WO2019002658A2 - Síntesis de biodiesel catalizada por un crudo enzimático inmovilizado sobre partículas magnéticas - Google Patents

Síntesis de biodiesel catalizada por un crudo enzimático inmovilizado sobre partículas magnéticas Download PDF

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WO2019002658A2
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Alicia Mª PRIETO ORZANCO
María MOLINA GUTIÉRREZ
Ángel T. MARTÍNEZ FERRER
Mª Jesús MARTÍNEZ HERNÁNDEZ
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
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    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a process for the enzymatic synthesis of methyl esters of long chain fatty acids, for use, preferably as a biofuel, from a short chain alcohol, preferably methanol as a substrate, and where the enzyme, preferably A glycoprotein is immobilized by the covalent attachment of its glucidic chains to amino-functionalized magnetic particles.
  • Biodiesel is a biofuel composed of mixtures of monoalkyl esters of long-chain fatty acids derived from renewable sources.
  • the industrial synthesis of these compounds is carried out by esterification or transesterification of the fatty acids, mono-, di-, and triglycerides present in vegetable oils or fats, generally using lipid waste for recycling, such as frying oils or inedible oils.
  • the reaction between the lipids and a short chain alcohol (C1 to C6) can be mediated by chemical catalysts (bases, acids, heterogeneous catalysts) or by enzymes.
  • the main aspects that maintain the enzymatic synthesis of biodiesel far from its industrial application are mainly two: (1) the cost of the catalyst and (2) the inhibition of many catalysts by methanol.
  • this can be reduced by recycling thereof, and this is possible when the catalyst is immobilized and can carry out successive reaction cycles without significant losses of activity.
  • the problem generated by the use of methanol as a substrate for the enzymatic reaction is more difficult to solve, since this alcohol causes the destabilization and / or inactivation of most of the known enzymes, including hydrolases of carboxylic esters (EC 3.1.1), group in which the enzymes that catalyze this reaction are found.
  • esters of longer chain alcohols have disadvantages compared to methyl esters for the production of biodiesel and the molar excesses of alcohol employed would require their recycling, increasing the costs of the process.
  • Other methods of covalent immobilization are also based on the use of magnetic nanoparticles, to which commercial lipase Lipozyme-TL binds using glutaraldehyde (Xie et al., Energy & Fuels 2009, 23: 1347-1353) or a carbodiimide (Xie et al.
  • the present invention relates to a glycoprotein covalently immobilized by the formation of a secondary amine on functionalized magnetic particles, which is preferably carried out by the oxidation of the glucidic chains of the glycoproteins.
  • Preferred glycoproteins covalently immobilized on magnetic particles according to the present invention are glycoproteins from the group of carboxylic ester hydrolases (EC 3.1.1) capable of synthesizing biodiesel, preferably with triacylglycerol lipase activity (EC 3.1.1.3), generally known as lipases .
  • lipases Within the group of enzymes generally called lipases, there is a group known as “strict lipases” which are enzymes that only act on glycerides, and another group known as “versatile lipases” which, in addition to acting on glycerides, also act against different esters. the glycerides (Barriuso et al. Biotechnology Advances 2016, 34: 874-885).
  • carboxyl esterases EC 3.1.1.1
  • esteral esterases EC 3.1.1.13
  • have a broad substrate specificity and also exhibit lipase activity Whiteley et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2013, 97: 156 -168; Vaquero et al Applied Microbiology and Biotechnology 2016, 100: 2047-2061
  • being able to catalyze the synthesis of biodiesel thanks to its activity against glycerides being able to catalyze the synthesis of biodiesel thanks to its activity against glycerides.
  • glycoproteins preferably glycoproteins with lipase activity, covalently immobilized by the formation of a secondary amine on functionalized magnetic particles, as described herein, show an increase in the yield of the synthesis process of biodiesel and allow the recovery of the enzyme covalently linked to the magnetic particles in a simple and efficient way, simply by applying a magnetic field.
  • Another advantage shown in the examples included herein for glycoproteins, preferably glycoproteins with lipase activity, covalently immobilized on magnetic particles as described herein is that the activity of said enzymes in the synthesis of biodiesel does not decrease over time, during 5 consecutive reaction cycles, and maintains high activity for at least 10 cycles.
  • the process of obtaining the biodiesel catalyzed by said enzymes covalently bound to the magnetic particles does not require the addition of cosolvents, although they can be used if desired.
  • the present invention relates to a glycoprotein covalently immobilized by the formation of a secondary amine on magnetic particles.
  • the glycoprotein is preferably any enzyme with lipase activity, more preferably is a lipase, both strict and versatile, and / or a sterol esterase.
  • Glycoproteins are proteins that, naturally, contain one or more glucidic chains that are covalently linked to certain asparagine, serine and threonine during protein biosynthesis.
  • the amino group of the side chain is associated to the carbohydrate by means of / V-glycosidic bond, while with serine and threonine an O-glycosidic bond is established by condensing the hydroxyl of its side chains with another of the monosaccharide.
  • the glucidic portion of the glycoproteins are very variable, ranging from monosaccharides to long and complex chains of different composition, structure, and degree of branching.
  • glycoproteins with lipase activity are preferably described, covalently immobilized by the formation of a secondary amine on magnetic particles, as well as their specific use as described in the present invention.
  • Lipases especially those produced by microorganisms, are the main enzymes used for biotechnological purposes in the production of biodiesel.
  • Some enzymes produced by fungi have a broad substrate versatility and combine lipase activity with an important esterase esterase activity, which as mentioned above are called versatile lipases, so these enzymes, despite being described as esteral esterases, They are also capable of synthesizing biodiesel under the right conditions.
  • the glycoprotein preferably a glycoprotein with lipase activity, more preferably the esterase esterase / lipase covalently immobilized on the magnetic particles according to the present invention is a versatile lipase, as defined above, synthesized naturally by the fungus dimorphic filamentous Ophiostoma piceae.
  • Said esteral esterase / lipase or native versatile lipase is a 66 kDa molecular mass glycoprotein comprising 8% glycosylation (Calero-Rueda et al Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics 2002, 1599: 28-35) .
  • esterase esterase gene refers to a nucleotide sequence encoding the esteral esterase / lipase or versatile lipase of O. piceae and is identified by SEQ. ID NO: 1.
  • glycoprotein with lipase activity for the purposes of the present invention, glycoprotein with lipase activity, esterase esterase / lipase and versatile lipase, are used interchangeably throughout this document and refer to the group of proteins that exhibit lipase activity, being able to be strict lipases and / or versatile lipases.
  • the native form of the esterase esterase / lipase or versatile lipase of the present invention comprises the complete amino acid sequence of the protein encoded by the esterase esterase gene of O. piceae, including the signal peptide (SEQ ID NO: 2).
  • the mature form of said enzyme comprises the amino acid sequence encoded by the esterase esterase gene, not including the signal peptide and is identified with SEQ ID NO: 3. of native enzyme as the mature form, without signal peptide, to differentiate it from the recombinant forms.
  • heterologous expression and “heterologous gene” refer to the introduction of a foreign (heterologous) gene into an organism in order to modify its genetic material and expression products.
  • said organism is a methylotrophic yeast, preferably Pichia pastoris.
  • the mature amino acid sequence encoded by the esterase esterase gene is expressed in the yeast P. pastoris, using as a signal peptide the pre-propeptide of the ⁇ factor of Saccharomyces cerevisiae, as described in the document Barba-Cedillo et al. to the.
  • the versatile recombinant lipase has modifications in its amino acid sequence, comprising between 6-8 new amino acids at the N-terminal end, added to the amino acid sequence of the mature native protein.
  • the versatile recombinant lipase from O. piceae and expressed in the yeast P. pastoris (OPEr) comprises the sequence SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • versatile lipase refers to an amino acid sequence of the enzyme with esterase esterase activity and lipase encoded by the esterase esterase gene of Ophiostoma piceae.
  • This enzyme is extracellular and can be native when expressed in the original organism (although being extracellular has lost the signal peptide and is referred to as a mature protein) or recombinant if the complete sequence of the protein or the sequence of the mature protein is expressed in another organism.
  • the versatile lipase of the present invention is selected from the list consisting of: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
  • the versatile lipase enzyme is selected from the list consisting of: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
  • any person skilled in the art can use any native or recombinant glycoprotein of any biological origin with known lipase activity, such as native lipases or recombinants produced by fungi other than O.
  • piceae eg: Candida sp., Candida rugosa, Melanocarpus albomyces, Candida antarctica (Cal A, Cal B), Thermomyces lanuginosus, Rhizopus oryzae, Mucor miehei, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Nectria haematococca, or Plicaturiopsis crispa.
  • the glycoprotein, preferably the versatile lipase, immobilized on magnetic particles as described in the present invention is preferably the versatile lipase comprising SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, immobilized on the magnetic particle Fe 3 0 4 .
  • a magnetic particle or particle with magnetic properties is understood to be that particle which, being or not being intrinsically magnetic, is attracted to a field or magnetic force when it is exposed to it.
  • the particles have magnetic properties of the superparamagnetic or ferromagnetic type.
  • the magnetic particle is a particle of metal, metal oxide, mixture of metal oxides, metal alloys or a mixture thereof having magnetic properties.
  • Preferred magnetic particles are selected from the list consisting of: iron oxides, metals, ferromagnetic materials and alloys.
  • the preferred magnetic particles are selected from the list consisting of: magnetite (Fe 3 0 4 ), maghemite, (yFe 2 0 3 ); magnetic particles based on metals, such as iron, cobalt and nickel, magnetic particles based on spinel-type ferromagnetic materials such as, MgFe 2 0 4 , MnFe 2 0 4 and CoFe 2 0 4 ; and magnetic particles based on alloys such as CoPt 3 and FePt.
  • the magnetic core of the nanoparticle can be protected by an inorganic cover (for example, silica, carbon or precious metals), organic (for example, surfactants or polymers), or oxides. The presence of this cover facilitates its functionalization.
  • Magnetic particles of iron oxide especially particles of magnetite (Fe 3 0 4 ) or maghemite (yFe 2 0 3 ) are preferred in the present invention.
  • magnetic particles of sizes between 0.001-100 ⁇ are used in the invention.
  • the magnetic particles are preferably my magnetic particles or magnetic nanoparticles, preferably magnetic nanoparticles between 1- 130 nm and more preferably between 10-30 nm.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention relates to any of the glycoproteins, more preferably to the glycoproteins of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and / or SEQ ID NO: 5, covalently immobilized as described in the present invention, on the magnetic particle Fe 3 0 4 .
  • Another aspect of the present invention relates to a method for obtaining the magnetic particles described above.
  • Any of the methods known to a person skilled in the technical field of magnetic particles can be used in the present invention.
  • known methods for the synthesis of magnetic particles are selected from the list consisting of: co-precipitation, micro-emulsion, thermal decomposition, solvo-thermal route, sono-chemical route, microwave assisted process, Laux process, treatment of Iron oxide minerals, laser pyrolysis, vapor deposition, arc discharge, gas phase synthesis, solid phase synthesis, chemical reduction or others.
  • the process to give rise to the magnetic particle of the invention is co-precipitation.
  • Another aspect of the present invention relates to a method of synthesis of the glycoprotein immobilized covalently by the formation of a secondary amine on magnetic particles as previously described herein, characterized in that it comprises the following steps:
  • step c) incubating the glycoprotein of step a) with a reducing agent, preferably gentle and with the amino functionalized magnetic particle of step b), and d) stabilizing the binding of the immobilized glycoprotein on the magnetic particles obtained in step c).
  • the process of synthesis of the glycoprotein covalently immobilized on the magnetic particles by the formation of a secondary amine is characterized in that the generation of aldehyde groups in the glycoprotein chains of the glycoprotein of step a) is carried out by an oxidation process, preferably in the presence of an oxidizing agent.
  • an oxidizing agent is understood to be any compound known in the art capable of oxidizing another in contact therewith.
  • the oxidizing agent is selected from those capable of generating aldehyde groups on glucidic chains.
  • the oxidizing agent capable of generating aldehyde groups in glucidic chains is selected from the list consisting of: enzymes, which are selected from the list consisting of oxidoreductases, aldose oxidases, alcohol dehydrogenases and oxidases, and oxidizing chemicals.
  • chemical oxidizing agents are selected from 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy radical (TEMPO), Dess-Martin periodinate, lead tetraacetate Pb- (0 2 CCH 3 ) 4, sodium bismutate (NaBi0 3 ), periodic acid or periodates.
  • TEMPO 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy radical
  • Dess-Martin periodinate Dess-Martin periodinate
  • sodium bismutate NaBi0 3
  • periodic acid or periodates Particularly preferred are periodates and more preferably sodium (Nal4 4 ) and potassium periodate (KI0 4 ).
  • the chemical oxidizing agent is applied in liquid form, generally dissolved in aqueous solvent, which facilitates and enhances its oxidative action.
  • the concentration of the solution of the oxidizing agent is between 5 to 50 mM, more preferably 10 mM.
  • step b) is carried out by the binding of amino groups to its surface, preferably by any of the selected methods from the list consisting of: silanization, coating with organic substances such as for example polymers, surfactants, etc., or with inorganic substances such as carbon, precious metals or oxides, among others.
  • the functionalization of step b) is preferably the binding of amino groups by silanization of the surface of the magnetic particle.
  • the magnetic particles are coated with a silicon layer by a process called silanization, and are functionalized with amino groups on their surface.
  • the amino groups can be attached directly or by a spacer to the silane group.
  • the term "spacer" refers to a group capable of linking the silyl group with the terminal amino group.
  • the spacer is an alkyl group, more preferably a C1-C10 alkyl group.
  • C1-C10 alkyl refers in the present invention to aliphatic, linear or branched chains, having from 1 to 10 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, -propyl, n-butyl, tert-butyl, sec-butyl, n-pentyl, etc.
  • the alkyl group has between 1 and 8 carbon atoms and more preferably 1 to 4 carbon atoms.
  • the magnetic particles of the invention are silanized and functionalized by alkylamino groups.
  • Silanization, as well as any of the other methods described above, and functionalization can be performed in a single step, using a single reagent that fulfills the two functions, or using two reagents, one of them being an exclusively silanizing agent to achieve a cover of a group comprising thicker silicon on the nanoparticle, where said agent is preferably tetraethoxysilane (TEOS), and another silanizing agent further comprising the functional group desired to functionalize the magnetic particle.
  • TEOS tetraethoxysilane
  • silanization and functionalization take place with a single reagent and in a single step.
  • the silanizing agents capable of incorporating amino functional groups on the surface of the magnetic particle are selected from the list consisting of (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES), (3-aminopropyl) trimethoxysilane, 3 [ 2- (2-aminoethylamino) ethylamino] propyltrimethoxysilane, 3- (2-aminoethylamino) -propyldimethoxymethylsilane, [3- (2-aminoethylamino) propyl] trimethoxysilane, 3-aminopropyldimethylmethoxysilane, 3-aminopropyl (diethoxy) methylsilane.
  • APTES 3-aminopropyl triethoxysilane
  • the concentration of 3-aminopropyl triethoxysilane is comprised between 5 to 150 mM, more preferably between 100 to 130 mM.
  • the concentration of accessible amino groups on the surface of the magnetic particle is between 5 to 100.
  • magnetic particle more preferably between 5 to 40 magnetic particle.
  • the magnetic particles of the invention previously silanized or coated with polymeric materials such as for example the amino-polyvinyl alcohol, can incorporate hydrazide groups on their surface.
  • the glycoprotein comprising aldehyde groups in its its glucidic chains preferably obtained by oxidation, as indicated in step a
  • the functionalized amino magnetic particle of step b) in the presence of a reducing agent, for a time of between 1 to 20 h, more preferably for at least 2 h, and at a temperature of between 4 to 37 ° C, more preferably at 28 ° C, with a protein concentration of between 0.01 to 1 mg of protein per mg of nanoparticles, more preferably between 0.02 to 0.04 mg of protein per mg of nanoparticles.
  • the term "reducing agent or proton donor” means any compound capable of releasing electrons to an oxidizing agent.
  • the reducing agent is a mild reducing agent, and more preferably is selected from the list consisting of metal hydrides such as sodium borohydride (NaBH 4 ), lithium hydride, lithium aluminum hydride, sodium cyanoborohydride, lithium cyanoborohydride, boranes such as trimethyl amino borane (TMAB) or ⁇ -picolino borane, triacetoxy borohydride sodium, or sodium borohydride modified with metal salts polyvalent or acid-activated.
  • the reducing agent is TMAB.
  • the reducing agent used is applied in liquid form, which facilitates and enhances the reducing action thereof.
  • the concentration of the reducing agent solution is between 100 and 300 mM, more preferably 150 mM.
  • the stabilization of step d) is produced by reductive amination to give a stable secondary amine.
  • the concentration of the reducing agent solution used in this step is between 0.5 to 5 mg / mL, more preferably 1 mg / mL.
  • the covalent immobilization between the amino magnetic particle functionalized on its surface with the glycoprotein, preferably with the enzyme with lipase activity, preferably with the versatile lipase described in the invention is produced by the formation of a secondary amine. as previously mentioned.
  • Said type of immobilization is carried out specifically through the oxidized glucidic chains of the enzyme with lipase activity, preferably with the versatile lipase on the surface of the functionalized amino particle, preferably amino-alkyl functionalized, by the reaction of the aldehydes previously generated via oxidation in the glucidic chains of sterol esterase / lipase, forming a mine (Schiff base) with the amino groups of the magnetic particles, and where said mine is stabilized by reductive amination to give rise to a secondary amine stable.
  • Said covalent immobilization procedure between the amino groups of the functionalized magnetic particle and the oxidized sugars of the glycoprotein maintains the structural integrity of the enzyme, whose protein sequence does not intervene in the interaction with the magnetic particle.
  • the immobilization through the glucidic chains of the enzyme provides a binding to the support by multiple points making it very stable, while allowing a certain degree of flexibility in the preparation to be maintained, which facilitates the access of the substrates to the center active and evacuation of synthesized products.
  • the covalent immobilization of the enzyme with lipase activity preferably of the versatile lipase of the invention by the formation of a secondary amine with the amino-functionalized magnetic particle increases the stability and efficiency of said catalyst, specifically in its use for the synthesis of biodiesel, as well as the recyclability of the immobilized enzyme.
  • Another aspect of the present invention relates to a process for the synthesis of alkyl esters comprising the transesterification and / or esterification of a source of fatty acids with an alcohol, in the presence of an enzymatic or crude preparation comprising a catalyst (enzyme) , preferably a glycoprotein with lipase activity, covalently immobilized by the formation of a secondary amine on magnetic particles, as described in the present invention.
  • a catalyst enzyme
  • the enzyme preparation comprising a catalyst or enzyme with lipase activity covalently immobilized by a secondary amino group on magnetic particles as described in the present invention, maintains its activity in a mixture of short-chain alcohol, preferably methanol, and glycerides, preferably long-chain fatty acids, with or without free fatty acids, without the need for cosolvents.
  • the transesterification and / or esterification reactions catalyzed by the glycoprotein with lipase activity, preferably the versatile lipase from the fungus O.
  • the process of synthesis of alkyl esters comprising the transesterification and / or esterification of a source of fatty acids with an alcohol, in the presence of a preparation comprising a glycoprotein, preferably a glycoprotein with lipase activity, covalently immobilized by the formation of a secondary amine on magnetic particles as described in the present invention, has produced the best yields in comparison with other methods of enzymatic immobilization of said enzyme and even other commercial enzymes with lipase activity.
  • the enzyme or catalyst is recovered simply and efficiently, simply by the application of a magnetic field.
  • the activity of the enzyme of the present invention does not decrease significantly over time, and that after at least 10 consecutive reaction cycles it maintains more than 70% of said activity.
  • the immobilized enzyme also catalyzes this reaction in the presence of cosolvents such as hexane, toluene or isooctane, more preferably in isooctane, although under these conditions the reaction proceeds more slowly.
  • esterification and "transesterification” as used in the present invention, refer respectively to the reaction that occurs between a fatty acid and an alcohol, or a mono, di or triglyceride of fatty acids and an alcohol.
  • the substrates used can comprise mixtures of fatty acids and glycerides, so when mixed with an alcohol, both types of reactions would take place. In both cases fatty acid esters are synthesized, but in the esterification water is released as a by-product while glycerol is liberated in the transesterification.
  • the transesterification can be catalyzed by bases, acids or enzymes.
  • the transesterification process is carried out in the presence of enzymes, preferably glycoproteins with lipase activity such as for example the strict, versatile lipases, or sterol esterases with lipase activity, or microorganisms that produce them.
  • the alkyl esters are obtained from the lipid preparation according to the invention by the transesterification or esterification of the glycerides or fatty acids that are part of the lipid preparation.
  • biodiesel refers to a chemical composition composed primarily of monoalkyl or alkyl esters of long chain fatty acids.
  • the esters that are part of the biodiesel are methyl, ethyl, propyl or butyl esters and the fatty acids come from the lipid composition according to the present invention.
  • the biodiesel according to the present invention comprises one or more of the following alkyl esters of fatty acids: methyl esters of fatty acids (FAME or fatty acid methyl esters, ethyl esters of fatty acids (FAEE or fatty acid ethyl esters), fatty acid propyl esters (FAPE or fatty acid propyl esters), butyl fatty acid esters (FABE or fatty acid butyl esters)
  • FAME methyl esters of fatty acids
  • FEE fatty acid methyl esters
  • FEE fatty acid ethyl esters
  • FAPE fatty acid propyl esters
  • butyl fatty acid esters FABE or fatty acid butyl esters
  • biodiesel is a fuel that is composed in its All biodiesters of biological origin that do not contain diesel from petroleum and that comprise monoalkyl esters of long chain fatty acids This type of biodiesel is known as B100 and indicates that 100% of the fuel is biodiesel
  • Chain fatty acids long are selected from the list consisting of: myristic or tetradecanoic acid (14: 0), myristoleic acid or cis-9-tetradecenoic acid (14: 1), pentadecyl or pentadecanoic acid (15: 0), pentadecenoic acid (15: 1) ), palmitic or hexadecanoic acid (16: 0), palmitoleic or hexadecenoic acid (16: 1), hexadecadienoic acid (16: 2), hexadecatrienoic acid (16: 3), margaric or heptadecanoic acid (17: 0), heptadecenoic acid (17: 1), stearic or octadecanoic acid (18: 0), oleic or octadecenoic acid (18: 1), linoleic or octadecadienoic acid (18: 2), linoleic or
  • biodiesel contains a predominant molecular species
  • the raw materials used for its production are usually mixtures that also contain short or medium-length fatty acids, which are also converted into monoalkyl esters during the process and are part of the process. the final mix of biodiesel.
  • the document by Hoekman et al. contains a list of the fatty acids most frequently found in biodiesel and the description of the fatty acid profile of biodiesel (methyl esters) obtained from different oils and fats .
  • the alcohol can be a short-chain alcohol, for example, C 1 -C 6 alkyl alcohol, more specifically C 1 -C 4 alkyl alcohol, particularly methanol or ethanol, more preferably methanol.
  • said esters of resulting fatty acids are methyl esters of fatty acids (FAME - Biodiesel).
  • said esters of resulting fatty acids are ethyl esters of fatty acids.
  • said alcohol is propanol
  • said resulting fatty acid esters are propyl esters of fatty acids.
  • said esters of resulting fatty acids are butyl esters of fatty acids.
  • the alcohol can also be a medium chain fatty alcohol (C6-C10) or long chain fatty alcohols (C12-C22).
  • the alcohol donor can be a monoalkyl ester or a dialkyl carbonate, such as dimethyl carbonate or diethyl carbonate.
  • the method of synthesis of alkyl esters described in the present invention is characterized in that the enzyme preparation or crude comprises the recombinant versatile lipase (OPEr) of the present invention, preferably the OPEr comprising the sequences SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, at a protein concentration between 1 to 20 mg / mL, preferably between 2 to 10 mg / mL, more preferably between 3 to 4 mg / mL, where said protein concentration comprises between 100 and 450 units of versatile lipase activity (OPEr) per milliliter measured against p-nitrophenyl butyrate, more preferably between 150-300 units of activity per milliliter.
  • OEPEr recombinant versatile lipase
  • enzyme preparation or “crude”, used interchangeably throughout the present document, refer to the liquid and / or supernatant obtained from the culture of the microorganism used for the production of the native versatile lipase enzyme (OPE), where said liquid and / or supernatant comprises the sequences SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or recombinant (OPEr) comprising the sequences SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • OEP native versatile lipase enzyme
  • the enzyme preparation of the invention or crude comprising the native versatile lipase (OPE) comprising the sequences SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, and / or recombinant (OPEr) comprising the sequences SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 can be concentrated, preferably by ultrafiltration through membranes between 3 and 50 kDa of pore, more preferably between 10 and 50 kDa. Any method known to a person skilled in the art can be used to concentrate the crude oil used in the present process of the invention.
  • the enzyme preparation of the invention can also be a purified crude or enzyme preparation. Any method known in the art for enzymatic purification can be used in the present invention.
  • the method of synthesis of alkyl esters described in the present invention is characterized in that the transesterification and / or esterification reaction proceeds at a temperature between 20 and 60 ° C, preferably between 25 and 50 ° C, more preferably between 25 and 35 ° C.
  • this catalyst both free and immobilized, carries out an efficient synthesis of FAMEs at temperatures lower than those described in other procedures, generally between 35-60 ° C, as described in the document by Gumba et al. (Biofuel Research Journal 2016, 3: 431-447), represents a considerable reduction in the energy cost associated with the biodiesel synthesis process.
  • the method of synthesis of alkyl esters described in the present invention is characterized in that the reaction is carried out at a pH of between 2 to 10, preferably at an acidic pH of 2 to 5.
  • the method of synthesis of alkyl esters described in the present invention is characterized in that the reaction can take place in a medium with up to 30% water, preferably with less than 10% and more preferably in the absence of water.
  • immobilized versatile lipase As described in the present invention, catalyzing the synthesis of biodiesel both in the absence and in the presence of a certain amount of water makes this enzyme particularly interesting, since on the one hand it does not require the addition of water for its activity, and on the other hand it is tolerant to the presence of water in the raw material used as substrate and to the water produced by the esterification of the free fatty acids that said substrate could contain.
  • Other processes described in the state of the art are not compatible with the presence of water in the reaction mixture and require the use of water removal systems (Mehrasbi et al. Renewable Energy 2017, 101: 593-602).
  • the method of synthesis of alkyl esters described in the present invention is characterized in that the reaction is carried out in the presence or absence of a cosolvent.
  • a cosolvent for the purposes of the present invention the preferred cosolvents are selected from the list consisting of hexane, toluene and isooctane.
  • the reaction is carried out without adding any cosolvent.
  • the source of fatty acids used in the process of the invention may comprise at least one of any of the following: vegetable oil, preferably soybean oil, canola oil, algae oil, oil rapeseed oil, olive oil, castor oil, palm oil, sunflower oil, peanut oil, cottonseed oil, Jatropha oil, Camelina oil, crude corn oil; animal fat, preferably fish oil; fat derived from animals; waste oil; burned fat; oil triglycerides derived from non-edible plant sources; partial glycerides and free fatty acids derived from these oils; or any mixture of at least two of them, in any desired ratio.
  • the source of fatty acids comprises free fatty acids, mono-, di- or triglycerides, their mixtures in any ratio, esters of fatty acids and amides, in the absence or presence of other derivatives of secondary fatty acids such as phospholipids and esteral esters, said source of fatty acids is unrefined, refined, bleached, deodorized or any of their combinations.
  • Fig. 1 Comparison of the stability at temperature (A) and pH (B) of free OPEr and covalently immobilized through its glucidic chains on amino functionalized magnetic particles (AMNP-CH-OPEr).
  • Fig. 2 Comparison of efficiency in biodiesel synthesis and operational stability of lipases Cal A (white bar), Cal B (light gray bar) and OPEr (dark gray bar), covalently immobilized on amino-functionalized magnetic nanoparticles. through its glucidic chains (AMNP-CH), and the commercial preparation of Cal B immobilized by adsorption Novozym 435 (N 435) (black bar).
  • the reaction was produced from recycled domestic oil and methanol (molar ratio 1: 4) at 28 ° C and with 100 rpm orbital shaking.
  • C1, C2, C3, C4 and C5 refers to each of the reaction cycles carried out by the same enzymes tested under the same conditions each cycle.
  • Fig. 4 Chromatograms comparing the synthesis of methyl oleate from triolein and methanol (molar ratio 1: 4) in 72 h reactions without co-solvent, at 28 ° C and 200 rpm. The reactions were catalyzed by: a) Novozym 435, b) OPE immobilized on Sepabeads, and c) OPE immobilized on Eupergit.
  • Fig. 5 Analysis of the scaling of biodiesel synthesis from mixtures of recycled oil and methanol, in the absence of co-solvent, and two different reaction volumes.
  • the amount of AMNP-CH-OPEr catalyst used in each reaction (0, 1 and 3.4 g) was proportional to the volume of it.
  • the percentage of triglycerides is shown on the X axis and the time expressed in hours on the Y axis.
  • Fig. 6 Chromatogram obtained after 9 hours of biodiesel synthesis reaction in the presence of 3.4 g of AMNP-CH-OPEr catalyst. The figure shows the transformation of most triglycerides, although there are still small amounts of diglycerides, monoglycerides and free fatty acids.
  • the naked magnetite particles (MNPs) used in the examples included in the present description have a size between 20-30 nm and come from lolitec GmbH (Heilbronn, Germany). Said magnetic particles were amino-functionalized in the laboratory with 3-aminopropyl triethoxysilane (APTES, Sigma). For the comparative tests, commercial magnetite nanoparticles already functionalized and ready for the immobilization of the versatile enzyme lipase used in the invention were acquired. Said commercial magnetite nanoparticles are: SiMAG-Amine having amino groups (these nanoparticles are the commercial analog of those used in the present invention) and SiMAG-Octyl-C8 comprising octyl groups, both of Chemicell.
  • the SiMAG-Octyl-C8 nanoparticles are used to compare the immobilization process described in the present invention with another non-covalent procedure, although it is suitable for the immobilization of hydrophobic proteins on magnetic particles.
  • the enzyme with versatile lipase activity used is the versatile lipase present in any crude produced by any microorganism that comprises the esteral esterase gene of the fungus Ophiostoma piceae (OPE).
  • Ophiostoma piceae Ophiostoma piceae
  • Said commercial enzymes of Novozymes being also glycoproteins, were immobilized by the procedure described in the invention, that is, they were immobilized covalently on magnetic particles. Amino-functionalized on its surface, in order to compare the validity of said method of immobilization and its effect on the efficiency and recyclability of commercial lipases, many of them with improved catalytic properties, when they are immobilized by said method.
  • P-NPP is a typical substrate for evaluating lipase activity, since it is an aryl-ester of long-chain fatty acid, while p-NPB is the most appropriate substrate for the measurement of sterol esterase activity as it is an aryl - ester of a short chain fatty acid.
  • the lipase activity of the OPEr and Cal A enzymes could be determined using p-NPP as a substrate, however, the Cal B enzyme was inactive under the reaction conditions tested.
  • p-NPP which is insoluble in water, it is necessary to add a detergent in the reaction medium and probably the enzyme Cal B is inactivated due to the action of said detergent.
  • Example 1 Immobilization of lipases, through their own glucidic chains, on amine-functionalized magnetite (Fe 3 0 4 ) nanoparticles (AMNP-CH).
  • OPEr OPEr
  • Cal A OPEr
  • Cal B all of which are glycoproteic in nature.
  • an enzyme treatment is carried out with Nal0 4 , which produces the breakage of the carbon-carbon (CC) bond of the monosaccharides when two adjacent carbons present hydroxyl groupscommunales (neighborhood diols), oxidizing said alcohols to aldehydes.
  • CC carbon-carbon
  • the enzymes OPEr, Cal A and Cal B are covalently immobilized on the amino-functionalized MNPs (AMNPs) by reacting the amino groups of said AMNPs with the aldehydes generated in the glycoprotein via oxidation, forming a mine (base of Schiff) which is stabilized by reductive amination to give rise to a stable secondary amine.
  • AMNPs amino-functionalized MNPs
  • 1 g of the magnetic nanoparticles is mixed, specifically the Fe 3 nanoparticles 0 4 , with 9.7 mL of ethanol in an ultrasonic bath for 20 min, add 300 ⁇ l of APTES, sonicate for 10 min, stir in a mixer at 80 rpm and 28 ° C for 16 h. Once this time has elapsed, the nanoparticles are separated with the aid of a magnet and the reaction liquid is removed, washing the MNPs functionalized with the amino groups on the surface of the same with 300 mL of 50% ethanol in water three times, sonicating between washed. The amino-functionalized MNPs are dried in an aeration oven at 65 ° C.
  • the density of accessible amino groups in the particles is evaluated by the procedure described by del Campo et al. (Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2005, 293: 33-40), showing that they present surface accessible amino groups in the range of 5-15 support, somewhat inferior to that described for commercial preparations.
  • the lipases In order for the lipases to be covalently bound to the amino-functionalized magnetic particles on their surface as described in the present invention, it is necessary to oxidize the glucidic chains of said enzymes.
  • the lipases are subjected to said oxidation pre-treatment, so that the differences shown in the comparative tests of the synthesis of biodiesel using said catalysts, are due exclusively to the type of immobilization carried out, and not to the oxidative pre-treatment to which it has previously been subjected to the enzyme.
  • the enzyme preparations or the crude ones containing the OPEr enzyme have been oxidized, as well as the different preparations of commercial enzymes (Cal A and Cal B).
  • the stability of the OPEr enzyme was compared in the crude ones before (free OPEr) and after its immobilization by AMNP-CH (AMNP-CH-OPEr).
  • the stability against temperature was evaluated in a range between 25 and 70 ° C, with the free catalyst (dissolved) or immobilized (resuspended) in 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.
  • the stability of the OPEr enzyme at different pHs was determined at 4 ° C by placing the free or immobilized catalyst sample in Britton & Robinson buffer adjusted to pH values between 2 and 10.
  • the enzyme AMNP-CH-OPEr is more stable at high temperatures than free OPEr (Fig. 1A).
  • the enzyme AMNP-CH-OPEr maintains 80% of its activity up to 50 ° C, while the free OPEr enzyme retains only 32% of its activity at the temperature of 40 ° C, and also, it is inactivated above this temperature.
  • the enzyme AMNP-CH-OPEr shows a stability equal to or greater than free OPEr in the entire pH range analyzed (pH from 2 to 10). It is interesting to note the improvement of the activity at alkaline pHs (8 and 9) and especially at acidic pH, where the activity becomes twice as high as pH 2 and 3 (Fig. 1 B).
  • the document Torres et al. (Catalysis Communications 2008, 9: 539-545) describes the immobilization of the native OPE enzyme on Dilbeads, a macroporous support, and its effect on thermal stability and pH in a period of 24 h. In this case, a stabilizing effect against the increase in temperature was observed, and with respect to the stability against pH, the authors only indicate a remarkable effect at pH 8.
  • Example 2 Synthesis of biodiesel with OPEr immobilized on commercial magnetite nanoparticles (Fe 3 0 4 ) functionalized with octyl groups (MNP-Octyl-OPEr).
  • MNP-Octil contains 50 mg of nanoparticles per ml_ of H 2 0.
  • the water is removed with the help of a magnet and the volume of oil equivalent to 0.5 U of activity is added ( measured against p-nitrophenyl butyrate, p-NPB) per mg of support and completed up to 1 ml_ with 100 mM Tris pH 7.
  • p-NPB p-nitrophenyl butyrate
  • Crude enzymes comprising the OPE enzyme were immobilized on two commercial epoxy microporous supports: Eupergit (Rohm Inc.) and Sepabeads (Resindion). These microporous supports differ in their internal geometry.
  • 180 U of enzymes sterol esterase / lipases Novozym 435, OPE immobilized on Sepabeads and OPE immobilized on Eupergit
  • Immobilizations were performed at 4 ° C in a mixer. rollers for 48 h.
  • the enzymes thus immobilized, Novozym 435, OPE immobilized on Sepabeads and OPE immobilized on Eupergit were tested in biodiesel synthesis reactions at 28 ° C and orbital shaking at 200 rpm, in the absence of cosolvent, using commercial triolein and methanol (molar ratio 1: 4) as substrates and comparing the result obtained with the enzyme OPE immobilized on Sepabeads or Eupergit, with that obtained using Novozym 435 as a catalyst.
  • the monitoring of these reactions was carried out by gas chromatography.
  • the reactions catalyzed by the OPE enzyme immobilized on both supports almost completely transformed the substrates although more slowly (72-96 h), while Novozym 435 barely produced methyl esters under the conditions tested (Fig. 4).
  • AMNP-CH-OPEr 1 g and 10 g of AMNP-CH-OPEr were prepared in parallel.
  • the reaction volume was 20 mL, while when immobilizing 10 g, 80 mL was added.
  • the immobilization reaction was scaled 10 times, obtaining an immobilized enzyme with activity comparable to that produced on a smaller scale (1 g).
  • the immobilized lipases, through their glucidic chains, on magnetic particles as described in the present invention are useful in the synthesis of methyl esters of long chain fatty acids (biodiesel) to from 500 recycled oil and methanol (molar ratio 1: 3), using 50 mg of the newly-synthesized AMNP-CH-OPEr catalyst on a larger scale.
  • the molar ratio oil: methanol was 1: 5, and the alcohol was dispensed three times, at 0 h, 5 h and 9 h, to avoid inactivation of the catalyst.
  • the reaction was maintained at 100 rpm in a mixer at a temperature between 25-28 ° C. After this time, aliquots of the reaction mixture (0, 5, 9 and 24 h) were analyzed by gas chromatography to monitor the kinetics of the two reactions. In Fig. 5 it is observed that the decrease of triglycerides throughout the reaction is similar regardless of the volume of reaction.

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Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis enzimática de ésteres de alquilo de ácidos grasos de cadena larga en presencia de un alcohol y de una preparación enzimática que comprende una esterol esterasa/lipasa inmovilizada covalentemente sobre partículas magnéticas funcionalizadas en su superficie. La inmovilización de la lipasa versátil mediante el procedimiento descrito es capaz de incrementar el rendimiento del proceso de síntesis de ésteres de alquilo, así como de permitir una recuperación del catalizador para futuras reacciones, sencilla y eficiente, sin que la actividad y velocidad de la esterol esterasa/lipasa se vea disminuida notablemente a lo largo de al menos 10 ciclos de reacción consecutivos.

Description

SÍNTESIS DE BIODIESEL CATALIZADA POR UN CRUDO ENZIMÁTICO INMOVILIZADO SOBRE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS
DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis enzimática de ésteres metílicos de ácidos grasos de cadena larga, para su uso, preferentemente como biocombustible, a partir de un alcohol de cadena corta, preferentemente metanol como sustrato, y donde la enzima, preferentemente una glicoproteína, se encuentra inmovilizada mediante la unión covalente de sus cadenas glucídicas a partículas magnéticas amino-funcionalizadas.
ESTADO DE LA TÉCNICA El biodiesel es un biocombustible compuesto por mezclas de ésteres monoalquílicos de ácidos grasos de cadena larga derivados de fuentes renovables. La síntesis industrial de estos compuestos se realiza mediante esterificación o transesterificación de los ácidos grasos, mono-, di-, y triglicéridos presentes en aceites vegetales o grasas, empleando generalmente residuos lipidíeos para su reciclado, como aceites de fritura o aceites no comestibles. La reacción entre los lípidos y un alcohol de cadena corta (C1 a C6) puede estar mediada por catalizadores químicos (bases, ácidos, catalizadores heterogéneos) o por enzimas.
La síntesis de biodiesel mediante catálisis química es rápida y muy productiva, además de ser los catalizadores muy baratos, aunque no todo son ventajas en este tipo de reacciones. Las temperaturas de reacción suelen ser altas lo que implica un coste energético muy elevado, los catalizadores se recuperan con dificultad, la separación de los productos es más complicada y el glicerol que se genera como subproducto del proceso químico tiene difícil aprovechamiento porque su refinado resulta muy costoso. Este subproducto puede utilizarse puro en los sectores alimentario, farmacéutico y cosmético, pero se sigue investigando en darle usos alternativos a los mencionados. Por otro lado, es interesante señalar que los catalizadores químicos son en la mayoría de las ocasiones ácidos o bases, por lo que su manejo y almacenamiento debe realizarse con cautela, y los efluentes o desechos del proceso son contaminantes y precisan un tratamiento previo a su eliminación. En cambio, aunque la síntesis de biodiesel mediante catálisis enzimática es considerablemente más lenta que la catálisis química y el precio de las enzimas utilizadas como catalizadores es elevado, las ventajas de la síntesis de biodiesel mediante dicho procedimiento son muchas. Entre las más importantes ventajas, destacan que las condiciones en las que se lleva a cabo la catálisis enzimática son más suaves, las enzimas son más específicas que los catalizadores químicos, la presencia de ácidos grasos libres no interfiere en la catálisis, sino que éstos también son esterificados, y la mezcla de reacción es mucho más limpia, lo que facilita la recuperación de los productos y no genera residuos tóxicos.
Hasta la fecha, los aspectos principales que mantienen la síntesis enzimática de biodiesel lejos de su aplicación industrial son principalmente dos: (1) el coste del catalizador y (2) la inhibición de muchos catalizadores por metanol. Respecto al coste derivado del empleo de catalizadores enzimáticos, éste puede reducirse mediante el reciclado de los mismos, y esto es posible cuando el catalizador está inmovilizado y puede llevar a cabo ciclos sucesivos de reacción sin pérdidas relevantes de actividad. Sin embargo, el problema que genera el uso de metanol como sustrato de la reacción enzimática es más difícil de resolver, ya que este alcohol produce la desestabilización y/o inactivación de la mayoría de las enzimas conocidas, incluyendo las hidrolasas de ésteres carboxilicos (EC 3.1.1), grupo en el que se encuentran las enzimas que catalizan esta reacción. Por dicho motivo, en el estado de la técnica se describe la síntesis de biodiesel mediante catálisis enzimática utilizando como sustratos preferentemente etanol, propanol o butanol cuando el biocatalizador no es estable a metanol. Sin embargo, aunque la toxicidad del metanol es superior a la del resto de los sustratos utilizados, dicho alcohol es el más utilizado en la industria debido a otras ventajas tales como su bajo coste, su bajo punto de ebullición y que, además, no forma mezclas azeotropas con el agua, facilitando así su posterior reciclado. Otra de las ventajas de utilizar el metanol como sustrato es que sus ésteres metílicos son menos viscosos que los ésteres de alcoholes de mayor longitud de cadena, y además, tienen mejores propiedades como biocombustible.
El interés de este tipo de reacciones enzimáticas para la síntesis de biocombustibles se ha incrementado en los últimos años. Es conocido el uso de una o varias lipasas microbianas comerciales inmovilizadas de forma no covalente sobre soportes porosos hidrofóbicos y macrorreticulares empleando etanol, metanol u otros dadores de alcohol como sustratos de la síntesis de biodiesel, así como una solución alcalina para mantener la estabilidad y efectividad de las enzimas (EP2542685 B1). Uno de los principales problemas que presenta la inmovilización de enzimas mediante, por ejemplo, el método CLEAs (Cross-Linked Enzyme Aggregates), en presencia o no de soporte, es que puede producir alteraciones y modificaciones en la estructura de la proteína, comprometiendo su actividad o dificultando el acceso de los sustratos al centro activo o la evacuación de los productos de reacción, lo que conlleva una baja eficacia en la síntesis de biodiesel.
Otros métodos utilizados en el estado de la técnica describen el uso de nanopartículas magnéticas funcionalizadas en superficie, sobre las que se inmoviliza mediante interacciones hidrofóbicas la enzima utilizada para la síntesis de biodiesel (El Batal et al. Bioengineering 2016, 3: 14). En este caso, al no existir una unión covalente entre la enzima y el soporte, se observa una pérdida de actividad del 66% al cabo de pocos ciclos de síntesis, debido principalmente al lixiviado de la propia enzima.
Por otro lado, también es conocido que la síntesis enzimática de biodiesel con una lipasa comercial inmovilizada sobre un soporte microporoso, mantiene la actividad durante 10 ciclos de síntesis de 24 h. Sin embargo, esta reacción tiene lugar a 50 °C o 65 °C, según el tipo de aceite utilizado como sustrato, con agitación de 250 rpm y un exceso molar de metanol de 6: 1 , lo que implicaría la retirada del metanol excedente y la peor recuperación del glicerol producido (Dizge et al. Bioresource Technology 2009, 100: 1983-1991 ; Dizge et al. Biochemical Engineering Journal 2009, 44:220-225). Por otra parte, varios grupos de investigación (Cruz-Izquierdo et al. PLoS ONE 2014, 9:e115202; López et al. Frontiers in Chemistry 2014, 2:72) inmovilizaron la enzima comercial Cal B en forma de CLEAs y mCLEAs (sobre un soporte magnético funcionalizado con grupos amino) para la producción de biodiesel. En estos casos, los autores sintetizaron ésteres etílicos de ácidos grasos vegetales utilizando grandes excesos molares de alcohol, alcanzando conversiones máximas en 24 h del 90% con una proporción de etanol:aceite 30: 1 y del 82% empleando propanol (proporción 6:1). Como ya se ha comentado, estos ésteres de alcoholes de cadena más larga presentan desventajas frente a los ésteres metílicos de cara a la producción de biodiesel y los excesos molares de alcohol empleados requerirían su reciclado, aumentando los costes del proceso. Otros procedimientos de inmovilización covalente se basan también en el uso de nanopartículas magnéticas, a las que se une la lipasa comercial Lipozyme-TL empleando glutaraldehído (Xie et al. Energy & Fuels 2009, 23: 1347-1353) o una carbodiimida (Xie et al. Biomass and Bioenergy 2010, 34:890- 896) para la síntesis de FAMEs (ésteres metílicos de ácidos grasos, del inglés Fatty Acid Methyl Esters), alcanzando una conversión en 24 h de entre el 75% (a 50 °C) y el 94% (a 45 °C). Aunque estos rendimientos no son malos, la reciclabilidad de las enzimas está lejos de ser óptima, ya que no admiten más de 3 o 4 ciclos catalíticos consecutivos. Estos mismos autores, inmovilizaron la lipasa comercial de Candida rugosa sobre microesferas magnéticas de quitosano activadas con glutaraldehído. Mediante dicho procedimiento, los autores sintetizaron FAMEs a partir de aceite de soja, con un rendimiento del 87% en reacciones de 30 h a 35 °C. El máximo número de reciclados sin una pérdida excesiva de actividad fue de cuatro (Xie et al. Biomass and Bioenergy 2012, 36:373-380).
En vista de lo expuesto en los párrafos anteriores, existe en el estado de la técnica la necesidad de proporcionar catalizadores y métodos alternativos de síntesis enzimática de biodiesel capaces de incrementar el rendimiento del proceso, así como de permitir una recuperación sencilla y eficiente de la enzima para futuras reacciones, sin que la actividad y velocidad de la misma se vea disminuida a lo largo de los ciclos de reacción consecutivos a los que se puede someter a dicha enzima.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una glicoproteína inmovilizada covalentemente mediante la formación de una amina secundaria sobre partículas magnéticas funcionalizadas, que preferiblemente se lleva a cabo mediante la oxidación de las cadenas glucídicas de las glicoproteínas. Las glicoproteínas preferidas inmovilizadas covalentemente sobre partículas magnéticas según la presente invención, son glicoproteínas del grupo de las hidrolasas de ésteres carboxílicos (EC 3.1.1) capaces de sintetizar biodiesel, preferentemente con actividad triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3), conocidas generalmente como lipasas. Dentro del grupo de enzimas denominadas generalmente lipasas, existe un grupo conocido como "lipasas estrictas" que son enzimas que solo actúan sobre glicéridos, y otro grupo conocido como "lipasas versátiles" que además de actuar sobre glicéridos, también actúan frente a ésteres diferentes a los glicéridos (Barriuso et al. Biotechnology Advances 2016, 34:874-885). Del mismo modo, algunas carboxil esterasas (EC 3.1.1.1) y esteral esterasas (EC 3.1.1.13) tienen una amplia especificidad de sustrato y presentan también actividad lipasa (Whiteley et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2013, 97: 156-168; Vaquero et al. Applied Microbiology and Biotechnology 2016, 100:2047-2061), pudiendo catalizar la síntesis de biodiesel gracias a su actividad frente a glicéridos. En el caso particular de las esterol esterasas con actividad lipasa, se ha propuesto recientemente que pasen a denominarse "lipasas versátiles" ya que algunas de ellas incluso tienen más actividad sobre glicéridos que sobre ésteres de esterol (Barriuso et al. Biotechnology Advances 2016, 34:874-885).
Según se demuestra en los ejemplos incluidos en el presente documento, las glicoproteínas, preferentemente glicoproteínas con actividad lipasa, inmovilizadas covalentemente mediante la formación de una amina secundaria sobre partículas magnéticas funcionalizadas, según se describe aquí, muestran un incremento en el rendimiento del proceso de síntesis de biodiesel y permiten la recuperación de la enzima unida covalentemente a las partículas magnéticas de forma sencilla y eficiente, simplemente mediante la aplicación de un campo magnético. Otra de las ventajas mostradas en los ejemplos incluidos en el presente documento para las glicoproteínas, preferentemente glicoproteínas con actividad lipasa, inmovilizadas covalentemente sobre partículas magnéticas según se describe en el presente documento, es que la actividad de dichas enzimas en la síntesis de biodiesel no disminuye a lo largo del tiempo, durante 5 ciclos de reacción consecutivos, y mantiene una elevada actividad durante al menos 10 ciclos. Adicionalmente, el proceso de obtención del biodiesel catalizado por dichas enzimas unidas covalentemente a las partículas magnéticas no requiere la adición de cosolventes, aunque pueden utilizarse si se desea. Así en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una glicoproteína inmovilizada covalentemente mediante la formación de una amina secundaria sobre partículas magnéticas. En una realización preferida, la glicoproteína es preferentemente cualquier enzima con actividad lipasa, más preferentemente es una lipasa, tanto estricta como versátil, y/o una esterol esterasa.
Las glicoproteínas son proteínas que, de forma natural, contienen una o más cadenas glucídicas que se unen covalentemente a ciertas asparaginas, serinas y treoninas durante la biosíntesis proteica. En el caso de su unión a asparagina, el grupo amino de la cadena lateral se asocia al carbohidrato mediante enlace /V-glicosídico, mientras que con serina y treonina se establece un enlace O-glicosídico al condensarse el hidroxilo de sus cadenas laterales con otro del monosacárido. La porción glucídica de las glicoproteínas es muy variable, pudiendo encontrarse desde monosacáridos hasta largas y complejas cadenas de diferente composición, estructura, y grado de ramificación. En esta invención se describen preferentemente glicoproteínas con actividad lipasa, inmovilizadas covalentemente mediante la formación de una amina secundaria sobre partículas magnéticas, así como su uso específico según se describe en la presente invención. Las lipasas, sobre todo aquéllas producidas por microorganismos, son las principales enzimas empleadas con fines biotecnológicos en la producción de biodiesel. Algunas enzimas producidas por hongos tienen una amplia versatilidad de sustrato y combinan la actividad lipasa con una importante actividad esteral esterasa, que tal y como se ha mencionado anteriormente se denominan lipasas versátiles, por lo que dichas enzimas, pese a encontrarse descritas como esteral esterasas, también son capaces de sintetizar biodiesel en las condiciones adecuadas. En una realización más preferida la glicoproteína, preferentemente una glicoproteína con actividad lipasa, más preferentemente la esteral esterasa/lipasa inmovilizada covalentemente sobre las partículas magnéticas según la presente invención es una lipasa versátil, según se ha definido anteriormente, sintetizada de forma natural por el hongo filamentoso dimórfico Ophiostoma piceae. Dicha esteral esterasa/lipasa o lipasa versátil nativa es una glicoproteína de masa molecular 66 kDa que comprende un 8% de glicosilación (Calero-Rueda et al. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics 2002, 1599:28-35).
En la presente invención, el término "gen esteral esterasa" se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica la esteral esterasa/lipasa o lipasa versátil de O. piceae y se identifica por la SEQ. ID NO: 1.
A efectos de la presente invención, los términos, glicoproteína con actividad lipasa, esteral esterasa/lipasa y lipasa versátil, se utilizan indistintamente a lo largo del presente documento y se refieren al grupo de proteínas que presentan actividad lipasa, pudiendo ser lipasas estrictas y/o lipasas versátiles. La forma nativa de la esteral esterasa/lipasa o lipasa versátil de la presente invención comprende la secuencia aminoacídica completa de la proteína codificada por el gen esteral esterasa de O. piceae, incluyendo el péptido señal (SEQ. ID NO: 2). La forma madura de dicha enzima comprende la secuencia aminoacídica codificada por el gen esteral esterasa, sin incluir el péptido señal y se identifica con la SEQ ID NO: 3. En adelante se hablará de enzima nativa como la forma madura, sin péptido señal, para diferenciarla de las formas recombinantes.
En la presente invención las expresiones "expresión heteróloga" y "gen heterólogo" se refieren a la introducción de un gen extraño (heterólogo) en un organismo con el fin de modificar su material genético y los productos de expresión. A efectos de la presente invención, dicho organismo es una levadura metilotrófica, preferentemente Pichia pastoris. En una realización particular, la secuencia aminoacídica madura codificada por el gen esteral esterasa, se expresa en la levadura P. pastoris, empleando como péptido señal el pre-propéptido del factor α de Saccharomyces cerevisiae, según se describe en el documento Barba-Cedillo et al. (Microbial Cell Faetones 2012, 1 1 :73) dando lugar a la esteral esterasa/lipasa o lipasa versátil recombinante descrita en la presente invención. Esta lipasa versátil recombinante presenta modificaciones en su secuencia aminoacídica, que comprende entre 6-8 aminoácidos nuevos en el extremo N- terminal, añadidos sobre la secuencia aminoacídica de la proteína nativa madura. En una realización más preferida, la lipasa versátil recombinante procedente de O. piceae y expresada en la levadura P. pastoris (OPEr), comprende la secuencia SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.
En la presente invención, los términos "lipasa versátil", "esteral esterasa/lipasa" se utilizan indistintamente a lo largo del presente documento y se refieren a una secuencia aminoacídica de la enzima con actividad esteral esterasa y lipasa codificada por el gen esteral esterasa de Ophiostoma piceae. Dicha enzima es extracelular y puede ser nativa cuando se expresa en el organismo original (aunque al ser extracelular haya perdido el péptido señal y se hable de proteína madura) o recombinante si la secuencia completa de la proteína o la secuencia de la proteína madura se expresa en otro organismo.
En otra realización preferida, la lipasa versátil de la presente invención se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. En una realización más preferida, la enzima lipasa versátil se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. A efectos de la presente invención, además de las lipasas versátiles de SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, cualquier experto en la materia puede utilizar cualquier glicoproteína nativa o recombinante de cualquier origen biológico con actividad lipasa conocida, tales como las lipasas nativas o recombinantes producidas por otros hongos distintos a O. piceae, por ej.: Candida sp., Candida rugosa, Melanocarpus albomyces, Candida antárctica (Cal A, Cal B), Thermomyces lanuginosus, Rhizopus oryzae, Mucor miehei, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Nectria haematococca, o Plicaturiopsis crispa. En una realización más preferida, la glicoproteína, preferentemente la lipasa versátil, inmovilizada sobre partículas magnéticas según se describe en la presente invención, es preferentemente la lipasa versátil que comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, inmovilizada sobre la partícula magnética Fe304. A efectos de la presente invención se entiende por partícula magnética o partícula con propiedades magnéticas a aquélla partícula que, siendo o no siendo intrínsecamente magnética, se ve atraída hacia un campo o fuerza magnética cuando se la expone a este. Preferentemente, las partículas tienen propiedades magnéticas del tipo superparamagnéticas o ferromagnéticas. En una realización preferida, la partícula magnética es partícula de metal, óxido de metal, mezcla de óxidos metálicos, aleaciones metálicas o mezcla de ellas que tengan propiedades magnéticas. Son preferidas las partículas magnéticas que se seleccionan de la lista que consiste en: óxidos de hierro, metales, materiales ferromagnéticos y aleaciones. Mas preferentemente, las partículas magnéticas preferidas se seleccionan de la lista que consiste en: magnetita (Fe304), maghemita, (yFe203); partículas magnéticas a base de metales, tales como hierro, cobalto y níquel, partículas magnéticas a base de materiales ferromagnéticos de tipo espinela tales como, MgFe204, MnFe204 y CoFe204; y partículas magnéticas a base de aleaciones tales como CoPt3 y FePt. El núcleo magnético de la nanopartícula puede estar protegido por una cubierta inorgánica (por ejemplo, de sílice, carbono o metales preciosos), orgánica (por ejemplo de surfactantes o polímeros), o de óxidos. La presencia de esta cubierta facilita su funcionalización. En la presente invención se prefieren partículas magnéticas de óxido de hierro, especialmente partículas de magnetita (Fe304) o maghemita (yFe203). Preferentemente, en la invención se emplean partículas magnéticas de tamaños comprendidos entre 0,001-100 μηι. En otra realización preferida, las partículas magnéticas son preferentemente mi ero partículas magnéticas o nanopartículas magnéticas, preferentemente nanopartículas magnéticas de entre 1- 130 nm y más preferentemente entre 10-30 nm. Una realización particularmente preferida de la presente invención se refiere a cualquiera de las glicoproteínas, más preferentemente a las glicoproteínas de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5, inmovilizada covalentemente según se describe en la presente invención, sobre la partícula magnética Fe304. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la obtención de las partículas magnéticas descritas anteriormente. Cualquiera de los métodos conocidos por un experto en el campo técnico de las partículas magnéticas puede utilizarse en la presente invención. Así, métodos conocidos para la síntesis de partículas magnéticas se seleccionan de la lista que consiste en: co-precipitación, micro-emulsión, descomposición térmica, ruta solvo-térmica, ruta sono-química, proceso asistido por microondas, proceso Laux, tratamiento de minerales de óxido de hierro, pirólisis láser, deposición de vapor, descarga en arco, síntesis en fase gaseosa, síntesis en fase sólida, reducción química u otros. Preferentemente, el proceso para dar lugar a la partícula magnética de la invención, es la co-precipitación.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis de la glicoproteína inmovilizada covalentemente mediante la formación de una amina secundaria sobre partículas magnéticas según se ha descrito previamente en el presente documento, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
a) generar grupos aldehido en las cadenas glucídicas de la glicoproteína, b) funcionalizar las partículas magnéticas, preferentemente con grupos amino en su superficie,
c) incubar la glicoproteína de la etapa a) con un agente reductor, preferentemente suave y con la partícula magnética amino funcionalizada de la etapa b), y d) estabilizar la unión de la glicoproteína inmovilizada sobre las partículas magnéticas obtenidas en la etapa c).
En una realización preferida, el procedimiento de síntesis de la glicoproteína inmovilizada covalentemente sobre las partículas magnéticas mediante la formación de una amina secundaria, se caracteriza por que la generación de grupos aldehido en las cadenas glucídicas de la glicoproteína de la etapa a) se lleva a cabo mediante un proceso de oxidación, preferentemente en presencia de un agente oxidante.
A efectos de la presente invención, se entiende por agente oxidante cualquier compuesto conocido en la técnica capaz de oxidar a otro en contacto con él. Preferiblemente el agente oxidante se selecciona entre aquéllos capaces de generar grupos aldehido en cadenas glucídicas. En otra realización más preferida aún, el agente oxidante capaz de generar grupos aldehido en cadenas glucídicas se selecciona de la lista que consiste en: enzimas, que se seleccionan de la lista que consiste en oxidorreductasas, aldosa oxidasas, alcohol deshidrogenasas y oxidasas, y agentes químicos oxidantes. En la presente invención los agentes químicos oxidantes se seleccionan de entre 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy radical (TEMPO), periodinato Dess-Martin, tetraacetato de plomo Pb-(02CCH3)4, bismutato sódico (NaBi03), ácido periódico o periodatos. Son particularmente preferidos los periodatos y más preferentemente el periodato sódico (Nal04) y potásico (KI04).
De acuerdo con una realización preferida, el agente químico oxidante se aplica en forma líquida, generalmente disuelto en solvente acuoso, lo cual facilita y potencia su acción oxidativa. Según una realización preferida, la concentración de la solución del agente oxidante está comprendida entre 5 a 50 mM, más preferentemente 10 mM.
En otra realización preferida del procedimiento de síntesis de la glicoproteína inmovilizada sobre partículas magnéticas de la invención se caracteriza por que la funcionalización de la etapa b) se lleva a cabo mediante la unión de grupos amino a su superficie, preferentemente mediante cualquiera de los procedimientos seleccionados de la lista que consiste en: silanización, recubrimiento con sustancias orgánicas tales como por ejemplo polímeros, surfactantes, etc, o con sustancias inorgánicas tales como carbono, metales preciosos u óxidos, entre otros. En otra realización preferida, la funcionalización de la etapa b) es preferiblemente la unión de grupos amino mediante silanización de la superficie de la partícula magnética.
A efectos de la presente invención, las partículas magnéticas se recubren de una capa de silicio mediante un procedimiento denominado silanización, y se funcionalizan con grupos amino en su superficie. Los grupos amino pueden estar unidos directamente o mediante un espaciador al grupo silano. A efectos de la presente invención, el término espaciador se refiere a un grupo capaz de unir el grupo sililo con el grupo amino terminal. Preferentemente, el espaciador es un grupo alquilo, más preferentemente un grupo alquilo C1-C10. A efectos de la presente invención el término "alquilo C1-C10" se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n- butilo, tert-butilo, sec-butilo, n-pentilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 8 átomos de carbono y más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono. Más preferiblemente, las partículas magnéticas de la invención se silanizan y funcionalizan mediante grupos alquil-amino.
La silanización, así como cualquiera de los otros métodos descritos anteriormente, y la funcionalización se pueden realizar en una única etapa, utilizando un único reactivo que cumpla las dos funciones, o bien empleando dos reactivos, siendo uno de ellos un agente exclusivamente silanizante para lograr una cubierta de un grupo que comprende silicio más gruesa sobre la nanopartícula, donde dicho agente es preferentemente el tetraetoxisilano (TEOS), y otro agente silanizante que además comprende el grupo funcional deseado para funcionalizar la partícula magnética. En una realización más preferida, la silanización y la funcionalización tienen lugar con un solo reactivo y en una única etapa. A efectos de la presente invención, los agentes silanizantes capaces de incorporar grupos amino funcionales en la superficie de la partícula magnética se seleccionan de la lista que consiste en (3- aminopropil)trietoxisilano (APTES), (3-aminopropil)trimetoxisilano, 3[2-(2- aminoetilamino)etilamino] propiltrimetoxisilano, 3-(2-aminoetilamino)- propildimetoximetilsilano, [3-(2-aminoetilamino)propil] trimetoxisilano, 3- aminopropildimetilmetoxisilano, 3-aminopropil(dietoxi)metilsilano. En una realización preferida, la silanización y funcionalización de la partícula magnética se lleva a cabo con 3-aminopropil trietoxisilano (APTES).
En otra realización preferida, la concentración de 3-aminopropil trietoxisilano está comprendida entre 5 a 150 mM, más preferentemente de entre 100 a 130 mM. En otra realización preferida, una vez finalizado el proceso, la concentración de grupos amino accesibles en la superficie de la partícula magnética está comprendida entre 5 a 100
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partícula magnética, más preferentemente entre 5 a 40 partícula magnética. En otra realización preferida, las partículas magnéticas de la invención, previamente silanizadas o recubiertas de materiales poliméricos tales como por ejemplo el amino- polivinil alcohol pueden incorporar grupos hidrazida sobre su superficie.
En otra realización preferida del procedimiento de obtención de la glicoprotreína inmovilizada covalentemente según se describe en la presente invención, éste se caracteriza por que la glicoproteína que comprende grupos aldehido en su sus cadenas glucídicas, preferentemente obtenidos mediante oxidación, según se indica en la etapa a), se mantiene en incubación con la partícula magnética amino funcionalizada de la etapa b) en presencia de un agente reductor, durante un tiempo de entre 1 a 20 h, más preferentemente durante al menos 2 h, y a una temperatura de entre 4 a 37 °C, más preferentemente a 28 °C, con una concentración de proteína de entre 0,01 a 1 mg de proteína por mg de nanopartículas, más preferentemente de entre 0,02 a 0,04 mg de proteína por mg de nanopartículas.
A efectos de la presente invención se entiende por agente reductor o donador de protones, a cualquier compuesto capaz de ceder electrones a un agente oxidante. Preferiblemente el agente reductor es un agente reductor suave, y más preferentemente se selecciona de la lista que consiste en hidruros metálicos como borohidruro de sodio (NaBH4), hidruro de litio, hidruro de litio y alumninio, cianoborohidruro de sodio, cianoborohidruro de litio, boranos como el trimetil amino borano (TMAB) o el α-picolino borano, triacetoxi borohidruro sódico, o borohidruro de sodio modificado con sales metálicas polivalentes o activado por ácidos. En una realización más preferida, el agente reductor es el TMAB. De acuerdo con una realización preferida, el agente reductor utilizado se aplica en forma líquida, lo cual facilita y potencia la acción reductora del mismo. Según una realización preferida, la concentración de la solución del agente reductor está comprendida entre 100 y 300 mM, más preferentemente 150 mM.
En otra realización preferida del procedimiento de obtención de la glicoproteína inmovilizada covalentemente según se describe en la presente invención, éste se caracteriza por que la estabilización de la etapa d) se produce mediante aminación reductiva para dar lugar a una amina secundaria estable. Según una realización preferida, la concentración de la solución del agente reductor utilizado en esta etapa está comprendida entre 0,5 a 5 mg/mL, más preferentemente 1 mg/mL. A efectos de la presente invención, la inmovilización covalente entre la partícula magnética amino funcionalizada en su superficie con la glicoproteína, preferentemente con la enzima con actividad lipasa, preferentemente con la lipasa versátil descrita en la invención, se produce mediante la formación de una amina secundaria tal y como se ha comentado previamente. Dicho tipo de inmovilización se lleva a cabo específicamente a través de las cadenas glucídicas oxidadas de la enzima con actividad lipasa, preferentemente con la lipasa versátil sobre la superficie de la partícula magnética amino funcionalizada, preferentemente amino-alquil funcionalizada, mediante la reacción de los aldehidos previamente generados vía oxidación en las cadenas glucídicas de la esterol esterasa/lipasa, formando una ¡mina (base de Schiff) con los grupos amino de las partículas magnéticas, y donde dicha ¡mina se estabiliza mediante aminación reductiva para dar lugar a una amina secundaria estable. Dicho procedimiento de inmovilización covalente entre los grupos amino de la partícula magnética funcionalizada y los azúcares oxidados de la glicoproteína, mantiene la integridad estructural de la enzima, cuya secuencia proteica no interviene en la interacción con la partícula magnética. Además, la inmovilización a través de las cadenas glucídicas de la enzima aporta una unión al soporte por múltiples puntos haciéndola muy estable, mientras que permite que se mantenga un cierto grado de flexibilidad en la preparación, lo que facilita el acceso de los sustratos al centro activo y la evacuación de los productos sintetizados. Adicionalmente, la inmovilización covalente de la enzima con actividad lipasa, preferentemente de la lipasa versátil de la invención mediante la formación de una amina secundaria con la partícula magnética amino-funcionalizada incrementa la estabilidad y eficiencia de dicho catalizador, específicamente en su uso para la síntesis de biodiesel, así como la reciclabilidad de la enzima inmovilizada.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis de ésteres de alquilo que comprende la transesterificación y/o esterificación de una fuente de ácidos grasos con un alcohol, en presencia de una preparación enzimática o crudo que comprende un catalizador (enzima), preferentemente una glicoproteína con actividad lipasa, inmovilizada covalentemente mediante la formación de una amina secundaria sobre partículas magnéticas, según se describe en la presente invención. La preparación enzimática que comprende un catalizador o enzima con actividad lipasa inmovilizada covalentemente mediante un grupo amino secundario sobre partículas magnéticas según se describe en la presente invención, mantiene su actividad en una mezcla de alcohol de cadena corta, preferentemente metanol, y de glicéridos, preferentemente de ácidos grasos de cadena larga, con o sin ácidos grasos libres, sin necesidad de cosolventes. Las reacciones de transesterificación y/o esterificación catalizadas por la glicoproteína con actividad lipasa, preferentemente la lipasa versátil procedente del hongo O. piceae, no necesitan ningún tipo de aditivo o cosolvente para llevar a cabo la transesterificación de mono- di- y triglicéridos dando lugar a ésteres metílicos y glicerol y la esterificación de los ácidos grasos libres que los acompañan para producir los correspondientes ésteres metílicos y agua como productos.
Así, el procedimiento de síntesis de ésteres de alquilo que comprende la transesterificación y/o esterificación de una fuente de ácidos grasos con un alcohol, en presencia de una preparación que comprende una glicoproteína, preferentemente una glicoproteína con actividad lipasa, inmovilizada covalentemente mediante la formación de una amina secundaria sobre partículas magnéticas según se describe en la presente invención, ha producido los mejores rendimientos en comparación con otros procedimientos de inmovilización enzimática de dicha enzima e incluso otras enzimas comerciales con actividad lipasa. Además, tal y como se observa en los ejemplos incluidos en la presente invención, la enzima o catalizador se recupera de forma sencilla y eficiente, simplemente mediante la aplicación de un campo magnético. Adicionalmente, se ha puesto también de manifiesto que la actividad de la enzima de la presente invención no disminuye significativamente a lo largo del tiempo, y que tras al menos 10 ciclos de reacción consecutivos mantiene más del 70% de dicha actividad. La enzima inmovilizada también cataliza esta reacción en presencia de cosolventes como hexano, tolueno o isooctano, más preferentemente en isooctano, aunque en estas condiciones la reacción transcurre más lentamente.
Los términos "esterificación" y "transesterificación" tal y como se usan en la presente invención, se refieren respectivamente a la reacción que se produce entre un ácido graso y un alcohol, o un mono, di o triglicérido de ácidos grasos y un alcohol. Los sustratos empleados pueden comprender mezclas de ácidos grasos y glicéridos, por lo que al mezclarse con un alcohol tendrían lugar ambos tipos de reacciones. En los dos casos se sintetizan ésteres de ácidos grasos, pero en la esterificación se libera agua como subproducto mientras que en la transesterificación se libera glicerol. La transesterificación puede ser catalizada por bases, ácidos o enzimas. A efectos de la presente invención, el procedimiento de transesterificación se lleva a cabo en presencia de enzimas, preferentemente glicoproteínas con actividad lipasa como por ejemplo las lipasas estrictas, versátiles, o esterol esterasas con actividad lipasa, o de microorganismos que las producen. En una forma de realización, los ésteres de alquilo se obtienen a partir de la preparación lipídica de acuerdo a la invención mediante la transesterificación o esterificación de los glicéridos o ácidos grasos que forman parte de la preparación lipídica.
El término "biodiesel" según se usa en la presente invención, se refiere a una composición química compuesta fundamentalmente por ésteres monoalquílicos o alquílicos de ácidos grasos de cadena larga. Los ésteres que forman parte del biodiesel son ésteres metilo, etilo, propilo o butilo y los ácidos grasos proceden de la composición lipídica de acuerdo a la presente invención. En formas preferidas de realización, el biodiesel de acuerdo a la presente invención comprende uno o varios de los siguientes ésteres alquílicos de ácidos grasos: esteres metílicos de ácidos grasos (FAME o fatty acid methyl esteή, esteres etílicos de ácidos grasos (FAEE o fatty acid ethyl esters), ésteres propílicos de ácidos grasos (FAPE o fatty acid propyl esters), ésteres butílicos de ácidos grasos (FABE o fatty acid butyl esters). En una forma preferida de la invención, el biodiesel es un combustible que está compuesto en su totalidad por ésteres de origen biológico que no contienen diésel procedente del petróleo y que comprende monoalquil ésteres de ácidos grasos de cadena larga. Este tipo de biodiesel se conoce como B100 e indica que el 100% del combustible es biodiesel. A efectos de la presente invención se consideran ácidos grasos de cadena larga los que contienen un número de átomos de carbono comprendido entre 14 y 22. Los ácidos grasos de cadena larga se seleccionan de la lista que consiste en: ácido mirístico o tetradecanoico (14:0), ácido miristoleico o cis-9-tetradecenoico (14: 1), ácido pentadecílico o pentadecanoico (15:0), ácido pentadecenoico (15:1), ácido palmítico o hexadecanoico (16:0), ácido palmitoleico o hexadecenoico (16: 1), ácido hexadecadienoico (16:2), ácido hexadecatrienoico (16:3), ácido margárico o heptadecanoico (17:0), ácido heptadecenoico (17: 1), ácido esteárico u octadecanoico (18:0), ácido oleico u octadecenoico (18: 1), ácido linoleico u octadecadienoico (18:2), ácido linoleico u octadecatrienoico (18:3), ácido estearidónico u octadecatetraoico (18:4), ácido araquídico o eicosanoico (20:0), ácido eicosenoico (20: 1), ácido eicosadienoico (20:2), ácido eicosatrienoico (20:3), ácido araquidónico o eicosatetraenoico (20:4), ácido eicosapentaenoico (20:5), ácido behénico o docosanoico (22:0), ácido docosenoico (22: 1), ácido docosatetraenoico (22:4), ácido docosapentaenoico (22:5) y ácido docosahexaenoico (22:6). Aunque en general un biodiesel concreto contiene una especie molecular predominante, las materias primas empleadas para su producción suelen ser mezclas que contienen también ácidos grasos de cadena corta, media o muy larga, que se transforman igualmente en ésteres monoalquílicos durante el proceso y forman parte de la mezcla final de biodiesel. El documento de Hoekman et al. (Renewable and Sustainable Energy Reviews 2012, 16: 143-169), recoge un listado de los ácidos grasos más frecuentemente encontrados en el biodiesel y la descripción del perfil de ácidos grasos del biodiesel (ésteres metílicos) obtenido a partir de diferentes aceites y grasas.
En todas las realizaciones y aspectos de la invención, el alcohol puede ser un alcohol de cadena corta, por ejemplo, alcohol de alquilo C1-C6, más específicamente alcohol de alquilo C1-C4, particularmente metanol o etanol, más preferiblemente metanol. Cuando dicho alcohol es metanol, dichos ésteres de ácidos grasos resultantes son ésteres de metilo de ácidos grasos (FAME - Biodiesel). Cuando dicho alcohol es etanol, dichos ésteres de ácidos grasos resultantes son ésteres de etílicos de ácidos grasos. Cuando dicho alcohol es propanol, dichos ésteres de ácidos grasos resultantes son ésteres de propilo de ácidos grasos. Cuando dicho alcohol es butanol, dichos ésteres de ácidos grasos resultantes son ésteres de butilo de ácidos grasos. El alcohol también puede ser un alcohol graso de cadena media (C6-C10) o alcoholes grasos de cadena larga (C12-C22). El dador de alcohol puede ser un éster de monoalquilo o un carbonato de dialquilo, tal como carbonato de dimetilo o carbonato de dietilo.
En una realización preferida, el procedimiento de síntesis de ésteres de alquilo descrito en la presente invención se caracteriza porque la preparación o crudo enzimático comprende la lipasa versátil recombinante (OPEr) de la presente invención, preferentemente la OPEr que comprende las secuencias SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, a una concentración de proteínas entre 1 a 20 mg/mL, preferentemente entre 2 a 10 mg/mL, más preferentemente entre 3 a 4 mg/mL, donde dicha concentración de proteínas comprende entre 100 y 450 unidades de actividad lipasa versátil (OPEr) por mililitro medida frente a p-nitrofenil butirato, más preferentemente entre 150-300 unidades de actividad por mililitro. A efectos de la presente invención los términos preparación enzimática o crudo, utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, se refieren al líquido y/o sobrenadante obtenido del cultivo del microorganismo empleado para la producción de la enzima lipasa versátil nativa (OPE), donde dicho líquido y/o sobrenadante comprende las secuencias SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, o recombinante (OPEr) que comprende las secuencias SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.
En otra realización preferida, la preparación enzimática de la invención o crudo que comprende la lipasa versátil nativa (OPE) que comprende las secuencias SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y/o recombinante (OPEr) que comprende las secuencias SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, puede concentrarse, preferentemente mediante ultrafiltración a través de membranas de entre 3 y 50 kDa de poro, más preferiblemente de entre 10 y 50 kDa. Cualquier método conocido por un experto en la materia puede ser utilizado para concentrar el crudo utilizado en el presente procedimiento de la invención. En otra realización preferida, la preparación enzimática de la invención también puede ser una preparación enzimática o crudo purificado. Cualquier método conocido en la técnica para la purificación enzimática puede ser utilizado en la presente invención.
En otra realización preferida, el procedimiento de síntesis de ésteres de alquilo descrito en la presente invención se caracteriza porque la reacción de transesterificación y/o esterificación transcurre a una temperatura de entre 20 y 60 °C, preferentemente entre 25 y 50 °C, más preferentemente de entre 25 y 35 °C. El hecho de que este catalizador, tanto libre como inmovilizado, lleve a cabo una síntesis eficiente de FAMEs a temperaturas inferiores a las descritas en otros procedimientos, generalmente entre 35-60 °C, según se describe en el documento de Gumba et al. (Biofuel Research Journal 2016, 3:431-447), representa una considerable reducción del coste energético asociado al proceso de síntesis de biodiesel.
En otra realización preferida, el procedimiento de síntesis de ésteres de alquilo descrito en la presente invención se caracteriza porque la reacción se lleva a cabo a un pH de entre 2 a 10, preferentemente a un pH ácido de 2 a 5.
En otra realización preferida, el procedimiento de síntesis de ésteres de alquilo descrito en la presente invención se caracteriza porque la reacción puede tener lugar en un medio con hasta 30% de agua, preferentemente con menos del 10% y más preferentemente en ausencia de agua. El hecho de que la lipasa versátil inmovilizada según se describe en la presente invención catalice la síntesis de biodiesel tanto en ausencia como en presencia de cierta cantidad de agua hace esta enzima particularmente interesante, ya que por una parte no requiere la adición de agua para su actividad, y por otra parte es tolerante a la presencia de agua en la materia prima empleada como sustrato y al agua producida por la esterificación de los ácidos grasos libres que pudiera contener dicho sustrato. Otros procedimientos descritos en el estado de la técnica no son compatibles con la presencia de agua en la mezcla de reacción y requieren el empleo de sistemas de eliminación del agua (Mehrasbi et al. Renewable Energy 2017, 101 :593-602).
En otra realización preferida, el procedimiento de síntesis de ésteres de alquilo descrito en la presente invención se caracteriza porque la reacción se lleva a cabo en presencia o ausencia de un cosolvente. A efectos de la presente invención los cosolventes preferidos se seleccionan de la lista que consiste en hexano, tolueno e isooctano. En una realización aún más preferida, la reacción se lleva a cabo sin añadir ningún cosolvente.
A efectos de la presente invención, la fuente de ácidos grasos usada en el proceso de la invención puede comprender al menos uno de entre cualquiera de los siguientes: aceite vegetal, preferentemente aceite de semillas de soja, aceite de cañóla, aceite de algas, aceite de colza, aceite de oliva, aceite de ricino, aceite de palma, aceite de girasol, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de Jatropha, aceite de Camelina, aceite de maíz crudo; grasa animal, preferentemente, aceite de pescado; grasa derivada de animales; aceite usado; grasa quemada; triglicéridos de aceite derivados de fuentes vegetales no comestibles; glicéridos parciales y ácidos grasos libres derivados de esos aceites; o cualquier mezcla de al menos dos de los mismos, en cualquier relación deseada. En otra realización más preferida del procedimiento de la presente invención, la fuente de ácidos grasos comprende ácidos grasos libres, mono-, di- o triglicéridos, sus mezclas en cualquier relación, ésteres de ácidos grasos y amidas, en ausencia o presencia de otros derivados de ácidos grasos secundarios tales como fosfolípidos y ésteres de esteral, dicha fuente de ácidos grasos está sin refinar, refinada, blanqueada, desodorizada o cualquiera de sus combinaciones. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Comparación de la estabilidad a temperatura (A) y pH (B) de OPEr libre e inmovilizada covalentemente a través de sus cadenas glucídicas sobre partículas magnéticas amino funcionalizadas (AMNP-CH-OPEr).
Fig. 2. Comparación de la eficiencia en síntesis de biodiesel y la estabilidad operacional de las lipasas Cal A (barra blanca), Cal B (barra gris claro) y OPEr (barra gris oscuro), inmovilizadas covalentemente sobre nanopartículas magnéticas amino- funcionalizadas a través de sus cadenas glucídicas (AMNP-CH), y de la preparación comercial de Cal B inmovilizada por adsorción Novozym 435 (N 435) (barra negra). La reacción se produjo a partir de aceite doméstico reciclado y metanol (relación molar 1 :4) a 28 °C y con agitación orbital de 100 rpm. C1 , C2, C3, C4 y C5 hace referencia a cada uno de los ciclos de reacción llevados a cabo por las mismas enzimas ensayadas en las mismas condiciones cada ciclo. Fig. 3. Comparación de la eficiencia y estabilidad operacional de OPEr inmovilizada covalentemente mediante AMNP-CH (barra gris oscura) y mediante interacción hidrofóbica sobre partículas comerciales SiMag-Octyl (barra gris clara). Se ha asignado el 100% al valor obtenido para el primer ciclo de reacción con AMNP-CH- OPEr. C1 , C2, C3, C4 y C5 hace referencia a cada uno de los ciclos de reacción llevados a cabo por las mismas enzimas ensayadas en las mismas condiciones cada ciclo.
Fig. 4. Cromatogramas comparando la síntesis de oleato de metilo a partir de trioleína y metanol (relación molar 1 :4) en reacciones de 72 h sin cosolvente, a 28 °C y 200 rpm. Las reacciones fueron catalizadas por: a) Novozym 435, b) OPE inmovilizada sobre Sepabeads, y c) OPE inmovilizada sobre Eupergit.
Fig. 5. Análisis del escalado de la síntesis de biodiesel a partir de mezclas de aceite reciclado y metanol, en ausencia de cosolvente, y a dos volúmenes de reacción diferentes. La cantidad del catalizador AMNP-CH-OPEr utilizada en cada reacción (0, 1 y 3,4 g) fue proporcional al volumen de la misma. En el eje X se muestra el porcentaje de triglicéridos y en el eje Y el tiempo expresado en horas.
Fig. 6. Cromatograma obtenido tras 9 horas de reacción de síntesis de biodiesel en presencia de 3,4 g de catalizador AMNP-CH-OPEr. La figura muestra la transformación de la mayor parte de los triglicéridos, aunque aún quedan pequeñas cantidades de diglicéridos, monoglicéridos y ácidos grasos libres.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Materiales y métodos
Las partículas de magnetita desnuda (MNPs) utilizadas en los ejemplos incluidos en la presente descripción tienen un tamaño de entre 20-30 nm y proceden de lolitec GmbH (Heilbronn, Alemania). Dichas partículas magnéticas se amino-funcionalizaron en el laboratorio con 3-aminopropil trietoxisilano (APTES, Sigma). Para los ensayos comparativos se adquirieron nanopartículas de magnetita comerciales ya funcionalizadas y listas para la inmovilización de la enzima lipasa versátil utilizada en la invención. Dichas nanopartículas de magnetita comerciales son: SiMAG-Amine que presenta grupos amino (estas nanopartículas son el análogo comercial de las utilizadas en la presente invención) y SiMAG-Octyl-C8 que comprenden grupos octilo, ambas de Chemicell. Las nanopartículas SiMAG-Octyl-C8 se utilizan para comparar el procedimiento de inmovilización descrito en la presente invención con otro procedimiento no covalente, aunque sí apto para la inmovilización de proteínas hidrofóbicas sobre partículas magnéticas. La enzima con actividad lipasa versátil utilizada es la lipasa versátil presente en cualquier crudo producido por cualquier microorganismo que comprenda el gen de la esteral esterasa del hongo Ophiostoma piceae (OPE). Para los diferentes ensayos comparativos también se utilizaron las lipasas comerciales Cal A (NS 40020) y Cal B (Lipozyme L) ambas de Novozymes. Dichas enzimas comerciales de Novozymes, al ser también glicoproteínas, se inmovilizaron mediante el procedimiento descrito en la invención, es decir, se inmovilizaron covalentemente sobre partículas magnéticas amino-funcionalizadas en su superficie, para así comparar la validez de dicho método de inmovilización y su efecto sobre la eficiencia y reciclabilidad de lipasas comerciales, muchas de ellas con propiedades catalíticas mejoradas, cuando son inmovilizadas mediante dicho procedimiento. También se comparó la actividad en la síntesis de biodiesel de la enzima Novozym 435 (Novozymes), la forma comercial de la enzima Cal B inmovilizada por adsorción sobre Lewatit VP OC 1600, una resina acrílica macroporosa.
La medida de la actividad lipasa en las preparaciones enzimáticas o crudos que comprenden la enzima libre y en los sobrenadantes tras la inmovilización (actividad residual) se valoró espectrofotométricamente (A410 nm) mediante la liberación de p- nitrofenol a partir de palmitato de p-nitrofenilo (p-NPP) y/o butirato de p-nitrofenilo (p- NPB), según se describe en Gutiérrez-Fernández et al. (Journal of Structural Biology 2014, 187:215-222). El p-NPP es un sustrato típico para evaluar la actividad lipasa, ya que es un aril-éster de ácido graso de cadena larga, mientras que el p-NPB es el sustrato más apropiado para la medida de actividad esterol esterasa al ser un aril- éster de un ácido graso de cadena corta. La actividad lipasa de las enzimas OPEr y Cal A pudo ser determinada utilizando p-NPP como sustrato, sin embargo, la enzima Cal B se inactivo en las condiciones de reacción ensayadas. Para lograr una suspensión homogénea del sustrato p-NPP, que es insoluble en agua, es preciso añadir un detergente en el medio de reacción y probablemente la enzima Cal B resulta inactivada debido a la acción de dicho detergente. Por esta razón, se determinó también la actividad de las tres enzimas frente a p-NPB, ya que este sustrato es soluble y no es necesario añadir detergente. En el caso de las enzimas Cal A y OPEr, sus actividades lipasa y esterol esterasa resultaron ser similares en las condiciones del ensayo.
Ejemplo 1. Inmovilización de lipasas, a través de sus propias cadenas glucídicas, sobre nanopartículas de magnetita (Fe304) amino-funcionalizadas (AMNP-CH).
Para que una enzima pueda ser inmovilizada a través de sus propias cadenas glucídicas es necesario que dicha enzima sea de naturaleza glicoproteica, ya que este tipo de inmovilización covalente de dicho tipo de enzimas sobre partículas magnéticas amino-funcionalizadas en su superficie se basa en la generación de grupos aldehido a partir de las cadenas glucídicas de la enzima a inmovilizar, que reaccionan con los grupos amino presentes en la superficie de las partículas magnéticas amino- funcionalizadas. Las cadenas glucídicas de la proteína son superficiales y la inmovilización de la enzima por dichas cadenas no modifica la estructura de la proteína ni afecta a la accesibilidad de los sustratos al centro activo de la misma. Entre las enzimas con actividad lipasa inmovilizadas según el procedimiento de la presente invención están OPEr, Cal A y Cal B, todas ellas de naturaleza glicoproteica. Para llevar a cabo la inmovilización de dichas enzimas mediante el procedimiento descrito en la presente invención se realiza un tratamiento de la enzima con Nal04, que produce la rotura del enlace carbono-carbono (C-C) de los monosacáridos cuando dos carbonos adyacentes presentan grupos hidroxilo vecinales (dioles vecinales), oxidando dichos alcoholes a aldehidos. Una vez oxidadas, las enzimas OPEr, Cal A y Cal B se inmovilizan covalentemente sobre las MNPs amino-funcionalizadas (AMNPs) al reaccionar los grupos amino de dichas AMNPs con los aldehidos generados en la glicoproteína vía oxidación, formando una ¡mina (base de Schiff) que se estabiliza mediante aminación reductiva para dar lugar a una amina secundaria estable.
1. 1. Preparación de nanopartículas de magnetita (Fe^O funcionalizadas con grupos amino (AMNPs). Las nanopartículas de Fe304 (lolitec GmbH) fueron silanizadas y funcionalizadas con 3-aminopropil trietoxisilano (APTES, Sigma), compuesto que incorpora grupos amino reactivos en la superficie de la nanopartícula. Basándonos en el método descrito por Chen et al. (International Journal of Molecular Sciences 2013, 14:4613-4628), se mezcla 1 g de las nanopartículas magnéticas, específicamente de las nanopartículas Fe304, con 9,7 mL de etanol en un baño de ultrasonidos durante 20 min. Se añaden 300 μ\- de APTES, sonicando durante 10 min. Se agita en un mezclador a 80 rpm y 28 °C durante 16 h. Una vez transcurrido este tiempo se separan las nanopartículas con ayuda de un imán y se retira el líquido de reacción, lavando las MNPs funcionalizadas con los grupos amino en la superficie de las mismas con 300 mL de etanol al 50% en agua tres veces, sonicando entre lavados. Finalmente, las MNPs amino- funcionalizadas se secan en una estufa de aireación a 65 °C. Se valora la densidad de grupos amino accesibles en las partículas mediante el procedimiento descrito por del Campo et al. (Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2005, 293:33-40), poniendo de manifiesto que presentan grupos amino accesibles en superficie en el rango de 5-15
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soporte, algo inferior al descrito para preparaciones comerciales.
1.2. Oxidación de las cadenas glucídicas de las esterol esterasas/lipasas.
Para que las lipasas se unan covalentemente a las partículas magnéticas amino- funcionalizadas en su superficie según se describe en la presente invención, es necesario oxidar las cadenas glucídicas de dichas enzimas. En los ejemplos mostrados en la presente invención, las lipasas se someten a dicho pre-tratamiento de oxidación, para que las diferencias mostradas en los ensayos comparativos de la síntesis de biodiesel utilizando dichos catalizadores, se deban exclusivamente al tipo de inmovilización realizada, y no al pre-tratamiento oxidativo al que se ha sometido previamente a la enzima. Se han oxidado las preparaciones enzimáticas o los crudos que contienen la enzima OPEr, así como las diferentes preparaciones de enzimas comerciales (Cal A y Cal B). Brevemente, a una solución de lipasa con 20 mg/mL de proteínas totales se le añade Nal04 en Tris-HCI 5 mM pH 7, a concentración final 10 mM. Se mantiene la reacción durante 3 h a 4 °C, en oscuridad y sin agitación, y se dializa frente a Tris-HCI 20 mM pH 7 para eliminar los reactivos y subproductos de baja masa molecular. La oxidación de las cadenas glucídicas de las lipasas se lleva a cabo para generar grupos aldehido en los azúcares de dichas enzimas, y posteriormente, durante el proceso de inmovilización sobre las MNPs amino-funcionalizadas, unir covalentemente estos grupos reactivos a los grupos amino de las nanopartículas. Antes de su uso para la inmovilización, se ajustan las soluciones de cada una de las enzimas con actividad lipasa para que contengan alrededor de 0,5 U de actividad medida frente a butirato de p-nitrofenilo (p-NPB) por mg de la preparación de partículas magnéticas funcionalizadas. 1.3. Inmovilización de lipasas.
Brevemente, se parte de 1 g de AMNPs al que se le añade Tris-HCI 20 mM pH 7 que posteriormente se retira con la ayuda de un imán. En ese mismo vial, se añade tampón Tris-HCI 100 mM pH 8, se agita y a continuación se añade el volumen de la preparación de la lipasa equivalente a una actividad de 0,5 U de actividad por mg de AMNP, y trimetil amino borano (TMAB) a una concentración final de 150 mM. Se agita y se mantiene en agitación a 80 rpm y 28 °C durante 16 h. Posteriormente se retira el sobrenadante, midiendo su actividad residual. Se añaden 30 ml_ de NaBH4 (1 mg/mL) a las nanopartículas magnéticas con la lipasa inmovilizada y se deja reaccionar durante 1 h. Finalmente se lava la preparación de AMNP-CH-OPEr secuencialmente con Tris-HCI 100 mM pH 7 y Tris-HCI 20 mM pH 7, resuspendiéndolas en este último solvente para su almacenamiento a 4 °C.
1.4. Estabilidad a pH y temperatura de las nanopartículas magnéticas con OPEr inmovilizada a través de la unión de sus cadenas glucídicas a MNPs amino- funcionalizadas (AMNP-CH-OPEr) .
Se comparó la estabilidad de la enzima OPEr en los crudos antes (OPEr libre) y después de su inmovilización mediante AMNP-CH (AMNP-CH-OPEr). La estabilidad frente a la temperatura se evaluó en un rango comprendido entre 25 y 70 °C, con el catalizador libre (disuelto) o inmovilizado (resuspendido) en tampón Tris-HCI 20 mM, pH 7. La estabilidad de la enzima OPEr a diferentes pHs se determinó a 4 °C poniendo la muestra de catalizador libre o inmovilizado en tampón Britton & Robinson ajustado a valores de pH comprendidos entre 2 y 10. Se tomaron 500 μ\- del crudo o de la suspensión de AMNP-CH-OPEr conteniendo aproximadamente la misma actividad frente a p-NPB, manteniéndolos durante 24 h en agitación (1200 rpm) en un termobloque a cada una de las temperaturas y pHs ensayados. Tras el tratamiento se midió actividad residual frente a p-NPB, considerando como el 100% el valor obtenido a 25 °C y pH 7, respectivamente. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.
La enzima AMNP-CH-OPEr es más estable a altas temperaturas que la OPEr libre (Fig. 1A). La enzima AMNP-CH-OPEr mantiene un 80% de su actividad hasta los 50 °C, mientras que la enzima OPEr libre conserva solo un 32% de su actividad a la temperatura de 40 °C, y además, se inactiva por encima de esta temperatura.
Con respecto al pH, la enzima AMNP-CH-OPEr muestra una estabilidad igual o mayor que la OPEr libre en todo el rango de pH analizado (pH de 2 a 10). Es interesante destacar la mejora de la actividad a pHs alcalinos (8 y 9) y muy especialmente a pH ácido, donde la actividad llega a duplicarse a pH 2 y 3 (Fig. 1 B). El documento Torres et al. (Catalysis Communications 2008, 9:539-545) describe la inmovilización de la enzima OPE nativa sobre Dilbeads, un soporte macroporoso, y su efecto sobre la estabilidad térmica y de pH en un periodo de 24 h. En este caso se observó un efecto estabilizador frente al incremento de temperatura, y respecto a la estabilidad frente a pH, los autores solo indican un efecto destacable a pH 8.
1.5. Síntesis de biodiesel con lipasas inmovilizadas sobre partículas magnéticas a través de sus cadenas glucídicas.
El análisis de la producción de biodiesel utilizando la lipasa versátil OPEr inmovilizada sobre AMNP-CH según se describe en la presente invención, y comparando dicha producción con la obtenida utilizando otras lipasas comerciales inmovilizadas sobre diferentes sustratos, según se describe en los ejemplos incluidos en el presente documento, se llevó a cabo con 500 μΙ_ de aceite reciclado y metanol (proporción molar 1 :3), y 50 mg de la enzima ensayada (0,3 mg de proteína), sin utilizar cosolventes. Las reacciones se mantuvieron a 28 °C y con agitación rotacional (360°) a 80-100 rpm en un mezclador durante 24 h. Para evaluar la estabilidad de las lipasas ensayadas en estas condiciones de reacción (estabilidad operacional), a las 24 h de reacción se separaron la fase líquida y el catalizador con la ayuda de un imán externo, se lavó el catalizador con Tris-HCI 20 mM pH 7 y se volvió a poner la reacción en las mismas condiciones.
Se realizó un seguimiento de la síntesis de biodiesel a lo largo del tiempo. Las muestras tomadas a las 24 h de reacción fueron analizadas mediante cromatografía de gases, determinando la producción de ésteres metílicos. El oleato de metilo sintetizado se cuantificó utilizando una recta patrón de este compuesto construida empleando colestenona como patrón interno. Los resultados obtenidos para la síntesis de biodiesel catalizada por OPEr, Cal A y Cal B inmovilizadas covalentemente sobre AMNP-CH se presentan en la Fig. 2. Los resultados ponen de manifiesto que las preparaciones de OPEr y Cal A inmovilizadas según se describe en el presente documento, tienen una eficiencia similar, siendo ambas más eficientes que la enzima Cal B también inmovilizada según la presente invención. La estabilidad operacional de AMNP-CH-OPEr y AMNP-CH-Cal A es excelente, ya que aunque en la Fig. 2 solo se muestran los resultados hasta el quinto ciclo de síntesis de biodiesel (24 h cada uno), esta preparación se ha reciclado más de diez veces, con baja pérdida de actividad (se mantiene más del 70% de la actividad inicial en el 10° ciclo). En las mismas condiciones ensayadas, la lipasa Cal B es menos eficiente que la enzima OPEr, tanto en su forma libre como tras su inmovilización como AMNP-CH-Cal B. Aunque en esta forma la enzima AMNP-CH-Cal B mantuvo estable su actividad en los cinco ciclos, dicha actividad es muy escasa comparada con la actividad mostrada por la enzima OPEr inmovilizada sobre AMNP- CH, o por la enzima AMNP-CH-Cal A. Por el contrario, la enzima Novozym 435 (N 435) produjo un rendimiento muy bajo en la síntesis de ésteres metílicos, y la actividad de dicha enzima despareció tras el segundo ciclo.
Estos resultados ponen de manifiesto que el procedimiento de inmovilización sobre partículas magnéticas amino-funcionalizadas en su superficie, a través de los carbohidratos oxidados presentes en las glicoproteínas, permite la eficaz recuperación y reciclado de la enzima.
Ejemplo 2. Síntesis de biodiesel con OPEr inmovilizada sobre nanopartículas comerciales de magnetita (Fe304) funcionalizada con grupos octilo (MNP-Octil- OPEr).
Para comparar la eficiencia del proceso de síntesis de biodiesel mediante la enzima OPEr inmovilizada covalentemente sobre nanopartículas magnéticas amino- funcionalizadas en su superficie (AMNP-CH-OPEr) respecto de otros procedimientos de inmovilización, se utilizó la misma enzima OPEr pero inmovilizada sobre nanopartículas magnéticas funcionalizadas con grupos octilo en su superficie (MNP- Octil-OPEr). La inmovilización de la enzima OPEr sobre nanopartículas magnéticas funcionalizadas con grupos octilo en su superficie tiene lugar por interacción hidrofóbica de la enzima con las cadenas alquílicas de ocho carbonos disponibles en las nanopartículas magnéticas.
Brevemente, la solución comercial de MNP-Octil (Chemicell) contiene 50 mg de nanopartículas por ml_ de H20. Se retira el agua con la ayuda de un imán y se añade el volumen de crudo equivalente a 0,5 U de actividad (medida frente a p-nitrofenil butirato, p-NPB) por mg de soporte y se completa hasta 1 ml_ con Tris 100 mM pH 7. Se mezcla suavemente con una pipeta durante 2 min tras los cuales se retira el sobrenadante utilizando el imán, y a continuación se mide la actividad residual tras la inmovilización. El catalizador inmovilizado se resuspende en Tris-HCI 20 mM pH 7 para su almacenamiento a 4 °C. La Fig. 3 muestra que en el primer ciclo la lipasa OPEr inmovilizada sobre Octil-MNP (MNP-Octil-OPEr) funcionó de forma similar a la enzima inmovilizada sobre AMNP- CH, pero luego la actividad enzimática comenzó a disminuir y en el quinto ciclo casi había desaparecido completamente. Estos resultados ponen de manifiesto la mayor eficiencia y rendimiento en la síntesis enzimática de biodiesel, así como un reciclado de la enzima para futuras reacciones, sencillo y eficiente, sin que la actividad y velocidad de la misma se vea disminuida a lo largo de los ciclos de reacción consecutivos, cuando dicha enzima, preferentemente la enzima OPEr se inmoviliza covalentemente sobre partículas magnéticas amino-funcionalizadas en su superficie, según se describe en la presente invención.
Ejemplo 3. Síntesis de biodiesel con esteral esterasas/lipasas inmovilizadas covalentemente sobre soportes microporosos funcionalizados.
Se inmovilizaron crudos que comprenden la enzima OPE sobre dos soportes microporosos epoxi comerciales: Eupergit (Rohm Inc.) y Sepabeads (Resindion). Dichos soportes microporosos difieren en su geometría interna. Para la inmovilización sobre ambos soportes se añadieron 180 U de enzimas esterol esterasa/lipasas (Novozym 435, OPE inmovilizada sobre Sepabeads y OPE inmovilizada sobre Eupergit) en 1 mL de H20. Las inmovilizaciones se realizaron a 4 °C en un mezclador de rodillos durante 48 h.
Para la inmovilización sobre el soporte Eupergit, se usaron 100 mg de soporte, 1 mL del crudo disuelto en agua y 1 ,5 mL de tampón fosfato 0,5 M pH 8. Para la inmovilización en Sepabeads se partió de 200 mg de soporte (puesto que este material tiene un alto grado de humedad) añadiendo 1 mL del crudo disuelto en agua y 500 de tampón fosfato 1 ,25 mM pH 8. En ambos casos, se enrasó hasta 3 mL con agua. Se realizó un seguimiento de la inmovilización en los dos soportes, tomando muestras a diferentes tiempos. Las muestras se centrifugaron, evaluando la actividad residual tras la inmovilización. Las enzimas así inmovilizadas, Novozym 435, OPE inmovilizada sobre Sepabeads y OPE inmovilizada sobre Eupergit, se ensayaron en reacciones de síntesis de biodiesel a 28 °C y agitación orbital a 200 rpm, en ausencia de cosolvente, utilizando trioleína comercial y metanol (relación molar 1 :4) como sustratos y comparando el resultado obtenido con la enzima OPE inmovilizada sobre Sepabeads o Eupergit, con el obtenido empleando Novozym 435 como catalizador. El seguimiento de estas reacciones se realizó por cromatografía de gases. Las reacciones catalizadas por la enzima OPE inmovilizada sobre ambos soportes transformaron casi totalmente los sustratos aunque más lentamente (72-96 h), mientras que Novozym 435 apenas produjo ésteres metílicos en las condiciones ensayadas (Fig. 4).
Ejemplo 4. Escalado de la inmovilización.
Se prepararon, en paralelo, 1 g y 10 g de AMNP-CH-OPEr. La preparación del soporte funcionalizado, del crudo de OPEr oxidado (30 mL x 2) y las condiciones de inmovilización fueron similares en ambos casos a las descritas en el Ejemplo 1 , excepto por el volumen final de la reacción de inmovilización que no se aumentó proporcionalmente al hacer el escalado. De este modo, con 1 g de soporte funcionalizado (AMNP) el volumen de reacción fue de 20 mL, mientras que al inmovilizar 10 g se añadieron 80 mL. La reacción de inmovilización se escaló 10 veces, obteniendo una enzima inmovilizada con actividad comparable a la producida a menor escala (1 g).
Ejemplo 5. Escalado de la reacción de síntesis enzimática de biodiesel.
Tal y como se ha demostrado en el Ejemplo 1 , las lipasas inmovilizadas, a través de sus cadenas glucídicas, sobre partículas magnéticas según se describe en la presente invención son útiles en la síntesis de ésteres metílicos de ácidos grasos de cadena larga (biodiesel) a partir de 500 de aceite reciclado y metanol (proporción molar 1 :3), utilizando 50 mg del catalizador de la invención AMNP-CH-OPEr recién sintetizado a mayor escala.
Al igual que en las reacciones descritas en el Ejemplo 1 , no se utilizó cosolvente para llevar a cabo el escalado de la reacción de síntesis biodiesel mediante dicho catalizador de la invención. Las condiciones del escalado se describen a continuación: Catalizador (g) Metanol (ml_) Aceite reciclado (ml_)
0,1 0,1 15 0,5
3,4 3,91 17
La proporción molar aceite: metanol fue 1 :5, y el alcohol se dispensó en tres veces, a las 0 h, 5 h y 9 h, para evitar la inactivación del catalizador. La reacción se mantuvo a 100 rpm en un mezclador a una temperatura de entre 25-28 °C. Transcurrido dicho tiempo se analizaron alícuotas de la mezcla de reacción (0, 5, 9 y 24 h) mediante cromatografía de gases para monitorizar la cinética de las dos reacciones. En la Fig. 5 se observa que la disminución de triglicéridos a lo largo de la reacción es similar independientemente del volumen de reacción.
Adicionalmente, el cromatograma registrado a las 9 horas de reacción con 3,4 g del catalizador de la invención AMNP-CH-OPEr muestra que tras este tiempo de reacción se han transformado la mayor parte de los triglicéridos, aunque aún quedan pequeñas cantidades de diglicéridos, monoglicéridos y ácidos grasos libres.
Los resultados del escalado (más de 30 veces) en la producción de biodiesel, demuestran que son comparables con los obtenidos a pequeña escala.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Glicoproteína inmovilizada covalentemente mediante la formación de una amina secundaria sobre partículas magnéticas.
2. Glicoproteína según la reivindicación 1 donde la glicoproteína es una lipasa y/o una esteral esterasa con actividad lipasa.
3. Glicoproteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde la glicoproteína se selecciona de entre cualquiera de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.
4. Glicoproteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la partícula magnética tiene un tamaño de entre 1 a 130 nm.
5. Glicoproteína según la reivindicación 4 donde la partícula magnética tiene un tamaño de entre 10 a 30 nm.
6. Glicoproteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la partícula magnética se selecciona de la lista que consiste en: magnetita (Fe304), maghemita (yFe203), partículas metálicas de hierro, partículas metálicas de cobalto, partículas metálicas de níquel, partículas metálicas de tipo espinela que se seleccionan de la lista que consiste en: MgFe204, MnFe204 y CoFe204, y partículas metálicas a base de aleaciones tales como CoPt3 y FePt.
7. Glicoproteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizada por que comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ I D NO: 4 o SEQ I D NO: 5 inmovilizada sobre la partícula magnética Fe304.
8. Procedimiento de síntesis de glicoproteínas inmovilizadas covalentemente sobre partículas magnéticas mediante la formación de un grupo amino secundario según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
a) generar grupos aldehido en las cadenas glucídicas de la glicoproteína, b) funcionalizar las partículas magnéticas con grupos amino en su superficie,
c) incubar la glicoproteína de la etapa a) con un agente reductor en presencia de la partícula magnética amino funcionalizada de la etapa b), y
d) estabilizar la unión de la glicoproteína inmovilizada sobre la partícula magnética obtenida en la etapa c).
9. Procedimiento según la reivindicación 8 donde la oxidación de la etapa a) se lleva a cabo en presencia de un agente oxidante que se selecciona de la lista que consiste en: 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy radical (TEMPO), periodinato Dess-Martin, tetraacetato de plomo Pb-(02CCH3)4, bismutato sódico (NaBi03), ácido periódico, periodato sódico (Nal04) y periodato potásico (KI04).
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9 donde la funcionalización de la etapa b) se lleva a cabo mediante silanización.
1 1. Procedimiento según la reivindicación 10 donde la funcionalización de la etapa b) y la silanización se llevan a cabo simultáneamente.
12. Procedimiento según la reivindicación 11 donde la funcionalización y silanización se lleva a cabo mediante un compuesto que se selecciona de la lista que consiste en: 3-aminopropil trietoxisilano (APTES), (3-aminopropil)trimetoxisilano, 3[2-(2- aminoetilamino)etilamino] propiltrimetoxísilano, 3-(2-aminoetilamino)- propildimetoximetilsilano,[3-(2-aminoetilamino)propil]trimeto-xisilano, 3- aminopropildimetilmetoxisilano y 3-aminopropil(dietoxi)metilsilano.
13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 donde el agente reductor de la etapa c) se selecciona de la lista que consiste en: borohidruro de sodio (NaBH4), cianoborohidruro de sodio, cianoborohidruro de litio, trimetil amino borano (TMAB) o triacetoxiborohidruro.
14. Procedimiento de síntesis de ésteres de alquilo que comprende la transesterificación y/o esterificación de una fuente de ácidos grasos con un alcohol, en presencia de una preparación enzimática que comprende una glicoproteína según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.
15. Procedimiento según la reivindicación 14 donde el alcohol es un alcohol de cadena corta.
16. Procedimiento según la reivindicación 15 donde el alcohol de cadena corta es metanol.
17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 donde la fuente de ácidos grasos se selecciona de la lista que consiste en aceite vegetal, grasa animal, aceite de algas, aceite de pescado, aceite usado, grasa quemada y/o cualquier combinación de los mismos.
18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 donde los ésteres de alquilo se seleccionan de la lista que consiste en: ésteres de metilo, etilo, propilo o butilo.
19. Procedimiento según la reivindicación 18 donde los ésteres de metilo son ésteres de metilo de ácidos grasos, los ésteres etílicos son esteres etílicos de ácidos grasos, los ésteres propílicos son ésteres propílicos de ácidos grasos y los ésteres butílicos son ésteres butílicos de ácidos grasos.
20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19 donde la concentración de la glicoproteína varía entre 1-20 mg/mL o la actividad de la glicoproteína varía entre 100-450 U/mL.
21. Procedimiento según la reivindicación 20 donde la concentración de la glicoproteína varía entre 2 a 10 mg/mL o la actividad de la glicoproteína varía entre 150-300 U/mL.
22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21 donde la reacción de transesterificación y/o esterificación se lleva a cabo a una temperatura de entre 20 a 60 °C y a un pH de entre 2 a 10.
23. Procedimiento según la reivindicación 22 donde la temperatura varía de entre 25 a 50 °C y el pH de 2 a 5.
24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 23 donde la temperatura varía entre 25 a 35 °C.
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WO2020201607A1 (es) * 2019-04-03 2020-10-08 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Catalizador biológico reciclable obtenido a partir de masa negra de pilas desechadas para la síntesis de ésteres alquílicos de ácidos grasos volátiles

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