JPH10179166A - 受容体型チロシンキナーゼＥｒｂＢのリガンドをコードする遺伝子及びその蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 受容体型チロシンキナーゼErbBの新規リガン
ドをコードする遺伝子を同定し、この遺伝子の組織中に
おける発現部位を特定することなどにより、生体におけ
るその機能を解明し、更にその医薬及び診断用途への利
用を提供する。 【解決手段】 本発明は、受容体型チロシンキナーゼEr
bBの新規リガンドNTAKをコードする遺伝子、その遺伝子
産物などからなる。本発明は、神経疾患、癌疾患あるい
は他の疾患において有用な治療薬又は診断薬を提供する
ものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、受容体型チロシン
キナーゼErbBの新規リガンドをコードする遺伝子、該遺
伝子を含有する組換えベクター、該ベクターによる形質
転換、該遺伝子を用いた受容体型チロシンキナーゼErbB
の新規リガンドの製造方法、及び該製造方法によって製
造される組換え受容体型チロシンキナーゼErbBの新規リ
ガンド、上記受容体型チロシンキナーゼErbBの新規リガ
ンドをコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズしう
るオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを用いて
受容体型チロシンキナーゼErbBの新規リガンドの生成を
抑制する方法、受容体型チロシンキナーゼErbBの新規リ
ガンドを認識する抗体、ならびに該抗体を用いて受容体
型チロシンキナーゼErbBの新規リガンドの生成を抑制す
る方法及びその検出を行う方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】これまで数多くの細胞増殖因子とその受
容体が報告されてきた。なかでも増殖因子EGFファミリ
ーとその受容体ErbBファミリーはその構造と機能につい
て最も解析が進んでいるものの一つである。また遺伝子
工学の技術を用いて作製された遺伝子欠損マウスの解析
からEGF-ErbBファミリーの生物個体における生理機能が
徐々に解明されつつある。その一方では、これまでに明
らかにされてきた因子のみでは説明のつかない現象も見
つかってきている。このことは既知の因子に新たな機能
があることや未知の因子が存在することを示唆する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】EGFファミリーはこれ
までに７種のメンバーが明らかにされており、上皮成長
因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、トランスフォー
ミング成長因子α(Transforming Growth Factor-alfa,
TGF-alfa)、 アンフィレグリン(amphiregurin, AR)、ヘ
パリン結合EGF様成長因子(Heparin-binding EGF-like G
rowth Factor, HB-EGF)、ベータセルリン(betacelluli
n, BTC)、ニューレグリン(neuregulin, NRG)及びエピレ
グリン(epiregulin, ERG)である。これらすべてのメン
バーは共通して3つのジスルフィドループからなるEGF様
ドメインを持ち、かつ、I型の膜結合型（pro型）として
生合成される。EGF受容体ファミリーは、ErbB1, ErbB2,
ErbB3及びErbB4の4種からなる。4種ともにI型の膜タン
パク質であり、細胞内にチロシンキナーゼドメインを有
する（Nature, 309, 418, 1984; Science, 230, 1132,
1985; Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 4905, 1990; Pro.
Natl. Acad. Sci. 90, 1746, 1993）。ErbB1, 2及び4に
はチロシンキナーゼ活性が検出されているがErbB3には
その活性は検出されていない。また、ErbB2に対するリ
ガンドはまだ見つかっていない。とくにErbBのリガンド
とリセプターの相互関係は、発生初期に重要な役割を果
たし（Science,269, 230, 1995; Science, 269, 234, 1
990; Nature, 369, 337, 1995; Nature, 378, 390, 199
5; Nature, 378, 390, 1995）、また乳癌などのある種
の癌の悪性度と関係していることが明らかにされている
（Science, 230, 1132, 1985; Science, 229, 974, 198
5）。

【０００４】ErbB1, ErbB2及びErbB4のノックアウトマ
ウスの研究から、ErbB1は、皮膚、肺及び胃腸管の上皮
の発生に重要な役割を果たし、ErbB2とErbB4は心筋や中
枢神経系の発生にやはり重要な役割を有していることが
判明している（Science, 269,230, 1995; Science, 26
9, 234, 1990; Nature, 369, 337, 1995; Nature, 378,
390, 1995; Nature, 378, 390, 1995）。また、ErbB2が
過剰発現していると、乳癌、子宮癌、胃癌、子宮内膜腫
及び小胞性肺癌において予後が悪くなることも明らかに
されている（Science, 235, 177, 1987; Science, 244,
707, 1989; Cancer Res., 51, 1034, 1991）。しかし
ながら、今までに発見されているErbBリガンドのどれも
ErbB2キナーゼを直接活性化するものはなく、また、Erb
B4とNRGを欠損させたノックアウトマウスのフェノタイ
プはお互いに異なっていることも判明した。これらのこ
とからErbB2あるいはErbB4の新たなリガンドの存在が示
唆されている。本発明の目的は、上記のリガンド、その
製造方法及び用途、当該リガンドをコードするＤＮＡを
提供するものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明の要旨は、 (1)配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列をコードす
る塩基配列、あるいはこれを一部置換、欠失もしくは付
加した塩基配列、あるいはこれらにハイブリダイズする
塩基配列を含むＤＮＡ； (2)上記(1)記載のＤＮＡを含有する組換えベクター； (3)上記(2)記載の組換えベクターにより形質転換された
原核又は真核宿主細胞； (4)上記(3)記載の宿主細胞を培養し、産生されたタンパ
ク質を分離、精製することを特徴とする組換えタンパク
質の製造方法； (5)組換えタンパク質が受容体型チロシンキナーゼErbB
のリガンドとなるタンパク質である上記(4)記載の組換
えタンパク質の製造方法； (6)上記(3)記載の宿主細胞を培養して得られる培養物を
分離、精製して得られる組換え受容体型チロシンキナー
ゼErbBのリガンド； (7)配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなる蛋
白質又は当該アミノ酸配列を含む若しくは当該アミノ酸
配列の一部のアミノ酸配列を含む蛋白質； (8)配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列をコードす
る塩基配列と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌク
レオチド； (9)上記(8)記載のオリゴヌクレオチドを動物に投与する
ことからなる、動物における受容体型チロシンキナーゼ
ErbBのリガンドの生成を抑制する方法； (10)受容体型チロシンキナーゼErbBのリガンドを認識す
る抗体； (11)配列番号１に示すアミノ酸から選択される任意の少
なくとも６個連続するアミノ酸を含むポリペプチドを動
物に免疫して得られる上記(10)記載の抗体； (12)上記(10)〜(11)のいずれかに記載の抗体を用いて、
受容体型チロシンキナーゼErbBのリガンドの生成を抑制
する方法及びその検出を行う方法；である。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明者らは、新規のErbB2及びE
rbB4のリガンドを発見するために、発明者らが開発した
ジャクスタクリン成長因子アッセイ法(Juxtacrine Grow
th Factor Assay; J. Cell Biol., 128, 929, 1995参
照、以下、ＪＧＦＡ法という）を用いて新規リガンドを
発現している細胞を選択し、PCR (Polymarase Chain Re
action)法によりリガンドの遺伝子を増幅して同定する
ことに成功した。ＪＧＦＡ法により細胞表面に存在する
少量の膜結合成長因子(Membrane-anchored growth fact
or)を検出して、PCR法によりEGF, TGF-alfa, AR, SDGF,
HB-EGF,BTC, ERGやNRG (NDF/Heregulin/GGF/ARIA)に共
通なトランスメンブランドメイン(Transmembrane domai
n)を有する新規リガンドをスクリーニングした。そのた
めに、30株以上のヒト及びラット癌細胞（32DB2-52及び
32DB4-17株）を、ErbB2とErbB4を発現している細胞株と
共培養してDNA合成を誘導する細胞を選択した。その中
から、ラットPC12細胞を選択してラット NRG cDNA配列
のEGFドメインをサンドイッチにしてプライマーを設計
してRT-PCRを行った。PCR産物のうち4クローンはラット
NRG cDNAに相同性のあるもので、PCRで解析を行った結
果、その4クローンはアイソマー（α1, α2, β, γ）
であることが判明した。さらに、プローブとしてcDNAフ
ラグメントの混合物を用いて、PC12細胞から作製したZA
P cDNAライブラリーから、ハイブリダイズするクローン
を発見した。得られた遺伝子は全長3076bp（配列表の配
列番号２）からなり、860個のアミノ酸をコードする258
0bpのオープンリーディングフレームを含んでいる。

【０００７】2580bpのオープンリーディングフレームか
ら予測されるアミノ酸配列（配列表の配列番号１）に
は、EGFファミリーの全てのメンバーに共通して見られ
るEGFドメインとそのC末端側に見られるトランスメンブ
ランドメインが存在する。当該クローンのEGFドメイン
の数は1個であり、EGF以外の他のメンバーと共通してい
る。つまりこのものはEGFの新しいメンバーと考えられ
る。また、当該クローンはN末端にシグナルペプチドと
思われる疎水配列をもち、EGFドメインとシグナルペプ
チドの間にさらに6個のシステイン残基を有しており、3
つのジスルフィド結合を有するものと推定される。トラ
ンスメンブランドメインのC末端側には約400個のアミノ
酸からなる細胞内ドメインが存在する。当該クローンと
他のEGFファミリーのメンバーとの一次構造上の相同性
はEGFドメイン近傍を除いては全く認められない。EGFド
メインの相同性はNRGと最も高く49%に及ぶ。さらに、当
該クローンのトランスドメインを含む約30残基の配列は
NRGのその領域と酷似している。また、当該クローンはE
GFドメインの第3ループとそのC末端でスプライシングを
起こし、いくつかのアイソフォームを形成する。前述の
ように、これまでに少なくとも4種のアイソフォームの
存在が確認されている。以上の結果から、当該クローン
をNTAK(neuregulin-like Transmembrane Activator for
ErbB Kineses)と命名した。

【０００８】ErbBファミリーにはErbB1, 2, 3及び4の４
種のメンバーが存在する。NTAKがどのメンバーを標的と
するのかを明らかにするために、組換えNTAKタンパク質
(rNTAK)をＣＨＯ細胞(Chinese Hamstar Ovary Cell)を
用いて作製し、NTAKタンパク質の生物活性ならびに標的
受容体を解析した。マウスミエロイド細胞32DGRにErbB
1,2及び4遺伝子を導入し、それぞれの遺伝子を単独に発
現する細胞株を作製し、これらの細胞に対するNTAKタン
パク質の活性を検討した。その結果、NTAKはErbB4を発
現した細胞のみに対し増殖活性を示し、ErbB1及びErbB2
を発現した細胞には増殖活性を示さなかった。このこと
から、NTAKは少なくともErbB4を標的受容体とすること
が明らかとなった。さらにヒト乳癌細胞株MDA-MB453細
胞及びT47D細胞が有するErbBタンパク質の活性化を示す
チロシンリン酸化の誘導が確認された。そして、NTAKα
2は、ErbB2/3とErbB4 キナーゼを活性化することが結論
された。

【０００９】NTAK遺伝子から推定されるタンパク質は細
胞膜結合型であることから、TAK遺伝子を安定に発現す
るCHO細胞株NS-67細胞の細胞表面をビオチン標識し、抗
NTAKペプチド抗体を用いて免疫沈降を行った。その結
果、120-160kDa付近に２本のバンドを検出した。このこ
とから、NTAKタンパク質の構造から推定される通り細胞
膜タンパク質として存在することが確認された。NTAKタ
ンパク質の機能解析を目的として、ラット胎児（17.5日
胚）を用いた免疫組織染色を行った。その結果、心房肉
柱、骨髄及び後脳神経接合部に陽性の染色像が認めら
れ、これらの組織での発生及び分化に関与していること
が示唆される。これまでに報告されたErbB4欠損マウス
の解析から、ErbB4が心房肉柱と後脳神経接合部の形成
に必須であることが示されていることから、NTAKが両部
位においてErbB4のリガンドとして機能していることが
推定される。

【００１０】一方、NTAKは標的受容体をNRGと共有して
いること、かつ、その発現が脳で観察されていることか
らNRGの重要な生理機能の一つである神経と筋接合部の
アセチルコリンリセプター（AChR）の発現調節にも関与
しているものと考えられる。近年、ニコチン性AChRは、
α1からα9とβ1からβ4の13種類のサブユニットが明ら
かにされている。中枢神経のニコチン性AChRはα2から9
とβ2から4のサブユニットの組み合わせと分布の違いで
異なる脳内生理機能を司っているものと考えられてい
る。ニコチン性AChRはニコチンによる自発運動量の亢
進、記憶、学習、ストレス応答に関与していること、さ
らにアルツハイマー病の患者の脳でニコチン性AChR量が
著しく減少していることが認められていることから、NT
AKタンパク質は脳内生理調節における役割は重要であ
る。

【００１１】これらの知見から、NTAKの投与あるいは発
現誘導、また、発現抑制は上記神経系疾患に有効な治療
薬として期待される。さらに、NTAKは、タンパク質とし
てその特異抗体によって検出したり、あるいはmRNAのレ
ベルで検出することにより、上記神経疾患の診断等に応
用することも可能である。また、前述のように、NTAKに
よってヒト乳癌細胞株MDA-MB453細胞及びT47D細胞が有
するErbBタンパク質の活性化を示すチロシンリン酸化の
誘導が確認されたことから、乳癌、子宮癌、胃癌、子宮
内膜腫及び小胞性肺癌における癌の悪性度あるいは予後
とも関係している可能性は高く、NTAKに対する抗体ある
いはNTAK-mRNAに特異的にハイブリダイズするオリゴヌ
クレオチド、また、発現抑制薬はこれらの癌に対する治
療薬としても有効に働くことが期待される。さらに、NT
AKはタンパク質としてその特異抗体によって検出した
り、あるいはmRNAのレベルで検出することにより、上記
癌疾患の診断等に応用することも可能である。

【００１２】

【発明の効果】本発明は、受容体型チロシンキナーゼEr
bBの新規リガンドNTAKをコードする遺伝子、該遺伝子を
含有する組換えベクター、該ベクターによる形質転換、
該遺伝子を用いた受容体型チロシンキナーゼErbBの新規
リガンドNTAKの製造方法、及び該製造方法によって製造
される組換え受容体型チロシンキナーゼErbBの新規リガ
ンドNTAK、上記受容体型チロシンキナーゼErbBの新規リ
ガンドNTAKをコードする遺伝子と特異的にハイブリダイ
ズしうるオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを
用いて受容体型チロシンキナーゼErbBの新規リガンドNT
AKの生成を抑制する方法、受容体型チロシンキナーゼEr
bBの新規リガンドNTAKを認識する抗体、ならびに該抗体
を用いて受容体型チロシンキナーゼErbBの新規リガンド
NTAKの生成を抑制する方法及びその検出を行う方法に関
する。これらの発明は、神経疾患、癌疾患あるいは他の
疾患において有用な治療薬あるいは診断薬を提供するも
のである。

【００１３】

【実施例】以下、実験例及び実施例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定され
るものではない。 試験例１ＪＧＦＡ法 ＪＧＦＡ法(Juxtacrine Growth Factor Assay)は、発明
者である東山らの方法に従った（J. Cell, Biol. 128,
929, 1995）。32DB2-52及び32DB4-17細胞株は、マウス
ミエロイド細胞株32DGRにヒトErbB2及びErbB4由来cDNA
をトランスフェクションして樹立した。種々の癌細胞の
32DB2-52及び32DB4-17細胞株に対するJuxtacrine活性の
測定を行った。すなわち、細胞(1x10⁵細胞/500μl/ウエ
ル)は２４ウエルプレートに接種して24時間培養した。
細胞は5%バッファードホルマリンで固定してPBSで3度洗
浄した。32DB2-52あるいは32DB4-17細胞（1x10⁵細胞/50
0μl/ウエル）を共培養した。48時間後、［³H] チミジ
ン (1 μCi/ウエル; 1 mCi=37MBq) をウエルに加えさら
に共培養を4時間行った。細胞はハーベストしてDNAへの
［³H] チミジンの取り込みを測定した。図１は、各細胞
株での［³H] チミジンの取り込みをみたものである。な
お、図中、黒バーは32DB2-52細胞株に対する結果、白バ
ーは32DB4-17細胞株に対する結果である。また、横軸の
細胞株の詳細は下記のとおりであり、これらの細胞はAT
CCから購入した。 細胞株１: ヒト HSC 2; ２: ヒト HSC 4; ３: ヒト SK-
BR-3; ４: ヒト MDA-MB-361; ５: ヒト U-138MG; ６:
ヒト SK-N-SH; ７: ラット L2; ８: ヒト Hep G2;９:
ヒト Hep 3B; １０: ラット PC12.

【００１４】試験例２ＤＮＡ断片の増幅、クローニング及び塩基配列決定 cDNAはMMLV逆転写酵素(reverse transcriptase, Gibco)
を用いてランダムヘキサマー プライミング(randomhexm
er priming)によってPC12細胞のpoly (A)⁺RNAから合成
した。DNA フラグメントの調製のためにオリゴヌクレオ
チド プライマーは次のものを調製した。 5'-プライマー, AAGGAGAAAACTTTCTGTGTGAATGG (KQKTFCV
NG, センス) 3'-プライマー, GCAGTAGGCCACCACACACATGATGCC (GIMCVV
AYC, アンチセンス) これらのプライマーは、ラット NRG cDNA配列に基づい
たEGFドメインをサンドイッチするものである。PCRは94
℃で1分間、55℃で2分間、72℃で1分間にて35サイクル
行った。PCR産物はpT7Blue (Novagen)につないで配列決
定に供した。NTAKのアイソフォームを分析するために、
NTAKに完全にマッチするPCR プライマーを以下のように
設計した。 5'-プライマー, ACAGCCAAGTCCTACTGTGTGAATGG (TAKSYCV
NG, センス) 3'-プライマー, ACAGTAGGCGACCACACAGACGATGCC (GIVCVV
AYC, アンチセンス) PCRは94℃で1分間、55℃で3分間、72℃で30秒間にて30
サイクル行った。

【００１５】Uni-ZAP XR cDNA ライブラリーは、ZAP cD
NA ライブラリー キット (Stratagene)を用いてPC12細
胞のpoly (A)⁺RNAから調製した。Uni-ZAP XRのPC12細胞
cDNAライブラリーから約5.8x10⁵プラークのフィルター
レプリカ(filter replica)を、PCRでクローン化した[³²
P] cDNA フラグメントでスクリーニングした。ハイブリ
ダイゼーションは42℃で20%ホルムアミド緩衝液で行っ
た(W.I. Wood et al.,Nature, 312, 330, 1984)。フィ
ルターは46℃で0.1% SDSを含むSSC(0.15 M NaCl, 0.015
M sodium citrate, pH 7.0)で洗浄した。３個のハイブ
リダイズするクローンを精製した。pBluescript phagem
idは、Uni-ZAP XR ベクターから切り取り、サンガー ジ
デオキ法(F. Sanger et al., J.Mol.Biol., 143, 161,
1980)によって塩基配列を決定した。得られた塩基配列
を配列番号２に示す。また、当該塩基配列のオープンリ
ーディングフレーム(2580bp)から予測されるアミノ酸配
列を配列番号１に示す。配列番号１のアミノ酸配列にお
いて、下線部(a)はセリン リッチ ドメインで、他のEGF
ファミリーにはない特異的な配列である。また、下線部
(b)はN末端アミノ酸配列、下線部(c)はEGF様ドメイン、
下線部(d)は膜貫通ドメインであり、またアミノ酸配列1
63-165、294-296及び467-469はN型糖鎖結合可能部位で
ある。図２は、NTAK cDNA フラグメントの検出を示した
ものである。右のレーンは、ファイエックス174 DNAをH
aeIII制限酵素で分解したもので、分子量のマーカーを
示すものである。NTAK cDNA フラグメントは271bpと234
bpの間に位置する。

【００１６】試験例３NTAKの発現及び生理活性 NTAKα2 cDNAをpRc/CMV プラスミド (Stratagene)にサ
ブクローンしてCHO-K1細胞にトランスフェクトしNS-67
細胞株を樹立した。rNTAKα2はNS-67細胞のコンディシ
ョン培地(condition medium)から精製した。コンディシ
ョン培地に0.25 MNaClを加え、0.4 M NaCl, 0.01 M tri
s-HCl, pH 7.2で平衡化したヘパリン-トヨパール(Hepar
in-Toyopearl, Toso, Japan)アフィニティ カラム(5x10
cm)に供した。rNTAKα2は1 M NaCl, 0.01 M tris-HCl,
pH 7.2、流速300 ml/hourの条件で溶出した。溶出物は
pH8.0に調整して、塩化銅で飽和して0.5 M NaCl, 0.01
Mtris-HCl, pH8.0で平衡化した銅-キレート セファロー
ス(copper-chelating Sepharose)カラム(2x10cm, Pharm
acia LKB Biotechnology)に供した。同じ緩衝液で洗浄
後、rNTAKα2を0.06 Mイミダゾール, 0.5 M NaCl, 0.01
M tris-HCl, pH8.0, 流速40 ml/hourで溶出した。rNTA
Kα2をC4 カラム(4.6x250mm, Nacarai tesk,Japan)のRP
-HPLCに供して5-50%グラジエントのアセトニトリルで溶
出した。

【００１７】rNTAKα2画分をプールして、同量のH2Oで
希釈し、再度C4 カラムに供した。結合タンパクは20-35
% グラジエントのアセトニトリルで溶出した。それぞれ
のクロマト画分は、MDA-MB-453細胞のErbB3のチロシン
リン酸化の増加で定量した。MDA-MB-453細胞は、6-ウエ
ル プレートにDMEM/10% FCSで接種して少なくても24時
間で付着させた。アッセイの前に、細胞を血清なしで24
時間処置した。0.5% BSAを含む500 μlのDMEMにカラム
画分(2-10 μl)を12分間37℃でインキュベートした。上
清を吸引してice-cold lysis bufferで反応を停止させ
た[500 μl, トリトン X-100(1.0%), 500 μM Na₃O₄V,
1 mM Na-ピロホスフェート, 1 mM Na-フルオロホスフェ
ート, 1 mM EDTA, 100 μM p-APMSF, 10μM 3,4-DCI 及
び 10 μg/ml アプロチニンを含有するPBS]。

【００１８】サンプルは5分間10,000rpmで遠心した。抗
-ErbB3 抗体 841(Santa Cruz Biotechnology)を1 μg上
清に添加して、4℃で4時間インキュベートして、10 μl
の50% プロテイン-A ビーズ サスペンション(Protein-A
beads suspension, Pierce)を加えた。4℃で4時間イン
キュベートした後、ビーズをlysis bufferで3度洗浄
し、1 mM β-メルカプトエタノールを含む20 μlのSDS-
PAGE sample bufferで3分間煮沸した。サンプルはSDS-
ゲル(6% ポリアクリルアミド)に供した。電気泳動後、
タンパクはニトロセルロース膜にエレクトロブロット(e
lectroblot)し、Tween 20 (0.05%)を含むPBS中でスキム
ミルク (5%)でブロックした。ブロットは抗-ホスホチ
ロシン抗体(PY-20, Transduction Laboratories) (1:20
00 dilution)で反応させ、西洋わさびパーオキシダーゼ
固定ヤギ抗マウスIgG抗体(HRP-conjugated goat anti-m
ouse IgG antibody, Vector Laboratories) (1:2500 di
lution)とECL ディテクション キット (Amersham)で検
出した。

【００１９】精製したrNTAKα2タンパク(8 μg)は、SDS
-ポリアクリルアミド ゲル (10%)/トリス-トリシン緩衝
液(tris-tricine buffer)で電気泳動に供した。rNTAKα
2はPVDF膜にエレクトロブロットして、クマシー ブリリ
アント ブルー(Coomassie Brilliant Blue)で染色し
た。染色した46 kDaバンドは切り出して蒸留水で洗浄し
た。この精製タンパクをHewlett Packard protein sequ
encer HP G1005Aに供した。その結果、以下のようなN末
端アミノ酸配列が決定された。 X-Y-S-P-S-L-K-S-V-Q-D-Q-A-Y-K-A-P-V-V-V-E-G-K-V-Q-
G-L-A-P-A-G-G-S-S-S-X（即ち、X-Tyr-Ser-Pro-Ser-Leu
-Lys-Ser-Val-Gln-Asp-Gln-Ala-Tyr-Lys-Ala-Pro-Val-V
al-Val-Glu-Gly-Lys-Val-Gln-Gly-Leu-Ala-Pro-Ala-Gly
-Gly-Ser-Ser-Ser-X） この配列は、予想されるアミノ酸配列（配列番号２）の
128から163のアミノ酸配列を示す。

【００２０】図３は、NTAK翻訳産物の概要である。上図
は親水性−親油性プロフィールを示し、422から444の位
置が親油性ドメインであることを示す。下図は、NTAKと
ラット NRGのドメイン構造の比較を示す。NTAKでは、ア
ミノ酸19-55がセリン リッチ ドメイン, 128-327が第１
-6-システイン ドメイン(1st six-cysteine domain), 3
61-397が第２-6-システイン ドメイン(2nd six-cystein
e domain) (EGF様 ドメイン), 422-444が親油性ドメイ
ン, 445-860がサイトプラスミック(cytoplasmic)ドメイ
ンである。NRGでは、57-112がIg ドメイン, 182-221が6
-システイン EGF様 ドメイン(six cysteine EGF-like d
omain), 243-265が親油性ドメイン, 266-422がサイトプ
ラスミック ドメインである。

【００２１】図４はNTAKとラット EGF ファミリー物質
のアイソフォーム分析を示す。図５Ａは、精製した組換
えNTAK（rNTAK）α2のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気
泳動の結果を示したものである。タンパクは銀染色をし
て検出している。レーン Cはサンプルはなく、レーン T
は約100 ngの精製rNTAKα2を供している。図５Ｂは、MD
A-MB-453細胞刺激後のERrbB2とErbB3の免疫沈降を示
す。細胞 (2x10⁶) を0.5% BSA含有1 ml DMEMに懸濁し、
rNTAKα2 (20 ng, レーン T)の存在下、非存在下 (レー
ン C)あるいはヒト NRGβ1(5 ng, レーン N)の存在下で
37℃で12分間インキュベートした。免疫沈降法は前述の
通りである。ErbB2とB3は、1μgの抗-ErbB2 抗体 Ab-1
(CALBIOCHEM)と1 μgの抗-ErbB3 抗体 841 (Santa Cruz
Biotechnology)で免疫沈降させた。ブロットは、抗-ホ
スホチロシン抗体 PY-20 (Transduction Laboratories)
で行った。

【００２２】図６は、MDA-MB-453細胞の分化誘導を示
す。細胞 (5x10⁵/ウエル, 6-ウエルプレート)を2% FCS
含有DMEMで24時間培養した。rNTAKα2 (20 ng/ml)ある
いはNRG (20 ng/ml)を培地に加えて、さらに3日間イン
キュベートした。rNTAKα2 あるいはNRGで処理した細胞
は核が大きく細胞質が増加しているフラットな形態(fla
tmorphology)を示した。一方、無処理細胞は、丸く中程
度の付着性をもった様相を呈した。

【００２３】図７は、EP170.7 (ErbB1)と32DB4-17 (Erb
B4)細胞アッセイを示す。ErbB1を発現しているEP170.7
細胞とErbB4を発現している32DB4-17細胞のDNAへの
［³H] チミジン の取り込みを測定して成長因子活性(Gr
owth factor activity)を測定した。rNTAKα2 (▲), NR
G (■), HB-EGF (●)を加えて、36時間後に［³H] チミ
ジンを添加した。4時間後に細胞はハーベストして［³H]
チミジンのDNAへの取り込みをベータプレート システ
ム(Betaplate system, Pharmacia LKB)で測定した。rNT
AKα2とNRGは、ErbB4を発現している32DB4-17細胞のDNA
合成を刺激するが、ErbB1を発現しているEP170.7細胞に
はそのような効果は見られなかった。

【００２４】図８は、¹²⁵I-ヒト NRGβ1のMDA-MB-453細
胞への結合の競合阻害を示す。ヒトNRGβ1は、¹²⁵I-Bol
ton-Hunter reagent (ICN)でラベルし、Gel P-2 (Bio-R
ad)ゲル濾過クロマトグラフィーで精製した(比放射能,
5x10⁴ dpm/μg)。0.5% BSA含有1 mlのDMEMに細胞を懸濁
(1x10⁵ cells)して、各種量のラベルしていないrNTAK
α2（あるいはヒト NRG)と一定量の¹²⁵I-ヒト NRGβ1を
4℃で2時間インキュベートした。結合しなかったリガン
ドを除き、細胞はice-cold DMEM/0.5% BSA/2M NaClで3
度洗浄した。そして結合した放射能(radioactivity)を
測定した。rNTAKα2 は、MDA-MB-453細胞に対する¹²⁵I-
ヒト NRGの結合を90%以上阻害することが判明した。

【００２５】図９は、prorNTAKα2のJuxtacrine activi
tyを示す。NS-67細胞 (1x10⁵ cells/ウエル)を24-ウエ
ル プレートに接種して、24時間培養した。Juxtacrine
activityは図１の方法に従って測定した。EP170.7細胞
と32DB2-52細胞は、NS-67細胞では生存せず、32DB4-17
細胞が生存した。この結果から、proNTAKα2はErbB4に
対して反応するが、ErbB1とB2には反応しないことが判
明した。しかし、NTAKα2はErbB2/3とErbB4 キナーゼを
活性化することが結論された。

【００２６】図１０は、NTAKのノザン ハイブリダイゼ
ーション アナリシス(Northern hybridization analysi
s)を示す。PC12細胞とラット組織 (脳, 心臓, 副腎, 精
巣,胸腺)からpoly (A)⁺RNAを調製し、これらのRNAをハ
イボンド(Hybond) N⁺ (Amersham)に固定化した。なお、
PC12, 2.5 μg; 脳, 45 μg; 心臓, 7.5 μg; 副腎,4.0
μg; 精巣, 2.0 μg; 胸腺, 6.0 μgを使用した。ハイ
ブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドを用いて、
4xSSC, 50% ホルムアミド, 1% SDS, 0.5% アイリッシュ
クリーム(Irish cream), 0.25 μg/mlの熱変性サケ精
子(heat-denatured sermon sperm) DNAの条件下、42℃
で行った。

【００２７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：８６０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Arg Gln Val Cys Cys Ser Ala Leu Pro Pro Pro Leu Glu Lys 5 10 15 Ala Arg Cys Ser Ser Tyr Ser Tyr Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser (a) 20 25 30Ser Ser Asn Asn Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Arg Ser Ser Ser 35 40 45Arg Ser Ser Ser Arg Ser Ser Arg Gly Ser Thr Thr Thr Thr Ser 50 55 60 Ser Ser Glu Asn Ser Gly Ser Asn Ser Gly Ser Ile Phe Arg Pro 65 70 75 Ala Ala Pro Pro Glu Pro Arg Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Arg 80 85 90 Ser Pro Ala Ala Arg Arg Ala Ala Ala Arg Ser Arg Ala Ala Ala 95 100 105 Ala Gly Gly Met Arg Arg Asp Pro Ala Pro Gly Ser Ser Met Leu 110 115 120 Leu Phe Gly Val Ser Leu Ala Cys Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser 125 (b) 130 135Val Gln Asp Gln Ala Tyr Lys Ala Pro Val Val Val Glu Gly Lys 140 145 150Val Gln Gly Leu Ala Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Asn Ser Thr 155 160 165 Arg Glu Pro Pro Ala Ser Gly Arg Val Ala Leu Val Lys Val Leu 170 175 180 Asp Lys Trp Pro Leu Arg Ser Gly Gly Leu Gln Arg Glu Gln Val 185 190 195 Ile Ser Val Gly Ser Cys Ala Pro Leu Glu Arg Asn Gln Arg Tyr 200 205 210 Ile Phe Phe Leu Glu Pro Thr Glu Gln Pro Leu Val Phe Lys Thr 215 220 225 Ala Phe Ala Pro Val Asp Pro Asn Gly Lys Asn Ile Lys Lys Glu 230 235 240 Val Gly Lys Ile Leu Cys Thr Asp Cys Ala Thr Arg Pro Lys Leu 245 250 255 Lys Lys Met Lys Ser Gln Thr Gly Glu Val Gly Glu Lys Gln Ser 260 265 270 Leu Lys Cys Glu Ala Ala Ala Gly Asn Pro Gln Pro Ser Tyr Arg 275 280 285 Trp Phe Lys Asp Gly Lys Glu Leu Asn Arg Ser Arg Asp Ile Arg 290 295 300 Ile Lys Tyr Gly Asn Gly Arg Lys Asn Ser Arg Leu Gln Phe Asn 305 310 315 Lys Val Lys Val Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Val Cys Glu Ala Glu 320 325 330 Asn Ile Leu Gly Lys Asp Thr Val Arg Gly Arg Leu His Val Asn 335 340 345 Ser Val Ser Thr Thr Leu Ser Ser Trp Ser Gly His Ala Arg Lys 350 355 360Cys Asn Glu Thr Ala Lys Ser Tyr Cys Val Asn Gly Gly Val Cys (c) 365 370 375Tyr Tyr Ile Glu Gly Ile Asn Gln Leu Ser Cys Lys Cys Pro Asn 380 385 390Gly Phe Phe Gly Gln Arg Cys Leu Glu Lys Leu Pro Leu Arg Leu 395 400 405 Tyr Met Pro Asp Pro Lys Gln Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln Lys 410 415 420 Arg Val Leu Thr Ile Thr Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Val Val (d) 425 430 435Gly Ile Val Cys Val Val Ala Tyr Cys Lys Thr Lys Lys Gln Arg 440 445 450 Arg Gln Met His His His Leu Arg Gln Asn Met Cys Pro Ala His 455 460 465 Gln Asn Arg Ser Leu Ala Asn Gly Pro Ser His Pro Arg Leu Asp 470 475 480 Pro Glu Glu Ile Gln Met Ala Asp Tyr Ile Ser Lys Asn Val Pro 485 490 495 Ala Thr Asp His Val Ile Arg Arg Glu Ala Glu Thr Thr Phe Ser 500 505 510 Gly Ser His Ser Cys Ser Pro Ser His His Cys Ser Thr Ala Thr 515 520 525 Pro Thr Ser Ser His Arg His Glu Ser His Thr Trp Ser Leu Glu 530 535 540 Arg Ser Glu Ser Leu Thr Ser Asp Ser Gln Ser Gly Ile Met Leu 545 550 555 Ser Ser Val Gly Thr Ser Lys Cys Asn Ser Pro Ala Cys Val Glu 560 565 570 Ala Arg Ala Arg Arg Ala Ala Ala Tyr Ser Gln Glu Glu Arg Arg 575 580 585 Arg Ala Ala Met Pro Pro Tyr His Asp Ser Ile Asp Ser Leu Arg 590 595 600 Asp Ser Pro His Ser Glu Arg Tyr Val Ser Ala Leu Thr Thr Pro 605 610 615 Ala Arg Leu Ser Pro Val Asp Phe His Tyr Ser Leu Ala Thr Gln 620 625 630 Val Pro Thr Phe Glu Ile Thr Ser Pro Asn Ser Ala His Ala Val 635 640 645 Ser Leu Pro Pro Ala Ala Pro Ile Ser Tyr Arg Leu Ala Glu Gln 650 655 660 Gln Pro Leu Leu Arg His Pro Ala Pro Pro Gly Pro Gly Pro Gly 665 670 675 Pro Gly Ala Asp Met Gln Arg Ser Tyr Asp Ser Tyr Tyr Tyr Pro 680 685 690 Ala Ala Gly Pro Gly Pro Arg Arg Gly Ala Cys Ala Leu Gly Gly 695 700 705 Ser Leu Gly Ser Leu Pro Ala Ser Pro Phe Arg Ile Pro Glu Asp 710 715 720 Asp Glu Tyr Glu Thr Thr Gln Glu Cys Ala Pro Pro Pro Pro Pro 725 730 735 Arg Pro Arg Thr Arg Gly Ala Ser Arg Arg Thr Ser Ala Gly Pro 740 745 750 Arg Arg Trp Arg Arg Ser Arg Leu Asn Gly Leu Ala Ala Gln Arg 755 760 765 Ala Arg Ala Ala Arg Asp Ser Leu Ser Leu Ser Ser Gly Ser Gly 770 775 780 Cys Gly Ser Ala Ser Ala Ser Asp Asp Asp Ala Asp Asp Ala Asp 785 790 795 Gly Ala Leu Ala Ala Glu Ser Thr Pro Phe Leu Gly Leu Arg Ala 800 805 810 Ala His Asp Ala Leu Arg Ser Asp Ser Pro Pro Leu Cys Pro Ala 815 820 825 Ala Asp Ser Arg Thr Tyr Tyr Ser Leu Asp Ser His Ser Thr Arg 830 835 840 Ala Ser Ser Arg His Ser Arg Gly Pro Pro Thr Arg Ala Lys Gln 845 850 855 Asp Ser Gly Pro Leu 860

【００２８】配列番号：２ 配列の長さ：３０７６ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源：ラットＰＣ１２細胞 配列 AATTCGGCAC GAGTCCTGGC GCACAGGGAG GGAGCGCTGC GCTGCGCCGG GGCTGCGCAT 60 CGCGGCCCAC TTGCCGCTTG TCCCCTGCCC TGGCTGGGCC ACCTCCCCGG GCTGCCGGTG 120 GAGGGCTTCG AGGCGCTAAC GTTACGCTGT TTCCGGTTTT CCAGAGGGCT CTGTTTCCCC 180 TCCCAAGGCG GCGGCGGCTG AGCGGCGGAG CCCCCCAAAT GGCCTGGCCA G 231 ATG CGG CAG GTT TGC TGC TCA GCG CTG CCG CCG CCA CTG GAG AAG 276 Met Arg Gln Val Cys Cys Ser Ala Leu Pro Pro Pro Leu Glu Lys 5 10 15 GCT CGG TGC AGC AGC TAC AGC TAC AGC GAC AGC AGC AGC AGC AGC 321 Ala Arg Cys Ser Ser Tyr Ser Tyr Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser 20 25 30 AGC AGC AAC AAC AGC AGC AGC AGC ACC AGC AGC AGA AGC AGC AGC 366 Ser Ser Asn Asn Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Arg Ser Ser Ser 35 40 45 AGA AGC AGC AGC AGA AGC AGC AGA GGC AGC ACC ACC ACC ACC AGC 411 Arg Ser Ser Ser Arg Ser Ser Arg Gly Ser Thr Thr Thr Thr Ser 50 55 60 AGC AGC GAG AAC AGC GGC AGC AAC AGC GGC AGC ATC TTC CGT CCC 456 Ser Ser Glu Asn Ser Gly Ser Asn Ser Gly Ser Ile Phe Arg Pro 65 70 75 GCT GCG CCC CCA GAG CCG CGG CCG CAG CCA CAG CCG CAG CCC CGC 501 Ala Ala Pro Pro Glu Pro Arg Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Arg 80 85 90 AGC CCC GCA GCC CGG AGA GCC GCC GCC CGC TCG CGA GCC GCA GCC 546 Ser Pro Ala Ala Arg Arg Ala Ala Ala Arg Ser Arg Ala Ala Ala 95 100 105 GCC GGC GGC ATG AGG CGC GAC CCG GCC CCC GGC TCC TCG ATG CTG 591 Ala Gly Gly Met Arg Arg Asp Pro Ala Pro Gly Ser Ser Met Leu 110 115 120 CTC TTC GGT GTG TCA CTC GCC TGC TAC TCG CCC AGC CTC AAG TCC 636 Leu Phe Gly Val Ser Leu Ala Cys Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser 125 130 135 GTG CAG GAC CAG GCG TAC AAG GCA CCC GTG GTG GTG GAG GGC AAG 681 Val Gln Asp Gln Ala Tyr Lys Ala Pro Val Val Val Glu Gly Lys 140 145 150 GTA CAG GGA CTG GCC CCG GCA GGC GGT TCC AGC TCT AAC AGC ACC 726 Val Gln Gly Leu Ala Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Asn Ser Thr 155 160 165 CGA GAG CCT CCC GCC TCG GGT CGG GTG GCG CTG GTG AAG GTG CTG 771 Arg Glu Pro Pro Ala Ser Gly Arg Val Ala Leu Val Lys Val Leu 170 175 180 GAC AAG TGG CCG CTC CGG AGC GGG GGG CTG CAG CGC GAG CAG GTG 816 Asp Lys Trp Pro Leu Arg Ser Gly Gly Leu Gln Arg Glu Gln Val 185 190 195 ATC AGC GTG GGC TCC TGC GCG CCG CTC GAA AGG AAC CAG CGC TAC 861 Ile Ser Val Gly Ser Cys Ala Pro Leu Glu Arg Asn Gln Arg Tyr 200 205 210 ATC TTT TTC CTG GAG CCC ACC GAG CAG CCC TTA GTT TTT AAG ACA 906 Ile Phe Phe Leu Glu Pro Thr Glu Gln Pro Leu Val Phe Lys Thr 215 220 225 GCC TTT GCC CCG GTC GAC CCT AAC GGC AAA AAC ATC AAG AAA GAG 951 Ala Phe Ala Pro Val Asp Pro Asn Gly Lys Asn Ile Lys Lys Glu 230 235 240 GTG GGC AAG ATC CTG TGC ACT GAC TGC GCA ACC CGG CCC AAG CTG 996 Val Gly Lys Ile Leu Cys Thr Asp Cys Ala Thr Arg Pro Lys Leu 245 250 255 AAG AAG ATG AAG AGT CAG ACA GGA GAG GTG GGC GAG AAG CAG TCG 1041 Lys Lys Met Lys Ser Gln Thr Gly Glu Val Gly Glu Lys Gln Ser 260 265 270 CTC AAG TGT GAG GCG GCG GCG GGG AAC CCC CAG CCC TCC TAT CGA 1086 Leu Lys Cys Glu Ala Ala Ala Gly Asn Pro Gln Pro Ser Tyr Arg 275 280 285 TGG TTC AAG GAC GGC AAG GAG CTC AAC CGG AGT CGT GAC ATT CGC 1131 Trp Phe Lys Asp Gly Lys Glu Leu Asn Arg Ser Arg Asp Ile Arg 290 295 300 ATC AAG TAT GGC AAC GGC AGA AAG AAC TCA CGG CTA CAG TTC AAC 1176 Ile Lys Tyr Gly Asn Gly Arg Lys Asn Ser Arg Leu Gln Phe Asn 305 310 315 AAA GTG AAG GTG GAG GAC GCT GGA GAG TAC GTC TGT GAG GCT GAG 1221 Lys Val Lys Val Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Val Cys Glu Ala Glu 320 325 330 AAC ATC CTT GGG AAG GAC ACT GTG AGG GGC CGG CTC CAT GTC AAC 1266 Asn Ile Leu Gly Lys Asp Thr Val Arg Gly Arg Leu His Val Asn 335 340 345 AGT GTG AGC ACC ACT CTG TCG TCC TGG TCG GGG CAC GCC CGG AAG 1311 Ser Val Ser Thr Thr Leu Ser Ser Trp Ser Gly His Ala Arg Lys 350 355 360 TGC AAT GAG ACA GCC AAG TCC TAC TGT GTG AAT GGA GGC GTG TGC 1356 Cys Asn Glu Thr Ala Lys Ser Tyr Cys Val Asn Gly Gly Val Cys 365 370 375 TAC TAC ATC GAA GGC ATC AAC CAA CTC TCC TGC AAA TGT CCA AAC 1401 Tyr Tyr Ile Glu Gly Ile Asn Gln Leu Ser Cys Lys Cys Pro Asn 380 385 390 GGA TTC TTC GGA CAG AGA TGT TTG GAG AAA CTG CCT TTG CGA TTG 1446 Gly Phe Phe Gly Gln Arg Cys Leu Glu Lys Leu Pro Leu Arg Leu 395 400 405 TAC ATG CCA GAT CCT AAG CAA AAG GCT GAG GAG CTG TAC CAG AAG 1491 Tyr Met Pro Asp Pro Lys Gln Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln Lys 410 415 420 AGA GTC CTG ACA ATT ACC GGC ATC TGT GTG GCT CTG CTG GTC GTG 1536 Arg Val Leu Thr Ile Thr Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Val Val 425 430 435 GGC ATC GTC TGT GTG GTC GCC TAC TGC AAG ACT AAA AAA CAG AGG 1581 Gly Ile Val Cys Val Val Ala Tyr Cys Lys Thr Lys Lys Gln Arg 440 445 450 AGG CAA ATG CAT CAC CAT CTC CGG CAG AAC ATG TGT CCG GCC CAC 1626 Arg Gln Met His His His Leu Arg Gln Asn Met Cys Pro Ala His 455 460 465 CAG AAC CGA AGC CTG GCC AAT GGG CCC AGC CAC CCT CGG CTG GAC 1671 Gln Asn Arg Ser Leu Ala Asn Gly Pro Ser His Pro Arg Leu Asp 470 475 480 CCT GAG GAG ATC CAG ATG GCA GAT TAC ATT TCC AAA AAT GTG CCA 1716 Pro Glu Glu Ile Gln Met Ala Asp Tyr Ile Ser Lys Asn Val Pro 485 490 495 GCT ACA GAC CAT GTG ATC CGG AGG GAA GCT GAG ACC ACA TTT TCT 1761 Ala Thr Asp His Val Ile Arg Arg Glu Ala Glu Thr Thr Phe Ser 500 505 510 GGG AGC CAC TCC TGT TCA CCC TCT CAC CAC TGT TCC ACA GCC ACA 1806 Gly Ser His Ser Cys Ser Pro Ser His His Cys Ser Thr Ala Thr 515 520 525 CCC ACC TCC AGC CAC AGA CAT GAG AGC CAC ACG TGG AGC TTG GAA 1851 Pro Thr Ser Ser His Arg His Glu Ser His Thr Trp Ser Leu Glu 530 535 540 CGT TCG GAG AGC CTG ACC TCG GAT TCC CAG TCA GGC ATC ATG CTA 1896 Arg Ser Glu Ser Leu Thr Ser Asp Ser Gln Ser Gly Ile Met Leu 545 550 555 TCA TCA GTG GGC ACC AGC AAG TGC AAC AGC CCA GCA TGT GTG GAG 1941 Ser Ser Val Gly Thr Ser Lys Cys Asn Ser Pro Ala Cys Val Glu 560 565 570 GCA CGG GCA CGG AGG GCA GCA GCC TAC AGC CAG GAG GAG CGA CGC 1986 Ala Arg Ala Arg Arg Ala Ala Ala Tyr Ser Gln Glu Glu Arg Arg 575 580 585 AGG GCT GCC ATG CCA CCC TAC CAC GAC TCC ATA GAC TCG CTG CGT 2031 Arg Ala Ala Met Pro Pro Tyr His Asp Ser Ile Asp Ser Leu Arg 590 595 600 GAC TCC CCA CAC AGT GAG AGG TAC GTG TCA GCC CTG ACC ACG CCC 2076 Asp Ser Pro His Ser Glu Arg Tyr Val Ser Ala Leu Thr Thr Pro 605 610 615 GCG CGC CTT TCG CCC GTG GAC TTC CAC TAC TCG CTG GCC ACC CAG 2121 Ala Arg Leu Ser Pro Val Asp Phe His Tyr Ser Leu Ala Thr Gln 620 625 630 GTG CCG ACT TTC GAG ATC ACG TCG CCC AAC TCT GCC CAC GCC GTG 2166 Val Pro Thr Phe Glu Ile Thr Ser Pro Asn Ser Ala His Ala Val 635 640 645 TCG CTG CCA CCC GCA GCG CCC ATC AGC TAC CGC CTA GCG GAG CAG 2211 Ser Leu Pro Pro Ala Ala Pro Ile Ser Tyr Arg Leu Ala Glu Gln 650 655 660 CAG CCG CTC CTG CGG CAC CCA GCG CCG CCC GGC CCG GGG CCA GGG 2256 Gln Pro Leu Leu Arg His Pro Ala Pro Pro Gly Pro Gly Pro Gly 665 670 675 CCC GGA GCG GAC ATG CAG CGC AGC TAC GAC AGC TAC TAC TAC CCG 2301 Pro Gly Ala Asp Met Gln Arg Ser Tyr Asp Ser Tyr Tyr Tyr Pro 680 685 690 GCG GCG GGG CCC GGG CCG CGG CGC GGC GCC TGC GCG CTG GGA GGC 2346 Ala Ala Gly Pro Gly Pro Arg Arg Gly Ala Cys Ala Leu Gly Gly 695 700 705 AGT TTG GGC AGC CTG CCC GCC AGC CCC TTC CGC ATC CCG GAG GAC 2391 Ser Leu Gly Ser Leu Pro Ala Ser Pro Phe Arg Ile Pro Glu Asp 710 715 720 GAC GAG TAC GAG ACC ACG CAG GAG TGC GCG CCC CCG CCA CCG CCG 2436 Asp Glu Tyr Glu Thr Thr Gln Glu Cys Ala Pro Pro Pro Pro Pro 725 730 735 CGG CCG CGC ACG CGC GGC GCG TCC CGC AGG ACG TCG GCG GGG CCG 2481 Arg Pro Arg Thr Arg Gly Ala Ser Arg Arg Thr Ser Ala Gly Pro 740 745 750 CGG CGC TGG CGG CGC TCC CGC CTC AAC GGG TTG GCT GCG CAG CGC 2526 Arg Arg Trp Arg Arg Ser Arg Leu Asn Gly Leu Ala Ala Gln Arg 755 760 765 GCA CGC GCA GCG CGG GAC TCG CTG TCG TTG AGC AGC GGT TCG GGC 2571 Ala Arg Ala Ala Arg Asp Ser Leu Ser Leu Ser Ser Gly Ser Gly 770 775 780 TGC GGC TCG GCG TCG GCC TCG GAC GAC GAT GCG GAC GAC GCG GAC 2616 Cys Gly Ser Ala Ser Ala Ser Asp Asp Asp Ala Asp Asp Ala Asp 785 790 795 GGG GCG CTG GCG GCC GAG AGC ACG CCT TTC CTC GGC CTG CGA GCG 2661 Gly Ala Leu Ala Ala Glu Ser Thr Pro Phe Leu Gly Leu Arg Ala 800 805 810 GCG CAC GAC GCG CTG CGC TCG GAC TCG CCG CCG CTC TGC CCG GCG 2706 Ala His Asp Ala Leu Arg Ser Asp Ser Pro Pro Leu Cys Pro Ala 815 820 825 GCG GAC AGC AGG ACT TAC TAC TCC CTG GAC AGC CAC AGC ACG CGC 2751 Ala Asp Ser Arg Thr Tyr Tyr Ser Leu Asp Ser His Ser Thr Arg 830 835 840 GCC AGC AGC AGA CAC AGC CGG GGG CCG CCC ACG AGG GCA AAG CAG 2796 Ala Ser Ser Arg His Ser Arg Gly Pro Pro Thr Arg Ala Lys Gln 845 850 855 GAC TCC GGG CCC CTC 2811 Asp Ser Gly Pro Leu 860 TAAGGCCT CCCGCCTCGC CCGCCTCACG TCTCCGAGGA GAGCGGAGAC CACCGACTGG 2869 AGAGGGAAAA AGGAGCGAAC AAAGAAATAA AAATATTTTT ATTTTCTATA AAAGGAAAAA 2929 AGTATAACAA AATGTTTTAT TTTCATTTTA GCAAAAAAAA TTGTCTTATA ATACTAGCTA 2989 ACGGCAAAGA CGTTTTTATA GGGAAACTAT TTATATGTAA CATCCTGATT TACAGCTTCG 3049 GAAAAAAAAA AGAAACAACA AAAAAAA 3076

【図面の簡単な説明】

【図１】種々の癌細胞の32DB2-52及び32DB4-17細胞株に
対するジャクスタリン(Juxtacrine)活性の測定結果を示
す図である。図において、黒バーは32DB2-52細胞株に対
する結果、白バーは32DB4-17細胞株に対する結果であ
る。また、横軸の細胞株の詳細は下記のとおりである。 細胞株１: ヒト HSC 2; ２: ヒト HSC 4; ３: ヒト SK-
BR-3; ４: ヒト MDA-MB-361; ５: ヒト U-138MG; ６:
ヒト SK-N-SH; ７: ラット L2; ８: ヒト Hep G2;９:
ヒト Hep 3B; １０: ラット PC12.

【図２】NTAK cDNA フラグメントの検出を示す電気泳動
写真である。

【図３】NTAK翻訳産物の概要を示す図で、上図は親水性
−親油性プロフィールを示し、下図はNTAKとラット NGR
のドメイン構造の比較を示す図である。

【図４】NTAKとラット EGFファミリー物質のアイソフォ
ーム分析を示す図である。

【図５】図５ＡはrNTAK α2のSDS-ポリアクリルアミド
電気泳動を示す写真であり、図５ＢはMDA-MB-453細胞刺
激後のERrbB2とErbB3の免疫沈降を示す写真である。

【図６】MDA-MB-453細胞の分化誘導を示す写真（生物の
形態）である。

【図７】EP170.7 (ErbB1)と32DB4-17 (ErbB4)細胞アッ
セイを示す図である。

【図８】¹²⁵I-ヒト NRGβ1のMDA-MB-453細胞への結合の
競合阻害を示す図である。

【図９】prorNTAKα2のジャクスタリン(Juxtacrine)活
性を示す図である。

【図１０】NTAKのノザン ハイブリダイゼーション アナ
リシスを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 31/70 33/566 39/395 ＡＤＵＥ // Ａ６１Ｋ 31/70 48/00 ＡＤＵ 38/46 ＡＡＡ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 39/395 ＡＤＵ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 48/00 ＡＤＵ 15/00 Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＡＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸
   配列をコードする塩基配列、あるいはこれを一部置換、
   欠失もしくは付加した塩基配列、あるいはこれらにハイ
   ブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡを含有する組
   換えベクター。
3. 【請求項３】 請求項２記載の組換えベクターによ
   り形質転換された原核又は真核宿主細胞。
4. 【請求項４】 請求項３記載の宿主細胞を培養し、
   産生されたタンパク質を分離、精製することを特徴とす
   る組換えタンパク質の製造方法。
5. 【請求項５】 組換えタンパク質が受容体型チロシ
   ンキナーゼErbBのリガンドとなるタンパク質である請求
   項４記載の組換えタンパク質の製造方法。
6. 【請求項６】 請求項３記載の宿主細胞を培養して
   得られる培養物を分離、精製して得られる組換え受容体
   型チロシンキナーゼErbBのリガンド。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸
   配列からなる蛋白質又は当該アミノ酸配列を含む若しく
   は当該アミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を含む蛋白
   質。
8. 【請求項８】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸
   配列をコードする塩基配列と特異的にハイブリダイズし
   うるオリゴヌクレオチド。
9. 【請求項９】 請求項７記載のオリゴヌクレオチド
   を動物に投与することからなる、動物における受容体型
   チロシンキナーゼErbBのリガンドの生成を抑制する方
   法。
10. 【請求項１０】 受容体型チロシンキナーゼErbBのリ
    ガンドを認識する抗体。
11. 【請求項１１】 配列番号１に示すアミノ酸から選択
    される任意の少なくとも６個連続するアミノ酸を含むポ
    リペプチドを動物に免疫して得られる請求項１０記載の
    抗体。
12. 【請求項１２】 請求項１０〜１１のいずれかに記載
    の抗体を用いて、受容体型チロシンキナーゼErbBのリガ
    ンドの生成を抑制する方法及びその検出を行う方法。