ES2785774B2 - Catalizador biologico reciclable obtenido a partir de masa negra de pilas desechadas para la sintesis de esteres alquilicos de acidos grasos volatiles - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓN
Catalizador biológico reciclable obtenido a partir de masa negra de pilas desechadas para la síntesis de ésteres alquílicos de ácidos grasos volátiles
La presente invención se refiere un catalizador biológico reciclable caracterizado por que comprende unas nanopartículas de óxido binario de fórmula, con estructura tipo espinela, silanizadas y que comprenden grupos amino reactivos en su superficie y una glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas donde la glicoproteína está inmovilizada covalentemente sobre el óxido binario a través de aminas secundarias y al procedimiento de obtención de dicho catalizador. Además, la presente invención se refiere al uso de dicho catalizador en la síntesis de ésteres alquílicos de ácidos grasos volátiles y al procedimiento de síntesis de ésteres alquílicos de ácidos grasos volátiles.
Por tanto, la presente invención tiene interés en la industria de la gestión de residuos sólidos urbanos y, a su vez, en la industria de los biocatalizadores.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los ésteres de ácidos grasos volátiles de cadena corta contribuyen al aroma y al sabor natural de las frutas y verduras y se utilizan profusamente como aditivos en las industrias farmacéutica, cosmética y alimentaria. Aunque se pueden extraer de fuentes naturales, las concentraciones son muy bajas. Por ello, para fines industriales suelen producirse mediante síntesis química a altas temperaturas empleando catalizadores no selectivos. En estas condiciones, se generan productos secundarios no deseados y los ésteres no se pueden etiquetar como productos naturales. Hoy en día, la preferencia de los consumidores por los alimentos naturales y la búsqueda de procesos químicos verdes y sostenibles han fomentado el interés por los productos químicos de base biológica. La síntesis de ésteres por biocatálisis da una solución a los problemas anteriores, ya que las reacciones son específicas, selectivas, limpias y se desarrollan bajo condiciones suaves. Por lo tanto, los ésteres producidos enzimáticamente cumplen con las regulaciones europeas y americanas para compuestos naturales, siendo la tasa de crecimiento anual esperada de su mercado global de alrededor del 6,4% para 2016 2021. Las lipasas de los hongos Candida rugosa, Candida antárctica, Rhizopus oryzae, Thermomyces lanuginosus o Rhizomucor miehei están entre los biocatalizadores más
frecuentemente utilizados para la síntesis de aromas y saborizantes de tipo éster como el valerato de butilo.
Entre las principales ventajas de los catalizadores biológicos frente a los químicos, podemos mencionar su selectividad, su especificidad, y su carácter "verde", ya que son eficientes en condiciones suaves de reacción y no generan subproductos tóxicos. Sin embargo, el coste de las enzimas es elevado. La inmovilización es una de las principales herramientas para disminuir el impacto de los biocatalizadores en los costes finales de los bioprocesos. Esta estrategia permite separar la enzima del resto de los componentes de la mezcla de reacción, utilizándola en sucesivos ciclos catalíticos sin pérdidas relevantes de actividad y facilitando además la separación de los productos. Todo ello se traduce en procesos menos costosos, medioambientalmente limpios y más simples, lo que justifica el creciente número de patentes que protegen aplicaciones relacionadas con el uso de biocatalizadores inmovilizados.
Los materiales empleados como soportes para la inmovilización pueden ser orgánicos, inorgánicos o híbridos. En general, se prefieren los inorgánicos por su mayor resistencia, especialmente microbiológica y mecánica, y porque se pueden modificar químicamente permitiendo la fijación de la proteína mediante distintos procedimientos.
Por tanto, es necesario continuar desarrollando nuevos materiales para este propósito.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención plantea el empleo de materiales derivados del reciclado de pilas como soporte inorgánico, sostenible y de bajo coste, para la inmovilización de glicoproteínas con cadenas glucídicas oxidadas. El uso de acumuladores de energía es esencial para nuestra actividad cotidiana, pero, desde una perspectiva medioambiental, es imprescindible tanto gestionar adecuadamente esos productos post-consumo como recuperar y reutilizar sus componentes valiosos, en este caso, zinc y manganeso que forman parte del ánodo y cátodo de las pilas y acumuladores.
En la presente invención se utilizan pilas desechadas del tipo alcalinas y de Zn/C, para sintetizar un óxido mixto binario de Zn/Mn en tamaño nanométrico, con estequiometria Zn 0 . 25 Mn 2 . 75 O 4 y simetría tetragonal con grupo espacial I41/amd correspondiente a una
estructura tipo espinela. Dicho óxido binario se utiliza como soporte para la inmovilización covalente de un crudo enzimático con actividad lipasa en la presente invención, concretamente de una glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas; la glicoproteína queda inmovilizada covalentemente sobre el óxido binario a través de aminas secundarias. El catalizador biológico formado es reciclable porque mantiene su actividad catalítica a lo largo de varios ciclos de reacción realizados en las mismas condiciones.
Para poder inmovilizar la glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas al oxido binario obtenido de pilas desechadas, éste óxido debe estar silanizado y tener grupos amino reactivos en su superficie; dichos grupos amino son los que reaccionan, en presencia de un agente reductor, con los aldehídos de las cadenas glucídicas oxidadas de la glicoproteína para formar la unión covalente entre el óxido binario y la glicoproteína en forma de aminas secundarias. El procedimiento de formación del catalizador biológico reciclable de la presente invención comprende por tanto una etapa de obtención del óxido binario a partir de pilas desechadas, una etapa de silanización e incorporación de grupos amino en la superficie del óxido binario mediante silanación y una etapa de inmovilización covalente con la ayuda de un agente reductor.
La presente invención se refiere además al uso de dicho catalizador biológico reciclable en la síntesis de ésteres alquílicos de ácidos grasos volátiles que comprende la transesterificación y/o esterificación de un ácido graso volátil con un alcohol en presencia del catalizador de la invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un catalizador biológico reciclable (a partir de aquí "el catalizador de la presente invención”) caracterizado por que comprende
• un óxido binario de fórmula ZnxMnyO 4 , donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2,15, con estructura tipo espinela que está en forma de partículas de tamaño nanométrico, donde dichas partículas están silanizadas y comprenden grupos amino reactivos en su superficie, y
• una glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas,
donde la glicoproteína está inmovilizada covalentemente sobre el óxido binario a través de aminas secundarias.
En una realización preferida del catalizador biológico reciclable de la presente invención, dicho catalizador comprende:
• un óxido binario de fórmula Zn 0 , 25 Mn 2 , 75 O 4 , con estructura tipo espinela que está en forma de partículas de tamaño nanométrico, donde dichas partículas están silanizadas y comprenden grupos amino reactivos en su superficie, y
• una glicoproteina con cadenas glucídicas oxidadas,
donde la glicoproteína está inmovilizada covalentemente sobre el óxido binario a través de aminas secundarias.
El óxido binario de fórmula ZnxMnyO 4 , donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2,15, del catalizador biológico reciclable de la presente invención tiene estructura tipo espinela y está en forma de partículas de tamaño nanométrico. En una realización preferida del catalizador de la presente invención, el óxido binario está en forma de partículas de tamaño de entre 35 nm y 50 nm.
En el catalizador biológico reciclable de la presente invención el óxido binario de fórmula ZnxMnyO 4 , donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2,15, actúa como soporte de la glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas. Para poder ser soporte de la glicoproteína el óxido binario debe estar silanizado y tener grupos amino reactivos en su superficie. Por el término "reactivos” se entiende en la presente invención como aquello grupos amino capaces de reaccionar con los grupos aldehídos de las cadenas glucídicas oxidadas de la glicoproteína en presencia de un agente reductor. Preferiblemente, la concentración de grupos amino reactivos en la superficie del soporte está comprendida entre 5 pmol/gpartícula y 20 pmol/gpartícula. La glicoproteína está inmovilizada covalentemente sobre el óxido binario a través de las aminas secundarias formadas.
A efectos de la presente invención, la inmovilización covalente entre el óxido binario que comprende grupos amino reactivos en su superficie y la glicoproteína se produce mediante la formación de aminas secundarias; en presencia de un agente reductor los
aldehidos de las cadenas glucídicas oxidadas de la glicoproteína reaccionan con los grupos amino reactivos que se encuentran en la superficie del óxido binario de fórmula ZnxMnyO 4 , donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2,15, para formar una imina (base de Schiff) que posteriormente se estabiliza mediante aminación reductiva formando una amina secundaria. La inmovilización aporta una unión covalente al soporte por múltiples puntos que resulta en una mejora de la eficiencia del catalizador. Cabe señalar, que la inmovilización mantiene la integridad estructural de la enzima, cuya secuencia proteica no interviene en la interacción con el óxido binario de fórmula ZnxMnyO 4 , donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2,15.
Las glicoproteínas a las que se refiere la presente invención son glicoproteínas del grupo de las hidrolasas de ésteres carboxílicos (EC 3.1.1), preferentemente con actividad triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3), conocidas generalmente como lipasas. Dentro del grupo de enzimas denominadas generalmente lipasas, existe un grupo conocido como "lipasas estrictas” que son enzimas que solo actúan sobre glicéridos, y otro grupo conocido como "lipasas versátiles” que además de actuar sobre glicéridos, también actúan frente a ésteres diferentes a los glicéridos. Del mismo modo, algunas carboxil esterasas (EC 3.1.1.1) y esterol esterasas (EC3.1.1.13) tienen una amplia especificidad de sustrato y presentan también actividad lipasa gracias a su actividad frente a glicéridos. En el caso particular de las esterol esterasas con actividad lipasa, se ha propuesto recientemente que pasen a denominarse "lipasas versátiles” ya que algunas de ellas incluso tienen más actividad sobre glicéridos que sobre ésteres de esterol.
En una realización preferida, la glicoproteína es preferentemente cualquier enzima con actividad lipasa, más preferentemente es una lipasa, tanto estricta como versátil, y/o una esterol esterasa.
Las glicoproteínas son proteínas que, de forma natural, contienen una o más cadenas glucídicas que se unen covalentemente a ciertas asparaginas, serinas y treoninas durante la biosíntesis proteica. En el caso de su unión a asparagina, el grupo amino de la cadena lateral se asocia al carbohidrato mediante enlace W-glicosídico, mientras que con serina y treonina se establece un enlace O-glicosídico al condensarse el hidroxilo de sus cadenas laterales con otro del monosacárido. La porción glucídica de las glicoproteínas es muy variable, pudiendo encontrarse desde monosacáridos hasta largas y complejas cadenas de diferente composición, estructura, y grado de
ramificación.
En una realización más preferida la glicoproteína es una lipasa versátil sintetizada de forma natural por el hongo filamentoso dimórfico Ophiostoma piceae. Dicha esterol esterasa/lipasa o lipasa versátil nativa es una glicoproteína de masa molecular 66 kDa que comprende un 8% de glicosilación.
En la presente invención, el término "gen esterol esterasa" se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica la esterol esterasa/lipasa o lipasa versátil de O. piceae y se identifica por la SEQ. ID NO: 1.
A efectos de la presente invención, los términos, glicoproteína con actividad lipasa, esterol esterasa/lipasa y lipasa versátil, se utilizan indistintamente a lo largo de la presente invención y se refieren al grupo de proteínas que presentan actividad lipasa, pudiendo ser lipasas estrictas y/o lipasas versátiles. La forma nativa de la esterol esterasa/lipasa o lipasa versátil de la presente invención comprende la secuencia aminoacídica completa de la proteína codificada por el gen esterol esterasa de O. piceae, incluyendo el péptido señal (SEQ. ID NO: 2). La forma madura de dicha enzima comprende la secuencia aminoacídica codificada por el gen esterol esterasa, sin incluir el péptido señal y se identifica con la SEQ ID NO: 3. En adelante se hablará de enzima nativa como la forma madura, sin péptido señal, para diferenciarla de las formas recombinantes.
En la presente invención las expresiones "expresión heteróloga" y "gen heterólogo" se refieren a la introducción de un gen extraño (heterólogo) en un organismo con el fin de modificar su material genético y los productos de expresión. A efectos de la presente invención, dicho organismo es una levadura metilotrófica, preferentemente Pichia pastons.
En una realización particular, la secuencia aminoacídica madura codificada por el gen esterol esterasa, se expresa en la levadura P. pastoris, empleando como péptido señal el pre-propéptido del factor a de Saccharomyces cerevisiae dando lugar a la esterol esterasa/lipasa o lipasa versátil recombinante descrita en la presente invención. Esta lipasa versátil recombinante presenta modificaciones en su secuencia aminoacídica, que comprende entre 6-8 aminoácidos nuevos en el extremo N-terminal, añadidos sobre
la secuencia aminoacídica de la proteína nativa madura. En una realización más preferida, la lipasa versátil recombinante procedente de O. piceae y expresada en la levadura P. pastoris (OPEr), comprende la secuencia SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.
En otra realización preferida, la lipasa versátil de la presente invención se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. En una realización más preferida, la enzima lipasa versátil se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
A efectos de la presente invención, además de las lipasas versátiles de SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, cualquier experto en la materia puede utilizar cualquier glicoproteína nativa o recombinante de cualquier origen biológico con actividad lipasa conocida, tales como las lipasas nativas o recombinantes producidas por otros hongos distintos a O. piceae, por ej.: Candida sp., Candida rugosa, Melanocarpus albomyces, Candida antárctica (Cal A, Cal B), Thermomyces lanuginosus, Rhizopus oryzae, Mucor miehei, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Nectria haematococca, o Plicaturiopsis crispa.
En una realización más preferida, la glicoproteína, preferentemente la lipasa versátil, inmovilizada sobre nanopartículas de óxido binario de fórmula ZnxMnyO 4 , donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2,15, con estructura tipo espinela según se describe en la presente invención, es preferentemente la lipasa versátil que comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.
El término “glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas” se refiere a una glicoproteína, tal y como se describe anteriormente, que, por medio de una reacción de oxidación, ha generado grupos aldehídos en sus cadenas glucídicas.
Ejemplos de agentes oxidantes capaces de generar grupos aldehído en cadenas glucídicas de glicoproteínas son
- enzimas, que se seleccionan de la lista que consiste en oxidorreductasas, aldosa oxidasas, alcohol deshidrogenasas y oxidasas,
- y agentes químicos oxidantes que se seleccionan de entre 2,2,6,6-tetramethyl-1piperidinyloxy radical (TEMPO), periodinato Dess-Martin, tetraacetato de plomo Pb-(O 2 CCH 3 ) 4 , bismutato sódico (NaBiO 3 ), ácido periódico, periodatos como periodato sódico (NaIO 4 ) y periodato potásico (KIO 4 ).
Otro aspecto de la invención se refiere al procedimiento de obtención del catalizador de la presente invención, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
a) obtener un óxido binario de fórmula ZnxMnyO 4 , donde x=0,25-0,85 y y=2,75-2,15, y estructura tipo espinela mediante:
a1) lixiviación en medio ácido constante de masa negra en una concentración de 300 g/l hasta obtener una concentración de Zn de entre 27,5 g/L y 46 g/L y una concentración de Mn de entre 110 g/L y 127 g/L, desechando los sólidos resultantes mediante filtración, y
a2) precipitación selectiva alcalina de la solución resultante de la filtración de la etapa (a1) utilizando de entre 2.4 L a 3 L de medio alcalino en concentraciones mayores de 6 M,
b) silanizar e incorporar grupos amino en la superficie del óxido binario obtenido en la etapa (a),
c) oxidar las cadenas glucídicas de la glicoproteína, e
d) inmovilizar covalentemente el óxido binario que comprende grupos amino reactivos en su superficie obtenido en la etapa (b) y la glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas obtenida en la etapa (c) con la ayuda de un agente reductor mediante d1) reacción entre los aldehídos de las cadenas glucídicas oxidadas de la glicoproteína obtenida en la etapa (c) y los grupos amino reactivos de la superficie del óxido binario obtenido en la etapa (b) en presencia de un agente reductor, y
d2) aminación reductiva de las iminas formadas en la etapa (d1) con un agente reductor
El óxido binario de fórmula ZnxMnyO 4 , donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2,15, y estructura tipo espinela se obtiene a partir de la masa negra obtenida de pilas desechadas.
En la presente invención se entiende por "masa negra” como aquel sólido inorgánico obtenido en las etapas de desmantelamiento de las pilas y que contiene los electrolitos, el grafito y los óxidos de manganeso y zinc que constituyen el ánodo y el cátodo de las pilas. Los principales componentes de las pilas son el dióxido de manganeso (electrodo
positivo), zinc (electrodo negativo), el electrolito (KOH o ZnCl 2 + NH 4 CI) y el acero (cubierta de la pila). Estos residuos generan gran preocupación en la sociedad por el impacto negativo sobre la salud pública y medio ambiente que producen, debido sobre todo a su alto contenido en metales pesados. La separación mecánica constituye el punto de partida de la obtención de masas negra y tiene por objeto separar los electrodos, el acero, papel, y plásticos mediante etapas de corte-trituración, separación magnética, separación dimensional (cribado), separación de ECS (usando corrientes de Foucault) y molienda de la fracción de polvo.
En la presente invención el óxido binario de fórmula ZnxMnyO 4 , donde x = 0,25 - 0,85 e y = 2,75 - 2,15, y estructura tipo espinela se obtiene a partir de (etapa (a1)) una lixiviación en medio ácido constante de masa negra en una concentración de 300 g/l hasta obtener una concentración de Zn de entre 27,5 g/L y 46 g/L y una concentración de Mn de entre 110 g/L y 127 g/L. Los sólidos resultantes se desechan mediante filtración. Preferiblemente, el medio ácido utilizado en esta etapa (a1) es una disolución ácida de 25 % v/v de agua, 25 % v/v de H 2 O 2 y 50 % v/v de HCl del 35 % de pureza. Un porcentaje inferior de H 2 O 2 no disuelve adecuadamente el Mn y un porcentaje mayor aumentan las espumas en el proceso de disolución y hace que el reactor rebose.
A esta etapa de lixiviación en medio ácido le sigue una precipitación selectiva alcalina (etapa (a2)) utilizando de entre 2,4 L a 3 L de medio alcalino en concentraciones mayores de 6 M. Preferiblemente el medio alcalino de la etapa (a2) es una disolución de NaOH o KOH, preferiblemente NaOH.
La siguiente etapa del procedimiento de la presente invención es la etapa (b) referente a la silanización e incorporación de grupos amino en la superficie del óxido binario de fórmula Zn 0,25 Mn 2,75 O 4 y estructura tipo espinela. El reactivo para la silanación y aminofuncionalización se selecciona preferentemente de la lista que consiste en (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES), (3-aminopropil)trimetoxisilano, 3[2-(2- 25 aminoetilamino)etilamino] propiltrimetoxisilano, 3-(2-aminoetilamino)-propildimetoximetilsilano, [3-(2-aminoetilamino)propil] trimetoxisilano, 3-aminopropildimetilmetoxisilano y 3-aminopropil(dietoxi)metilsilano.
La oxidación de las cadenas glucídicas de una glicoproteína con actividad lipasa de la etapa (c) se lleva a cabo preferentemente en presencia de un agente oxidante. A efectos
de la presente invención, se entiende por agente oxidante cualquier compuesto conocido en la técnica capaz de oxidar a otro en contacto con él. Preferiblemente el agente oxidante se selecciona entre aquéllos capaces de generar grupos aldehído en cadenas glucídicas. En otra realización más preferida aún, el agente oxidante capaz de generar grupos aldehído en cadenas glucídicas se selecciona de la lista que consiste en: enzimas, que se seleccionan de la lista que consiste en oxidorreductasas, aldosa oxidasas, alcohol deshidrogenasas y oxidasas, y agentes químicos oxidantes. En otra realización más preferida aún de la presente invención los agentes químicos oxidantes se seleccionan de entre 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy radical (TEMPO), periodinato Dess-Martin, tetraacetato de plomo Pb-(O 2 CCH 3 ) 4 , bismutato sódico (NaBiO 3 ), ácido periódico o periodatos. Son particularmente preferidos los periodatos y más preferentemente el periodato sódico (NaIO 4 ) y potásico (KIO 4 ).
De acuerdo con una realización preferida, el agente químico oxidante se aplica en forma líquida, generalmente disuelto en solvente acuoso, Io cual facilita y potencia su acción oxidativa. Según una realización preferida, Ia concentración de Ia solución del agente oxidante está comprendida entre 5 mM a 50 mM, más preferentemente 10 mM.
Una vez generados grupos aldehído en las cadenas glucídicas, en la etapa (d1), reaccionan los aldehídos de las cadenas glucídicas oxidadas de la glicoproteína obtenida en la etapa (c) con los gruposamino reactivos de la superficie del óxido binario obtenido en la etapa (b) para formar iminas (base de Schiff) en presencia del agente reductor. El agente reductor de la etapa (d1) se selecciona preferentemente de entre la lista que consiste borohidruro de sodio (NaBH 4 ), hidruro de litio, hidruro de litio y alumninio, cianoborohidruro de sodio, cianoborohidruro de litio, boranos como el trimetil amino borano (TMAB) o el a-picolino borano, triacetoxiborohidruro sódico, o borohidruro de sodio modificado con sales metálicas polivalentes o activado por ácidos.
Si dicho agente reductor se aplica en forma de solución se potencia la acción reductora, por lo que, en una realización preferida de la presente invención el agente reductor es una solución de trimetil amino borano en una concentración de entre 100 mM y 300 mM. Preferiblemente una solución con una concentración de 150 mM.
Finalmente, las iminas formadas en la etapa (d1) se convierten en aminas secundarias estables (enlace covalente) por aminación reductiva en una etapa (d 2 ); dicha etapa (d 2 )
es por tanto una etapa de estabilización donde se forman los enlaces covalentes en forma de aminas secundarias entre la glicoproteína y el óxido binario. Preferentemente el agente reductor de la etapa (d2) se selecciona de entre borohidruro de sodio (NaBH 4 ), hidruro de litio, hidruro de litio y aluminio, cianoborohidruro de sodio, cianoborohidruro de litio, boranos o el a-picolino borano, triacetoxiborohidruro sódico, o borohidruro de sodio modificado con sales metálicas polivalentes o activado por ácidos.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del catalizador de la invención para la síntesis de ésteres alquílicos de ácidos grasos volátiles, preferiblemente para la síntesis de valerato de butilo.
Por el término "éster alquílico de ácido graso volátil” se entiende en la presente invención como aquel éster alquílico proveniente de ácidos grasos de cadena corta o ácidos grasos volátiles que son un subgrupo de ácidos grasos con cadenas carbonadas de menos de seis átomos de carbono, como por ejemplo ácido acético. ácido propiónico. ácido isobutírico. ácido butírico, ácido isovalérico, el ácido valérico y el ácido caproico, entre otros. Su volatilidad se debe a la corta cadena carbonada que poseen, en contraste con los ácidos grasos de cadena larga, que son sólidos a temperatura ambiente. La parte del éster que es un alquilo es un alquilo de cadena corta, preferiblemente de entre 4 y 7 átomos de carbono.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al procedimiento de síntesis de ésteres alquílicos de ácidos grasos volátiles que comprende la transesterificación y/o esterificación de un ácido graso volátil con un alcohol en presencia del catalizador de la invención. Preferiblemente, el alcohol es un alcohol de cadena corta C 1 -C 4 , más preferiblemente el alcohol es butanol, aún más preferiblemente es 1-butanol en presencia de isooctano.
En una realización preferida del procedimiento de síntesis de ésteres alquílicos de ácidos grasos volátiles, el ácido graso volátil es ácido valérico.
En otra realización preferida del procedimiento de síntesis de ésteres alquílicos de ácidos grasos volátiles, la reacción de transesterificación y/o esterificación se lleva a cabo a una temperatura de entre 20 °C a 50 °C.
En otra realización preferida del procedimiento de síntesis de ásteres alquílicos de ácidos grasos volátiles, la proporción molar del ácido graso volátil y el alcohol es de entre 1:1 a 1:3.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 Esquema del proceso llevado a cabo para la obtención de los óxidos binarios
FIG. 2 Patrones de difracción de rayos X de los óxidos metálicos binarios.
FIG. 3 Reciclabilidad del biocatalizador G1-CH-OPEr en reacciones de síntesis de valerato de butilo.
FIG. 4 Estabilidad térmica de OPEr libre e inmovilizada sobre el soporte G1 a través de sus cadenas glucídicas oxidadas.
FIG. 5 Estabilidad a diferentes valores de pH de OPEr libre e inmovilizada sobre el soporte G1 a través de sus cadenas glucídicas oxidadas.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Síntesis y caracterización de óxidos metálicos binarios G1, G4 y G5
En la presente invención se sintetizan óxidos metálicos binarios partiendo de una masa
negra procedente del reciclado mecánico de pilas y baterías alcalinas y de Zn/C agotadas.
El óxido metálico binario denominado G1 se corresponde con el producto objeto de la presente invención, mientras que los productos G4 y G5 se presentan como datos comparativos.
La síntesis de los óxidos metálicos binarios con diferentes proporciones de Zn/Mn se llevó a cabo a partir de un residuo generado en el reciclado de pilas y baterías alcalinas a través de etapas de (1) lixiviación ácida (con HCl) del Zn y Mn, seguida de (2) la precipitación de los cationes Zn2+ y Mn2+ en un medio alcalino. De este modo, se pueden obtener óxidos de Mn-Zn con diferentes relaciones molares Mn/Zn (1,4-11) del tipo ZnxMn 3 -xO 4 (0,25 < x > 1,25) y con estructura cristalina tipo espinela. La Figura 1 resume el proceso llevado a cabo.
Las pilas y baterías fuera de uso se trituraron bajo una atmosfera de N 2 . El producto resultante se sometió a una etapa de separación magnética para eliminar el acero y finalmente, se separaron los componentes de plástico y papel mediante cribas. El producto resultante de estas etapas está constituido por los electrodos (grafito) y los electrolitos de las pilas y baterías (sales de zinc, manganeso y potasio). A este producto, le denominamos masa negra inicial. El análisis de la composición química mediante fluorescencia de rayos X (XRF) de la masa negra inicial se presenta en la Tabla 1.
Tabla 1. Composición química de la masa negra de partida (% en peso)
La masa negra está compuesta fundamentalmente por Mn (36,8 wt%) y Zn (23,7 wt.%). Mineralógicamente, las fases cristalinas mayoritarias son zincita (ZnO), hetaerolite (ZnMn 2 O 4 ) y silvita (KCl), siendo wt% el porcentaje en peso.
La lixiviación de la masa negra se llevó a cabo utilizando 1 litro de una solución formada por 250 mL de agua milliQ, 500 mL de ácido clorhídrico (HCl, 32%-35% de riqueza) y 250 mL de agua oxigenada (H 2 O 2 , 39% de riqueza) para diferentes relaciones masa negra/disolución lixiviante (S/L). Estos ensayos fueron llevados a cabo a temperatura ambiente durante una hora empleándose agitación mecánica, de 500 rpm y después de ese tiempo, se filtraron utilizando un filtro Millipore Holder a 7 bar de presión.
La espinela de fórmula Zn 0 , 25 Mn 2 , 75 O 4 (G1), se obtiene cuando disolvemos 300 g de masa negra en 1L de disolución ácida; nos referimos a una disolución que está formada por una mezcla de 25 %v/v de agua, 25% v/v de H 2 O 2 (solución de H 2 O 2 en agua al 30% en peso) y 50% v/v de HCl del 35% de pureza (11,33M). El pH de esta disolución está comprendido entre 3,5 y 3,7.
En la Tabla 2 se resumen los resultados obtenidos tras el análisis mediante
espectroscopia de absorción atómica (AAS) (SpectraAA 200 spectrometer, Varian) de las diferentes soluciones obtenidas en función de las distintas condiciones de operación. El pH de estas soluciones está en todos los casos comprendido entre 0 y 4 unidades.
Tabla 2. Contenido en Mn y Zn y eficiencia de las diferentes lixiviaciones.
El Zn y el Mn se precipitaron selectivamente a partir de las soluciones lixiviadas de cada uno de las nanopartículas LG1, LG4 y LG5, utilizando una disolución de NaOH 6 M hasta alcanzar un valor de pH ~ 12-14. Las precipitaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente, empleando constantemente agitación mecánica a 500 rpm. Una vez alcanzado el pH básico, la disolución se filtró y el sólido resultante se secó en una estufa a 80 °C durante 24 h.
La disolución LG1 se precipita con solución 6 M de NaOH para obtener el producto G1. El consumo de solución de NaOH 6M está comprendido entre 2,4 y 3,0 L por cada litro de LG1. Para la solución LG4 el consumo está comprendido entre 2,0 y 2,4 L de NaOH 6M y para la solución LG5, entre 1,1 y 1,4 L de NaOH 6M.
Los sólidos resultantes (G1, G4 y G5) se analizaron mediante difracción de rayos-X para determinar su naturaleza cristalina y su estequiometria, utilizando para ello refinamientos de la estructura mediante análisis Rietveld. En la Tabla 3 se muestra la composición química (porcentaje en peso) en términos de óxidos binarios de cada uno de los sólidos resultantes G1, G4 y G5.
Tabla 3. Composición química en términos de óxidos binarios (% en peso) de cada sólido resultante G1, G4 y G5.
La composición en fases cristalinas fue examinada por DRX. La Figura 2 muestra los patrones de difracción de rayos X para cada uno de los sólidos G1, G4 y G5, y las reflexiones que pueden ser indexadas a una simetría tetragonal con grupo espacial I41/amd correspondiente a una estructura tipo espinela, en concordancia con JCPDS, Card No. 24-1133.
Los datos obtenidos mediante DRX fueron analizados por el método de Rietveld. Los perfiles de difracción correspondientes se refinaron considerando la estructura tipo
espinela, donde los átomos de Zn se colocaron en las posiciones cristalográficas 4a ocupando los sitios tetraédricos mientras que los átomos de Mn ocupan los sitios octaédricos en las posiciones 4d. En la Tabla 4 se recoge la composición en fases cristalinas de las muestras sintetizadas obtenidas a partir de los refinamientos Rietveld observándose la variación en las proporciones Mn/Zn. Los distintos óxidos mixtos Mn/Zn obtenidos en la síntesis presentan una pureza elevada (95-96%). En lo que se refiere a los parámetros de red para la fase ZnMn 2 O 4 , los valores del parámetro a son ligeramente superiores a los encontrados en la literatura, que están comprendidos entre 5,709 Á y 5,722 Á, mientras que los valores del parámetro b (9,240 Á) son similares a los obtenidos en la literatura (varían entre 9,222 y 9,238 Á).
Tabla 4. Estequiometria de los óxidos Zn/Mn sintetizados obtenida mediante análisis de los resultados de DRX por el método Rietveld.
Síntesis de G1-CH, G4-CH y G5-CH: Inmovilización de la lipasa OPEr sobre nanopartículas G1, G4 y G5.
Se sintetizaron biocatalizadores a partir de los tres nanomateriales G1, G4 y G5 utilizándolos como soportes para la inmovilización de enzimas, concretamente como soporte de un crudo enzimático rico en lipasa OPEr (SEQ ID NOs: 4 y 5). La inmovilización se realizó a través de las cadenas glucídicas oxidadas de dicha lipasa mediante el procedimiento que se explica a continuación.
Las nanopartículas de óxido binario de fórmula Zn 0 , 25 Mn 2 , 75 O 4 , con estructura tipo
espinela fueron silanizadas y funcionalizadas con 3-aminopropil trietoxisilano (APTES, Sigma), compuesto que incorpora grupos amino reactivos en la superficie de la nanopartícula. Basándonos en el método descrito por Chen et al. (International Journal of Molecular Sciences 2013, 14:4613-4628), se mezcla 1 g de las nanopartículas de óxido binario de fórmula Zn 0 , 25 Mn 2 , 75 O 4 , con estructura tipo espinela, con 9,7 mL de etanol en un baño de ultrasonidos durante 20 min. Se añaden 300 p,L de APTES, sonicando durante 10 min. Se agita en un mezclador a 80 rpm y 28 °C durante 16 h. Una vez transcurrido este tiempo se separan las nanopartículas por centrifugación y se retira el líquido de reacción, lavando las partículas funcionalizadas con los grupos amino en la superficie de las mismas con 50 mL de etanol al 50% en agua seis veces. Finalmente, las nanopartículas de óxido binario de fórmula Zn 0 , 25 Mn 2 , 75 O 4 , con estructura tipo espinela amino-funcionalizadas se secan en una estufa de aireación a 65 °C. Se valora la densidad de grupos amino accesibles en las partículas mediante el procedimiento descrito por del Campo et al. (Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2005, 293:33-40), poniendo de manifiesto que presentan grupos amino accesibles en superficie en el rango de 5-20 ^moles/g soporte.
Oxidación de las cadenas glucídicas de la lipasa OPEr
Para que la lipasa OPEr (SEQ ID NOs: 4 y 5) se una covalentemente a los soportes amino-funcionalizados en su superficie es necesario oxidar sus cadenas glucídicas. Brevemente, a una solución de lipasa con 20 mg/mL de proteínas totales se le añade NaIO 4 en Tris-HCl 5 mM pH 7, a concentración final 10 mM. Se mantiene la reacción durante 3 h a 4 °C, en oscuridad y sin agitación, y se dializa frente a Tris-HCl 20 mM pH 7 para eliminar los reactivos y subproductos de baja masa molecular. La oxidación de las cadenas glucídicas de la lipasa se lleva a cabo para generar grupos aldehído en los azúcares de dicha enzima, y posteriormente, durante el proceso de inmovilización sobre los soportes amino-funcionalizados, unir covalentemente estos grupos reactivos a los grupos amino de las nanopartículas.
Inmovilización de la lipasa OPEr.
Brevemente, se parte de 1 g de nanopartículas funcionalizadas G1-CH, G4-CH y G5-CH al que se le añade Tris-HCl 20 mM pH 7, sonicando durante 10 min. Se retira el
tampón por centrifugación a 5000 x g. En ese mismo vial, se añade tampón Tris-HCl 100 mM pH 8, se agita y a continuación se añade el volumen de la preparación de la lipasa equivalente a una actividad de 1,2 U de actividad por mg de soporte aminofuncionalizado GX-CH (que corresponden a 20 microgramos de proteína total por mg de soporte), y trimetil amino borano (TMAB) a una concentración final de 150 mM. Se agita y se mantiene en agitación a 80 rpm y 28 °C durante 16 h. Posteriormente se retira el sobrenadante, midiendo su actividad residual. La actividad se determinó utilizando un sustrato modelo, p-nitrofenil butirato (pNPB), cuya hidrólisis permite un seguimiento colorimétrico sencillo de la actividad, tanto en los sobrenadantes de las reacciones de inmovilización como del biocatalizador inmovilizado.
Se añaden 30 mL de NaBH 4 (1 mg/mL) a las nanopartículas magnéticas con la lipasa OPEr (SEQ ID NO: 4 y 5) inmovilizada y se deja reaccionar durante 1 h. Finalmente se lavan las preparaciones de OPEr (SEQ ID NOs: 4 y 5) inmovilizada sobre los tres soportes secuencialmente con Tris-HCl 100 mM pH 7 y Tris-HCl 20 mM pH 7, resuspendiéndolas en este último solvente para su almacenamiento a 4 °C.
En la Tabla 5 se muestran los resultados de la reacción de inmovilización. En los tres casos, la cantidad de actividad residual detectada en el sobrenadante tras la inmovilización fue prácticamente nula, sugiriendo que toda la actividad aportada había sido inmovilizada. Sin embargo, la actividad específica de los tres biocatalizadores producidos corresponde a entre el 15% y el 61% de la actividad total ofrecida (1,2 U/mg). Esto probablemente se debe a la inactivación parcial de la enzima en las condiciones de inmovilización, que además parece depender de la composición de las nanopartículas.
Tabla 5. Resultados de la reacción de inmovilización de OPEr sobre nanopartículas G1, G4 y G5.
Síntesis de valerato de butilo catalizada por los biocatalizadores G1-CH-OPEr, G4-CH-OPEr y G5-CH-OPEr.
Se ensayó la actividad de los tres biocatalizadores G1-CH-OPEr, G4-CH-OPEr y G5-CH-OPEr en una reacción de síntesis de interés biotecnológico, concretamente en la producción del valerato de butilo, responsable de ciertos aromas naturales, mediante esterificación directa. La mezcla de reacción, que no contenía agua, estaba compuesta por 11 U totales de actividad (medida frente a pNPB), 100 mM ácido valérico y 200 mM de 1-butanol en isooctano, manteniendo la reacción a 25 °C con agitación rotatoria a 100 rpm durante 8 h. Los resultados se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Porcentajes de esterificación de 1-butanol y ácido valérico catalizado por los tres biocatalizadores G1-CH-OPEr, G4-CH-OPEr y G5-CH-OPEr ensayados.
Todas las preparaciones fueron activas, aunque con considerables diferencias. El biocatalizador G1-CH-OPEr fue el que mostró en este experimento la mayor actividad, y fue seleccionado para evaluar el efecto de la concentración de sustratos sobre el rendimiento de síntesis del éster así como la reciclabilidad en esta reacción.
En el caso concreto del soporte G5 y a pesar de que la eficiencia de la esterificación de 1-butanol y ácido valérico fue del 76,3%±4,9 en las condiciones ensayadas, la actividad específica del biocatalizador G5-CH-OPEr es de tan solo 0,2 U/mg (Ver Tabla 5). Por esta razón los siguientes experimentos se realizaron con los biocatalizadores G1-CH-OPEr y G4-CH-OPEr.
Estabilidad de almacenamiento de G1-CH-OPEr y G4-CH-OPEr
Para el almacenamiento de los biocatilizadores G1-CH-OPEr y G4-CH-OPEr se ensayaron dos procedimientos. Por un lado, los biocatalizadores fueron mantenidos en buffer a 4 °C durante 1 mes tras el cual se comprobó su actividad. Por otro lado, se liofilizó una cantidad del biocatalizador y se ensayó su actividad tras resuspenderlas en buffer durante 1 h. En la Tabla 7 podemos ver que manteniendo los catalizadores en buffer a 4 °C la actividad se mantiene para ambos tipos de inmovilización y soporte. Sin embargo, tras liofilizar hay una gran pérdida de actividad.
Tabla 7. Estabilidad almacenamiento en buffer a 4 °C y tras liofilización
Reciclabilidad de los biocatalizadores G1-CH-OPEr y G4-CH-OPEr
También se probó la reciclabilidad de los biocatalizadores G1-CH-OPEr y G4-CH-OPEr seleccionados para la síntesis de valerato de butilo, utilizando una concentración de ácido 100 mM. La separación de los biocatalizadores se realizó por centrifugación a 20000 x g, lavando las nanopartículas con tampón Tris-HCl e isooctano entre ciclos. Esta velocidad de centrifugación es necesaria para que el biocatalizador sedimente y poder recuperarlo para reciclarlo. Sin embargo, la centrifugación provoca una cierta compactación del biocatalizador, lo que puede repercutir en su actividad. Por otra parte, el biocatalizador G4-CH-OPEr sedimenta mal incluso a esta velocidad, de manera que es más difícil de recuperar.
A pesar de todo, los resultados mostrados en la Figura 3 permiten constatar la reciclabilidad de ambos biocatalizadores. Estos sustratos son de pequeño tamaño y no parecen presentar problemas para difundir a pesar de la compactación del biocatalizador, que es observable a simple vista. Con el biocatalizador G1-CH-OPEr se consigue prácticamente el 100% de esterificación a lo largo de 5 ciclos de reacción. El biocatalizador G4-CH-OPEr mantiene un 80-86% de esterificación en los tres primeros
ciclos, pero este valor decae en los posteriores. Por esta razón, se seleccionó el biocatalizador G1-CH-OPEr para los ensayos posteriores.
Efecto de la concentración de los sustratos sobre la actividad de G1-CH-OPEr en la síntesis de valerato de butilo
Se ensayó el efecto de la concentración de los sustratos 1-butanol y ácido valérico, manteniendo todas las condiciones del experimento inicial, incluyendo la proporción molar de los sustratos (1:2). El rendimiento de síntesis catalizada en cada caso se muestra en la Tabla 8.
A la vista de los resultados, podemos decir que este biocatalizador es capaz de sintetizar el valerato de butilo en el rango de concentraciones ensayado, aunque la eficiencia de esterificación desciende con el aumento de la concentración de los sustratos.
Tabla 8. Porcentajes de esterificación de distintas concentraciones de 1-butanol y ácido valérico (proporción molar 2:1) catalizada por G1-CH-OPEr.
Estabilidad de la lipasa OPEr libre y del biocatalizador G1-CH-OPEr a temperatura y pH
La termoestabilidad de la lipasa OPEr (SEQ ID NOs: 4 y 5) se evaluó entre 25 y 70 °C, con el catalizador libre (disuelto) o inmovilizado a través de sus cadenas glucídicas sobre el soporte G1 resuspendido en tampón Tris-HCl 20 mM a pH 7. La estabilidad frente a distintos valores de pH se determinó a 4 °C en tampón Britton & Robinson ajustado a pH entre 2 y 10. En ambos casos, se agitaron 0,25 mg de catalizador, disueltos o resuspendidos en 500 pL de tampón, durante 24 horas a 1200 rpm en un termobloque a cada una de las temperaturas y los pH analizados. Se midió la actividad residual, tomando el valor obtenido a 25 °C y pH 7, respectivamente, como el 100%.
Los resultados presentados en la Figura 4 muestran que la inmovilización de la lipasa OPEr con el soporte (G1-CH-OPEr) y procedimiento presentado aquí mejora notablemente la estabilidad térmica de la glicoproteína, conservando el 80% de actividad tras 24 h a 50 °C y el 45% a 60 °C, mientras que la lipasa OPEr libre (SEQ ID NO: 4 y 5) es poco o nada activa en estas condiciones.
En cuanto a la estabilidad a pH, en la Figura 5 se observa que la actividad del biocatalizador G1-CH-OPEr se mantiene en valores cercanos al 100% entre pH 3 y 10, a diferencia de la enzima libre (SEQ ID NOs: 4 y 5), cuya actividad decae por debajo de pH 6 y por encima de pH 8.
Claims (21)
1. Un catalizador biológico reciclable caracterizado por que comprende
• un óxido binario de fórmula ZnxMnyO 4 , donde x=0,25-0,85 e y=2,75-2,15, con estructura tipo espinela que está en forma de partículas de tamaño nanométrico, donde dichas partículas están silanizadas y comprenden grupos amino reactivos en su superficie, y
• una glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas,
donde la glicoproteína está inmovilizada covalentemente sobre el óxido binario a través de aminas secundarias.
2. El catalizador según la reivindicación 1, donde el óxido binario está en forma de partículas de tamaño de entre 35 nm y 50 nm.
3. El catalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la concentración de grupos amino reactivos en la superficie del óxido binario está comprendida entre 5 pmol/gpartícula y 20 pmol/gpartícula.
4. El catalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la glicoproteína se selecciona de una lipasa y/o una esterol esterasa con actividad lipasa.
5. El catalizador según la reivindicación 4, donde la lipasa versátil se selecciona de entre cualquiera de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
6. Un procedimiento de obtención del catalizador biológico reciclable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que comprende las siguientes etapas: a) obtener un óxido binario de fórmula ZnxMnyO 4 , donde x=0,25-0,85 e y=2,75-2,15, y estructura tipo espinela mediante:
a1) lixiviación en medio ácido constante de masa negra en una concentración de 300 g/l hasta obtener una concentración de Zn de entre 27 g/L y 46 g/L y una concentración de Mn de entre 110 g/L y 127 g/L, desechando los sólidos resultantes mediante filtración, y
a2) precipitación selectiva alcalina de la solución resultante de la filtración de la etapa (a1) utilizando de entre 2,4 L a 3 L de medio alcalino en concentraciones mayores de 6 M,
b) silanizar e incorporar grupos amino en la superficie del óxido binario obtenido en la etapa (a),
c) oxidar las cadenas glucídicas de la glicoproteína, e
d) inmovilizar covalentemente el óxido binario que comprende grupos amino reactivos en su superficie, obtenido en la etapa (b) y la glicoproteína con cadenas glucídicas oxidadas obtenida en la etapa (c) con la ayuda de un agente reductor mediante d1) reacción entre los aldehídos de las cadenas glucídicas oxidadas de la glicoproteína obtenida en la etapa (c) y los grupos amino reactivos de la superficie del óxido binario obtenido en la etapa (b) en presencia de un agente reductor, y
d2) aminación reductiva de las iminas formadas en la etapa (d1) con un agente reductor
7. El procedimiento según la reivindicación 6, donde el medio ácido de la etapa (a1) es una disolución ácida de 25 % v/v de agua, 25 % v/v de H 2 O 2 y 50 % v/v de HCl del 35 % de pureza.
8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, donde el medio alcalino de la etapa (a2) es una disolución de NaOH o KOH.
9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde el reactivo de la silanación y amino-funcionalización de la etapa (b) se selecciona de la lista que consiste en (3- aminopropil)trietoxisilano (APTES), (3-aminopropil)trimetoxisilano, 3[2-(2- 25 aminoetilamino)etilamino] propiltrimetoxisilano, 3-(2-aminoetilamino)-propildimetoximetilsilano, [3-(2-aminoetilamino)propil] trimetoxisilano, 3-aminopropildimetilmetoxisilano y 3-aminopropil(dietoxi)metilsilano.
10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, donde el agente oxidante de la etapa (c) se selecciona de entre la lista que consiste en oxidorreductasas, aldosa oxidasas, alcohol deshidrogenasas y oxidasas.
11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde el agente oxidante de la etapa (c) se selecciona de entre la lista que consiste en 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy radical (TEMPO), periodinato Dess-Martin, tetraacetato de plomo Pb-(O 2 CCH 3 ) 4 , bismutato sódico (NaBiÜ 3 ), ácido periódico y periodatos.
12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, donde el agente reductor de la etapa (d1) se selecciona de entre la lista que consiste en: borohidruro de sodio (NaBH 4 ), hidruro de litio, hidruro de litio y aluminio, cianoborohidruro de sodio, cianoborohidruro de litio, trimetil amino borano (TMAB), a-picolino borano, triacetoxiborohidruro sódico, y borohidruro de sodio modificado con sales metálicas polivalentes o activado por ácidos.
13. El procedimiento según la reivindicación 12, donde el agente reductor es una solución de trimetil amino borano en una concentración de entre 100 mM y 300 mM.
14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, donde el agente reductor de la etapa (d2) se selecciona de entre la lista que consiste en: borohidruro de sodio (NaBH 4 ), hidruro de litio, hidruro de litio y aluminio, cianoborohidruro de sodio, cianoborohidruro de litio, trimetil amino borano (TMAB), a-picolino borano, triacetoxiborohidruro sódico, y borohidruro de sodio modificado con sales metálicas polivalentes o activado por ácidos.
15. Uso del catalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la síntesis de ásteres alquílicos de ácidos grasos volátiles, preferentemente para la síntesis de valerato de butilo.
16. Procedimiento de síntesis de ásteres alquílicos de ácidos grasos volátiles que comprende la transesterificación y/o esterificación de un ácido graso volátil con un alcohol en presencia de un catalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, donde el alcohol es un alcohol de cadena corta C1-C4.
18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, donde el alcohol es 1-butanol en presencia de isooctano.
19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde el ácido graso volátil es ácido valérico.
20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde la reacción de transesterificación y/o esterificación se lleva a cabo a una temperatura de entre 20 °C a 50 °C.
21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20 donde la proporción molar del ácido graso volátil y el alcohol es de entre 1:1 a 1:3.
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