CN108728475A - 一种利用蓝藻合成塔格糖的方法 - Google Patents

一种利用蓝藻合成塔格糖的方法 Download PDF

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CN108728475A CN201810665124.XA CN201810665124A CN108728475A CN 108728475 A CN108728475 A CN 108728475A CN 201810665124 A CN201810665124 A CN 201810665124A CN 108728475 A CN108728475 A CN 108728475A
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cyanobacteria
leu
syn7942
tagatose
ala
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朱文博
陈贤情
夏文豪
杨月
王筱
王文
杨慧
江会峰
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P19/02—Monosaccharides

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Abstract

本发明涉及一种利用蓝藻来生产塔格糖的方法，步骤：1)首先根据蓝藻Syn7942的NSI基因构建整合载体NSI，然后将HXK、FbaA以及phytase三个基因插入到载体NSI上，得到需要的重组载体NSI‑HFP；2)将载体NSI‑HFP转化至蓝藻Syn7942细胞内，然后通过氯霉素固体培养基初步筛选出单克隆转基因蓝藻Syn7942；3)将筛选出的单克隆转基因蓝藻Syn7942转接带有氯霉素抗性的液体培养基，提取蓝藻基因组，进行目的基因的PCR验证；4)单克隆转基因蓝藻Syn7942在合适条件下培养，添加IPTG诱导基因HXK、FbaA以及phytase的表达，这些酶将以蓝藻光合作用产生的果糖为底物合成塔格糖；5)分离提纯。本发明以蓝藻为底盘生物进行改造合成塔格糖，生产原料仅需阳光和水分等，生产设备和生产环境构建简单，生产成本大幅度降低。

Description

一种利用蓝藻合成塔格糖的方法
技术领域
本发明涉及塔格糖的一种合成技术，尤其涉及一种利用蓝藻来生产塔格糖的方法，属于合成生物学领域。
背景技术
蓝藻(Cyanobacteria)是一类通过光合作用获取能量的细菌，又名蓝绿藻、蓝绿菌或蓝细菌，其形态结构简单，无固定细胞核，体内含有的藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白加上叶绿体蛋白使之呈现出蓝绿色。蓝藻是地球上最早出现的藻类，是最简单、最原始的单细胞生物，在漫长的进化过程中，蓝藻把地球变成氧化型地球，并被内吞成植物的叶绿体，可以认为蓝藻是最简单的光合作用单位。
由于蓝藻独特的能进行光合作用的生理特性，许多科学家将蓝藻看作一种“生物光反应器”，通过它将空气中的二氧化碳和水变成人类需要的化工产品和一些高价值的天然产物。对蓝藻进行基因改造来生物合成这些产品具有许多优势：(1)目前许多常见蓝藻的基因组，如聚球藻、集胞藻、鱼腥藻等，都已经被测序完毕，同时由于蓝藻的基因组小、结构简单，科学家已经发明了一套针对蓝藻细胞的成熟、易操作的基因编辑体系；(2)相对于高等动植物，蓝藻具有微生物生长快速的特点，适于进行产品的大规模生产操作；(3)蓝藻的适应能力很强，能在很多恶劣环境中生存，同时蓝藻需要的生存条件非常简单，甚至只需阳光和水分就能存活，因此在大规模培养时不仅能大幅度节省原料成本，而且不需要占用耕地资源，避免了和生产食物粮食等竞争土地资源的冲突。(4)蓝藻通过光合作用吸收空气中的二氧化碳并产生氧气排放到空中，因此大规模培养蓝藻能有效地缓解人类不断使用化石原料等造成的“温室效应”，起到一定的环保作用。所以使用蓝藻作为合成生物学中的底盘生物，具有广大的前景和巨大的价值。
塔格糖是稀少糖的一种，近年被发现的一种具有特殊保健功能的功能甜味剂，其甜度与蔗糖相似，而产生的热量只为蔗糖的1/3，所以被称之为低热量甜味剂，具有能量低，可改善肠道菌群，降低血糖，抗龋齿等功能。2001年被美国食品与药物管理局(F D A)确定为普遍公认安全食品(GRAS)。随后塔格糖在美国被通用于健康饮料及酸乳、果汁等产品，作为蔗糖的代用品。同时还被广泛应用于糖尿病专用食品、减肥食品、口香糖、谷物食品、饮料、肉制品、糖果等工业中，并在医药中被用于咳嗽糖浆、粉剂、起泡剂、固定假牙的豁合剂及口腔消毒剂中。目前塔格糖在国际市场上的市场份额正逐年增加，国内市场还正在发展，由于中国人口基数大，糖尿病患者高居世界首位，功能性甜味剂市场广阔等，塔格糖在中国市场上具有极大的潜力。
目前，塔格糖的合成方法主要是化学催化合成法和生物转化法，化学催化合成法是以半乳糖为原材料，通过金属氢氧化合物(常为Ca(OH)2)以及碱金属催化剂(常为CaCl2)催化半乳糖生成塔格糖-Ca复合物，再通过酸中和将塔格糖从复合物中释放出来，该方法具有原材料较贵、产生化学污染物、碱性条件副产物多、分离困难等诸多缺点。而生物转化法是通过L-阿拉伯糖异构酶将半乳糖转化为塔格糖，但同样该反应具有原材料较贵、转化效率低、产物分离难度大等缺点，很难实现工业化大规模生产。本发明通过改造蓝藻生产根皮素旨在解决上面提到的这些技术难题，开发出一种产量高、无污染、生产周期短、成本低且环保的根皮素生物合成方法。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种利用蓝藻合成塔格糖的生物合成方法，该方法产量高、无污染、生产周期短、成本低且环保。
本发明的目的是通过以下技术解决方案来实现的：
一种利用蓝藻合成塔格糖的生物合成方法，包括以下步骤：
1)首先根据蓝藻Syn7942的NSI基因构建整合载体NSI，该载体见附图2，再根据本研究所用蓝藻Syn7942细胞密码子偏好性优化基因HXK、FbaA以及phytase的密码子，然后将三个基因插入到载体NSI上，得到需要的重组载体NSI-HFP，该载体将见附图3；
2)利用蓝藻Syn7942在自然状态下可以吸收外源基因的特性，将载体NSI-HFP转化至蓝藻Syn7942细胞内，然后通过氯霉素固体培养基初步筛选出单克隆转基因蓝藻Syn7942；
3)将筛选出的单克隆转基因蓝藻Syn7942转接带有氯霉素抗性的液体培养基，待蓝藻长起来后，提取蓝藻基因组，进行目的基因的PCR验证，进一步确定我们所需要的转NSI-HFP蓝藻Syn7942；
4)将最终验证成功的单克隆转基因蓝藻Syn7942转接大摇瓶液体培养基，在合适条件下培养，待蓝藻长到一定浓度后，添加IPTG诱导基因HXK、FbaA以及phytase的表达；
5)对产物塔格糖进行分离提纯，然后用高效液相色谱仪检测。优选的，所述步骤2)中氯霉素固体培养基的组成基于专用于培养蓝藻的BG11培养基，添加氯霉素和琼脂，氯霉素终浓度为25-30ug/L，琼脂终浓度为15g/L，所述BG11培养基配方为：
1)磷酸氢二钾3.17g/100ml
2)硫酸镁7.5g/100ml
3)氯化钙3.6g/100ml
4)柠檬酸0.6g/100ml
5)柠檬酸铁铵0.6g/100ml
6)EDTA.2Na.2H2O 0.105g/100ml
7)碳酸钠2.0g/100ml
8)A5包括：
配制BG11培养基时，取2)、3)、4)、6)、7)、A5溶液各1mL，加入1.5g NaNO3，混匀后加蒸馏水定容至1L，然后高温灭菌，等溶液冷却后再往里加入SmL的1)和5)溶液，即完成BGS1液体培养基配制；
优选的，所述步骤3)和步骤4)中液体培养基的组成基于专用于培养蓝藻的BG11培养基，添加氯霉素，氯霉素终浓度为25-30ug/L，所述BG11培养基配方为：
1)磷酸氢二钾3.17g/100ml
2)硫酸镁7.5g/100ml
3)氯化钙3.6g/100ml
4)柠檬酸0.6g/100ml
5)柠檬酸铁铵0.6g/100ml
6)EDTA·2Na·2H2O 0.105g/100ml
7)碳酸钠2.0g/100ml
8)A5包括：
配制BG11培养基时，取2)、3)、4)、6)、7)、A5溶液各1mL，加入1.5g NaNO3，混匀后加蒸馏水定容至1L，然后高温灭菌，等溶液冷却后再往里加入1mL的1)和5)溶液，即完成BG11液体培养基配制。
优选的，所述步骤4)中，培养条件如下：100-200rpm旋转，30-35℃光照培养至OD730大于或等于1.0时，添加IPTG至终浓度为1mM，培养24-120h。
优选的，所述塔格糖的分离提纯操作如下：
取IPTG诱导后培养的转基因蓝藻培养液100mL，用高压破碎仪破碎蓝藻细胞，然后10000rpm，离心10min，取上清液，用高效液相色谱仪检测塔格糖。
本发明生产塔格糖与现有技术的不同之处在于：
1)以蓝藻为底盘生物进行改造合成塔格糖，生产原料仅需阳光和水分等，生产设备和生产环境构建简单，不需要大量用电，因此相较于其它生产方法，生产成本大幅度降低；
2)以改造微生物为技术基础，在微生物体内进行生物酶的催化合成，避免大规模的提取、分离、纯化过程，从生产成本和对环境友好方面容易控制；
3)本工艺在生产设备的规模和数量上比其他方法要要少，操作简单，易于产业转化；
4)本工艺仅在生产的最后步骤有分离纯化工序，产品纯化工艺简单，产品质量比一般方法纯度更好、含量更高；
5)合成过程没有废液排放，环境友好，无污染，可持续生产，本发明工艺从经济、环境和职业健康角度均为优良的工业化生产指路线。
本专利用到的物种及基因见下表1。
表1专利中用到的物种
附图说明
图1为本项目的塔格糖生物合成路线图；
图2为本项目中用到的质粒图谱；
图3为本项目中用到的质粒图谱；
具体实施方式
以下结合附图，对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
质粒构建过程：根据蓝藻Syn7942的NSI基因序列，按照附图2中的质粒图谱构建整合载体NSI。然后根据本发明中提供的基因HXK、FbaA以及phytase的氨基酸序列，按照蓝藻Syn7942细胞密码子偏好性设计相应基因的核酸序列，将基因HXK、FbaA以及phytase送商业公司合成，设计20bp左右大小的同源臂，按照附图3中的质粒图谱，利用一步克隆试剂盒，将这三个基因构建于整合载体NSI上。
实施例2
转化过程：
1)取2mL生长密度OD730为0.8～1.2的野生型Syn7942于离心管中，然后10000rpm，离心2min，去掉上清液；
2)用1mL 10mM氯化钠溶液混匀上一步中的沉淀物，然后10000rpm，离心2min，去掉上清液；
3)用1mL已灭菌的无抗BG11液体培养基混匀上一步中的沉淀物，然后10000rpm，离心2min，去掉上清液；
4)用100uL已灭菌的无抗BG11液体培养基混匀上一步中的沉淀物，然后向其中加入200ng的质粒DNA。用锡箔纸彻底密封该离心管(避光处理)，然后在摇床中，100rpm，30℃培养10小时；
5)将上一步离心管中的蓝藻全部涂到含有25ug/mL氯霉素的BG11固体培养基上，将平板放入30℃光照培养箱中，待1到2个星期长出蓝藻单克隆后进行后续验证。
(除离心外，以上其余操作必须在超净台中完成，保证无菌环境)
实施例3
转基因蓝藻的验证和产物的检测过程：
挑取10个左右含有25ug/mL氯霉素BG11固体培养基上长出来的单克隆蓝藻菌斑，接入5mL25ug/mL氯霉素BG11液体体培养基中培养，待蓝藻培养到OD730为0.5时，提取基因组，以设计好的引物PCR验证HXK、FbaA以及phytase三个目的基因，并PCR将产物送测序，确定基因序列是否正确；将验证正确的单克隆转基因蓝藻Syn7942转接至接入100mL BG11液体培养基中光照培养，待OD730为S时，添加IPTG诱导HXK、FbaA以及phytase三个基因表达，表达的酶将以蓝藻光合作用产生的果糖为底物合成塔格糖，然后分别取诱导后培养1天、3天、5天时的转基因蓝藻，用高压破碎仪破碎蓝藻细胞，对产物分离提纯后，用高效液相色谱仪检测。(以上实验均用野生型Syn7942做阴性对照实验)以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应在本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司
<120> 一种利用蓝藻合成塔格糖的方法
<130> 201806201806201806201806
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1529
<212> DNA
<213> 蓝藻(Synechococcus elongatus PCC7942)
<400> 1
tatcaagatt gctggggaag aaccgaccat ccacaacgcg atcgagcggc tgcttggcaa 60
aaaccgtaag gaaatcgagc aaattgccaa ggagaccctc gaaggcaact tgcgtggtgt 120
tttagccagc ctcacgccgg agcagatcaa cgaggacaaa attgcctttg ccaaaagtct 180
gctggaagag gcggaggatg accttgagca gctgggtcta gtcctcgata cgctgcaagt 240
ccagaacatt tccgatgagg tcggttatct ctcggctagt ggacgcaagc agcgggctga 300
tctgcagcga gatgcccgaa ttgctgaagc cgatgcccag gctgcctctg cgatccaaac 360
ggccgaaaat gacaagatca cggccctgcg tcggatcgat cgcgatgtag cgatcgccca 420
agccgaggcc gagcgccgga ttcaggatgc gttgacgcgg cgcgaagcgg tggtggccga 480
agctgaagcg gacattgcta ccgaagtcgc tcgtagccaa gcagaactcc ctgtgcagca 540
ggagcggatc aaacaggtgc agcagcaact tcaagccgat gtgatcgccc cagctgaggc 600
agcttgtaaa cgggcgatcg cggaagcgcg gggggccgcc gcccgtatcg tcgaagatgg 660
aaaagctcaa gcggaaggga cccaacggct ggcggaggct tggcagaccg ctggtgctaa 720
tgcccgcgac atcttcctgc tccagaagct cgagtccctg ctcgtcacgc tttcaggcac 780
cgtgccagat atcgacgtgg agtcgatcac tgtgattggc gaaggggaag gcagcgctac 840
ccaaatcgct agcttgctgg agaagctgaa acaaaccacg ggcattgatc tggcgaaatc 900
cctaccgggt caatccgact cgcccgctgc gaagtcctaa gagatagcga tgtgaccgcg 960
atcgcttgtc aagaatccca gtgatcccga accataggaa ggcaagctca atgcttgcct 1020
cgtcttgagg actatctaga tgtctgtgga acgcacattt attgccatca agcccgatgg 1080
cgttcagcgg ggtttggtcg gtacgatcat cggccgcttt gagcaaaaag gcttcaaact 1140
ggtgggccta aagcagctga agcccagtcg cgagctggcc gaacagcact atgctgtcca 1200
ccgcgagcgc cccttcttca atggcctcgt cgagttcatc acctctgggc cgatcgtggc 1260
gatcgtcttg gaaggcgaag gcgttgtggc ggctgctcgc aagttgatcg gcgctaccaa 1320
tccgctgacg gcagaaccgg gcaccatccg tggtgatttt ggtgtcaata ttggccgcaa 1380
catcatccat ggctcggatg caatcgaaac agcacaacag gaaattgctc tctggtttag 1440
cccagcagag ctaagtgatt ggacccccac gattcaaccc tggctgtacg aataaggtct 1500
gcattccttc agagagacat tgccatgcc 1529
<210> 1
<211> 485
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
Met Val His Leu Gly Pro Lys Lys Pro Gln Ala Arg Lys Gly Ser Met
1 5 10 15
Ala Asp Val Pro Lys Glu Leu Met Asp Glu Ile His Gln Leu Glu Asp
20 25 30
Met Phe Thr Val Asp Ser Glu Thr Leu Arg Lys Val Val Lys His Phe
35 40 45
Ile Asp Glu Leu Asn Lys Gly Leu Thr Lys Lys Gly Gly Asn Ile Pro
50 55 60
Met Ile Pro Gly Trp Val Met Glu Phe Pro Thr Gly Lys Glu Ser Gly
65 70 75 80
Asn Tyr Leu Ala Ile Asp Leu Gly Gly Thr Asn Leu Arg Val Val Leu
85 90 95
Val Lys Leu Ser Gly Asn His Thr Phe Asp Thr Thr Gln Ser Lys Tyr
100 105 110
Lys Leu Pro His Asp Met Arg Thr Thr Lys His Gln Glu Glu Leu Trp
115 120 125
Ser Phe Ile Ala Asp Ser Leu Lys Asp Phe Met Val Glu Gln Glu Leu
130 135 140
Leu Asn Thr Lys Asp Thr Leu Pro Leu Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Pro
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asn Lys Ile Asn Glu Gly Ile Leu Gln Arg Trp Thr Lys
165 170 175
Gly Phe Asp Ile Pro Asn Val Glu Gly His Asp Val Val Pro Leu Leu
180 185 190
Gln Asn Glu Ile Ser Lys Arg Glu Leu Pro Ile Glu Ile Val Ala Leu
195 200 205
Ile Asn Asp Thr Val Gly Thr Leu Ile Ala Ser Tyr Tyr Thr Asp Pro
210 215 220
Glu Thr Lys Met Gly Val Ile Phe Gly Thr Gly Val Asn Gly Ala Phe
225 230 235 240
Tyr Asp Val Val Ser Asp Ile Glu Lys Leu Glu Gly Lys Leu Ala Asp
245 250 255
Asp Ile Pro Ser Asn Ser Pro Met Ala Ile Asn Cys Glu Tyr Gly Ser
260 265 270
Phe Asp Asn Glu His Leu Val Leu Pro Arg Thr Lys Tyr Asp Val Ala
275 280 285
Val Asp Glu Gln Ser Pro Arg Pro Gly Gln Gln Ala Phe Glu Lys Met
290 295 300
Thr Ser Gly Tyr Tyr Leu Gly Glu Leu Leu Arg Leu Val Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Asn Glu Lys Gly Leu Met Leu Lys Asp Gln Asp Leu Ser Lys Leu
325 330 335
Lys Gln Pro Tyr Ile Met Asp Thr Ser Tyr Pro Ala Arg Ile Glu Asp
340 345 350
Asp Pro Phe Glu Asn Leu Glu Asp Thr Asp Asp Ile Phe Gln Lys Asp
355 360 365
Phe Gly Val Lys Thr Thr Leu Pro Glu Arg Lys Leu Ile Arg Arg Leu
370 375 380
Cys Glu Leu Ile Gly Thr Arg Ala Ala Arg Leu Ala Val Cys Gly Ile
385 390 395 400
Ala Ala Ile Cys Gln Lys Arg Gly Tyr Lys Thr Gly His Ile Ala Ala
405 410 415
Asp Gly Ser Val Tyr Asn Lys Tyr Pro Gly Phe Lys Glu Ala Ala Ala
420 425 430
Lys Gly Leu Arg Asp Ile Tyr Gly Trp Thr Gly Asp Ala Ser Lys Asp
435 440 445
Pro Ile Thr Ile Val Pro Ala Glu Asp Gly Ser Gly Ala Gly Ala Ala
450 455 460
Val Ile Ala Ala Leu Ser Glu Lys Arg Ile Ala Glu Gly Lys Ser Leu
465 470 475 480
Gly Ile Ile Gly Ala
485
<210> 1
<211> 359
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli str. K-12)
<400> 1
Met Ser Lys Ile Phe Asp Phe Val Lys Pro Gly Val Ile Thr Gly Asp
1 5 10 15
Asp Val Gln Lys Val Phe Gln Val Ala Lys Glu Asn Asn Phe Ala Leu
20 25 30
Pro Ala Val Asn Cys Val Gly Thr Asp Ser Ile Asn Ala Val Leu Glu
35 40 45
Thr Ala Ala Lys Val Lys Ala Pro Val Ile Val Gln Phe Ser Asn Gly
50 55 60
Gly Ala Ser Phe Ile Ala Gly Lys Gly Val Lys Ser Asp Val Pro Gln
65 70 75 80
Gly Ala Ala Ile Leu Gly Ala Ile Ser Gly Ala His His Val His Gln
85 90 95
Met Ala Glu His Tyr Gly Val Pro Val Ile Leu His Thr Asp His Cys
100 105 110
Ala Lys Lys Leu Leu Pro Trp Ile Asp Gly Leu Leu Asp Ala Gly Glu
115 120 125
Lys His Phe Ala Ala Thr Gly Lys Pro Leu Phe Ser Ser His Met Ile
130 135 140
Asp Leu Ser Glu Glu Ser Leu Gln Glu Asn Ile Glu Ile Cys Ser Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Glu Arg Met Ser Lys Ile Gly Met Thr Leu Glu Ile Glu Leu
165 170 175
Gly Cys Thr Gly Gly Glu Glu Asp Gly Val Asp Asn Ser His Met Asp
180 185 190
Ala Ser Ala Leu Tyr Thr Gln Pro Glu Asp Val Asp Tyr Ala Tyr Thr
195 200 205
Glu Leu Ser Lys Ile Ser Pro Arg Phe Thr Ile Ala Ala Ser Phe Gly
210 215 220
Asn Val His Gly Val Tyr Lys Pro Gly Asn Val Val Leu Thr Pro Thr
225 230 235 240
Ile Leu Arg Asp Ser Gln Glu Tyr Val Ser Lys Lys His Asn Leu Pro
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Gln Glu Ile Lys Asp Ser Val Ser Tyr Gly Val Val Lys Met Asn Ile
275 280 285
Asp Thr Asp Thr Gln Trp Ala Thr Trp Glu Gly Val Leu Asn Tyr Tyr
290 295 300
Lys Ala Asn Glu Ala Tyr Leu Gln Gly Gln Leu Gly Asn Pro Lys Gly
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Glu Asp Gln Pro Asn Lys Lys Tyr Tyr Asp Pro Arg Val Trp Leu Arg
325 330 335
Ala Gly Gln Thr Ser Met Ile Ala Arg Leu Glu Lys Ala Phe Gln Glu
340 345 350
Leu Asn Ala Ile Asp Val Leu
355
<210> 1
<211> 432
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 1
Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr
1 5 10 15
Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser
20 25 30
Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr
35 40 45
Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val
50 55 60
Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys
85 90 95
Lys Gly Cys Pro Gln Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp
100 105 110
Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro
115 120 125
Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp
130 135 140
Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala
145 150 155 160
Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp
165 170 175
Phe Thr Gly His Arg Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu
180 185 190
Asn Phe Pro Gln Ser Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu
195 200 205
Ser Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala
210 215 220
Asp Asn Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr
225 230 235 240
Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp
245 250 255
Gly Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His
260 265 270
Asn Ala Gln Phe Tyr Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His
290 295 300
Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu
305 310 315 320
Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu
325 330 335
Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly
340 345 350
Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln
355 360 365
Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp
370 375 380
Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr
385 390 395 400
Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala
405 410 415
Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
420 425 430

Claims (5)

1.一种利用蓝藻合成塔格糖的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)首先，基于蓝藻Syn7942的NSI基因构建整合载体NSI，再根据蓝藻Syn7942细胞密码子偏好性优化基因HXK、FbaA以及phytase的密码子，然后将三个基因插入到载体NSI上，得到重组载体NSI-HFP；
2)基于蓝藻Syn7942在自然状态下能够吸收外源基因的特性，将重组载体NSI-HFP转化至蓝藻Syn7942细胞内，然后通过氯霉素固体培养基初步筛选出单克隆转基因蓝藻Syn7942；
3)将筛选出的单克隆转基因蓝藻Syn7942转接至带有氯霉素抗性的液体培养基中，待蓝藻生长出后，提取蓝藻基因组，进行目的基因的PCR验证；
4)将验证成功的单克隆转基因蓝藻Syn7942转接至液体培养基，在一定条件下培养，待蓝藻长到OD730大于或等于1时，添加IPTG诱导基因HXK、FbaA以及phytase的表达，表达的酶以蓝藻光合作用产生的果糖为底物合成塔格糖；
5)对产物塔格糖进行分离提纯。
2.根据权利要求1所述的利用蓝藻合成塔格糖的方法，其特征在于：所述步骤2)中氯霉素固体培养基的组成基于专用于培养蓝藻的BG11培养基，添加氯霉素和琼脂，氯霉素终浓度为25-30ug/L，琼脂终浓度为15g/L，所述BG11培养基配方为：
1)磷酸氢二钾 3.17g/100ml
2)硫酸镁 7.5g/100ml
3)氯化钙 3.6g/100ml
4)柠檬酸 0.6g/100ml
5)柠檬酸铁铵 0.6g/100ml
6)EDTA·2Na·2H2O 0.105g/100ml
7)碳酸钠 2.0g/100ml
8)A5包括：
H3BO3 2.8g/L
MnCl2·4H2O 1.81g/L
ZnSO4·7H2O 0.22g/L
Na2MoO4·2H2O 0.39g/L
CuSO4·5H2O 0.08g/L
CoCl2·6H2O 0.01g/L；
配制BG11培养基时，取2)、3)、4)、6)、7)、A5溶液各1mL，加入1.5g NaNO3，混匀后加蒸馏水定容至1L，然后高温灭菌，等溶液冷却后再往里加入1mL的1)和5)溶液，即完成BG11液体培养基配制。
3.根据权利要求1所述的利用蓝藻合成塔格糖的方法，其特征在于：所述步骤3)和步骤4)中液体培养基的组成基于专用于培养蓝藻的BG11培养基，添加氯霉素，氯霉素终浓度为25-30ug/L，所述BG11培养基配方为：
1)磷酸氢二钾3.17g/100ml
2)硫酸镁7.5g/100ml
3)氯化钙3.6g/100ml
4)柠檬酸0.6g/100ml
5)柠檬酸铁铵0.6g/100ml
6)EDTA·2Na·2H2O 0.105g/100ml
7)碳酸钠2.0g/100ml
8)A5包括：
H3BO3 2.8g/L
MnCl2·4H2O 1.81g/L
ZnSO4·7H2O 0.22g/L
Na2MoO4·2H2O 0.39g/L
CuSO4·5H2O 0.08g/L
CoCl2·6H2O 0.01g/L；
配制BG11培养基时，取2)、3)、4)、6)、7)、A5溶液各1mL，加入1.5g NaNO3，混匀后加蒸馏水定容至1L，然后高温灭菌，等溶液冷却后再往里加入1mL的1)和5)溶液，即完成BG11液体培养基配制。
4.根据权利要求1所述的利用蓝藻合成塔格糖的方法，其特征在于：所述步骤4)中，培养条件如下：100-200rpm旋转，30-35℃光照培养至OD730大于或等于1.0时，添加IPTG至终浓度为1mM，培养24-120h。
5.根据权利要求1所述的利用蓝藻合成塔格糖的方法，其特征在于：所述塔格糖的分离提纯操作如下：
取IPTG诱导后培养的转基因蓝藻培养液100mL，用高压破碎仪破碎蓝藻细胞，然后10000rpm，离心10min，取上清液，用高效液相色谱仪检测塔格糖。
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