de la OHasa produzcan dicho al menos un hidroxi-FA in situ y esterificación por la lipasa como se ilustra en la ejemplificación (véanse los Ejemplos 1 a 4).

Ventajosamente, el medio de reacción se puede complementar adicionalmente con un triglicérido que se hidroliza con la misma lipasa que se usa para la reacción de esterificación. Esto proporciona en el medio de reacción el sustrato de ácido graso para la OHasa y, por lo tanto, permite un proceso enzimático de un solo paso para obtener uno o más estólidos de ácido graso directamente del triglicérido sin necesidad de ninguna etapa de separación.

El producto estólido puede verse afectado por las condiciones de reacción. Por lo tanto, mientras que todos las etapas enzimáticos de un método enzimático de un solo recipiente pueden llevarse a cabo a la misma temperatura, como se indicó anteriormente, no se excluye de la consideración un método de dos temperaturas en el que la temperatura se mantiene primero a una temperatura adecuada para la OHasa elegida, por ejemplo, 30-35 °C, y luego se aumenta a una temperatura más alta, por ejemplo, para favorecer la síntesis de oligómeros de estólidos superiores (estólidos más largos que dímeros) con alta conversión. El cambio de pH con la temperatura tampoco está excluido de la consideración para influir en los productos finales, por ejemplo, para permitir la acción de la lipasa a un pH no óptimo para la OHasa elegida. Sin embargo, tal cambio de temperatura y/o pH no es esencial para el concepto inventivo que reside en permitir por primera vez un proceso enzimático en un solo recipiente para convertir triglicéridos en productos de estólidos.

Por ejemplo, como se indicó anteriormente, dicho proceso puede proporcionar uno o más estólidos de ácidos grasos de 10-HSA a partir de trioleína, como se muestra en el esquema que se muestra en la Figura 3. En este caso, el producto comprenderá, consistirá esencialmente en uno o más estólidos de ácidos grasos seleccionados entre el monoestólido de 10-HSA con su ácido graso insaturado original, es decir, el ácido oleico, el monoestólido de 10-HSA consigo mismo, y oligómeros de éster superior de 10-HSA encapsulados o no encapsulados por ácido oleico (ver Figura 4). En algunos casos, es concebible que algún éster cíclico pueda ocurrir como un producto secundario. Sin embargo, la lipasa y las condiciones pueden elegirse de modo que se obtenga(n) estólido(s) de cadena exclusivamente abierta como se ilustra en los ejemplos de este documento.

Un método de la invención como se discutió anteriormente puede comprender además la extracción de uno o más productos de éster, por ejemplo, un estólido de ácido graso, del medio de reacción o tal extracción y posterior purificación y/o incorporación en una composición. Se pueden hacer reaccionar uno o más productos de éster de la esterificación de lipasa para obtener un producto adicional antes o después de la extracción o después de la extracción y posterior purificación.

Breve descripción de las figuras.

La invención se describirá más detalladamente a continuación con referencia a las siguientes figuras:

Figura 1: la reacción de hidratación del ácido oleico catalizada por el oleato hidratasa para producir 10-HSA.

Figura 2: las estructuras de ejemplos de ácidos grasos C14-C18 insaturados con un enlace doble cis entre C9 y C10 que se sabe que son sustratos para oleato hidratasas microbianas; ácidos grasos monoinsaturados: ácido miristioleico (C14; ácido 9-cis- tetradecanoico), ácido palmitoleico (C16; ácido 9-cis- hexadecanoico), ácido oleico (C18; ácido 9-cis- octadecanoico); ácidos grasos di- o tri- cis insaturados: ácido linoleico (C18; ácido cis-9,12-octadecanoico), ácido a-linolénico (C18; ácido (9Z,12Z,15Z)-octadecatrienoico) y ácido Y-linolénico (C18; ácido (6Z, 9Z, 12Z)-octadecatrienoico); el ácido ricinoleico de ácido graso hidroxilado (C18; ácido 12(R)-hidroxi-9(Z)-octadecanoico).

Figura 3: Esquema para la conversión de trioleína en uno o más estólidos de ácidos grasos mediante un proceso enzimático de un solo recipiente de la invención. Las condiciones de reacción que se muestran corresponden a las condiciones de reacción ilustradas por los ejemplos, pero pueden variar siempre que tanto la OHasa como la lipasa permanezcan activas.

Figura 4: Formación de estólida en un proceso de un recipiente de la invención donde los monómeros disponibles para la esterificación de lipasa son ácido oleico y 10-HSA

Figura 5: análisis espectral MALDI-TOF-MS de los productos éster obtenidos mediante la realización de un proceso enzimático de un recipiente de la invención partiendo de trioleína; (traza superior) la matriz; (traza central) los productos de éster extraídos con disolvente obtenidos mediante el proceso del Ejemplo 1; (traza inferior) los productos de éster extraídos con disolvente obtenidos mediante el proceso del Ejemplo 2.

Figura 6: Análisis espectral MALDI-TOF-MS de los productos éster obtenidos al realizar un proceso enzimático de un recipiente de la invención partiendo de trioleína con 2 mg/ml de oleato hidratasa y Candida rugosa lipasa en las siguientes concentraciones: (A) 2 mg/ml; (B) 0.2 mg/ml; (C) 0.04 mg/ml (Ejemplo 3).

Figura 7: Espectros MALDI-TOF-MS de estólidos obtenidos a partir de 10-HSA con lipasa de P. fluorescente en fase acuosa a 60 °C y pH 4, pH 6.5 y pH 8, respectivamente.

Figura 8: Diagrama de la formación de partículas compuestas de quitosano magnético para la inmovilización después de la activación con glutaraldehído de OHasa recombinante con una cola His de terminal N.

Figura 9: Perfiles de pH de OHasa nativa e inmovilizada covalentemente (ver Ejemplo 8): ▲ OHasa nativa; ♦ OHasa-CHT-GL; • OHasa-CMP; ■ OHasa-AMP-CHT

Figura 10: Estabilidad térmica de OHasa nativa e inmovilizada (ver Ejemplo 8): ▲ OHasa nativa; ♦ OHasa-CHT-GL;

• OHasa-CMP; ■ OHasa-AMP-CHT

Figura 11: Variación de actividad de OHasa inmovilizada sobre partículas compuestas de quitosano magnético con múltiples reutilizaciones a 30 °C durante 2 horas por ciclo con recuperación de enzimas por separación magnética.

Descripción detallada de la invención

Como se indicó anteriormente, la invención permite la formación de estólidos de ácidos grasos en un ambiente acuoso, a baja temperatura y presión ambiental sin necesidad de separación y purificación de productos intermedios. Permite la integración de tres reacciones consecutivas catalizadas por solo dos enzimas en un solo medio de reacción para derivar estólidos de ésteres grasos a partir de triglicéridos que se sabe que forman un alto porcentaje del contenido de lípidos de los aceites vegetales naturales. Por lo tanto, permite la producción de compuestos de alto valor a partir de materia prima de base biológica con alta eficiencia y bajo coste de energía.

Condiciones de reacción

Como se indicó anteriormente, las condiciones de reacción pueden elegirse para que sean totalmente compatibles con la actividad de una oleato hidratasa para convertir un sustrato de ácido graso insaturado en el ácido graso hidroxi correspondiente en el mismo medio acuoso. En este caso, generalmente el medio de reacción comprenderá una solución tamponada acuosa a un pH de aproximadamente 8.0, o a u n p H de 6-8 o a un pH de 6 a 6.5. El pH óptimo estará influenciado por la OHasa elegida y si está inmovilizada o no. En algunos casos, la OHasa puede mostrar dos valores máximos de actividad distintos a un pH de aproximadamente 6-6.5 y aproximadamente 8.0; en otros, la OHasa puede exhibir una única actividad óptima a aproximadamente pH 8.0 o aproximadamente a pH 6-6.5 (ver Ejemplo 7). Por ejemplo, el medio de reacción puede comprender preferiblemente una solución tampón acuosa simple a un pH de aproximadamente 6.5, por ejemplo, un tampón de fosfato simple a pH 6.5. Sin embargo, en algunos casos, se puede elegir para permitir la operación de la lipasa a un pH diferente después de un período de operación de la OHasa. Esto generalmente estará dentro del rango de aproximadamente pH 4 a 8, por ejemplo, después de un período de operación de la OHasa, por ejemplo, 24 horas, el pH puede reducirse a aproximadamente pH 6.5 o menos, por ejemplo, aproximadamente pH 4, para influir en los productos derivados de los hidroxilo-FA(s) producidos in situ por actividad OHasa.

El medio puede contener preferiblemente NaCl para mejorar la actividad de la OHasa, por ejemplo, a una concentración de hasta aproximadamente 150-200 mM, por ejemplo, aproximadamente 150 mM o aproximadamente 40 a 150 mM, aproximadamente 40 a 100 mM, aproximadamente 40 a 60 mM o aproximadamente 50 mM. La concentración óptima puede variar de nuevo con la naturaleza precisa de la OHasa empleada. Con la OHasa recombinante purificada de E. meningoseptica empleado para la ejemplificación de este documento, se encontró que NaCl a 150 mM era favorable (ver Ejemplo 1).

Como se indicó anteriormente, se puede elegir una temperatura que sea consistente tanto con la actividad de la OHasa como con la función de la lipasa para la esterificación e hidrólisis del triglicérido. Así, una única temperatura de reacción elegida puede estar entre aproximadamente 10 y 50 °C, preferiblemente entre aproximadamente 20 y 40 °C. Por lo tanto, la temperatura elegida puede ser generalmente de aproximadamente 30 a 37 ° C o de aproximadamente 30 a 35 °C. Puede elegirse una temperatura de aproximadamente 30 °C. Así, por ejemplo, puede emplearse convenientemente un medio acuoso con un pH de aproximadamente 6-8 y aproximadamente 20-40 °C, por ejemplo, a aproximadamente pH 6.5 y aproximadamente 30 °C, como se ilustra en la ejemplificación. Sin embargo, si se utilizan enzimas con una alta estabilidad térmica, pueden ser posibles temperaturas de reacción superiores a 50 °C, por ejemplo, una temperatura de 60 °C o incluso 75 °C. Cuando se usan enzimas con diferente estabilidad térmica, es decir, una oleato hidratasa con menor estabilidad térmica que la de la lipasa, se puede usar un aumento gradual de la temperatura, es decir, comenzando a una temperatura más baja adecuada para la actividad de la OHasa, por ejemplo, 30 °C durante un período de, por ejemplo, 24 horas, seguido de un aumento de la temperatura, por ejemplo, a 60 °C durante un período de, por ejemplo, otras 24 horas.

El medio de reacción se puede complementar adicionalmente con uno o más aditivos, por ejemplo, para ayudar a la actividad de la oleato hidratasa en el medio de reacción, por ejemplo, FAD para una OHasa dependiente de FAD, como la OHasa de Macrococcus caseolyticus. Se puede añadir una pequeña cantidad de un disolvente orgánico, generalmente inferior al 4-5 % v/v, para aumentar la solubilidad del hidroxi-FA, por ejemplo, 10-HSA. El disolvente no debe inhibir las enzimas y debe ser miscible con los sustratos (por ejemplo, trioleína y ácido oleico) y los productos.

Se pueden incluir uno o más monómeros en el medio de reacción para la esterificación que complementan al menos un hidroxi-FA derivado de un sustrato de oleato hidratasa y cualquier sustrato que permanezca en el medio de reacción. Dichos monómeros adicionales pueden ser, por ejemplo, monómeros de ácidos no grasos capaces de esterificarse por la lipasa al grupo hidroxi de un hidroxi-FA. Pueden ser un monómero de ácido graso. Se pueden añadir uno o más ácidos grasos saturados para limitar la formación de estólidos a partir de monómero(s) de hidroxi-FA. Sin embargo, comúnmente los monómeros disponibles para la etapa de esterificación de la lipasa estarán restringidos a los productos hidroxi-FA de la actividad de la oleato hidratasa y los ácido(s) graso(s) insaturado(s) cis-9 originales, por ejemplo, 10-HSA y ácido oleico, ácido 10-hidroxihexadecanoico (10-HHDA) y ácido palmitoleico y ácido 10-hidroxi-12-undecenoico (10-HUDA) y ácido linoleico.

Cuando se añade un triglicérido al medio de reacción acuoso para la hidrólisis de la lipasa, es deseable que las dos fases líquidas se mezclen completamente para formar una emulsión. Esto se puede lograr hilando, por ejemplo, a aproximadamente 1000 rpm, para ayudar a la dispersión de la fase oleosa de triglicéridos en el medio de reacción acuoso.

La reacción se puede detener mediante la adición de ácido y el (los) producto(s) de éster de ácido graso se puede(n) extraer usando un disolvente orgánico, por ejemplo, diclorometano. Los productos así extraídos pueden analizarse mediante MALDI-TOF-MS. De esta forma, la reacción puede controlarse y las enzimas y/o las condiciones y/o el tiempo de reacción pueden variar para influir en el (los) producto(s) de éster. Se apreciará que el proceso de la invención es muy versátil y que los compuestos de partida y las condiciones se pueden variar para dirigir el proceso hacia la obtención de una amplia gama de productos de éster deseados.

El(los) producto(s) de éster

El producto o productos de la etapa de esterificación de la lipasa estarán restringidos por los monómeros disponibles para la esterificación. En general, los ésteres serán uno o más estólidos de ácidos grasos que consisten únicamente en monómeros de ácidos grasos. Por lo tanto, como se señaló anteriormente, cuando se proporciona un mono-hidroxi-FA original, por ejemplo, 10-HSA in situ por la acción de una oleato hidratasa, se puede obtener cualquiera de los siguientes estólidos de ácidos grasos: el monoestólido del hidroxi-FA con su ácido graso insaturado original, el monoestólido del hidroxi-FA consigo mismo y los oligómeros de éster superior del hidroxi -FA encapsulados o no encapsulados por el ácido graso insaturado original.

La hidroxilación química de ácidos grasos insaturados es difícil y con frecuencia se obtienen derivados dihidroxilados. Al llevar a cabo un proceso de la invención, se puede asegurar de manera deseable que se generen únicamente uno o más ácidos grasos monohidroxilados in situ para esterificación. Esto simplificará los posibles productos de éster. Por lo tanto, en una realización preferida de la invención en la que solo se proporcionan uno o más ácidos grasos monohidroxilados en el medio de reacción para la esterificación de la lipasa, los posibles productos de estólidos grasos pueden restringirse a uno o más estólidos de ácidos grasos seleccionados de un monoestólido de un hidroxi-FA con un ácido graso insaturado, por ejemplo, su ácido graso insaturado cis-9 original, un monoestólido de un hidroxi-FA consigo mismo o con otro hidroxi-FA, y oligómeros de ésteres superiores formados a partir de uno o más hidroxi-FA encapsulados o no encapsulados por un ácido graso insaturado no hidroxi.

Por tanto, si se proporciona trioleína como único triglicérido de partida para un proceso de la invención, únicamente se proporcionará ácido oleico mediante hidrólisis de la trioleína por lipasa como sustrato para el oleato hidratasa. A su vez, el oleato hidratasa generará únicamente 10-HSA. Como se señaló anteriormente, esto restringe los posibles productos de estólidos de cadena abierta al monoestólido de 10-HSA con ácido oleico, el monoestólido de 10-HSA consigo mismo y los oligómeros de éster superior de 10-HSA encapsulados o no encapsulados por ácido oleico. Cuando se proporciona un solo mono-10 hidroxi FA para la esterificación, la lipasa y las condiciones pueden elegirse para limitar el producto de estólido única o esencialmente únicamente al producto de monoestólido.

Por lo tanto, la distribución del producto puede verse afectada por la cinética de cada reacción y factores que incluyen la elección de la lipasa y la proporción de lipasa a OHasa. Por ejemplo, puede disponerse que el único, o esencialmente el único, producto de éster generado sea monoestólido de un ácido graso insaturado proporcionado como sustrato para la OHasa y el mono-hidroxi-FA resultante de la acción de la OHasa sobre ese sustrato, por ejemplo, el monoestólido de ácido oleico con 10-HSA (ver Ejemplo 1 usando la lipasa de Candida rugosa y figura 4). Alternativamente, un proceso de la invención con el mismo triglicérido de partida puede proporcionar única o esencialmente dos monoestólidos diferentes: el monoestólido de un mono-hidroxi-FA consigo mismo, por ejemplo, el dímero de monoestólido formado a partir de dos cadenas 10-HSA, y un monoestólido de ese hidroxi-FA con su ácido graso insaturado cis-9 original (ver Ejemplo 2 que ilustra el uso de la lipasa de una especie Pseudomonas y Figura 4).

Sin embargo, se reconocerá que se puede lograr una variedad de productos de estólido. Por ejemplo, como se ampliará a continuación, se ha encontrado que una amplia gama de lipasas de diferentes fuentes puede catalizar la síntesis de estólidos 10-HSA y la elección de la lipasa y las condiciones precisas de uso de la lipasa pueden influir en la naturaleza de los estólidos alcanzados. Por ejemplo, en un sistema acuoso a pH 6.5 y a 40 °C, la lipasa de P. fluorescens se ha descubierto que sintetiza mono- y di-estólidos de 10-HSA, con una conversión de aproximadamente el 20 %, en 24 horas. Al aumentar la temperatura a 60 °C, se ha encontrado que se pueden obtener poliestólidos de hasta 15 meros y la conversión aumenta al 70 %. Como se indicó anteriormente, se contempla que dicha formación de estólido podría combinarse con el uso de una OHasa a temperatura más baja, por ejemplo, a 30-35 °C, para favorecer la producción de 10-HSA a partir de ácido oleico seguido de un aumento de temperatura a 60 °C para la esterificación. Sin embargo, como alternativa, con una OHasa de mayor termoestabilidad (debido a la inmovilización y/o fuente microbiana) se pueden lograr poliestólidos superiores a los dímeros a partir de un ácido graso insaturado cis-9 en un proceso a temperatura constante de acuerdo con la invención, por ejemplo, operación a 50-60 °C.

Elección de lipasa

Puede emplearse cualquier lipasa que actúe en el grupo -OH secundario de 10-HSA para formar un enlace éster. Tal lipasa puede seleccionarse de las muchas lipasas que previamente se ha demostrado que actúan en los grupos -OH secundarios de los hidroxi-FA de origen natural tales como el ácido ricinoleico y el ácido lesquerólico. Deseablemente, la lipasa puede ser una lipasa microbiana; puede ser una lipasa recombinante.

Basándose en estudios previos de lipasas para la esterificación de hidroxi-FA, generalmente la lipasa elegida será una lipasa no específica de posición 1,3 con respecto a la hidrólisis de triglicéridos. Puede ser una lipasa no específica sin especificidad posicional con respecto a la hidrólisis de triglicéridos. A modo de ejemplo, se pueden emplear lipasas no específicas de las siguientes especies de hongos y bacterias: especies Candida, por ejemplo Candida rugosa, Candida antarctica, Candida lipolytica, especies Chromobacterium, por ejemplo Chromobacterium viscosum, especies Geotrichum, por ejemplo Geotrichum candidum, especies Pseudomonas, por ejemplo Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas stutzeri, especies Alcaligenes, especies Termomices, por ejemplo Thermomyces lanuginosus; Thermoanaerobium brockii, Aspergillus oryzae, Rhizopus arrhizus y Mucor javanicus. Por ejemplo, las lipasas de C. rugosa, P. fluorescens y P. stutzeri los inventores han demostrado que son adecuados, están disponibles comercialmente y, por lo tanto, pueden usarse convenientemente.

La síntesis de estólidos también se puede realizar con lipasas inmovilizadas que se pueden eliminar fácilmente de la mezcla de reacción y reutilizar para varios ciclos de reacción. Son útiles las lipasas inmovilizadas usando diferentes métodos de inmovilización tales como adsorción, unión iónica, afinidad, interacción hidrófoba, unión covalente, encapsulación en membrana, atrapamiento en gel y entrecruzamiento. Dichas lipasas se conocen en la técnica y, de nuevo, están disponibles comercialmente como se indicó anteriormente.

Como se indicó anteriormente, se reconoce que la elección de la lipasa será un factor que puede influir en la distribución del producto. Por ejemplo, la lipasa de Candida rugosa puede emplearse cuando se desee favorecer la producción de monoestólido entre un hidroxi-FA, obtenido u obtenible por acción de una oleato hidratasa, y su FA insaturado original (véase el Ejemplo 1).

Elección de oleato hidratasa

Cuando se emplea una oleato hidratasa para producir un hidroxi-FA in situ en el medio de reacción será preferentemente una oleato hidratasa recombinante. Como se indicó anteriormente, las secuencias codificantes de una serie de enzimas microbianas de oleato hidratasa se han clonado previamente y pueden identificarse fácilmente. Por ejemplo, se puede preferir usar oleato hidratasa producida recombinantemente de Elizabethkingia meningoseptica. Como se señaló anteriormente, la secuencia de codificación de esa OHasa se ha depositado previamente en GenBank y puede expresarse fácilmente en E. coli, por ejemplo, con una cola de His para ayudar a la purificación.

Uso de OHasa inmovilizada

Como se indicó anteriormente, se reconoce que la OHasa recombinante purificada tiene baja estabilidad incluso a temperatura ambiente, lo que limita su reutilización en aplicaciones comerciales. La inmovilización de la enzima puede provocar la pérdida de actividad, pero, no obstante, puede preferirse para ganar estabilidad térmica y una fácil eliminación de la mezcla de reacción con el reciclado. Si bien se pueden contemplar varios métodos para la inmovilización, los estudios de los inventores mencionados anteriormente y ahora informados con más detalle aquí (ver Ejemplo 7) proporcionan la base para un interés particular en la OHasa recombinante unida covalentemente a partículas magnéticas recubiertas de quitosano. Tales partículas compuestas en las que partículas magnéticas de óxido de hierro más pequeñas, por ejemplo, de aproximadamente 1 pm de diámetro, se dispersan en una matriz de quitosano y se pueden preparar convenientemente utilizando partículas magnéticas disponibles en el mercado, como partículas magnéticas de óxido de hierro terminadas en amino (ver Figura 8). Para este propósito, las partículas magnéticas terminadas en amino en agua (por ejemplo, a 50 mg/ml) pueden dispersarse en una solución de quitosano acidificada, por ejemplo, quitosano al 2 % (p/v) en ácido acético al 2 %, por ejemplo, en una solución de quitosano: proporción de partículas magnéticas húmedas de aproximadamente 5:1 (p/p). Para la inmovilización de OHasa recombinante con una cola His de terminal N, las partículas de quitosana magnéticas compuestas pueden activarse para el enlace covalente de la OHasa usando glutaraldehído.

OHasa recombinante de E. meningoseptica inmovilizados de esta manera mostraron una actividad de recuperación adecuada (superior a la lograda con otros métodos de inmovilización de enzimas reconocidos; consulte la Tabla 4 en el Ejemplo 7) y, lo que es más importante, como se señaló anteriormente, mostraron una mejora muy efectiva de la estabilidad operativa: la enzima unida covalentemente conservó el 75 % de la inicial actividad después de cinco reutilizaciones a 30 °C durante 2 horas por ciclo (ver Tabla 2 en el Ejemplo 7 y Figura 11). Esto fue acompañado por una estabilidad térmica mejorada. Tal OHasa inmovilizada puede recuperarse fácilmente de un medio de reacción mediante separación magnética y, por lo tanto, ahora se contempla como favorable para usar en la realización de métodos de la invención con reciclaje de la OHasa a nuevas mezclas de partida para operación por lotes.

Provisión de sustrato de ácido graso para una OHasa

Para un proceso de la invención, el sustrato de ácido graso para una oleato hidratasa se puede agregar al medio de reacción como uno o más ácidos grasos insaturados cis, por ejemplo, como uno o más ácidos grasos insaturados cis-9 insaturados purificados o un hidrolizado detriglicéridos. Sin embargo, como se indicó anteriormente, se generará un sustrato de ácido graso más deseable para una OHasa in situ en el medio de reacción por hidrólisis de triglicéridos por la misma lipasa que se proporcionó para la etapa de esterificación.

Por lo tanto, como una realización preferida, la presente invención proporciona un método enzimático de un solo recipiente para producir uno o más ésteres de uno o más ácidos grasos hidroxilados en el que al menos uno de dichos ácidos grasos hidroxilados es un ácido graso hidroxilado que se puede obtener por la acción de una oleato hidratasa sobre un sustrato de ácido graso insaturado, dicho método comprende el uso de una oleato hidratasa y una lipasa en un solo medio de reacción acuoso tamponado para llevar a cabo las siguientes etapas sin ninguna etapa de separación:

(i) hidrólisis de uno o más triglicéridos, por ejemplo, trioleína, por la lipasa para generar uno o más ácidos grasos insaturados con un enlace doble C9-C10 como sustrato para dicha oleato hidratasa;

(ii) conversión de dichos uno o más ácidos grasos insaturados en uno o más hidroxiácidos grasos mediante dicha oleato hidratasa; y

(iii) conversión de dichos uno o más hidroxiácidos grasos por la misma lipasa en uno o más ésteres.

Como se indicó anteriormente, la mezcla de reacción generalmente se centrifugará para ayudar a la dispersión del triglicérido. Dado que los ácidos grasos insaturados, por ejemplo, el ácido oleico, producido por la hidrólisis de la lipasa, se convierte inmediatamente en el mismo medio de reacción en hidroxi-FA, lo que favorece la conversión total de los triglicéridos.

En ausencia de monómeros adicionales en el medio de reacción capaces de formar enlaces éster con los hidroxi-FA producidos in situ por la OHasa, los productos de éster serán exclusivamente uno o más estólidos de éster graso. En el caso de provisión en el medio de reacción de uno o más mono-10-hidroxi-FA, se apreciará que los posibles estólidos son cualquiera de un monoestólido de un hidroxi-FA con un ácido graso insaturado, por ejemplo, su ácido graso insaturado original, un monoestólido de un hidroxi-FA consigo mismo o con otro hidroxi-FA, y oligómeros de ésteres superiores formados a partir de uno o más hidroxi-FA encapsulados o no encapsulados por un ácido graso insaturado no hidroxi.

El uno o más sustratos de ácidos grasos insaturados proporcionados para el oleato hidratasa pueden ser cualquier sustrato de ácidos grasos insaturados que la hidratasa pueda convertir en un hidroxi-FA. Como se indicó anteriormente, se sabe que dichos sustratos incluyen no solo ácido oleico sino también otros ácidos grasos insaturados con un enlace doble cis entre C9-C10. Por ejemplo, como se indicó anteriormente, dichos sustratos se han identificado como ácidos grasos insaturados C14-C18 con un enlace doble cis-9, que incluyen una serie de tales ácidos grasos de origen natural. Los ácidos grasos insaturados adecuados pueden tener más de un enlace doble cis, por ejemplo, al menos un enlace doble cis-9 y cis-12, en cuyo caso, como se indicó anteriormente, se puede producir un ácido graso dihidroxi con un grupo hidroxi C10 y C13. Los sustratos de ácidos grasos insaturados adecuados pueden tener exclusivamente enlaces dobles cis. Así, los sustratos de ácidos grasos adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de ácido miristoleico, ácido palmitoleico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido a-linolénico y ácido Y-linolénico, todos los cuales se encuentran como componentes de acilo graso de aceites naturales.

La OHasa de E. meningoseptica (EC 4.2.1 53) es estrictamente específico para un enlace doble cis C9-C10. Así, aunque pueden estar presentes otros dobles enlaces, un enlace cis C9-C10 se considera necesario en cualquier sustrato de ácido graso para esa enzima. Por lo tanto, particularmente si la OHasa recombinante de Elizabethkingia meningoseptica se utiliza para un proceso de un recipiente de la invención, se considera que un triglicérido de partida debe contener al menos una cadena de ácido graso con un enlace doble cis en C9-C10.

Como se indicó anteriormente, en general se preferirá proporcionar para la esterificación solo uno o más mono-hidroxi-FA, más preferiblemente un solo 10-hidroxi-FA. Así, como se indicó anteriormente, preferiblemente una OHasa en el medio de reacción puede ponerse en contacto únicamente con ácido oleico como su sustrato de ácido graso y usarse para proporcionar únicamente 10-HSA para la esterificación de lipasa.

El oleato hidratasa y una lipasa pueden, por ejemplo, ponerse en contacto con trioleína, o una trioleína que contenga aceite, en un medio de reacción tamponado acuoso adecuado para la actividad de ambas enzimas, por ejemplo, una solución tampón de fosfato acuosa a pH 6.0-6.5 y 30-35 °C que contiene NaCl 50-150 mM, donde las siguientes etapas ocurren consecutivamente sin ninguna etapa de separación:

(iv) hidrólisis de trioleína para generar ácido oleico;

(v) conversión de ácido oleico a 10-HSA por el oleato hidratasa y

(vi) conversión de 10-HSA en uno o más estólidos por esterificación consigo mismo y/o con ácido oleico,

siendo deseable que la mezcla de reacción se centrifugue continuamente, por ejemplo, a 1000 rpm durante 24-48 horas.

Si bien la trioleína tiene un solo tipo de cadena de acilo graso, se entenderá que los triglicéridos proporcionados en el medio de reacción para la hidrólisis por la lipasa pueden tener un componente de glicerol esterificado a un solo tipo de cadena de acilo graso o más de un tipo de cadena de acilo graso, siendo el único requisito que dicha hidrólisis proporcione al menos un sustrato de ácido graso insaturado para una oleato hidratasa. Se pueden proporcionar uno o más triglicéridos purificados en el medio de reacción, como la trioleína comercialmente disponible. Sin embargo, más deseablemente se pueden proporcionar uno o más triglicéridos como componente de un aceite natural, un producto de desecho oleoso o una preparación que contiene aceite derivada del mismo.

Por ejemplo, para este propósito se puede emplear un aceite vegetal natural. De particular interés para este propósito son los aceites vegetales que comprenden triacilgliceroles que se sabe que contienen un alto porcentaje de un sustrato de ácido graso C18 monoinsaturado para OHasa, por ejemplo, aceite de ricino, aceite de maíz, aceite de soja, aceite de linaza, aceite de colza, aceite de palma y aceite de girasol. Varios aceites vegetales comprenden un alto contenido de ácido oleico que contiene triacilglicerol y, por lo tanto, pueden ser de uso particular cuando se desea proporcionar 10-HSA para la formación de estólidos, por ejemplo, aceite de oliva, aceite de maíz, aceite de linaza, aceite de canola, aceite de girasol, aceite de soja, aceite de maní, aceite de nuez, aceite de macadamia, aceite de semilla de uva y aceite de sésamo. Los siguientes aceites con una cantidad relativamente alta de trioleína/ácido oleico han sido elegidos como fuente inicial de triglicéridos por los inventores: aceite de oliva (55-83 % de ácido oleico), aceite de maíz (20.0-42.2 % de ácido oleico), aceite de linaza (14.0-40 % de ácido oleico), aceite de girasol (14-39.4 % de ácido oleico), aceite de soja (17-30 % de ácido oleico), aceite de cacahuete (52-60 % de ácido oleico) [Harwood et al. The Lipid Handbook con c D-ROM, 3ra edición, CRC Press 2007, páginas 66-67].

Otros aceites naturales de posible interés para la biotransformación de triglicéridos en estólidos de acuerdo con la invención incluyen aceite oiticica y aceite de bogol (un subproducto de la fabricación de pulpa de madera que incluye ácidos resínicos y ácidos grasos que incluyen ácido oleico). Una fuente inicial de triglicéridos, como un aceite natural o un producto de desecho aceitoso, puede proporcionar monómeros para la etapa final de esterificación de lipasa además de uno o más hidroxi-FA a través de la hidrólisis de la lipasa y la acción de la OHasa. Sin embargo, para simplificar los productos finales para los estudios iniciales de prueba de concepto, se prefirió el uso de trioleína comercialmente disponible, como se ilustra en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos 1 a 3 concuerdan con el esquema de un recipiente que se muestra en la Figura 3. El ejemplo 4 ilustra el mismo esquema en el que se sustituye la trioleína por un aceite natural que contiene un alto porcentaje del mismo triglicérido.

Ejemplo 1: Síntesis de monoestólido de ácido 10-hidroxiesteárico con ácido oleico en una conversión de trioleína en un solo recipiente utilizando una lipasa de C rugosa y oleato hidratasa de Elizabethkingia meningoseptica

Enzimas

La lipasa de Candida rugosa se obtuvo de Fluka. La actividad hidrolítica de la lipasa se determinó en 0.05 U/mg usando palmitato de p-nitro-fenilo como sustrato. Una unidad hidrolizará un micromol de p-nitrofenol por minuto a partir de palmitato de p-nitrofenol a 37 °C y pH 8.

OHasa recombinante de E. meningoseptica con una cola de His de terminal N se obtuvo mediante el uso de extracto libre de células de E. coli TOP10 que contienen el plásmido pBAD-HISA-OH (Bevers et al. (2009) J. Bacteriol. 191, 5010-5012). Las células recombinantes se cultivaron a 37 °C en medio TB (Terrific Broth) suplementado con 100 |jg ml-1 ampicilina hasta que la OD600 alcanzó el valor 0.6-0.8. La expresión de la enzima recombinante se indujo utilizando arabinosa hasta una concentración final de 0.02 %, seguido de incubación a 30 °C, 180 rpm durante la noche. Las células se recogieron por centrifugación (10.000 rpm, 30 min, 4 °C; Sorvall), se lavaron con Tris-HCl 20 mM pH 8 y se lisaron en el mismo tampón con un disruptor celular a 1.5 kBar (Constant Systems, IUL Instruments). El extracto libre de células se separó de los restos celulares mediante centrifugación (4 °C, 14000 rpm, 30 min) y luego se filtró a través de un filtro de 0.45 jm . La enzima se purificó adicionalmente mediante cromatografía de afinidad con Ni (purificación con cola de His) usando una columna HisTrap-HP (GE Healthcare) y un sistema FPLC equipado con detección UV. El tampón de lavado durante la purificación fue Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM, imidazol 5 mM, pH 8.0 y la elución de la proteína se logró con un gradiente de hasta el 50 % del mismo tampón (Tris/HCl 20 mM, NaCl 50 mM, NaCl 500 imidazol mM, pH 8.0). Las fracciones agrupadas se concentraron y desalinizaron usando un tubo de ultrafiltración Viva spin (límite de 10 kDa; Vivascience) y se concentraron nuevamente hasta aproximadamente 5-15 mg ml-1 en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8.0. Las soluciones madre de la enzima se almacenaron a -20 °C. La purificación se controló mediante SDS - PAGE. el oleato hidratasa se identificó como una banda de proteína de 70 kDa en SDS - PAGE. Esto es consistente con los 646 aminoácidos conocidos de la proteína más la cola de hexahistidina.

La actividad de la OHasa se determinó usando ácido oleico (2 mM) como sustrato en 500 j l de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8, mediante incubación a 30 °C, 1000 rpm durante 2 horas. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 j l de HCl y el sustrato y el producto se recuperaron mediante tres extracciones consecutivas con un volumen de diclorometano. Después de la evaporación del disolvente, los ácidos grasos se derivaron utilizando bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida/trimetilclorosilano (BSTFA) y se analizaron mediante GC-MS. La actividad de OHasa determinada fue de 104.76 U/g de proteína. Una unidad es la cantidad de enzima que convierte un micromol de ácido oleico por minuto, a 30 °C y a pH 8.

Estudios anteriores sobre el efecto de la concentración de NaCl de 0 a 200 mM sobre la actividad de la OHasa confirmaron que el NaCl era importante para la actividad. Se observó actividad a todas las concentraciones de NaCl probadas (50 mM, 100 mM, 150 mM y 200 mM) pero fue óptima a 150 mM de NaCl. Por lo tanto, se empleó NaCl 150 mM en todos los medios de reacción futuros para ejemplificar la invención.

Proceso de reacción

Mezclas de reacción que contienen lipasa de Candida rugosa (10 mg/ml), oleato hidratasa (0.2 mg/ml) y trioleína 10 mM en tampón fosfato 20 mM NaCl 150 mM, pH 6.5 se incubaron a 30 °C, 1000 rpm durante 24 horas. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 j l de HCl 2N y el sustrato y los productos se extrajeron tres veces utilizando un volumen de diclorometano. El solvente se evaporó a 40 °C y el producto se analizó por GC-MS y MALDI-TOF MS.

El análisis MALDI-TOF-MS identificó el monoestólido del ácido 10-hidroxiesteárico con ácido oleico como único producto de la reacción, ilustrado por los picos correspondientes a las masas de aductos moleculares [MK]+, m/z: 603.04 encontrado 603.59 y [M-2K]+, m/z: 641.14 encontrado 641.22 (ver Figura 5; trazo medio). El glicerol fue detectado por GC-MS. Se logró la conversión total de trioleína, así como la conversión total de la 10-HSA obtenida por hidroxilación catalizada por OHasa del ácido oleico liberado.

Como control negativo, se llevó a cabo la misma reacción usando solo lipasa de Candida rugosa (10 mg/ml) y sin oleato hidratasa. El producto de la reacción de control contenía únicamente ácido oleico producido a partir de trioleína por hidrólisis enzimática. El producto no contenía ácido 10-hidroxiesteárico ni el monoestólido de ácido 10-hidroxiesteárico con ácido oleico.

Ejemplo 2: Síntesis de monoestólidos de ácido 10-hidroxiesteárico en una conversión de trioleína en un solo recipiente utilizando una lipasa de P. fluorescens y oleato hidratasa de Elizabethkingia meningoseptica

Enzimas

Lipasa de Pseudomonas fluorescens se obtuvo de Sigma-Aldrich y tenía una actividad catalítica de 0.11 U/mg. Una unidad hidrolizará un micromol de p-nitrofenol por minuto a partir de palmitato de p-nitrofenol, a 37 °C y pH 8.

Se empleó oleato hidratasa recombinante como en el Ejemplo 1.

Proceso de reacción

Mezclas de reacción que contienen lipasa de Pseudomonas fluorescens (5 mg/ml), oleato hidratasa (0.2 mg/ml) y trioleína 10 mM en tampón fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6.5, se incubaron a 30 °C, 1000 rpm durante 48 horas. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 j l de HCl 2N y el sustrato y los productos se extrajeron tres veces utilizando un volumen de diclorometano. El solvente se evaporó a 40 °C y el sustrato extraído y el producto se analizaron por GC-MS y MALDI-TOF MS.

El análisis MALDI-TOF-MS identificó el monoestólido del ácido 10-hidroxiesteárico con ácido oleico ([M-K]+, m/z: 603.04, encontrado 603.31 y[M-2K]+, m/z: 641.14, encontrado 641.49) y el monoestólido de ácido 10-hidroxiesteárico consigo misma ([M-K]+, m/z: 621.04, encontrado 621.54 y [M-2K]+, m/z: 659.14, encontrado 659.56), como productos de reacción (Figura 5; traza inferior). Trazas de trioleína ([M-K]+, m/z: 923.53, encontrado 923.76) y algo de ácido 10-hidroxioleico sin reaccionar ([M-K]+, m/z: 376.68, encontrado 377.22) también fueron identificados.

Como control negativo, se llevó a cabo la misma reacción usando solo lipasa de Pseudomonas fluorescens (5 mg/ml) y sin oleato hidratasa. El producto de la reacción de control contenía solo ácido oleico producido a partir de trioleína por hidrólisis enzimática y una pequeña cantidad de trioleína sin reaccionar. El producto no contenía ácido 10-hidroxiesteárico, monoestólido de ácido 10-hidroxiesteárico con ácido oleico ni monoestólido de ácido 10-hidroxiesteárico consigo mismo.

Ejemplo 3: Biotransformación de trioleína a estólidos a diferentes relaciones lipasa/oleato hidratasa

Las mezclas de reacción que contenían trioleína (14.3 mM, 12.4 mM y 13.2 mM) en tampón de fosfato 20 mM, NaCI 150 mM, pH 6.5, se trataron con oleato hidratasa de Elizabethkingia meningoseptica (2 mg/ml) y varias cantidades de lipasa de Candida rugosa, por ejemplo, 2 mg/ml, 0.2 mg/ml y 0.04 mg/ml. Las mezclas se incubaron a 30 °C, 1000 rpm durante 24 horas. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 50 j l de HCl 2N y el sustrato y los productos se extrajeron tres veces utilizando un volumen de diclorometano. El solvente se evaporó a 40 °C y el sustrato extraído y el producto se analizaron por GC-MS y MALDI-TOF MS. Los resultados se resumen en la Tabla 1 y la Figura 6. Como se ve en la Tabla 1, la relación entre la actividad de la lipasa y la actividad de la oleato hidratasa utilizada tiene un gran efecto sobre la conversión global de trioleína y el rendimiento de estólido. No se formó estólido con una relación lipasa/oleato hidratasa muy baja, aunque el 58 % del ácido oleico producido a partir de trioleína por hidrólisis se convirtió en 10-HSA.

Tabla 1. Resultados de la conversión de trioleínas a diferentes relaciones entre lipasa de C. rugosa y oleato hidratasa de E. meningoseptica (2 mg/ml)

Ejemplo 4: Biotransformación de aceite de oliva a estólidos en una conversión en un solo recipiente utilizando una lipasa de C. rugosa y oleato hidratasa de Elizabethkingia meningoseptica

Las mezclas de reacción que contenían 21.4 mg/ml de aceite de oliva que constaba de aproximadamente un 84 % de trioleína en tampón de fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6.5, se trataron con oleato hidratasa de Elizabethkingia meningoseptica (2 mg/ml) y lipasa de Candida rugosa (2 mg/ml). La mezcla se incubó a 30 °C, 1000 rpm durante 24 horas. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 j l de HCl 2N y el sustrato y los productos se extrajeron tres veces utilizando un volumen de diclorometano. El solvente se evaporó a 40 °C y el sustrato extraído y el producto se analizaron por GC-MS y MALDI-TOF MS.

Se obtuvo una alta conversión del componente trioleína del aceite de oliva. El ácido oleico y la 10-HSA se determinaron mediante análisis GC en una relación molar de 40:60, mostrando una alta conversión de ácido oleico bajo la acción de la oleato hidratasa. La formación del monoestólido de 10-HSA cubierta con ácido oleico se identificó en los espectros MALDI-TOF-MS. No se encontraron productos de las reacciones (es decir, 10-HSA y estólidos) mediante análisis GC y MALDI-TOF-MS de reacciones de control sin enzimas.

Como se indicó anteriormente, el aceite de oliva puede ser sustituido en el protocolo por otros aceites con una alta cantidad de trioleína/ácido oleico, incluidos el aceite de girasol, el aceite de soja, el aceite de maní, el aceite de linaza y el aceite de maíz.

Ejemplo 5: Formación de lipasa de ésteres de 10-HSA

a) Detección de lipasas para la síntesis de estólidos

Enzimas:

Se seleccionaron las siguientes lipasas: Amano lipasa de Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens; 0.11 U/mg), Pseudomonas cepacia (P. cepacia; 0.37 U/mg), Thermomyces lanuginosus (T. lanuginosus; 1.09 U/mg), y CLEA Alcalase se adquirieron de Sigma Aldrich. Las lipasas de C. rugosa (0.05 U/mg), Aspergillus oryzae (A. oryzae; 1.30 U/mg), Candida antarctica A (C. antarctica A; 0.02 U/mg), Rhizopus arrhizus (R. arrhizus; 0.01 U/mg), Penicillium roqueforti (P. roqueforti; 0.01 U/mg), Mucor javanicus (M. javanicus; 0.16 U/mg), Candida lipolytica (C. lipolytica; 2.59 U/mg), Thermanaerobium brockii (T. brockii; 1.31 U/mg) se obtuvieron de Fluka. Novozyme 435, Lipozyme tL, Candida antarctica B (C. antarctica B) la lipasa se adquirió de Novozymes. Las lipasas de Alcaligenes sp (lipasa TL; 3.86 U/mg), Pseudomonas stutzeri (P. stutzeri; 1.21 U/mg) (lipasa TL), eran productos de Meito Sangyo Co. Ltd, Japón. El CLEA de C. antarctica B y P. stutzeri fueron adquiridos de CLEA Technologies. Una unidad hidrolizará un micromol de pnitrofenol por minuto a partir de palmitato de p-nitrofenol, a 37 °C y pH 8.

Proceso:

Las reacciones se realizaron añadiendo lipasas nativas e inmovilizadas, 50 U/mmol de sustrato, a una solución 1 mM de ácido 10-hidroesteárico llevada a un volumen final de 1 ml en tolueno, a 60 °C a 350 rpm durante 24 h. Al final de la reacción, la enzima se eliminó por centrifugación (13.000 rpm, 3 min) y la mezcla de reacción se analizó por GC-MS y MALDI-TOF MS.

El producto de reacción se derivó con BSTFA+TMCS (99:1), en una proporción de reactivo:muestra de 2:1 (p/p), durante 1 h a 95 °C, y se analizó mediante GC-MS, utilizando hexadecano como estándar interno. Para el cálculo de las conversiones se determinó la concentración de cada sustrato a partir de una curva de calibración en el rango de 0.05 mM a 3 mM, utilizando hexadecano como patrón interno. Para el análisis MALDI-TOF MS, las muestras se mezclaron con matriz de trans-2-[3-(4-t-butilfenil)-2-metil-2-propenilideno]malononitrilo (DCTB) y trifluoroacetato de potasio (KTFA) como agente de ionización. Se mezclaron 10 pl de la muestra con 10 pl de solución matriz (40 mg/ml de DCTB solubilizado en THF) y 3 pl de KTFA (5 mg/ml). Se aplicaron aproximadamente 0.3 pl de la mezcla en la placa y se midió en el modo positivo.

Los resultados dados en la Tabla 2 muestran que todas las lipasas probadas, excepto la lipasa de P. cepacia, son capaces de convertir 10-HSA en el correspondiente monoestólido (ME). Lipasas de A. oryzae, C. antarctica A, C. rugosa y P. fluorescens produjo pequeñas cantidades de diéster cíclico (c De ) en cantidades bajas, que van desde 1.2 % (A. oryzae) al 10 % (P. fluorescens). La lipasa de P. stutzeri, tanto libres como inmovilizados, produjeron bajas cantidades de estólidos más largos, por ejemplo, diestólidos (DE) y triéstólidos (TE). La conversión de 10-HSA más alta se obtuvo con enzimas inmovilizadas, muy probablemente debido a la mayor estabilidad.

Tabla 2. Síntesis de estólidos a partir de 10HSA utilizando lipasas libres e inmovilizadas

b) Síntesis de estólidos por conversión catalizada por lipasa de 10-hidroxiestearato en fase acuosa a diferentes temperaturas

Enzimas: Lipasa de Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens; 0.11 U/mg, obtenida de Sigma) y lipasa de Pseudomonas stutzeri (P. stutzeri; 1.21 U/mg, obtenido de Meito Sangyo Co. Ltd, Japón) en estos experimentos. Una unidad hidrolizará un micromol de p-nitrofenol por minuto a partir de palmitato de p-nitrofenol, a 37 °C y pH 8. Reacción: A una suspensión de ácido 10-hidroxiesteárico 15 mM en tampón de fosfato 20 mM a un pH dado, por ejemplo, pH 4, pH 6.5 o pH 8, se añadieron 100 pl de solución de enzima, hasta una concentración de enzima de 50 U/mmol de sustrato. El volumen total de la mezcla de reacción fue de 1 ml. La mezcla de reacción se agitó a 350 rpm durante 24 h. Las reacciones se llevaron a cabo a 40 °C y 60 °C respectivamente. Como control negativo, se llevó a cabo la misma reacción en idénticas condiciones, pero sin la adición de la enzima. Al final de la reacción, la enzima se eliminó por centrifugación (13.000 rpm, 3 min) y la mezcla de reacción se analizó por GC-MS y MALDI-TOF MS.

Las muestras se trataron antes del análisis como se describe en el Ejemplo 5a. La Figura 7 muestra los espectros MALDI-TOF-MS de los productos producidos a valores de pH ácidos. Los espectros MALDI-TOF-MS de las reacciones de control contenían solo la masa correspondiente al sustrato 10-HSA ([M-K]+, m/z: 377.04). Los resultados de la Tabla 3 muestran el aumento de la conversión de 10-HSA en estólidos, así como la formación de estólidos más largos [los estólidos iban desde monoestólidos (es decir, dímeros) hasta E14 (es decir, 15-meros)] al aumentar la temperatura de 40 a 60 °C a valores de pH ácidos, por ejemplo, pH 4 y pH 6.5. Bajas temperaturas, por ejemplo, 40 °C y pH 6.5 son favorables para la producción de monoestólidos de 10-HSA como producto único.

Tabla 3: Conversión de 10-HSA con lipasa de P. fluorescens y P. stutzeri en tampón de diferentes valores de pH, a 40 y 60 °C. ME: monoestólido, DE: diestólido, TE: triestólido; Mw: peso molecular promedio (g/mol), PDI: índice de polidispersidad; PD: grado de polimerización

Ejemplo 6: Hidratación de ácido oleico con oleato hidratasa de E. meningoseptica

El ácido 10-hidroxiesteárico se obtuvo por hidratación de ácido oleico usando oleato hidratasa de E. meningoseptica. Se añadieron 5 ml de extracto libre de células de OHasa expresado en células E. coli TOP10 (48 mg/ml de contenido de proteína total) a una emulsión que contenía ácido oleico al 0.6 % (v/v) en tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8.0 y la mezcla se incubó a 30 °C a 200 rpm durante 12 h. (volumen total 50 ml). La reacción se terminó mediante la adición de 100 |jl de HCl 4 N 4 N (pH final 1-2), y el producto 10-HSAque se separa de la mezcla como un precipitado blanco, se aisló por filtración, se disolvió en acetona y se aisló después de eliminación del disolvente al vacío (475 mg, 1.55 mmol, rendimiento de 10HSAdel 96 %, pureza > 99 %, según lo determinado porGC, GC-MS y RMN).

Ejemplo 7: Aumento de la estabilidad operativa y térmica de la oleato hidratasa por inmovilización

Oleato hidratasa recombinante (OHasa) de Elizabethkingia meningoseptica, expresado en E. coli y se purificó como se describió anteriormente, se inmovilizó mediante diferentes estrategias de inmovilización que incluyen adsorción, reticulación, atrapamiento y enlace covalente. Entre los métodos de inmovilización probados, la unión covalente a partículas compuestas de quitosano magnético fue el más eficiente; se consiguieron rendimientos de inmovilización superiores al 90 % y actividades recuperadas de hasta el 24 % mediante unión covalente sobre tales partículas compuestas. Este es un buen resultado para una enzima tan difícil e inestable. Los biocatalizadores resultantes se caracterizaron con más detalle en términos de estabilidad y reutilización. La estabilidad térmica mejoró después de la inmovilización. La OHasa inmovilizada en partículas compuestas de quitosano magnético retuvo más del 65 % de su actividad original después de la incubación a 50 °C durante 2 horas, mientras que la enzima nativa se inactivó por completo. Es importante destacar que también se encontró sorprendentemente que la inmovilización de la OHasa en partículas compuestas de quitosano magnético resultó en una mejora radical de la estabilidad operativa de la OHasa, ya que la enzima unida covalentemente conservó el 75 % de la actividad inicial después de cinco reutilizaciones. Esto hace que dicha OHasa inmovilizada sea de particular interés para la aplicación comercial de los métodos de un recipiente de la invención.

Como se señaló anteriormente, una preocupación importante para el uso de OHasa aislada con fines industriales ha sido su baja estabilidad, incluso a temperatura ambiente. Como no se conoce un enfoque directo para establecer un buen método de inmovilización para una enzima específica, esto debe determinarse experimentalmente mediante ensayos (Liese & Hilterhaus (2013), Chem. Soc. Rev. 42, 6236-6249).

Métodos de inmovilización

Químicos

Ácido oleico 96 %, quitosano 85 % partículas magnéticas terminadas en amino desacetiladas (AMP), glutaraldehído 50 %, partículas magnéticas terminadas en carboxilo (CMP), isotiocianato de fluoresceína (FITC), Span 80 (oleato de sorbitán), bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida/trimetilclorosilano (BSTFA+TMCS = 99:1) se adquirieron de Sigma Aldrich. Resindion S.R.L. proporcionó gentilmente las Sepabeads EC-EP de grado estándar. (Italia), la resina Ni-NTA Superflow se adquirió de Qiagen, Celite 545 se obtuvo de Merck. Los precursores de silano dimetildimetoxisilano (DMeDMeOS, 96 %), tetraetoxisilano (TEOS, 98 %) se adquirieron de Fluka Chemie GmbH (Buchs, Suiza). Isobutil trimetoxisilano (iButMOS, 97 %) y (3-aminopropil)trimetoxisilano (3-NH2PrTMOS, 97 % se obtuvieron de Sigma Aldrich (Steinheim, Alemania), mientras que tetrametoxisilano (TMOS, 99 %) se obtuvo de Acros Organics (Geel, Bélgica). Ensayo de actividad

Las actividades para la OHasa libre e inmovilizada se determinaron usando ácido oleico (2 mM) como sustrato en 500 |jl de tampón Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8, mediante incubación a 30 °C, 1000 rpm durante 2 horas. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 50 j l de HCl 3N y el sustrato y el producto se recuperaron mediante tres extracciones consecutivas con un volumen de diclorometano. Después de la evaporación del solvente, los ácidos grasos se derivaron usando BSTFA (Hudson et al. (1995) Appl. Microbiol. Biotechnol. 44.1-6) y analizado por GC-MS. La separación se llevó a cabo en Interscience Trace GC Ultra GC+PTV con automuestreador AS3000 II equipado con columna capilar Restek Rxi-5ms de 30 m x 0.25 mm x 0.25 jm , utilizando las siguientes condiciones: temperatura del horno: 100-300 °C con una velocidad de calentamiento de 10 °C min-1, temperatura del inyector de 300 °C, flujo de gas portador (helio) de 1.0 ml min'1. Se utilizó hexadecano como patrón interno. Los espectros de masas se obtuvieron de un detector selectivo de masas de cuadrupolo Interscience Trace DSQ II XL (El, rango de masas 35-500 Dalton, velocidad de muestreo de 150 ms), espectrómetro de masas operado a 70 eV.

La actividad específica se expresó como la cantidad de 10-HSA (jm ol) formada por 1 g de proteína enzimática en 1 min.

La actividad recuperada se definió como la proporción porcentual de la actividad total de la enzima inmovilizada y la actividad total de la enzima nativa utilizada para la inmovilización.

Método de inmovilización 1: absorción

Se mezclaron 20 mg de Celite 545 con 500 j l de solución de OHasa (2.87 mg ml-1) en tampón fosfato 20 mM, pH 8. La mezcla se agitó a 4 ° C durante 48 h. La Celite-OHasa adsorbida se separó por centrifugación y se lavó cinco veces con tampón fosfato 20 mM pH 8 y dos veces con tampón Tris 20 mM. La concentración de proteína se determinó en cada etapa de lavado (excepto los lavados con tampón Tris) mediante el ensayo de Bradford. La Celite-OHasa se almacenó en tampón TRIS 20 mM a 4 °C hasta su uso posterior. La inmovilización en presencia de un emulsionante se realizó por el mismo procedimiento, añadiendo 30 j l de emulsionante (Span 80) en la solución de inmovilización. Método 2: Inmovilización de perlas de agarosa Ni-NTA

Se añadió 1 ml de solución de OHasa (2.5 mg ml-1) en tampón Tris 20 mM pH 8 a 200 j l de resina Ni-NTA Superflow. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 horas, 100 pm. La resina se lavó tres veces con tampón Tris y se almacenó a 4 °C hasta su uso posterior.

Método 3: Unión iónica en quitosano

Se añadieron 500 j l de tampón fosfato 20 mM, pH 6.5, a 25 mg de quitosano y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 3 h, 100 rpm. El quitosano húmedo se separó de la solución tampón por centrifugación a 14.000 rpm durante 10 min, se añadieron 500 j l de solución de OHasa en tampón fosfato 20 mM pH 6.5 (2.5 mg ml-1) y la mezcla se agitó a 4 °C, 100 rpm durante 24 horas. La etapa de lavado se realizó como se describe en el método 1. Unión covalente sobre diferentes soportes.

El análisis de la secuencia de OHasa revela una alta densidad de 50 grupos Lys que pueden participar en la unión covalente con varios soportes activados.

Método 4a: Epoxi-sepabeads

25 °C/4 °C. Se añadieron 900 j l de solución de OHasa (1.15 mg ml-1) en tampón fosfato 50 mM pH 8 a 100 mg de soporte de inmovilización activado con grupos epoxi. La mezcla se incubó durante la noche a 100 rpm, 24 h, a 4 °C y 25 °C, respectivamente. Se realizó un conjunto de experimentos tratando con solución de glicina 3M en tampón de fosfato 20 mM pH 6.5, durante la noche a 4 °C, 100 rpm, para bloquear todos los grupos epoxi libres. Las epoxisepabeads se eliminaron de la mezcla por filtración, se lavaron como se describe para el método 1 y se almacenaron a 4 °C hasta su uso posterior.

Método 4b: 4 °C-tres etapas

La inmovilización de OHasa en tres etapas se realizó como se describió previamente por Mateo et al. (2002) Biotechnol. Prog. 18 629-634 a pH 7 en fosfato de sodio 1 M durante 24 h, seguido de incubación de la enzima inmovilizada a pH 9 en fosfato de sodio 100 mM durante 72 h e hidrofilización de la superficie del soporte mediante incubación del derivado durante 24 h a pH 8.5 en presencia de glicina 3 M.

Partículas magnéticas funcionalizadas (terminadas en amino, terminadas en carboxilo)

Método 5a: Partículas magnéticas terminadas en amino (AMP)

Se activaron tres veces 200 j l de suspensión de AMP, que contenía partículas de óxido de hierro magnético de aproximadamente 1 jm de tamaño, utilizando tampón de acoplamiento (piridina 0.01 M en agua destilada, pH 6, ajustado con HCl 2 N) hasta un volumen final de 1 ml y agitación vigorosa. Se aspiró el sobrenadante y se añadieron 400 j l de solución de glutaraldehído al 5 %. Las partículas se volvieron a suspender y se agitaron suavemente a temperatura ambiente durante 3 horas. Se aspiró el sobrenadante y se lavó la torta húmeda tres veces para eliminar el glutaraldehído sin reaccionar. Se añadieron 300 j l de solución de OHasa (5.74 mg ml-1 en tampón de fosfato 20 mM, pH 8) a las partículas activadas con glutaraldehído y después de la resuspensión de las partículas, la mezcla se agitó suavemente a 4 °C durante 48 horas. A continuación, las partículas se separaron magnéticamente y se resuspendieron en 500 j l de solución de extinción de glicina (1.0 M en agua destilada, pH 8, ajustada con NaOH 2 N), durante 30 min a temperatura ambiente, 100 rpm. Al final se realizó una etapa de lavado tres veces con tampón de lavado (base Tris 0.01 M que contenía NaCl 0.15 M, albúmina de suero bovino al 0.1 % (p/v), sal sódica de EDTA 0.001 M y azida de sodio al 0.1 % (p/v), y tres veces con tampón Tris 20 mM, pH 8. La enzima inmovilizada se almacenó a 4 °C en tampón Tris 20 mM, pH 8.

Método 6: Partículas magnéticas terminadas en carboxilo (CMP)

Se activaron 250 j l de suspensión de CMP 3 veces utilizando tampón de acoplamiento (tampón de fosfato 0.01 M con NaCl 150 mM en agua destilada, pH 5.5, ajustado con HCl 2 N) hasta un volumen final de 0.5 ml y agitando vigorosamente. Las partículas se resuspendieron en 250 j l de tampón de acoplamiento, 100 j l de agente de acoplamiento (1-etil-3(3-dimetilaminopropil) carbodiimida EDCl, -0.6 mg ml-1), 250 j l de solución de OHasa en tampón fosfato (5.74 mg ml-1), y la mezcla se agitó suavemente a 4 °C durante 48 horas. Las condiciones de lavado y almacenamiento fueron las mismas que con AMP (ver arriba).

Método 7: Unión covalente en quitosano preactivado (CHT-GL)

Se añadieron 400 j l de glutaraldehído al 25 % a 25 mg de quitosano en 1.6 ml de tampón fosfato 20 mM, pH 6.5. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 3 h, 100 rpm. El quitosano activado con glutaraldehído se lavó tres veces con 2 ml de tampón fosfato 20 mM pH 7. Se añadieron 500 j l de solución de OHasa (2.5 mg ml'1) y la mezcla se agitó a 4 °C, 100 rpm, durante 24 h. La etapa de lavado se realizó como se describe en el método 1.

Método 8: Unión covalente sobre partículas compuestas de quitosano magnético (AMP-CHT).

Las partículas compuestas de quitosano magnético, en las que las partículas magnéticas terminadas en amino (AMP) como se describe anteriormente se dispersan en una matriz de quitosano (consulte la Figura 8), se prepararon como se describe por Kumar et al. (2013) Biotechnol. Bioprocess Eng. 18, 787-795) con algunas modificaciones. Se añadió solución de quitosano al 2 % (p/v) en ácido acético (2 %) a 187.5 mg de AMP húmedo en una proporción de 5:1 (p/p). La mezcla se agitó vigorosamente y se mantuvo 1 h en un baño de ultrasonidos para una homogeneización completa. Las macropartículas se precipitaron en una solución de hidróxido de sodio 1 M que contenía etanol al 26 % como se describe en otra parte (Biró et al. (2008) J. Biochem. Biophys. Methods 70, 1240-1246), lavado con agua destilada y almacenado a 4 °C hasta su uso posterior. Antes de la inmovilización, las partículas se activaron añadiendo glutaraldehído al 5 % durante 4 horas a 10 °C en tampón fosfato 20 mM de pH 6.5. Se añadieron 250 j l de solución de OHasa (2.5 mg ml-1) a 150 mg de macropartículas húmedas, se completó hasta un volumen total de 1 ml con tampón fosfato 20 mM pH 7 y se mezcló suavemente durante la noche a 10 °C. La enzima inmovilizada se lavó como se describió anteriormente para el método 1 y se almacenó a 4 °C en tampón Tris 20 mM pH 8.

Método 9: Agregados enzimáticos reticulados (CLEA)

Se mezclaron 250 j l de solución de OHasa (2.3 mg ml-1) con 750 j l de solución saturada de sulfato de amonio, ajustada a pH 8 con NaOH. La mezcla se agitó a 500 rpm a 4 °C para 112.5 j l (0.3 %, p/v) de glutaraldehído al 25 % (p/v) se añadió gota a gota en el tubo y la mezcla se agitó a 4 °C, 500 rpm por 3 horas. Los CLEA se eliminaron por centrifugación (14.000 rpm, 30 min), se lavaron tres veces con tampón fosfato 20 mM pH 8 y dos veces con tampón TRIS 20 mM y se almacenaron en el mismo tampón hasta su uso posterior.

Método 10: Atrapamiento de sol-gel

El atrapamiento de sol-gel de OHasa se ha realizado principalmente como el método descrito anteriormente para la subtilisina (Corici et al. (2011) J. Mol. Catalán. B: Enzima. 73, 90-97). En un vial de vidrio de 4 ml de solución de OHasa (195 jl, que contiene 5.87 mgml-1, en tampón Tris 20 mM pH 8), NaF 1 M (25 jl), solución de PEG 20.000 al 4 % (25 j l ) y alcohol isopropílico (50 j l ) se mezclaron (agitación magnética, 600 rpm). Se añadieron 1.5 mmoles de precursores de silano en diferentes relaciones molares y se continuó mezclando a temperatura ambiente hasta que comenzó la gelificación. El gel se mantuvo 24 horas a 4 °C para completar la polimerización y luego el gel en volumen se lavó para eliminar los monómeros y aditivos que no reaccionaron con agua Milli-Q (2.5 ml), alcohol isopropílico (1.25 ml) y n hexano (1.25 ml) y secado a 25 °C por 24 h. La enzima encapsulada en sol-gel se trituró en un mortero y se almacenó a 4 °C hasta su uso posterior.

Influencia del pH en la actividad de la OHasa

El efecto del pH sobre la actividad de la OHasa nativa e inmovilizada se evaluó en el rango de pH 4-9 en 9 etapas, utilizando una amplia gama de soluciones tampón de pH que contenían ácido cítrico, ácido bórico y tampón de fosfato trisódico.

Influencia de la temperatura en la actividad de la OHasa

La incubación de la enzima nativa/inmovilizada se llevó a cabo durante 2 h en ausencia del sustrato a diferentes temperaturas, en el rango de 30-50 °C, seguido de enfriamiento en hielo durante 10 min. Luego se determinó la actividad residual de la enzima.

Reutilización del biocatalizador

La actividad de la OHasa inmovilizada se determinó después del uso repetido del biocatalizador a 30 °C durante 2 horas por ciclo. Después de cada ciclo, la enzima inmovilizada se separó y se lavó con tampón Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8, 3 veces. Se añadieron tampón y sustrato nuevos, se analizó la actividad del biocatalizador reutilizado y se comparó el valor obtenido con la primera serie (definida como 100 %).

Caracterización morfológica de OHasa inmovilizada

La proteína OHasa se marcó con FITC (basado en el kit de etiquetado PIERCE EZ-Label TM FITC). La reacción de acoplamiento de OHasa con FITC se inició añadiendo gota a gota 600 pl de FITC (1 mg ml-1 disueltos en dimetilformamida) a la solución de OHasa (5.87 mg ml-1 en tampón fosfato pH 8). La mezcla se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La OHasa marcada se separó de FITC sin reaccionar mediante varios lavados con tampón de fosfato 20 mM pH 8, utilizando un dispositivo de filtro centrífugo (Centricon PL-30, con un límite de peso molecular nominal de membrana de 30.000 Da). Los espectros UV-VIS se recogieron después de cada etapa de lavado, hasta que la absorbancia a 493 nm (valores característicos de FITC) disminuyó hasta 0.1 unidades de absorbancia. La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de Bradford. La proteína marcada con FITC se inmovilizó según el método descrito para la unión covalente en partículas compuestas de quitosano magnético y las micrografías de fluorescencia se registraron con un Leica True Confocal Scanner (Leica TCS SPE), con una magnitud de punto de 10 veces.

Resultados y discusión

Los resultados se presentan en la Tabla 4 y se analizan en detalle para cada método de inmovilización en esta sección.

Adsorción:

La inmovilización de OHasa en Celite 545, un soporte ligeramente hidrófobo, dio como resultado una baja carga de proteínas y una baja actividad recuperada. (Tabla 4, entrada 1). La falta de actividad podría atribuirse a las regiones hidrófilas en la superficie de la enzima que conducen a la desorción en ambiente acuoso, superando la interacción entre la parte hidrofóbica de la superficie de la enzima y el soporte hidrófobo. De hecho, la mayor parte de la proteína enzimática se recuperó en las etapas de lavado. Al usar Span 80 como aditivo durante el proceso de inmovilización, la carga de proteína aumentó hasta 3 veces, lo que demuestra que la adsorción de la enzima fue más efectiva en presencia de un emulsionante, pero la actividad se mantuvo baja.

Unión iónica:

La unión iónica de la OHasa al quitosano, un polisacárido aminofuncional con un pKa del grupo amino de 6.5, se realizó a este pH (es decir, 6.5) ya que la carga neta de la enzima calculada en base a la secuencia de aminoácidos es de aproximadamente -12.0. El valor de carga de proteína (Tabla 4, entrada 4) superó el 95 %, pero la actividad específica de 11.8 U/g de proteína corresponde a solo el 5.5 % de actividad recuperada.

Afinidad:

Debido a que la OHasa recombinante tenía una etiqueta de His y se usó cromatografía de afinidad de Ni para purificar la enzima con una alta recuperación de proteínas, este método también se estudió como una herramienta de inmovilización. La resina Ni-Superflow condujo a la unión total de la enzima, pero desafortunadamente la enzima inmovilizada mostró una actividad específica muy baja y se recuperó menos del 5 % de la actividad inicial (Tabla 4, entrada 3). Los resultados sugieren que la inmovilización de enzimas de cola de His por afinidad no es universalmente aplicable, aunque el método se ha utilizado con éxito para la inmovilización de PikC hidroxilasa (P450 bacteriana), pnitrobencil esterasa, benzaldehído liasa y peroxidasa de rábano.

Agregados enzimáticos reticulados:

La OHasa CLEA obtenida mostró una alta actividad específica en comparación con la enzima inmovilizada física (Tabla 4, entrada 5), pero la actividad recuperada no superó el 17 %.

Atrapamiento en matrices sol-gel de sílice:

Este enfoque se aplicó previamente para el atrapamiento sol-gel de lipasas designadas para trabajar en solventes orgánicos, así como para la isubtilisina y la nitrilo hidratasa, que exhibieron niveles suficientemente altos. En el presente estudio, la OHasa quedó completamente atrapada en todas las preparaciones sol-gel (Tabla 4, entradas 12 15), pero no mostró actividad catalítica.

Enlace covalente:

Las actividades recuperadas (Tabla 4, entradas 6-11) abarcaron un amplio rango, entre 1.0 % y 23.7 %, incluso si los protocolos de inmovilización se realizaron en condiciones suaves. La unión covalente de epoxi sepabeads se realizó a diferentes temperaturas en uno o tres etapas, para evitar la pérdida de actividad enzimática durante el proceso de inmovilización. Sin embargo, el uso de epoxi-sepabeads como vehículo para la OHasa (Tabla 4, entradas 9 y 10) produjo menos del 5 % de actividad recuperada. La actividad recuperada de la OHasa inmovilizada en epoxi sepabeads fue baja, incluso cuando se usó glicina por primera vez para bloquear una parte de los grupos epoxi reactivos disponibles. Por lo tanto, la caída de la actividad no puede atribuirse únicamente a la unión covalente multipunto.

Los resultados obtenidos cuando se utilizó quitosano como soporte de la OHasa muestran la idoneidad de este soporte natural para acomodar la enzima. Véase actividad específica de 27.2 U/g, (Tabla 4, entrada 8).

Unión covalente de OHasa sobre partículas magnéticas funcionalizadas:

Se obtuvieron actividades recuperadas de hasta el 20 % correspondientes a 42.5 U/g cuando se usaron partículas magnéticas terminadas en carboxilo como soporte, pero ocurrieron algunas dificultades operativas durante la separación magnética de la enzima inmovilizada, debido a la heterogeneidad del sistema de reacción. El producto 10HSA es un sólido blanco y no se pudo evitar la adsorción parcial de este compuesto, así como del sustrato sin reaccionar en la superficie de las partículas magnéticas. Por esta razón, también se estudiaron partículas magnéticas modificadas, recubiertas con unas pocas capas atómicas de polímero químicamente activo para proporcionar grupos funcionales para el enlace. El quitosano se investigó como una capa adecuada para partículas magnéticas sobre la base de los experimentos con quitosano mencionados anteriormente.

Partículas compuestas de quitosano magnético (AMP-CHT):

Usando dichas partículas como soporte y glutaraldehído como conector, se recuperó aproximadamente el 24 % (aproximadamente 51 U/g) de la actividad inicial después de la inmovilización. Como se señaló anteriormente, esto se consideró un buen resultado. La mayor eficiencia de inmovilización en comparación con otros métodos se debe a la disponibilidad de numerosos grupos de lisina cerca de la superficie para la unión covalente. La explicación de la pérdida parcial de actividad en comparación con la enzima nativa podría ser el enlace intramolecular de glutaraldehído entre los residuos de lisina de la enzima, o la posible orientación incorrecta de la enzima en el transportador causada por la presencia de un residuo de Lys cerca de la entrada al sitio activo.

Tabla 4: Rendimiento de inmovilización y actividad recuperada de OHasa inmovilizada por diferentes métodos.

Efecto del pH sobre la actividad catalítica

El efecto del pH sobre la actividad de la enzima nativa e inmovilizada se estudió en el intervalo de pH de 4.0 a 9.0 utilizando las tres preparaciones de OHasa inmovilizadas covalentemente más activas (AMP-CHT, CMP y CHT-GL); consulte la figura 9. Se encontraron dos valores distintos de actividad máxima para la enzima nativa a pH 6.5 y 8.0. El mismo comportamiento se observó utilizando quitosano como soporte de inmovilización. Este comportamiento suele deberse a la existencia de dos isoenzimas activas que difieren ligeramente en su estructura, pero este no es el caso de la OHasa. Una modificación importante del perfil de pH ocurrió cuando se usaron ambas formas de partículas magnéticas funcionalizadas como soporte de inmovilización. Estas dos preparaciones fueron activas en un rango de pH mayor en comparación con la enzima nativa y su perfil de pH mostró solo una actividad óptima, a pH 6.5 y pH 8.0 para OHasa inmovilizada en CMP y AMP-CH, respectivamente. La explicación más razonable de la aparición de múltiples picos en el perfil de pH de la OHasa es el diferente estado físico del sustrato, el ácido oleico, en función del pH de la solución. Avalores de pH inferiores a 7, el ácido oleico está en fase oleosa y los grupos carboxílicos están protonados. Por encima de pH 7, se produce un aumento de la ionización y se forman sistemas laminares más estructurados o grandes vesículas de ácido oleico. Parece que ambas formas son adecuadas para interaccionar con el sitio activo de la enzima. La caída de la actividad de la enzima nativa a pH 7 probablemente se deba a la menor reactividad de la forma no ionizada del sustrato. En el caso de la enzima inmovilizada en partículas magnéticas funcionalizadas, las interacciones con los grupos carboxilo o amino libres que aún existen en la superficie de las partículas probablemente condujeron a un cierto grado de ionización incluso a pH 7 y aumentaron la accesibilidad del sustrato para la reacción de hidratación.

Estabilidad térmica

Se investigó la estabilidad térmica de las mismas preparaciones de OHasa; ver la figura 10. Todas las OHasas inmovilizadas mostraron una mejor estabilidad térmica en comparación con la enzima nativa demostrada por los valores más altos de actividad a temperaturas superiores a 40 °C. El valor de actividad relativa más alto se logró cuando se utilizó AMP-CHT como soporte. La mayor estabilidad térmica se puede atribuir a la flexibilidad restringida de la enzima después de la inmovilización, haciéndola más resistente al despliegue y la desnaturalización. En la reacción por lotes, como se indicó anteriormente, la OHasa inmovilizada en macropartículas compuestas de quitosano magnético retuvo más del 65 % de su actividad original después de la incubación a 50 °C, mientras que la enzima nativa se inactivó por completo. Una mejora tan significativa hace que esta enzima esté disponible para su uso en un rango de temperatura considerado normal para los procesos biocatalíticos, a velocidades de reacción suficientemente altas.

Uso repetido de la OHasa inmovilizada

La OHasa inmovilizada en partículas compuestas de quitosano magnético se evaluó a través de varios usos repetitivos. Después de cada ciclo, el biocatalizador se recuperó por separación magnética, se lavó y se recicló para la producción de 10-HSA a partir de ácido oleico. Después de la acidificación de la solución sobrenadante, el producto y la materia prima sin reaccionar se extrajeron tres veces con diclorometano. Se ha tomado como referencia la actividad del primer lote. La Figura 11 muestra la variación de la actividad de OHasa inmovilizada durante múltiples reutilizaciones por separación magnética. Como se indicó anteriormente, después de cinco ciclos de reacción, la actividad relativa seguía siendo de alrededor del 75 %, un valor excelente teniendo en cuenta la escasa estabilidad de la enzima en la forma nativa. Además, pensando en la aplicación práctica, se considera que la reutilización de la enzima contrarresta completamente la pérdida de actividad durante la inmovilización.

Caracterización morfológica de partículas AMP-CHT con OHasa inmovilizada covalentemente

La distribución de la enzima inmovilizada sobre/en las partículas compuestas de quitosano magnético se evaluó marcando la OHasa con isotiocianato de fluoresceína (FITC) antes de la inmovilización. La capa fluorescente en la parte externa de la partícula compuesta de quitosano seccionada indicó una distribución uniforme del complejo OHasa-FITC inmovilizado en la superficie de las esferas de quitosano. La parte interna de las partículas permaneció compacta y no contenía enzima inmovilizada. Por lo tanto, todas las moléculas de enzima estaban disponibles para ser alcanzadas por el sustrato 10-HSA.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de un recipiente para producir uno o más ésteres de uno o más ácidos grasos hidroxi que comprende: (a) proporcionar un ácido graso insaturado con un enlace doble cis C9-C10 en un medio de reacción tamponado acuoso;

(b) hacer reaccionar dicho ácido graso insaturado con una oleato hidratasa aislada en el medio de reacción tamponado acuoso para producir al menos un ácido graso hidroxi; y

(c) esterificación de dicho al menos un hidroxiácido graso mediante una lipasa en el medio de reacción tamponado acuoso.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha oleato hidratasa es oleato hidratasa recombinante de Elizabethkingia meningoseptica.

3. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha oleato hidratasa es una oleato hidratasa recombinante con una cola His de terminal N unida covalentemente a partículas compuestas de quitosano magnético activado con glutaraldehído en las que las partículas de óxido de hierro magnético se dispersan en una matriz de quitosano.

4. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el medio de reacción comprende además uno o más triglicéridos, por lo que dichos uno o más triglicéridos son hidrolizados por dicha lipasa para proporcionar dicho sustrato de ácido graso insaturado con un enlace doble cis C9-C10.

5. Un método como se reivindica en la reivindicación 4, en el que la mezcla de reacción se mezcla para ayudar a la dispersión de dichos uno o más triglicéridos en dicho medio de reacción acuoso.

6. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha lipasa es una lipasa sin especificidad posicional 1,3 para la hidrólisis de triglicéridos.

7. Un método como se reivindica en la reivindicación 6, en el que dicha lipasa se selecciona de lipasas microbianas de especies Candida, especies Pseudomonas, especies Chromobacterium, especies Geotrichum, especies Alcaligenes y especies Termomices.

8. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que se lleva a cabo a un pH de 6 a 8 y a 20-40 °C.

9. Un método como se reivindica en la reivindicación 8 que se lleva a cabo a pH 6.5 y 30 °C.

10. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el medio de reacción acuoso es una solución tamponada acuosa que contiene NaCl en una concentración de hasta 150-200 mM.

11. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho uno o más ésteres son uno o más estólidos de ácidos grasos.

12. Un método como se reivindica en la reivindicación 11, en el que uno o más hidroxiácidos grasos para la producción de dichos uno o más estólidos de ácidos grasos se seleccionan de mono-10-hidroxiácidos grasos.

13. Un método como se reivindica en la reivindicación 12, en el que el ácido 10-hidroxiesteárico es el único hidroxiácido graso proporcionado para la esterificación por dicha lipasa.

14. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13, en el que una oleato hidratasa y una lipasa se ponen en contacto con trioleína o un aceite que comprende trioleína dispersa en un medio de reacción tamponado acuoso adecuado para la actividad de ambas enzimas, en el que las siguientes etapas ocurren consecutivamente sin ninguna etapa de separación:

(i) hidrólisis de trioleína para generar ácido oleico;

(ii) conversión de ácido oleico en ácido 10-hidroxiesteárico (10-HSA) por dicha oleato hidratasa y

(iii) conversión de 10-HSA en uno o más estólidos por esterificación consigo mismo y/o con ácido oleico.

15. Un método como se reivindica en la reivindicación 14, en el que dicha lipasa se selecciona de la lipasa de Candida rugosa o una especie Pseudomonas tales que se forman el monoestólido de 10-HSA con ácido oleico o dicho monoestólido y un dímero de éster de 10-HSA, respectivamente.

16. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende además la extracción de uno o más productos de éster del medio de reacción o la extracción y posterior purificación de uno o más productos de éster y/o la incorporación en una composición.

17. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que se hacen reaccionar además uno o más productos de éster de la esterificación de lipasa.