WO2020201607A1 - Catalizador biológico reciclable obtenido a partir de masa negra de pilas desechadas para la síntesis de ésteres alquílicos de ácidos grasos volátiles - Google Patents

Catalizador biológico reciclable obtenido a partir de masa negra de pilas desechadas para la síntesis de ésteres alquílicos de ácidos grasos volátiles Download PDF

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WO2020201607A1
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glycoprotein
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binary oxide
synthesis
acid
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Alicia PRIETO ORZANCO
María MOLINA GUTIÉRREZ
Félix Antonio LÓPEZ GÓMEZ
Irene GARCÍA DÍEZ
Lorena ALCARAZ ROMO
María Jesús MARTÍNEZ HERNÁNDEZ
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
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    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
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    • Y02P20/584—Recycling of catalysts

Definitions

  • the present invention refers to a recyclable biological catalyst characterized in that it comprises binary oxide nanoparticles of the formula, with a spinel-like structure, silanized and comprising reactive amino groups on their surface and a glycoprotein with oxidized giucidic chains where the glycoprotein is covalently immobilized on binary oxide through secondary amines and the process for obtaining said catalyst. Furthermore, the present invention relates to the use of said catalyst in the synthesis of alkyl esters of volatile fatty acids and to the process of synthesis of alkyl esters of volatile fatty acids. Therefore, the present invention is of interest in the urban solid waste management industry and, in turn, in the biocatalyst industry.
  • Short chain volatile fatty acid esters contribute to the natural aroma and flavor of fruits and vegetables and are widely used as additives in the pharmaceutical, cosmetic and food industries. Although they can be extracted from natural sources, the concentrations are very low. For this reason, for industrial purposes they are usually produced by chemical synthesis at high temperatures using non-selective catalysts. Under these conditions, unwanted side products are generated and asters cannot be labeled as natural products. Today, consumers' preference for natural foods and the pursuit of green and sustainable chemical processes have fostered interest in bio-based chemicals. The synthesis of asters by biocatalysis provides a solution to the above problems, since the reactions are specific, selective, clean and take place under mild conditions.
  • the materials used as supports for immobilization can be organic, inorganic or hybrid.
  • inorganic ones are preferred due to their greater resistance, especially microbiological and mechanical, and because they can be chemically modified allowing the protein to be fixed by different procedures.
  • the present invention proposes the use of materials derived from! recycling of batteries as a low-cost, sustainable inorganic support for the immobilization of glycoproteins with oxidized carbohydrate chains.
  • the use of energy accumulators is essential for our daily activity, but, from an environmental perspective, it is essential both to properly manage these post-consumer products and to recover and reuse their valuable components, in this case, zinc and manganese that are part of the anode. and cathode of batteries and accumulators.
  • discarded alkaline and Zn / C batteries are used to synthesize a binary mixed oxide of Zn / Mn in nanometric size, with stoichiometry Zn 0, 25Mn2 , 7sO4 and tetragonal symmetry with space group 141 / amd corresponding to a spinel-like structure.
  • Said binary oxide is used as a support for the covalent immobilization of an enzymatic crude with lipase activity in the present invention, specifically of a glycoprotein with oxidized carbohydrate chains; the glycoprotein is covalently immobilized on the binary oxide through secondary amines.
  • the biological catalyst formed is recyclable because it maintains its catalytic activity throughout several reaction cycles carried out under the same conditions.
  • this oxide In order to immobilize the glycoprotein with oxidized carbohydrate chains to the binary oxide obtained from discarded batteries, this oxide must be silanized and have reactive amino groups on its surface; Said amino groups are those that react, in the presence of a reducing agent, with the aldehydes of the oxidized glycoprotein chains to form the covalent bond between the binary oxide and the glycoprotein in the form of secondary amines.
  • the process for forming the recyclable biological catalyst of the present invention therefore comprises a stage of obtaining the binary oxide from discarded batteries, a stage of sylanization and incorporation of amino groups on the surface of the binary oxide by means of sylanization, and a stage of covalent immobilization with the help of a reducing agent.
  • the present invention further relates to the use of said recyclable biological catalyst in the synthesis of alkyl esters of volatile fatty acids which comprises the transesterification and / or esterification of a volatile fatty acid with an alcohol in the presence of the catalyst of the invention.
  • the present invention refers to a recyclable biological catalyst (hereinafter “the catalyst of the present invention”) characterized in that it comprises
  • glycoprotein with oxidized glycid chains, where the glycoprotein is covalently immobilized on the binary oxide through secondary amines.
  • said catalyst comprises:
  • the binary oxide is in the form of particles of size between 35 nm and 50 nm.
  • the binary oxide of formula Zn x Mn y 0 4 acts as a support for the glycoprotein with glycidic chains Rusty.
  • the binary oxide In order to support the glycoprotein, the binary oxide must be silanized and have reactive amino groups on its surface.
  • reactants is understood in the present invention as those amino groups capable of reacting with the aldehyde groups of the oxidized glycoprotein chains in the presence of a reducing agent.
  • the support is between 5 pmol / g P aricuia and 20 pmol / g P aricuia.
  • the glycoprotein is covalently immobilized on the binary oxide through the secondary amines formed.
  • the immobilization provides a covalent attachment to the support at multiple points that results in improved catalyst efficiency.
  • glycoproteins to which the present invention refers are glycoproteins from the group of carboxylic ester hydrolases (EC 3.1.1), preferably with triacylglycerol lipase activity (EC 3.1.1.3), generally known as lipases.
  • carboxylic ester hydrolases EC 3.1.1
  • triacylglycerol lipase activity EC 3.1.1.3
  • lipases Within the group of enzymes generally called lipases, there is a group known as “strict lipases” which are enzymes that only act on glycerides, and another group known as “versatile lipases” which, in addition to acting on glycerides, also act against asters other than ios glycerides.
  • carboxyl esterases EC 3.1 1.1
  • sterol esterases EC3.1.1.13
  • they have a broad substrate specificity and also exhibit lipase activity thanks to their activity against glycerides.
  • sterol esterases with lipase activity it has recently been proposed that they be called “versatile lipases” since some of them even have more activity on glycerides than on ester asters!
  • the glycoprotein is preferably any enzyme with lipase activity, more preferably it is a lipase, both strict and versatile, and / or a stereo! esterase.
  • Glycoproteins are proteins that naturally contain one or more glycide chains that are covalently linked to certain asparagine, serine, and threonine during protein biosynthesis.
  • the amino group of the side chain it is associated with carbohydrate through a / V-glycosidic bond, while with serine and threonine an O-giicosidic bond is established by condensing the hydroxyl of its side chains with another of the monosaccharide.
  • the carbohydrate portion of the glycoproteins is highly variable, ranging from monosaccharides to long and complex chains of different composition, structure, and degree of branch.
  • the glycoprotein is a versatile lipase naturally synthesized by the dimorphic filamentous fungus Ophiostoma piceae.
  • Said estuary! esterase / lipase or native versatile lipase is a glycoprotein of molecular mass 66 kDa comprising 8% glycosylation.
  • stereose gene refers to a nucleotide sequence encoding the esteral esterase / lipase or versatile ipase from O. piceae and is identified by SEQ. ID NO: 1
  • glycoprotein with lipase activity stereo! esterase / lipase and versatile lipase are used interchangeably throughout the present invention and refer to the group of proteins that present lipase activity, and may be strict lipases and / or versatile iipases.
  • the native form of the esteral esterase / lipase or versatile lipase of the present invention comprises the complete amino acid sequence of the protein encoded by the stero gene! esterase of O. piceae, including the signal peptide (SEQ. ID NO: 2)
  • the mature form of said enzyme comprises the amino acid sequence encoded by the steral esterase gene, without including the signal peptide and is identified with SEQ ID NO: 3.
  • the native enzyme will be referred to as the mature form, without signal peptide, to differentiate it from the recombinant forms.
  • heterologous expression and “heterologous gene” refer to the introduction of a foreign (heterologous) gene into an organism in order to modify its genetic material and expression products.
  • said organism is a methylotrophic yeast, preferably Pichia pasioris.
  • the mature amino acid sequence encoded by the steral esterase gene is expressed in yeast P. pasioris, using as signal peptide the pre-propeptide of factor a from Saccharomyces cerevisiae giving rise to esteral esterase / lipase or ⁇ Recombinant versatile ipase described in the present invention.
  • the recombinant versatile lipase from O. piceae and expressed in P pastor ⁇ s yeast comprises the sequence SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • the versatile lipase of The present invention is selected from the list consisting of: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
  • the versatile lipase enzyme is selected from the list consisting of: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
  • any expert in the matter can use any native or recombinant glycoprotein of any biological origin with known lipase activity, such as the native or recombinant lipases produced by fungi other than O.
  • piceae for example: Candida sp, Candida rugosa, Melanocarpus albomyces, Candida antárctica (Cal A, Cai B), Thermomyces ianuginosus, Rhizopus oryzae, Mucor miehei, Aspergiüus oryzae, Trichoderma reesei, Aspergiüus niger, Nectria haematococca, or PHcaturiopsis crispa.
  • the term "glycoprotein with glycid chains "oxidized" refers to a glycoprotein, as described above, which, through an oxidation reaction, has generated aldehyde groups in its carbohydrate chains.
  • oxidizing agents capable of generating aldehyde groups on glycoprotein glycid chains are
  • oxidoreductases which are selected from the list consisting of oxidoreductases, aidosa oxidases, alcohol dehydrogenases and oxidases, - and chemical oxidizing agents which are selected from 2,2,6,6-teirameibyM- piperidinyloxy lies! (TEMPO), Dess-Martin periodinate, lead tetraacetate Pb ⁇ (0 2 CCH 3 ) 4 , sodium bismutate (NaBiOs), periodic acid, periodates such as sodium periodate (NalC) and potassium periodate (KIO4).
  • TEMPO 2,2,6,6-teirameibyM- piperidinyloxy lies!
  • Dess-Martin periodinate Dess-Martin periodinate
  • lead tetraacetate Pb ⁇ (0 2 CCH 3 ) 4 sodium bismutate
  • periodic acid periodates such as sodium periodate (NalC) and potassium periodate (KIO4).
  • KIO4 potassium periodate
  • step (a2) selective alkaline precipitation of the solution resulting from the filtration of step (a1) using from 2.4 L to 3 L of alkaline medium in concentrations greater than 6 M,
  • step (b) covalently immobilizing the binary oxide comprising reactive amino groups on its surface obtained in step (b) and the glycoprotein with oxidized glycid chains obtained in step (c) with the help of glutaraldehyde and / or a reducing agent by
  • step (d2) reductive amination of the imines formed in step (d1) with glutaraldehyde and / or a reducing agent
  • black mass is understood as that inorganic solid obtained in the dismantling stages of the batteries and that contains the electrolytes, graphite and the manganese and zinc oxides that constitute the! anode and cathode batteries.
  • the main components of batteries are manganese dioxide (positive electrode), zinc (negative electrode), electrolyte (KOH or ZnC + NH CI) and steel (battery cover). These wastes generate great concern in society due to the negative impact on public health and the environment that they produce, mainly due to their high content of heavy metals.
  • the mechanical separation constitutes the starting point of obtaining black masses and aims to separate the electrodes, steel, paper, and plastics by means of cutting-grinding steps, magnetic separation, dimensional separation (screening), ECS separation (using eddy currents) and grinding the dust fraction.
  • the acidic medium used in this step (a1) is an acidic solution of 25% v / v of water, 25% v / v of H2G2 and 50% v / v of HCl of 35% purity.
  • a lower percentage of H2O2 does not adequately dissolve Mn and a higher percentage increases the foams in the dissolution process and causes the reactor to overflow.
  • stage ⁇ a2 This step of leaching in an acid medium is followed by a selective alkaline precipitation (stage ⁇ a2)) using between 2.4 L to 3 L of alkaline medium in concentrations greater than 6 M.
  • the alkaline medium of stage (a2) is a solution of NaOH or KOH, preferably NaOH.
  • stage (b) referring to the siianization and incorporation of amino groups on the surface of the binary oxide of formula Zno , 2 sn 2.7 s0 4 and spinel-like structure.
  • the reagent for siianization and amino-functionalization is preferably selected from the list consisting of (3-aminopropyl) triethoxysilane (ARTES), (3-aminopropyl) trimethoxysilane, 3 [2- (2- (2- 25-aminoethylaminojetylamino] propyltrimethoxysilane, 3- ( 2-aminoethylamino) - propyldimethoxymethylsilane, [3- (2-aminoethylamino) propii] trimethoxysiiano, 3-aminopropyldimefilmethoxysilane, and 3-aminopropyl (diethoxy) mephilicilane.
  • ARTES (3-aminopropyl) triethoxy
  • step (c) is preferably carried out in the presence of an oxidizing agent.
  • oxidizing agent is understood to be any compound known in the art capable of oxidizing another in contact with it.
  • the oxidizing agent is selected from those capable of generating aldehyde groups on glycid chains.
  • the oxidizing agent capable of generating aldehyde groups in glycidic chains is selected from the list consisting of: enzymes, which are selected from the list consisting of oxidoreductases, aldose oxidases, alcohol dehydrogenases and oxidases, and agents oxidizing chemicals.
  • the oxidizing chemical agents are selected from 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy radical (TEMPO), Dess-Martin periodinate, lead tetraacetate Pb- (Q2CCH3) 4 , sodium bismuthate (NaBiOs), periodic acid or periodates. Periodates are particularly preferred and more preferably sodium periodate (NaiG- and potassium (KIO 4 ).
  • the oxidizing chemical agent is applied in liquid form, generally dissolved in aqueous solvent, which facilitates and enhances its oxidative action.
  • the concentration of the oxidizing agent solution is between 5 mM to 50 mM, more preferably 10 mM.
  • step (d1) the aldehydes react of the oxidized glycid chains of the glycoprotein obtained in step (c) with the reactive amino groups on the surface of the binary oxide obtained in step (b) to form imines (Schiff's base) in the presence of glutaraidehyde and / or an agent
  • the reducing agent of step (d1) is preferably selected from the list consisting of sodium borohydride (NaBhU), lithium hydride, lithium aiumninium hydride, cyanob sodium orohydride, lithium cyanoborohydride, boranes such as trimethyl amino borane (TMAB) or a-picolin borane, sodium triacetoxyborohydride, or sodium borohydride modified with polyvalent metal salts or activated by acids.
  • the reducing agent is a solution of trimethyl amino borane in a concentration between 100 mM and 300 mM. Preferably a solution with a concentration of 150 mM.
  • the imines formed in step (d1) are converted into stable secondary amines (covalent bond) by reductive amination in one step (d2); said step (d2) is therefore a stabilization step where covalent bonds are formed in the form of secondary amines between the glycoprotein and the binary oxide.
  • the reducing agent of step (d2) is selected from among sodium borohydride (NaBH 4 ), lithium hydride, lithium aluminum hydride, sodium cyanoborohydride, lithium cyanoborohydride, borans or the a-picolin borane, sodium triacetoxyborohydride , or sodium borohydride modified with polyvalent metal salts or activated by acids.
  • sodium borohydride NaBH 4
  • lithium hydride lithium aluminum hydride
  • sodium cyanoborohydride lithium cyanoborohydride
  • lithium cyanoborohydride lithium cyanoborohydride
  • borans or the a-picolin borane sodium triacetoxyborohydride
  • sodium borohydride modified with polyvalent metal salts or activated by acids sodium borohydride modified with polyvalent metal salts or activated by acids.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the catalyst of the invention for the synthesis of volatile fatty acid alkylesters, preferably for the synthesis of butyl vaierate
  • volatile fatty acid alkyl ester is understood in the present invention as that alkyl ester derived from short chain fatty acids or volatile fatty acids that are a subgroup of fatty acids with carbon chains of less than six carbon atoms, such as acetic acid propionic acid. isobutyric acid. butyric acid, isovaleric acid, valeric acid and caproic acid, among others. Their volatility is due to the short carbon chain they possess, in contrast to long-chain fatty acids, which are solid at room temperature.
  • the part of the ester that is an alkyl is a short chain alkyl, preferably of between 4 and 7 carbon atoms.
  • Another aspect of the present invention refers to the process for the synthesis of volatile fatty acid aikyl esters that comprises the transesterification and / or esterification of a volatile fatty acid with an alcohol in the presence of the catalyst of the invention.
  • the alcohol is a C1-C4 short chain alcohol, more preferably the alcohol is butanol, even more preferably it is 1-butane! in the presence of isooctane.
  • the volatile fatty acid is valeric acid.
  • the transesterification and / or esterification reaction is carried out at a temperature of between 20 ° C to 50 ° C.
  • the molar ratio of the volatile fatty acid to the alcohol is between 1: 1 to 1: 3.
  • FIG, 1 Scheme of the process carried out to obtain binary oxides
  • FIG. 2 X-ray diffraction patterns of binary metal oxides.
  • FIG. 3 Recisability of the biocatalyst G1-CH ⁇ GPEr in butyl valerate synthesis reactions.
  • FIG. 4 Thermal stability of free and immobilized OPEr on the G1 support through its oxidized giucidic chains.
  • FIG. 5 Stability at different pH values of OPEr free and immobilized on the G1 support through its oxidized giucidic chains.
  • FIG. 8 A) Temperature stability of biocatalysts. B) Stability at pH of the biocataiizers.
  • FIG. 7 Residual activity (%) of the biocatalysts after 6 months of storage at 4 ° C in Tris-HC! 20 mM pH 7.
  • FIG. 8 Course of the esterification reactions of each acid.
  • binary metal oxides G1, G4 and G5 are synthesized starting from a black mass originating from the mechanical recycling of spent alkaline and Zn / C cells and batteries.
  • the binary metal oxide called G1 corresponds to the product object of the present invention, while the products G4 and G5 are presented as comparative data.
  • Disused cells and batteries were ground under an atmosphere of N2.
  • the resulting product was subjected to a magnetic separation stage to remove the steel and finally, the plastic and paper components were separated by sieves. He
  • the product resulting from these stages is made up of the electrodes (graphite) and the electrolytes of the cells and batteries (zinc, manganese and potassium salts).
  • XRF X-ray fluorescence
  • the black mass is mainly composed of Mn (36.8 wt%) and Zn (23.7 wt.%) Mineralogically, the majority crystalline phases are zincite (ZnO), betaerolite (ZnMnsCL) and sylvite (KCI), with wt% the percentage by weight.
  • ZnO zincite
  • ZnMnsCL betaerolite
  • KCI sylvite
  • Leaching ia ilevó black mass out using 1 liter of a solution consisting of 250 mL of water mliliQ, 500 mL of hydrochloric acid (HCl, 32% -35% purity) and 250 mL of hydrogen peroxide (H 2 0 , 39% richness) for different black mass / leaching solution (S / L) ratios. These tests were carried out at room temperature for one hour using mechanical stirring, 500 rpm and after that time, they were filtered using a Millipore Holder filter at 7 bar pressure.
  • the spinel of formula Zno , 2 sMn 2.7 s0 4 (G1), is obtained when we dissolve 300 g of black mass in 1 L of acid solution;
  • the pH of this solution is between 3.5 and 3.7.
  • Table 2 summarizes the results obtained after the analysis by means of atomic absorption spectroscopy (AAS) (SpectraAA 200 spectrometry, They vary) of the different solutions obtained depending on the different operating conditions. The pH of these solutions is in all cases between 0 and 4 units. Table 2. Mn and Zn content and efficiency of the different leaching.
  • AAS atomic absorption spectroscopy
  • Zn and Mn were selectively precipitated from the leached solutions of each of the LG1, LG4 and LG5 nanoparticles, using a 6M NaOH solution until reaching a pH-12-14 value. Precipitations were carried out at room temperature, constantly using mechanical stirring at 500 rpm. Once the basic pH was reached, the solution was filtered and the resulting solid was dried in an oven at 80 ° C for 24 h.
  • the LG1 solution is precipitated with 6M NaOH solution to obtain product G1.
  • the 6M NaOH solution consumption is between 2.4 and 3.0 L for each liter of LG1.
  • consumption is between 2.0 and 2.4 L of 6M NaOH and for the LG5 solution, between 1.1 and 1.4 L of 6M NaOH
  • the resulting solids (G1, G4 and G5) were analyzed by X-ray diffraction to determine their crystalline nature and stoichiometry, using refinements of the structure by Rietveld analysis.
  • Table 3 shows the chemical composition (percentage by weight) in terms of binary oxides of each of the resulting solids G1, G4 and G5.
  • Figure 2 shows the X-ray diffraction patterns for each of the solids G1, G4 and G5, and the reflections that can be indexed to a tetragonai symmetry with space group 141 / amd corresponding to a spinel-like structure, in agreement with JCPDS,
  • the data obtained by XRD were analyzed by the Rietveid method.
  • the corresponding diffraction profiles were refined considering the spinel-like structure, where the Zn atoms were placed in the 4a crystallographic positions occupying the tetrahedral sites while the Mn atoms occupy the octahedral sites in the 4d positions.
  • Table 4 shows the composition in crystalline phases of the synthesized samples obtained from the Rietveid refinements, observing the variation in the Mn / Zn ratios.
  • the different mixed Mn / Zn oxides obtained in the synthesis have a high purity (95-96%).
  • the values of the parameter a are slightly higher than those found in the literature, which are between 5,709 ⁇ and 5,722 ⁇ , while the values of the parameter b (9,240 A) are similar to those obtained in the literature (they vary between 9.222 and 9.238 ⁇ ).
  • Biocatalysts were synthesized from the three nanomaterials G1, G4 and G5, using them as supports for the immobilization of enzymes, specifically as support for an enzymatic crude rich in OPEr lipase (SEG ID NOs: 4 and 5). Immobilization was carried out through the oxidized carbohydrate chains of said lipase by the procedure explained below.
  • the binary oxide nanoparticles of the formula Zno.asMna sO, *, with a spinel-like structure were silanized and functionalized with 3 ⁇ aminopropyl! triefoxysuano (ARTES, Sigma), a compound that incorporates reactive amino groups on the surface of the nanoparticle.
  • ARTES International Journal of Molecular Sciences 2013, 14: 4813-4628
  • 1 g of the binary oxide nanoparticles of the formula Zn 0, 2sMn 2, 7sG4, with spinel-like structure is mixed with 9.7 mL of ethanol in a bath of ultrasound for 20 min. 300 m are added.1. of ARTES, sonicating for 10 min.
  • the oxidation of the glucidic chains of the ipase is carried out to generate aldehyde groups in the sugars of said enzyme, and later, during the immobilization process on the amino-functionalized supports, covalently bind these reactive groups to The amino groups of the nanoparticles. Immobilization of the lipase OPEr.
  • pNPB p-nitrophenyl butyrate
  • the activity of the three biocatalysts G1 -CH-OPEr, G4-CH-0PEr and G5-CH-OPEr was tested in a synthesis reaction of biotechnological interest, specifically in the production of butyl valerate, responsible for certain natural aromas, by means of direct esterification.
  • the reaction mixture which did not contain water, consisted of 1 1 U total of activity (measured against pNPB), 100 mM valeric acid and 200 mM 1-butane! in isooctane, keeping the reaction at 25 ° C with rotary stirring at 100 rpm for 8 h.
  • Table 6 Percentages of esterification of 1-butanol and valeric acid catalyzed by the three biocatalysts G1-CH-QPEr, G4-CH-OPEr and G5-CH-OPEr tested.
  • the biocatalyst G1-CH-OPEr was the one that showed the highest activity in this experiment, and was selected to evaluate the effect of the concentration of substrates on the yield of ester synthesis, as well as the recyclability in this reaction.
  • this biocatalyst is capable of synthesizing butyl vaiate in the range of concentrations tested, although the efficiency of esterification decreases with increasing concentration of the substrates.
  • thermostability of OPEr lipase was evaluated between 25 and 70 ° C, with the catalyst free (dissolved) or immobilized through its carbohydrate chains on the G1 support resuspended in the Tris-HCI post. 20 mM at pH 7
  • the stability against different pH values was determined at 4 ° C in a Britton & Robinson lamp adjusted to pH between 2 and 10. In both cases, 0.25 mg of catalyst was stirred, dissolved or resuspended in 500 pL of lampon, for 24 hours at 1200 rpm in a thermoblock at each of the temperatures and the pH analyzed. The residual activity was measured, taking the value obtained at 25 ° C and pH 7, respectively, as 100%.
  • GA qlutaraldehyde
  • the amino functionalized nanoparticles were treated with GA before adding the enzymatic crudes.
  • 1 g of amino functionalized nanoparticles were weighed and incubated with a 250 mM glutaraldehyde solution in water (40 mL), for 3 h at room temperature under rotational shaking, at 80 rpm.
  • the glutaraldehyde-modified nanoparticles were washed with water to remove the residual glutaraldehyde and once more with 20 mM Tris-HCl buffer solution, pH 7.
  • the immobilized enzyme assays 250 pg of the nanobiocatalyst was resuspended in 500 pL of lampon. In all cases, it was stirred for 24 b at 1200 rpm in a ter or block at each of the temperatures and pH tested.
  • biocatalysts Two long-term storage procedures for these biocatalysts were tested and their stability studied. On the one hand, the biocatalysts were kept at 4 ° C in Tris-HCi 20 mlV3 pH 7, without the addition of stabilizers, for 6 months. On the other hand, a quantity of the biocatalyst was lyophilized and its activity was tested after resuspending them in buffer for 1 h.
  • the biocatalysts for the synthesis of all the esters were studied for biocatalysts using a 100 mM acid concentration.
  • the immobilized biocatalyst was separated by centrifugation at 14000 rpm, washing the nanoparticles with Tris-HCl and isooctane lampon between cycles.
  • This system causes a certain co-compaction of the immobilized biocatalyst, which can affect its activity, furthermore, the biocatalysts with the G4 support (G4-CH and G4-GA) are deposited worse during centrifugation, which causes loss of catalyst during washing. between cycles.

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Abstract

La presente invención se refiere un catalizador biológico reciclable caracterizado por que comprende unas nanoparticulas de óxido binario, con estructura tipo espinela, silanizadas y que comprenden grupos amino reactivos en su superficie y una glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas donde la glicoproteína está inmovilizada covalentemente sobre el óxido binario a través de aminas secundarias y al procedimiento de obtención de dicho catalizador. Además, la presente invención se refiere al uso de dicho catalizador en la síntesis de ésteres alquílicos de ácidos grasos volátiles y ai procedimiento de síntesis de ésteres alquílicos de ácidos grasos volátiles. Por tanto, la presente invención tiene interés en la industria de la gestión de residuos sólidos urbanos y, a su vez, en la industria de ios biocatalizadores.

Description

DESCRIPCIÓN
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desechadas para la síntesis de ásteres aüquíjicos de ácidos grasos volátiles
La presente invención se refiere un catalizador biológico reciclable caracterizado por que comprende unas nanopartículas de óxido binario de fórmula, con estructura tipo espinela, silanizadas y que comprenden grupos amino reactivos en su superficie y una giicoproteína con cadenas giucídicas oxidadas donde la glicoproteína está inmovilizada covalentemente sobre el óxido binario a través de aminas secundarias y al procedimiento de obtención de dicho catalizador. Además, la presente invención se refiere al uso de dicho catalizador en la síntesis de ásteres alquilicos de ácidos grasos volátiles y ai procedimiento de síntesis de ásteres alquilicos de ácidos grasos volátiles. Por tanto, la presente invención tiene interés en la industria de ¡a gestión de residuos sólidos urbanos y, a su vez, en la industria de ios biocatalizadores.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los ásteres de ácidos grasos volátiles de cadena corta contribuyen al aroma y al sabor natural de las frutas y verduras y se utilizan profusamente como aditivos en las industrias farmacéutica, cosmética y alimentaria. Aunque se pueden extraer de fuentes naturales, las concentraciones son muy bajas. Por ello, para fines industriales suelen producirse mediante sintesis química a altas temperaturas empleando catalizadores no selectivos. En estas condiciones, se generan productos secundarios no deseados y los ásteres no se pueden etiquetar como productos naturales. Hoy en día, la preferencia de ios consumidores por ios alimentos naturales y la búsqueda de procesos químicos verdes y sostenibles han fomentado el interés por ios productos químicos de base biológica. La síntesis de ásteres por biocatáiisis da una solución a los problemas anteriores, ya que ¡as reacciones son específicas, selectivas, limpias y se desarrollan bajo condiciones suaves. Por lo tanto, los ásteres producidos enzimáticamente cumplen con las regulaciones europeas y americanas para compuestos naturales, siendo ¡a tasa de crecimiento anual esperada de su mercado global de alrededor del 8,4% para 2016- 2021. Las lipasas de los hongos Candida rugosa, Candida antárctica, Rhizopus oryzae, Thermomyces ianuginosus o Rhizomucor miehei están entre ios biocatalizadores más frecuentemente utilizados para la síntesis de aromas y saborizantes de tipo éster como el valerato de butilo.
Entre las principales ventajas de los catalizadores biológicos frente a los químicos, podemos mencionar su selectividad, su especificidad, y su carácter "verde", ya que son eficientes en condiciones suaves de reacción y no generan subproductos tóxicos. Sin embargo, el coste de las enzimas es elevado. La inmovilización es una de las principales herramientas para disminuir el impacto de ios biocataiizadores en los costes finales de los bioprocesos. Esta estrategia permite separar la enzima del resto de los componentes de la mezcla de reacción, utilizándola en sucesivos ciclos catalíticos sin pérdidas relevantes de actividad y facilitando además ia separación de los productos. Todo ello se traduce en procesos menos costosos, medioambientalmente limpios y más simples, lo que justifica el creciente número de patentes que protegen aplicaciones relacionadas con el uso de biocataiizadores inmovilizados
Los materiales empleados como soportes para ia inmovilización pueden ser orgánicos, inorgánicos o híbridos. En general, se prefieren los inorgánicos por su mayor resistencia, especialmente microbiológica y mecánica, y porque se pueden modificar químicamente permitiendo la fijación de la protema mediante distintos procedimientos.
Por tanto, es necesario continuar desarrollando nuevos materiales para este propósito. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención plantea el empleo de materiales derivados de! reciclado de pilas como soporte inorgánico, sostenible y de bajo coste, para ia inmovilización de glicoproteínas con cadenas glucídicas oxidadas. El uso de acumuladores de energía es esencial para nuestra actividad cotidiana, pero, desde una perspectiva medioambiental, es imprescindible tanto gestionar adecuadamente esos productos post-consumo como recuperar y reutiiizar sus componentes valiosos, en este caso, zinc y manganeso que forman parte del ánodo y cátodo de las pilas y acumuladores.
En la presente invención se utilizan pilas desechadas del tipo alcalinas y de Zn/C, para sintetizar un óxido mixto binario de Zn/Mn en tamaño nanométrico, con estequiometria Zn0,25Mn2,7sO4 y simetría tetragonal con grupo espacial 141/amd correspondiente a una estructura tipo espinela. Dicho óxido binario se utiliza como soporte para ia inmovilización covalente de un crudo enzimático con actividad lipasa en la presente invención, concretamente de una glicoproteina con cadenas glucídicas oxidadas; la glicoproteína queda inmovilizada covalentemente sobre el óxido binario a través de aminas secundarias. El catalizador biológico formado es reciclable porque mantiene su actividad catalítica a lo largo de varios ciclos de reacción realizados en las mismas condiciones.
Para poder inmovilizar la glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas al oxido binario obtenido de pilas desechadas, este óxido debe estar silanizado y tener grupos amino reactivos en su superficie; dichos grupos amino son los que reaccionan, en presencia de un agente reductor, con ios aldehidos de las cadenas glucídicas oxidadas de ia glicoproteína para formar la unión covalente entre el óxido binario y la glicoproteína en forma de aminas secundarias. El procedimiento de formación del catalizador biológico reciclable de ia presente invención comprende por tanto una etapa de obtención del óxido binario a partir de pilas desechadas, una etapa de sílanización e incorporación de grupos amino en ¡a superficie del óxido binario mediante sílanización y una etapa de inmovilización covalente con la ayuda de un agente reductor. La presente invención se refiere además ai uso de dicho catalizador biológico reciclable en la síntesis de ásteres alquílicos de ácidos grasos volátiles que comprende la transesterificación y/o esterificación de un ácido graso volátil con un alcohol en presencia del catalizador de la invención. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, ia presente invención se refiere a un catalizador biológico reciclable (a partir de aquí“el catalizador de ¡a presente invención”) caracterizado por que comprende
un óxido binario de fórmula ZnxMny04, donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2,15, con estructura tipo espinela que está en forma de partículas de tamaño nanométrico, donde dichas partículas están silanizadas y comprenden grupos amino reactivos en su superficie, y
una glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas, donde ¡a glicoproteína está inmovilizada covalentemente sobre el óxido binario a través de aminas secundarias.
En una realización preferida del catalizador biológico reciclable de la presente invención, dicho catalizador comprende:
• un óxido binario de fórmula Zno,2slV! 02,75(1)4, con estructura tipo espinela que está en forma de partículas de tamaño nanométrico, donde dichas partículas están silanizadas y comprenden grupos amino reactivos en su superficie, y
® una glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas, donde la glicoproteína está inmovilizada covalentemente sobre el óxido binario a través de aminas secundarias. El óxido binario de fórmula ZnxMny04, donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2,15, del catalizador biológico reciclable de la presente invención tiene estructura tipo espinela y está en forma de partículas de tamaño nanométrico. En una realización preferida del catalizador de la presente invención, el óxido binario está en forma de partículas de tamaño de entre 35 nm y 50 nm.
En el catalizador biológico reciclable de la presente invención el óxido binario de fórmula ZnxMny04, donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2, 15, actúa como soporte de la glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas. Para poder ser soporte de la glicoproteína el óxido binario debe estar silanizado y tener grupos amino reactivos en su superficie. Por el término“reactivos” se entiende en la presente invención como aquellos grupos amino capaces de reaccionar con los grupos aldehidos de las cadenas glucídicas oxidadas de la glicoproteína en presencia de un agente reductor. Preferiblemente, ¡a concentración de grupos amino reactivos en la superficie de! soporte está comprendida entre 5 pmol/gPartícuia y 20 pmol/gPariícuia. La glicoproteína está inmovilizada covalentemente sobre el óxido binario a través de las aminas secundarias formadas.
A efectos de la presente invención, la inmovilización covalente entre el óxido binario que comprende grupos amino reactivos en su superficie y la glicoproteína se produce mediante la formación de aminas secundarias; en presencia de un agente reductor ios aldehidos de las cadenas gíucídicas oxidadas de la gllcoproteína reaccionan con los grupos amino reactivos que se encuentran en la superficie del óxido binario de fórmula ZnxMny04, donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2,15, para formar una ¡mina (base de Schiff) que posteriormente se estabiliza mediante aminación reductiva formando una amina secundaria. La inmovilización aporta una unión covalente al soporte por múltiples puntos que resulta en una mejora de la eficiencia del catalizador. Cabe señalar, que la inmovilización mantiene la integridad estructural de la enzima, cuya secuencia proteica no interviene en la interacción con el óxido binario de fórmula ZnxMny04, donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2,15.
Las giicoproteínas a las que se refiere la presente invención son glicoproteínas del grupo de las hidrolasas de ásteres carboxílicos (EC 3.1.1), preferentemente con actividad triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3), conocidas generalmente como lipasas. Dentro del grupo de enzimas denominadas generalmente lipasas, existe un grupo conocido como “lipasas estrictas” que son enzimas que solo actúan sobre glicéridos, y otro grupo conocido como“lipasas versátiles” que además de actuar sobre glicéridos, también actúan frente a ásteres diferentes a ios glicéridos. Del mismo modo, algunas carboxil esterases (EC 3.1 1.1) y esterol esterasas (EC3.1.1.13) tienen una amplia especificidad de sustrato y presentan también actividad lipasa gracias a su actividad frente a glicéridos. En el caso particular de las esterol esterasas con actividad lipasa, se ha propuesto recientemente que pasen a denominarse“lipasas versátiles” ya que algunas de ellas incluso tienen más actividad sobre glicéridos que sobre ásteres de estero!.
En una realización preferida, la gllcoproteína es preferentemente cualquier enzima con actividad lipasa, más preferentemente es una lipasa, tanto estricta como versátil, y/o una estero! esterase.
Las glicoproteínas son proteínas que, de forma natural, contienen una o más cadenas gíucídicas que se unen covalentemente a ciertas asparaginas, serinas y treoninas durante la biosíntesis proteica. En el caso de su unión a asparagina, el grupo amino de la cadena latera! se asocia ai carbohidrato mediante enlace /V-glicosídico, mientras que con serína y treonina se establece un enlace O-giicosídico al condensarse el hídroxilo de sus cadenas laterales con otro del monosacárido. La porción glucídica de las glicoproteínas es muy variable, pudiendo encontrarse desde monosacáridos hasta largas y complejas cadenas de diferente composición, estructura, y grado de ramificación.
En una realización más preferida la giicoproteína es una lipasa versátil sintetizada de forma natural por el hongo filamentoso dimórfico Ophiostoma piceae. Dicha estero! esterasa/lipasa o lipasa versátil nativa es una giicoproteína de masa molecular 66 kDa que comprende un 8% de glicosilación.
En la presente invención, el término "gen esteral esterasa" se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica la esteral esterasa/lipasa o ¡ipasa versátil de O. piceae y se identifica por ¡a SEQ. ID NO: 1
A efectos de la presente invención, ios términos, giicoproteína con actividad lipasa, estero! esterasa/lipasa y lipasa versátil, se utilizan indistintamente a lo largo de la presente invención y se refieren al grupo de proteínas que presentan actividad lipasa, pudiendo ser lipasas estrictas y/o iipasas versátiles. La forma nativa de la esteral esterasa/lipasa o lipasa versátil de la presente invención comprende la secuencia amínoacídica completa de la proteína codificada por el gen estero! esterasa de O. piceae, incluyendo el péptido señal (SEQ. ID NO: 2) La forma madura de dicha enzima comprende la secuencia amínoacídica codificada por el gen esteral esterasa, sin Incluir el péptido señal y se identifica con ¡a SEQ ID NO: 3. En adelante se hablará de enzima nativa como la forma madura, sin péptido señal, para diferenciarla de ¡as formas recombinantes.
En la presente invención las expresiones "expresión heteróloga" y "gen heterólogo" se refieren a ¡a introducción de un gen extraño (heterólogo) en un organismo con el fin de modificar su material genético y los productos de expresión. A efectos de la presente invención, dicho organismo es una levadura metí ¡otrófica, preferentemente Pichia pasioris. En una realización particular, la secuencia amínoacídica madura codificada por el gen esteral esterasa, se expresa en ¡a levadura P. pasioris, empleando como péptido señal el pre-propéptido del factor a de Saccharomyces cerevisiae dando lugar a la esteral esterasa/lipasa o ¡ipasa versátil recombinante descrita en la presente invención. Esta ¡ipasa versátil recombinante presenta modificaciones en su secuencia amínoacídica, que comprende entre 6-8 aminoácidos nuevos en el extremo N-terminal, añadidos sobre la secuencia aminoaeídica de la proteína nativa madura. En una realización más preferida, la lipasa versátil recombinante procedente de O. piceae y expresada en la levadura P pastorís (OPEr), comprende la secuencia SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otra realización preferida, la lipasa versátil de la presente invención se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. En una realización más preferida, la enzima lipasa versátil se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. A efectos de la presente invención, además de las lipasas versátiles de SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, cualquier experto en la materia puede utilizar cualquier giicoproteína nativa o recombinante de cualquier origen biológico con actividad lipasa conocida, tales como las lipasas nativas o recombinantes producidas por otros hongos distintos a O. piceae, por ej : Candida sp , Candida rugosa, Melanocarpus albomyces, Candida antárctica (Cal A, Cai B), Thermomyces ianuginosus, Rhizopus oryzae, Mucor miehei, Aspergiüus oryzae, Trichoderma reesei, Aspergiüus niger, Nectria haematococca, o PHcaturiopsis crispa.
En una realización más preferida, la giicoproteína, preferentemente la lipasa versátil, inmovilizada sobre nanopartículas de óxido binario de fórmula ZnxMny04, donde x = 0,25 ~ 0,85 e y = 2,75 - 2,15, con estructura tipo espinela según se describe en la presente invención, es preferentemente la lipasa versátil que comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. El término “giicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas” se refiere a una giicoproteína, tal y como se describe anteriormente, que, por medio de una reacción de oxidación, ha generado grupos aldehidos en sus cadenas glucídicas.
Ejemplos de agentes oxidantes capaces de generar grupos aldehido en cadenas glucídicas de glicoproteínas son
- enzimas, que se seleccionan de la lista que consiste en oxidorreductasas, aidosa oxidasas, alcohol deshídrogenasas y oxidasas, - y agentes químicos oxidantes que se seleccionan de entre 2,2,6,6-teírameibyM- piperidinyloxy radica! (TEMPO), periodinato Dess-Martin, tetraacetato de plomo Pb~ (02CCH3)4, bismutato sódico (NaBiOs), ácido periódico, periodatos como periodato sódico (NalC ) y periodato potásico (KIO4). Otro aspecto de la invención se refiere al procedimiento de obtención del catalizador de la presente invención, caracterizado por que comprende ias siguientes etapas:
a) obtener un óxido binario de fórmula ZnxMnyQí, donde x=0,25-0,85 y y=2,75-2,15, y estructura tipo espinela mediante:
a1) lixiviación en medio ácido constante de masa negra en una concentración de 300 g/l hasta obtener una concentración de Zn de entre 27,5 g/L y 46 g/L y una concentración de Mn de entre 110 g/L y 127 g/L, desechando los sólidos resultantes mediante filtración, y
a2) precipitación selectiva alcalina de la solución resultante de la filtración de la etapa (a1) utilizando de entre 2.4 L a 3 L de medio alcalino en concentraciones mayores de 6 M,
b) silanizar e incorporar grupos amino en la superficie del óxido binario obtenido en la etapa (a),
c) oxidar ias cadenas glucídícas de la glicoproteína, e
d) inmovilizar cova!entemente el óxido binario que comprende grupos amino reactivos en su superficie obtenido en la etapa (b) y la glicoproteína con cadenas glucídícas oxidadas obtenida en la etapa (c) con la ayuda de glutaraldehído y/o un agente reductor mediante
d1) reacción entre los aldehidos de las cadenas glucídícas oxidadas de la glicoproteína obtenida en la etapa (c) y ios grupos amino reactivos de la superficie del óxido binario obtenido en la etapa (b) en presencia de glutaraldehído y/o un agente reductor, y
d2) aminación reductiva de las iminas formadas en la etapa (d1) con glutaraldehído y/o un agente reductor El óxido binario de fórmula ZnxMny04, donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2, 15, y estructura tipo espinela se obtiene a partir de la masa negra obtenida de pilas desechadas.
En la presente invención se entiende por“masa negra” como aquel sólido inorgánico obtenido en las etapas de desmanteiamiento de ias pilas y que contiene ios electrolitos, el grafito y los óxidos de manganeso y zinc que constituyen e! ánodo y el cátodo de las pilas. Los principales componentes de las pilas son el dióxido de manganeso (electrodo positivo), zinc (electrodo negativo), el electrolito (KOH o ZnC + NH CI) y el acero (cubierta de la pila). Estos residuos generan gran preocupación en la sociedad por el impacto negativo sobre la salud pública y medio ambiente que producen, debido sobre todo a su alto contenido en metales pesados. La separación mecánica constituye el punto de partida de la obtención de masas negra y tiene por objeto separar ios electrodos, el acero, papel, y plásticos mediante etapas de corte-trituración, separación magnética, separación dimensional (cribado), separación de ECS (usando corrientes de Foucault) y molienda de la fracción de polvo.
En la presente invención el óxido binario de fórmula ZnxMny04, donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2,15, y estructura tipo espinela se obtiene a partir de (etapa (a1)) una lixiviación en medio ácido constante de masa negra en una concentración de 300 g/i basta obtener una concentración de Zn de entre 27,5 g/L y 46 g/L y una concentración de Mn de entre 110 g/L y 127 g/L. Los sólidos resultantes se desechan mediante filtración.
Preferiblemente, el medio ácido utilizado en esta etapa (a1) es una disolución ácida de 25 % v/v de agua, 25 % v/v de H2G2 y 50 % v/v de HCI del 35 % de pureza. Un porcentaje inferior de H2O2 no disuelve adecuadamente el Mn y un porcentaje mayor aumentan las espumas en el proceso de disolución y hace que el reactor rebose.
A esta etapa de lixiviación en medio ácido le sigue una precipitación selectiva alcalina (etapa Ía2)) utilizando de entre 2,4 L a 3 L de medio alcalino en concentraciones mayores de 6 M. Preferiblemente el medio alcalino de la etapa (a2) es una disolución de NaOH o KOH, preferiblemente NaOH.
La siguiente etapa del procedimiento de la presente invención es la etapa (b) referente a la siianización e incorporación de grupos amino en la superficie del óxido binario de fórmula Zno,2s n2,7s04 y estructura tipo espinela. El reactivo para la siianización y amino- funcionalización se selecciona preferentemente de la lista que consiste en (3- aminopropil)trietoxisilano (ARTES), (3-aminopropil)trimetoxisilano, 3[2-(2- 25 aminoetilaminojetilamino] propiltrimetoxisilano, 3-(2-aminoet¡lamino)- propildimetoxímetilsilano, [3-(2-aminoeti!amino)propii] trimetoxisiiano, 3- amínopropildimefilmetoxisilano y 3-aminopropii(dietoxi)mefilsilano. La oxidación de las cadenas glucídicas de una glicoproteína con actividad lipasa de la etapa (c) se lleva a cabo preferentemente en presencia de un agente oxidante. A efectos de la presente invención, se entiende por agente oxidante cualquier compuesto conocido en la técnica capaz de oxidar a otro en contacto con él. Preferiblemente el agente oxidante se selecciona entre aquéllos capaces de generar grupos aldehido en cadenas glucidicas. En otra realización más preferida aún, el agente oxidante capaz de generar grupos aldehido en cadenas glucidicas se selecciona de la lista que consiste en: enzimas, que se seleccionan de la lista que consiste en oxidorreductasas, aldosa oxidasas, alcohol deshidrogenasas y oxidases, y agentes químicos oxidantes. En otra realización más preferida aún de la presente invención los agentes químicos oxidantes se seleccionan de entre 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy radical (TEMPO), periodinato Dess-Martin, tetraacetato de plomo Pb-(Q2CCH3)4, bismutato sódico (NaBiOs), ácido periódico o periodatos. Son particularmente preferidos los periodatos y más preferentemente el periodato sódico (NaiG- y potásico (KIO4). De acuerdo con una realización preferida, el agente químico oxidante se aplica en forma líquida, generalmente disueito en solvente acuoso, lo cual facilita y potencia su acción oxidativa. Según una realización preferida, la concentración de la solución del agente oxidante está comprendida entre 5 mM a 50 mM, más preferentemente 10 mM. Una vez generados grupos aldehido en las cadenas glucidicas, en la etapa (d1), reaccionan los aldehidos de las cadenas glucidicas oxidadas de la glicoproteína obtenida en la etapa (c) con los grupos amino reactivos de la superficie del óxido binario obtenido en la etapa (b) para formar iminas (base de Schiff) en presencia de glutaraidehído y/o un agente reductor. El agente reductor de la etapa (d1) se selecciona preferentemente de entre la lista que consiste borohídruro de sodio (NaBhU), hidruro de litio, hidruro de litio y aiumninio, cianoborohidruro de sodio, cianoborohidruro de litio, boranos como el trimetil amino borano (TMAB) o el a-picolino borano, triacetoxiborohidruro sódico, o borohídruro de sodio modificado con sales metálicas polivalentes o activado por ácidos.
Si dicho agente reductor se aplica en forma de solución se potencia la acción reductora, por lo que, en una realización preferida de la presente invención el agente reductor es una solución de trimetil amino borano en una concentración de entre 100 mM y 300 mM. Preferiblemente una solución con una concentración de 150 mM. Finalmente, las iminas formadas en la etapa (d1) se convierten en aminas secundarias estables (enlace covalente) por aminación reductiva en una etapa (d2); dicha etapa (d2) es por tanto una etapa de estabilización donde se forman los enlaces covaientes en forma de aminas secundarias entre la giicoproteína y el óxido binario. Preferentemente el agente reductor de la etapa (d2) se selecciona de entre borohidruro de sodio (NaBH4), hidruro de litio, hidruro de litio y aluminio, cianoborohidruro de sodio, cianoborohidruro de litio, boranos o el a-picolino borano, triacetoxiborohidruro sódico, o borohidruro de sodio modificado con sales metálicas polivalentes o activado por ácidos. Otro aspecto de la presente invención se refiere ai uso del catalizador de la invención para la sintesis de ásteres aiquílicos de ácidos grasos volátiles, preferiblemente para la síntesis de vaierato de butilo.
Por el término“éster alquílico de ácido graso volátil” se entiende en la presente invención como aquel éster aiquílico proveniente de ácidos grasos de cadena corta o ácidos grasos volátiles que son un subgrupo de ácidos grasos con cadenas carbonadas de menos de seis átomos de carbono, como por ejemplo ácido acético ácido propiónico. ácido isobutírico. ácido butírico, ácido isovalérico, el ácido valérico y el ácido caproico, entre otros. Su volatilidad se debe a la corta cadena carbonada que poseen, en contraste con ios ácidos grasos de cadena larga, que son sólidos a temperatura ambiente. La parte del éster que es un alquilo es un alquilo de cadena corta, preferiblemente de entre 4 y 7 átomos de carbono.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al procedimiento de síntesis de ésteres aiquílicos de ácidos grasos volátiles que comprende la transesterificación y/o esterificación de un ácido graso volátil con un alcohol en presencia del catalizador de la invención. Preferiblemente, el alcohol es un alcohol de cadena corta C1-C4, más preferiblemente el alcohol es butanol, aún más preferiblemente es 1 -butano! en presencia de isooctano.
En una realización preferida del procedimiento de síntesis de ésteres aiquílicos de ácidos grasos volátiles, el ácido graso volátil es ácido valérico. En otra realización preferida dei procedimiento de síntesis de ásteres alquílicos de ácidos grasos volátiles, la reacción de transesterificación y/o esterificación se lleva a cabo a una temperatura de entre 20 °C a 50 °C. En otra realización preferida del procedimiento de síntesis de ásteres alquílicos de ácidos grasos volátiles, la proporción molar del ácido graso volátil y el alcohol es de entre 1 :1 a 1 :3.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para ios expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG, 1 Esquema del proceso llevado a cabo para la obtención de los óxidos binarios FIG. 2 Patrones de difracción de rayos X de los óxidos metálicos binarios.
FIG. 3 Reciciabilidad dei biocatalizador G1-CH~GPEr en reacciones de síntesis de valerato de butilo. FIG. 4 Estabilidad térmica de OPEr libre e inmovilizada sobre el soporte G1 a través de sus cadenas giucídicas oxidadas.
FIG. 5 Estabilidad a diferentes valores de pH de OPEr líbre e inmovilizada sobre el soporte G1 a través de sus cadenas giucídicas oxidadas.
FIG. 8 A) Estabilidad a temperatura de los biocatalizadores. B) Estabilidad a pH de ios biocataiizadores.
FIG, 7 Actividad residual (%) de los biocatalizadores tras 6 meses de almacenamiento a 4 °C en Tris-HC! 20 mM pH 7. FIG. 8 Curso de las reacciones de esterificación de cada ácido. A) ácido butírico, B) ácido valérico, C) ácido bexanoico, D) ácido heptanoico F!G. 9 Reciclabilidad de ios biocatalizadores en reacciones de síntesis de ásteres butíiicos de varios ácidos grasos de cadena corta. A) G1-CH-OPEr, B) G1-GA-OPEr, C) G4-CH-OPEr, D) G4-GA-OPEr.
EJEMPLOS A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad dei producto de la invención.
Síntesis y caracterización de óxidos metálicos binarios G1, G4 y G5 En ia presente invención se sintetizan óxidos metálicos binarios partiendo de una masa negra procedente dei reciclado mecánico de pilas y baterías alcalinas y de Zn/C agotadas.
E i óxido metálico binario denominado G1 se corresponde con ei producto objeto de ia presente invención, mientras que ios productos G4 y G5 se presentan como datos comparativos.
La síntesis de ios óxidos metálicos binarios con diferentes proporciones de Zn/Mn se llevó a cabo a partir de un residuo generado en el reciclado de pilas y baterías alcalinas a través de etapas de (1) lixiviación ácida (con HCI) del Zn y Mn, seguida de (2) ia precipitación de ios cationes Zn2+ y Mn2+ en un medio alcalino. De este modo, se pueden obtener óxidos de Mn-Zn con diferentes relaciones molares Mn/Zn (1 ,4-11) del tipo ZnxMn3-x04 (0,25 < x > 1 ,25) y con estructura cristalina tipo espinela. La Figura 1 resume el proceso llevado a cabo.
Las pilas y baterías fuera de uso se trituraron bajo una atmosfera de N2. El producto resultante se sometió a una etapa de separación magnética para eliminar el acero y finalmente, se separaron ios componentes de plástico y papel mediante cribas. El producto resultante de estas etapas está constituido por los electrodos (grafito) y los electrolitos de las pilas y baterías (sales de zinc, manganeso y potasio). A este producto, le denominamos masa negra inicial. El análisis de la composición química mediante fluorescencia de rayos X (XRF) de la masa negra inicial se presenta en la Tabla 1.
Tabla 1. Composición química de la masa negra de partida (% en peso)
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La masa negra está compuesta fundamentalmente por Mn (36,8 wt%) y Zn (23,7 wt.%) Mineralógicamente, las fases cristalinas mayoritarias son zincita (ZnO), betaerolite (ZnMnsCL) y silvita (KCI), siendo wt% el porcentaje en peso. La lixiviación de ia masa negra se ilevó a cabo utilizando 1 litro de una solución formada por 250 mL de agua mliliQ, 500 mL de ácido clorhidrico (HCI, 32%-35% de riqueza) y 250 mL de agua oxigenada (H 02, 39% de riqueza) para diferentes relaciones masa negra/disolución lixiviante (S/L). Estos ensayos fueron llevados a cabo a temperatura ambiente durante una hora empleándose agitación mecánica, de 500 rpm y después de ese tiempo, se filtraron utilizando un filtro Miliipore Holder a 7 bar de presión.
La espinela de fórmula Zno,2sMn2,7s04 (G1), se obtiene cuando disolvemos 300 g de masa negra en 1 L de disolución ácida; nos referimos a una disolución que está formada por una mezcla de 25 %v/v de agua, 25% v/v de H2Q2 (solución de H2O2 en agua al 30% en peso) y 50% v/v de HCI del 35% de pureza (1 1 ,33M). El pH de esta disolución está comprendido entre 3,5 y 3,7. En la Tabla 2 se resumen los resultados obtenidos tras el análisis mediante espectroscopia de absorción atómica (AAS) (SpectraAA 200 spectromeíer, Varían) de las diferentes soluciones obtenidas en función de las distintas condiciones de operación. El pH de estas soluciones está en todos ios casos comprendido entre 0 y 4 unidades. Tabla 2. Contenido en Mn y Zn y eficiencia de las diferentes lixiviaciones.
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El Zn y el Mn se precipitaron selectivamente a partir de las soluciones lixiviadas de cada uno de las nanopartíeulas LG1 , LG4 y LG5, utilizando una disolución de NaOH 6 M hasta alcanzar un valor de pH - 12-14. Las precipitaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente, empleando constantemente agitación mecánica a 500 rpm. Una vez alcanzado el pH básico, la disolución se filtró y el sólido resultante se secó en una estufa a 80 °C durante 24 h. La disolución LG1 se precipita con solución 6 M de NaOH para obtener el producto G1. El consumo de solución de NaOH 6M está comprendido entre 2,4 y 3,0 L por cada litro de LG1. Para la solución LG4 el consumo está comprendido entre 2,0 y 2,4 L de NaOH 6M y para la solución LG5, entre 1 ,1 y 1 ,4 L de NaOH 6M
Los sólidos resultantes (G1 , G4 y G5) se analizaron mediante difracción de rayos-X para determinar su naturaleza cristalina y su estequiomeíria, utilizando para ello refinamientos de la estructura mediante análisis Rietveld. En la Tabla 3 se muestra la composición química (porcentaje en peso) en términos de óxidos binarios de cada uno de ios sólidos resultantes G1 , G4 y G5.
Tabla 3. Composición química en términos de óxidos binarios (% en peso) de cada sólido resultante G1 , G4 y G5.
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La composición en fases cristalinas fue examinada por DRX. La Figura 2 muestra ¡os patrones de difracción de rayos X para cada uno de los sólidos G1 , G4 y G5, y las reflexiones que pueden ser indexadas a una simetría tetragonai con grupo espacial 141/amd correspondiente a una estructura tipo espinela, en concordancia con JCPDS,
Card No. 24-1133.
Los datos obtenidos mediante DRX fueron analizados por el método de Rietveid. Los perfiles de difracción correspondientes se refinaron considerando la estructura tipo espinela, donde los átomos de Zn se colocaron en las posiciones cristalográficas 4a ocupando los sitios tetraédricos mientras que los átomos de Mn ocupan los sitios octaédricos en las posiciones 4d. En la Tabla 4 se recoge la composición en fases cristalinas de las muestras sintetizadas obtenidas a partir de ios refinamientos Rietveid observándose la variación en las proporciones Mn/Zn. Los distintos óxidos mixtos Mn/Zn obtenidos en la síntesis presentan una pureza elevada (95-96%). En lo que se refiere a los parámetros de red para ¡a fase ZnMnzG^ los valores del parámetro a son ligeramente superiores a los encontrados en la literatura, que están comprendidos entre 5,709 Á y 5,722 Á, mientras que ios valores del parámetro b (9,240 A) son similares a ¡os obtenidos en ¡a literatura (varían entre 9,222 y 9,238 Á).
Tabla 4. Estequiometria de ios óxidos Zn/Mn sintetizados obtenida mediante análisis de ios resultados de DRX por el método Rietveid.
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EJEMPLO 1
Síntesis de G1-CH, G4-CH y G5-CH: Inmovilización de la lipasa QPEr sobre nanopartículas G1 , G4 y G5.
Se sintetizaron biocatalizadores a partir de ios tres nanomateriaies G1 , G4 y G5 utilizándolos como soportes para la inmovilización de enzimas, concretamente como soporte de un crudo enzimático rico en lipasa OPEr (SEG ID NOs: 4 y 5). La inmovilización se realizó a través de las cadenas glucídicas oxidadas de dicha lipasa mediante el procedimiento que se explica a continuación.
Preparación de nanopartículas de óxido binario de fórmula Zhp ?*Mn? 75O4. con estructura UPO espinela, silanizadas v funcionalizadas con grupos amino .
Las nanopartículas de óxido binario de fórmula Zno.asMna sO,*, con estructura tipo espinela fueron silanizadas y funcionalizadas con 3~aminopropi! triefoxisüano (ARTES, Sigma), compuesto que incorpora grupos amino reactivos en la superficie de la nanopartícula. Basándonos en ei método descrito por Chen et al. (International Journal of Molecular Sciences 2013, 14:4813-4628), se mezcla 1 g de las nanopartículas de óxido binario de fórmula Zn0,2sMn2,7sG4, con estructura tipo espinela, con 9,7 mL de etanol en un baño de ultrasonidos durante 20 min. Se añaden 300 m.1. de ARTES, sonicando durante 10 min. Se agita en un mezclador a 80 rpm y 28 °C durante 16 h. Una vez transcurrido este tiempo se separan las nanopartículas por centrifugación y se retira el líquido de reacción, lavando las partículas funcionalizadas con los grupos amino en la superficie de las mismas con 50 mL de etanol ai 50% en agua seis veces. Finalmente, las nanopartículas de óxido binario de fórmula ZnozsM^ sGr, con estructura tipo espinela amino-funcionalizadas se secan en una estufa de aireación a 65 °G Se valora la densidad de grupos amino accesibles en las partículas mediante el procedimiento descrito por dei Campo eí ai. (Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2005, 293:33-40), poniendo de manifiesto que presentan grupos amino accesibles en superficie en ei rango de 5-20 pmoles/g soporte. Oxidación de las cadenas glucídicas de la ¡¡pasa OPEr
Para que la ¡ipasa OPEr (SEQ ID NOs: 4 y 5) se una covalentemente a los soportes amino-funcionalizados en su superficie es necesario oxidar sus cadenas glucídicas. Brevemente, a una solución de lipasa con 20 mg/mL de proteínas totales se le añade NalÜ4 en Tris-HCI 5 mM pH 7, a concentración final 10 mM. Se mantiene la reacción durante 3 h a 4 °C, en oscuridad y sin agitación, y se dialíza frente a Tris-HCI 20 mM pH 7 para eliminar ios reactivos y subproductos de baja masa molecular. La oxidación de ¡as cadenas glucídicas de ¡a ¡ipasa se lleva a cabo para generar grupos aldehido en ¡os azúcares de dicha enzima, y posteriormente, durante el proceso de inmovilización sobre ¡os soportes amino-funcionalizados, unir covalentemente estos grupos reactivos a ¡os grupos amino de las nanopartículas. Inmovilización de !a lipasa OPEr.
Brevemente, se parte de 1 g de nanopartículas funcionalizadas G1-CH, G4-CH y G5- CH ai que se ¡e añade Tris-HCI 20 mM pH 7, sonicando durante 10 min. Se retira el tampón por centrifugación a 5000 x g. En ese mismo vial, se añade tampón Tris-HCI 100 mM pH 8, se agita y a continuación se añade el volumen de la preparación de la
¡ipasa equivalente a una actividad de 1 ,2 U de actividad por mg de soporte amino- funcionalizado GX-CH (que corresponden a 20 microgramos de proteína total por mg de soporte), y trimetil amino borano (TMAB) a una concentración final de 150 mM. Se agita y se mantiene en agitación a 80 rpm y 28 °C durante 16 h. Posteriormente se retira el sobrenadante, midiendo su actividad residual. La actividad se determinó utilizando un sustrato modelo, p-nitrofenil butirato (pNPB), cuya hidrólisis permite un seguimiento colorimétrico sencillo de ¡a actividad, tanto en ¡os sobrenadantes de las reacciones de inmovilización como del biocatalizador inmovilizado. Se añaden 30 mL de NaBH4 (1 mg/mL) a las nanopartículas magnéticas con ¡a ¡ipasa OPEr (SEQ ID NO: 4 y 5) inmovilizada y se deja reaccionar durante 1 h. Finalmente se lavan las preparaciones de OPEr (SEQ ID NOs: 4 y 5) inmovilizada sobre los tres soportes secuencialmente con Tris-HCI 100 mM pH 7 y Tris-HCI 20 mM pH 7, resuspendiéndolas en este último solvente para su almacenamiento a 4 °C. En ¡a Tabla 5 se muestran los resultados de la reacción de inmovilización. En los tres casos, ia cantidad de actividad residual detectada en el sobrenadante tras la inmovilización fue prácticamente nula, sugiriendo que toda la actividad aportada había sido inmovilizada. Sin embargo, la actividad específica de ¡os tres biocatalizadores producidos corresponde a entre el 15% y el 61 % de la actividad total ofrecida (1 ,2 U/mg).
Esto probablemente se debe a la inactivación parcial de la enzima en las condiciones de inmovilización, que además parece depender de la composición de ¡as nanopartículas. Tabla 5. Resultados de ¡a reacción de inmovilización de OPEr sobre nanopartículas G1 , G4 y G5.
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Síntesis de vaíerato de butilo catalizada por los biocatalizadores Gi-CH-OPEr, G4- CH-OPEr y G5-CH~OPEr.
Se ensayó la actividad de los tres biocatalizadores G1 -CH-OPEr, G4-CH-0PEr y G5- CH-OPEr en una reacción de síntesis de interés biotecnológico, concretamente en ia producción del valerato de butilo, responsable de ciertos aromas naturales, mediante esterificación directa. La mezcla de reacción, que no contenía agua, estaba compuesta por 1 1 U totales de actividad (medida frente a pNPB), 100 mM ácido valérico y 200 mM de 1 -butano! en isooctano, manteniendo la reacción a 25 °C con agitación rotatoria a 100 rpm durante 8 h. Los resultados se muestran en la Tabla 6. Tabla 6. Porcentajes de esterificación de 1-butanol y ácido valérico catalizado por ¡os tres biocatalizadores G1-CH-QPEr, G4-CH-OPEr y G5-CH-OPEr ensayados.
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Todas las preparaciones fueron activas, aunque con considerables diferencias. El biocatalizador G1-CH-OPEr fue el que mostró en este experimento la mayor actividad, y fue seleccionado para evaluar el efecto de la concentración de sustratos sobre el rendimiento de síntesis del éster, así como la reciciabiiidad en esta reacción.
En el caso concreto del soporte G5 y a pesar de que la eficiencia de la esterificación de 1 -butano! y ácido vaiérico fue del 76,3%±4,9 en las condiciones ensayadas, la actividad específica del biocatalizador G5-CH-OPEr es de tan solo 0,2 U/mg (Ver Tabla 5). Por esta razón los siguientes experimentos se realizaron con ¡os biocatalizadores G1-CH- OPEr y G4-GH-OPEr
Estabilidad de almacenamiento de G1-CH-OPEr y G4-CH-OPEr Para el almacenamiento de los biocatiiizadores G1-CH-OPEr y G4-CH-OPEr se ensayaron dos procedimientos. Por un lado, los biocatalizadores fueron mantenidos en buffer a 4 °C durante 1 mes tras el cual se comprobó su actividad. Por otro lado, se ¡iofiiizó una cantidad de! biocatalizador y se ensayó su actividad tras resuspenderlas en buffer durante 1 h. En la Tabla 7 podemos ver que manteniendo los catalizadores en buffer a 4 °C la actividad se mantiene para ambos tipos de inmovilización y soporte. Sin embargo, tras iiofilizar hay una gran pérdida de actividad.
Tabla 7 Estabilidad almacenamiento en buffer a 4 °C y tras liofiiización
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Reciciabiiidad de los biocatalizadores G1~CH~OPEr y G4-CH-QPEr También se probó la reciclabiiidad de los biocatalizadores G1~CH-OPEr y G4-CH~GPEr seleccionados para ¡a sintesis de vaierato de butilo, utilizando una concentración de ácido 100 mM. La separación de los biocatalizadores se realizó por centrifugación a 20000 x g, lavando las nanopartículas con lampón Tris-HCl e isooctano entre ciclos. Esta velocidad de centrifugación es necesaria para que el biocataiizador sedimente y poder recuperarlo para reciclario. Sin embargo, la centrifugación provoca una cierta compactación dei biocataiizador, lo que puede repercutir en su actividad. Por otra parte, el biocataiizador G4--CH-OPEr sedimenta mal incluso a esta velocidad, de manera que es más difícil de recuperar.
A pesar de todo, ios resultados mostrados en ia Figura 3 permiten constatar la reciclabiiidad de ambos biocatalizadores. Estos sustratos son de pequeño tamaño y no parecen presentar problemas para difundir a pesar de la compactación dei biocataiizador, que es observable a simple vista. Con el biocataiizador G1-CH-GPEr se consigue prácticamente el 100% de esterificación a lo largo de 5 ciclos de reacción. Ei biocataiizador G4-CH-OPEr mantiene un 80-86% de esterificación en los tres primeros ciclos, pero este valor decae en los posteriores. Por esta razón, se seleccionó el biocataiizador G1-CH-OPEr para los ensayos posteriores Efecto de la concentración de los sustratos sobre la actividad de G1-CH-OPEr en la síntesis de vaierato de butilo
Se ensayó el efecto de la concentración de los sustratos 1 -butano! y ácido valérico, manteniendo todas las condiciones del experimento Inicial, incluyendo la proporción molar de los sustratos (1 :2). El rendimiento de síntesis catalizada en cada caso se muestra en la Tabla 8
A ia vísta de los resultados, podemos decir que este biocataiizador es capaz de sintetizar el vaierato de butilo en el rango de concentraciones ensayado, aunque la eficiencia de esterificación desciende con el aumento de ia concentración de los sustratos.
Tabla 8. Porcentajes de esterificación de distintas concentraciones de 1 -butano! y ácido valérico (proporción molar 2:1) catalizada por G1-CH-OPEr.
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Estabilidad de la lipasa OPEr libre y del biocatalizador Gi-CH-OPEr a temperatura y pH
La termoestabilidad de la lipasa OPEr (SEQ ID NOs: 4 y 5) se evaluó entre 25 y 70 °C, con el catalizador libre (disuelto) o inmovilizado a través de sus cadenas glucídicas sobre el soporte G1 resuspendido en la pón Tris-HCI 20 mM a pH 7 La estabilidad frente a distintos valores de pH se determinó a 4 °C en lampón Britton & Robinson ajustado a pH entre 2 y 10. En ambos casos, se agitaron 0,25 mg de catalizador, disueltos o resuspendidos en 500 pL de lampón, durante 24 horas a 1200 rpm en un termobloque a cada una de las temperaturas y los pH analizados. Se midió la actividad residual, tomando el valor obtenido a 25 °C y pH 7, respectivamente, como el 100%.
Los resultados presentados en la Figura 4 muestran que la inmovilización de la lipasa OPEr con el soporte (G1~CH-GPEr) y procedimiento presentado aquí mejora notablemente la estabilidad térmica de la glicoproteína, conservando el 80% de actividad tras 24 h a 50 °C y el 45% a 60 °C, mientras que la lipasa OPEr libre (SEQ ID NO: 4 y 5) es poco o nada activa en estas condiciones.
En cuanto a la estabilidad a pH, en la Figura 5 se observa que la actividad del biocatalizador G1-CH-OPEr se mantiene en valores cercanos al 100% entre pH 3 y 10, a diferencia de la enzima libre (SEQ ID NOs: 4 y 5), cuya actividad decae por debajo de pH 6 y por encima de pH 8.
EJEMPLO 2
Se compararon las características de la lipasa OPEr inmovilizada por dos métodos distintos sobre ios soportes AG1 y AG4:
A) sobre el soporte aminofuncionalizado y activado con glutaraldehído (GA), y
B) mediante el procedimiento descrito en el EJEMPLO 1 , en el que la lipasa OPEr se une ai soporte aminofuncionalizado a través de grupos aldehido obtenidos en la proteína a partir de sus propias cadenas glucídicas (CH-) Los datos de la inmovilización se presentan en la Tabla 9. La actividad se determinó utilizando un sustrato modelo, p- nitrofenil butirato (pNPB), cuya hidrólisis permite un seguimiento colorimétrico sencillo de la actividad, tanto en los sobrenadantes de las reacciones de inmovilización como del biocatalizador inmovilizado.
A. Inmovilización sobre nanoparticuias aminofuncionalizadas activadas con qlutaraldehído (GA). Mediante este procedimiento, ampliamente descrito para añadir grupos aldehido en la superficie de soportes de diferentes tipos, se trataron las nanoparticuias aminofuncionalizadas con GA antes de añadir ios crudos enzimáticos. Se pesó 1 g de nanoparticuias aminofuncionalizadas y se incubaron con una solución de glutaraldehido 250 mM en agua (40 mL), durante 3 h a temperatura ambiente en agitación rotacional, a 80 rpm. Las nanoparticuias modificadas con glutaraldehido se lavaron con agua para eliminar ei glutaraldehido residual y una vez más con solución lampón Tris-HCI 20 mM, pH 7. Los soportes obtenidos, con grupos aldehido superficiales, se denominan AG1- GA y AG4-GA. A continuación, se incubó 1 g de cada uno de los soportes con una solución que contenía 750 mU de la lipasa OPEr (10 pg de proteína total) por mg de soporte, en un volumen final de 30 L (solución de la pón Tris-HCI 100 M, pH 7). La mezcla se mantuvo en agitación a 80 rpm durante 24 h a temperatura ambiente. Después de la inmovilización, se recuperó el sobrenadante para medir la actividad lipasa. Las preparaciones se lavaron con lampón Tris~HC! 20 mM, pH 7, para retirar las proteínas no unidas. Las proteínas inmovilizadas, a las que denominaremos como AG1-GA-OPEr y AG4-GA- OPEr se mantuvieron en ei mismo lampón a 4 °C hasta su uso.
Tras la inmovilización, se recuperó aproximadamente el 50% de la actividad lipasa inicial y la actividad específica de los catalizadores obtenidos fue de 0,4 U/mg para AG1-GA- OPEr y 0,35 para AG4-GA-OPEr (Tabla 9).
B. Inmovilización sobre nanoparticuias aminofuncionalizadas a través de las cadenas de carbohidratos de la proteína. El tratamiento con periodato sódico de las soluciones con la lipasa OPEr (utilizado para formar grupos aldehido a partir de dioles vecinales en sus cadenas glucídicas) y el protocolo seguido para la posterior inmovilización de OPEr sobre los soportes AG1-CH y AG4-CH, se realizaron tal y como se describe en el ejemplo 1 , produciendo ios catalizadores AG1-CH-OPEr y AG4-GH-OPEr. En este caso, la actividad inicial de la solución de OPEr contenía 1500 mU de OPEr (20 pg de profeína total) por mg de soporte. La actividad especifica de ios dos biocafalizadores producidos corresponde a alrededor del 60% de dicha actividad total ofrecida (Tabla 9) y la actividad específica de ¡os catalizadores fue 0,89 y 0,94 U/mg.
Tabla 9. Resultados de la reacción de inmovilización para las distintas dosis de proteína de OPEr ensayadas sobre nanopartículas de Zn/Mn.
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Ar = Actividad residual en el sobrenadante tras la inmovilización
hendimiento inmovilización = 100 x (Ar/Ai)
^Eficiencia = 100 x (Ae/Ai-Ar)
cActividad recuperada = 100 x (Ae/AÍ) Estabilidad a pH y temperatura de los biocatalizadores con soporte G1
Se evaluó la estabilidad térmica de OPEr libre e inmovilizada, disueita o resuspendida en tampón Tris-HCI 20 mM, pH 7, en un rango de temperaturas comprendido entre 25 y 70 °C. La estabilidad a pH se determinó a 4 °C en soluciones o suspensiones con la enzima en lampón Britton y Robinson, en un rango de valores de pH entre 2 y 10.
Para los ensayos con enzimas inmovilizadas se resuspendieron 250 pg del nanobiocatalizador en 500 pL de lampón. En todos los casos, se agitó durante 24 b a 1200 rpm en un ter obloque a cada una de las temperaturas y pH probados.
Finalmente, se midió la actividad residual frente a pNPB, asignando arbitrariamente como el 100% de actividad al valor obtenido a 25 °C, en las valoraciones de termoestabilidad, y a pH 7 para las de estabilidad a pH. Los ensayos se realizaron por triplicado.
Los resultados (FIG. 6) muestran que ambos procedimientos de inmovilización mejoran la estabilidad tanto frente a temperatura como a pH ya sean ácidos o básicos. En ambos casos la mejora es ligeramente mayor para ¡a inmovilización a través de las cadenas de carbohidratos de la proteína (AG1-GH).
Estabilidad de almacenamiento de los biocatalizadores
Se ensayaron dos procedimientos de almacenamiento a largo plazo de estos biocatalizadores y se estudió su estabilidad. Por un lado, los biocatalizadores fueron mantenidos a 4 °C en Tris-HCi 20 mlV3 pH 7, sin adición de estabilizantes, durante 6 meses. Por otro lado, se liofilizó una cantidad del biocatalizador y se ensayó su actividad tras resuspenderlas en buffer durante 1 h.
Tras llofllízar, se mantiene tan solo entre el 16 y el 30% de la actividad inicial, mientras que tras 6 meses de almacenamiento a 4 °C en Tris-HCI 20 mM pH 7, sin adición de estabilizantes se mantiene entre el 80% y el 100% de la actividad, para ambos tipos de inmovilización y soporte (FIG. 7).
Ensayo de la actividad de los biocatalizadores en la síntesis de ésteres butílicos
A continuación, se estudió la eficiencia de ios biocatalizadores en la sintesis de ésteres butílicos de ácidos grasos de cadena corta de entre 4 y 7 átomos de C (butírico, valérico, hexanoico y beptanoico).
Todos los catalizadores fueron capaces de producir los cuatro ésteres (FIG.8), rindiendo más de un 80% en prácticamente todos los casos al cabo de 8 b. En general, el rendimiento de cada catalizador mejora conforme aumenta la longitud de la cadena de! ácido, lo que se corresponde con una disminución de la acidez. Aunque las reacciones se llevaron a cabo en ausencia de agua, las enzimas están rodeadas de una pequeña cantidad de este solvente, indispensable para mantener su actividad catalítica. Por ello, los sustratos de cadena más corta (más ácidos), al entrar en contacto con el centro activo de la enzima, pueden alterar su actividad, mientras que este efecto sería mucho menor en el caso de sustratos de cadena más larga, menos ácidos.
Además, se ensayó el efecto de la concentración de cada uno de ¡os ácidos para el catalizador G1-CH, manteniendo todas las condiciones del experimento inicial, incluyendo la proporción molar de los sustratos (1 :2). El rendimiento de síntesis catalizada en cada caso se muestra en ¡a Tabla 10.
Tabla 10. Porcentajes de esterificación de 1 -butano! y cada uno de los ácidos indicados catalizado por G1-CH. Entre paréntesis se indica el número de átomos de C del compuesto.
Figure imgf000028_0001
A la vísta de los resultados, podemos decir que este biocataiizador es eficiente con todos ¡os sustratos en el rango de concentraciones ensayado, aunque la eficiencia de esterificación desciende con el aumento de la concentración de ¡os sustratos. Por otra parte, la reacción parece ser más estable en el caso de! ácido graso de cadena más larga (heptanoico), independientemente de su concentración. Reciciabiiidad de los biocatalizadores
Se estudió la reciciabiiidad de los biocatalizadores para la síntesis de todos ios ásteres utilizando una concentración de ácido 100 mM. La separación del biocataiizador inmovilizado se realizó por centrifugación a 14000 rpm, lavando las nanopartícuias con lampón Tris-HCI e isooctano entre ciclos. Este sistema causa una cierta co pactación de¡ biocatalizador inmovilizado, que puede repercutir en su actividad, además ios biocataiizadores con ei soporte G4 (G4-CH y G4-GA) se depositan peor durante la centrifugación lo que provoca pérdidas de catalizador durante los lavados entre ciclos.
Los resultados mostrados en la FIG. 9 permiten constatar la excelente reciclabilidad de ios biocataiizadores en todas las reacciones evaluadas. En este caso, no se ha observado una gran pérdida de actividad a lo largo de los sucesivos ciclos para ei biocatalizador con soporte G1. Estos sustratos son de pequeño tamaño y no parecen presentar problemas para difundir a pesar de la compactación del biocatalizador, que es observable a simple vista. En ei caso de los catalizadores con ei soporte G4 se observa una ligera pérdida de actividad, para todos ios ácidos, en cada ciclo debido a pequeñas pérdidas de catalizador en ¡os lavados. La mayor pérdida de actividad se encontró en las reacciones con ácido butírico para ios catalizadores G1-CH y G4-CH, probablemente por su mayor acidez como ya hemos comentado, ya que en esta inmovilización la enzima tiene mayor flexibilidad y se puede ver más afectada por cambios en su entorno. En el caso de la inmovilización G4-GA la enzima está inmovilizada en una configuración más rígida lo que evita que sufra fuertes cambios conformacionaies.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un catalizador biológico reciclable caracterizado por que comprende
· un óxido binario de fórmula ZnxMny04, donde x=G,25-0,85 e y=2,75-2,15, con estructura tipo espinela que está en forma de partículas de tamaño nanométrico, donde dichas partículas están silanizadas y comprenden grupos amino reactivos en su superficie, y
• una glicoproteina con cadenas glucídicas oxidadas,
donde la glicoproteina está inmovilizada covalentemente sobre el óxido binario a través de aminas secundarias
2. El catalizador según la reivindicación 1 , donde el óxido binario está en forma de partículas de tamaño de entre 35 nm y 50 nm.
3. El catalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la concentración de grupos amino reactivos en la superficie de! óxido binario está comprendida entre 5 jjmOl/Qparticula Y 20 mGTΊqI/Qpartícula· 4 El catalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la glicoproteina se selecciona de una lipasa y/o una esterol esterasa con actividad lipasa.
5. El catalizador según la reivindicación 4, donde la lipasa versátil se selecciona de entre cualquiera de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
6 Un procedimiento de obtención del catalizador biológico reciclable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que comprende las siguientes etapas: a) obtener un óxido binario de fórmula ZnxMny04, donde x=0,25-0,85 e y=2,75-2,15, y estructura tipo espinela mediante:
a1) lixiviación en medio ácido constante de masa negra en una concentración de 300 g/l hasta obtener una concentración de Zn de entre 27 g/L y 46 g/L y una concentración de Mn de entre 110 g/L y 127 g/L, desechando los sólidos resultantes mediante filtración, y a2) precipitación selectiva alcalina de la solución resultante de la filtración de la etapa (a1) utilizando de entre 2,4 L a 3 L de medio alcalino en concentraciones mayores de 6 M,
b) silanizar e incorporar grupos amino en la superficie del óxido binario obtenido en la etapa (a),
c) oxidar las cadenas glucídicas de la glicoproteína, e
d) inmovilizar covaientemente el óxido binario que comprende grupos amino reactivos en su superficie, obtenido en la etapa (b) y la glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas obtenida en la etapa (c) con ¡a ayuda de glutaraldehído y/o un agente reductor mediante
d1) reacción entre los aldehidos de las cadenas glucídicas oxidadas de la glicoproteína obtenida en la etapa (c) y los grupos amino reactivos de la superficie del óxido binario obtenido en la etapa (b) en presencia de glutaraldehído y/o un agente reductor, y
d2) aminación reductiva de las iminas formadas en la etapa (d1) con glutaraldehído y/o un agente reductor
7. El procedimiento según la reivindicación 6, donde el medio ácido de la etapa (a1) es una disolución ácida de 25 % v/v de agua, 25 % v/v de H2O2 y 50 % v/v de HCi del 35 % de pureza.
8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, donde el medio alcalino de la etapa (a2) es una disolución de NaOH o KOH. 9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde el reactivo de la siianización y amino-funcionaiización de la etapa (b) se selecciona de la lista que consiste en (3- aminopropil)trietoxisi¡ano (ARTES), {3-aminopropii)trimetoxisiiano, 3[2- (2- 25 aminoetilamino)etilamino] propiltrimetoxisilano, 3-(2-aminoetilamino)- propildimetoximetilsílano, [3-(2-amínoetiiamino)propi¡] trimetoxisilano, 3- aminopropiidimetiímetoxisilano y 3-aminopropii(dietoxi)metiísiiano
10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, donde el agente oxidante de la etapa (c) se selecciona de entre ia lista que consiste en oxidorreductasas, aldosa oxidasas, alcohol deshidrogenasas y oxidasas.
11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde el agente oxidante de ¡a etapa (c) se selecciona de entre ia lista que consiste en 2,23,6- tetramethyM-piperidinyloxy radical, periodinato Dess-Martin, tetraacetato de plomo, bismutato sódico, ácido periódico y periodatos.
12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 , donde el agente reductor de la etapa (d1) se selecciona de entre ia lista que consiste en: borohidruro de sodio, hidruro de litio, hidruro de litio y aluminio, cianoborobidruro de sodio, cianoborohidruro de litio, trimetil amino borano, a-picolino borano, triacetoxiborohidruro sódico, y borohidruro de sodio modificado con sales metálicas polivalentes o activado por ácidos.
13. El procedimiento según la reivindicación 12, donde el agente reductor es una solución de trimetil amino borano en una concentración de entre 100 mM y 300 mM.
14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, donde el agente reductor de ia etapa (d2) se selecciona de entre la lista que consiste en: borohidruro de sodio, hidruro de litio, hidruro de litio y aluminio, cianoborohidruro de sodio, cianoborohidruro de litio, trimetil amino borano, a-picolino borano, triacetoxiborohidruro sódico, y borohidruro de sodio modificado con sales metálicas polivalentes o activado por ácidos.
15. Uso del catalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la síntesis de ásteres alquílicos de ácidos grasos volátiles, preferentemente para la síntesis de valerato de butilo.
16. Procedimiento de síntesis de ásteres alquílicos de ácidos grasos volátiles que comprende ia transesterificación y/o esterificación de un ácido graso volátil con un alcohol en presencia de un catalizador según cualquiera de ¡as reivindicaciones 1 a 5.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, donde el alcohol es un alcohol de cadena corta C1-C4.
18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, donde ei alcohol es 1 -butano! en presencia de isooctano. 19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 18, donde el ácido graso volátil es ácido valérico. 20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde la reacción de transesterificación y/o esterificación se lleva a cabo a una temperatura de entre 20 °C a 50 °C.
21. Procedimiento según cualquiera de ¡as reivindicaciones 18 a 20 donde la proporción molar del ácido graso volátil y el alcohol es de entre 1 :1 a 1 :3.
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