DE69529674T2 - Biologisch aktive ligande der eph familie - Google Patents

Description

EINFÜHRUNG
• Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verstärkung der biologischen Aktivität von löslichen Formen von Liganden zur Verfügung, die Proteine binden, die zur Eph- Unterfamilie von rezeptorähnlichen Protein-Tyrosin-Kinasen wie die Ehks (umfassend Ehk-1, Ehk-2 und Ehk-3), Eck und Elk gehören. Sie bezieht sich auch auf, biologisch aktive, geclusterte Formen des Liganden und auf einen neuen Liganden, der den Ehk-1-Rezeptor bindet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Die Fähigkeit von Polypeptid-Liganden, Zellen zu binden und dadurch eine phänotypische Antwort wie Zellwachstum, -überleben oder -differenzierung auszulösen, wird oft durch transmembrane Tyrosin-Kinasen vermittelt. Der extrazelluläre Abschnitt jeder Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) ist im Allgemeinen der auffälligste Abschnitt des Moleküls, da es das Protein mit seiner Liganden erkennenden Eigenschaft darstellt. Die Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne ergibt eine Signalübertragung durch eine intrazelluläre katalytische Domäne einer Tyrosin-Kinase, die ein biologisches Signal an intrazelluläre Zielproteine überträgt. Die besondere Anordnung von Sequenzmotiven dieser cytoplasmatischen katalytischen Domäne bestimmt ihren Zugang zu potenziellen Kinase- Substraten (Mohammadi, et al., 1990. Mol. Cell. Biol. 11: 5068-5078; Fantl, et al., 1992, Cell, 69: 413413).
• Die RTKs scheinen nach der Ligandenbindung eine Dimerisierung oder eine ähnliche Konformationsänderung zu durchlaufen (Schlessinger, J., 1988, Trend Biochem. Sci. 13: 443- 447; Ulrich und Schlessinger, 1990, Cell, 61: 203-212; Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron 9: 383-391); molekulare Interaktionen zwischen dimerisierenden cytoplasmatischen Domänen führen zur Aktivierung der Kinasefunktion. In manchen Fällen, wie zum Beispiel dem Wachstumsfaktor Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) ist der Ligand ein Dimer, der zwei Rezeptor-Moleküle bindet (Hart et al., 1988, Science, 2404529-1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chent 264: 8905-8912) wohingegen der Ligand im Falle von EGF ein Monomer ist (Weber et al., 1984, J. Biol. Chem., 259: 14631-14636).
• Bei höheren Organismen stellt die Gewebeverteilung eines bestimmten Tyrosin- Kinase-Rezeptors wichtige Daten hinsichtlich der biologischen Funktion des Rezeptors zur Verfügung. Die Tyrosin-Kinase-Rezeptoren für einige Wachstums- und Differenzierungsfaktoren wie dem Fibroblasen-Wachstumsfaktor (FGF) werden im großen Maßstab exprimiert und scheinen somit eine allgemeine Rolle beim Wachstum und Erhalt von Gewebe zu spielen. Angehörige der Trk-RTK-Familie (Glass & Yancopoulos, 1993, Trends in Cell Biol. 3: 262-268) von Rezeptoren sind allgemeiner auf Zellen des Nervensystems beschränkt und die Nerven-Wachstumsfaktor-Familie, die aus NGF, BDNF, NT-3 und NT-4/5 (bekannt als die Neutrophine) bestehen, die diese Rezeptoren binden, fördern die Differenzierung diverser Neuronengruppen im Gehirn und in der Peripherie (Lindsay, R. M., 1993, in Neurotrophic Factors, S. E. Loughlin & J. H. Fallon, Hrsg., S. 257- 284 (San Diego, CA: Academic Press). Die Lokalisierung eines derartigen Trk-Familien- Rezeptors, trkB in Gewebe gewährte einigen Einblick in die potenzielle biologische Rolle dieses Rezeptors ebenso wie die Liganden, die diesen Rezeptor binden (hierin als Verwandte bezeichnet). Demnach wurde herausgefunden, dass trkB z. B. in adulten Mäusen vorzugsweise im Hirngewebe exprimiert wurde, obwohl signifikante Mengen an trkB-mRNAs auch in Lunge, Muskel und Eierstöcken beobachtet wurden. Des weiteren wurden trkB-Transkripte auch in Embryonen der mittleren bis späten Gestation nachgewiesen. Die in-situ- Hybridisierungsanalyse von 14 und 18 Tagen alten Mausemryonen zeigte, dass trkB- Transkripte in den zentralen und peripheren Nervensystemen, umfassend Gehirn, Rückenmark, spinalen und cranialen Ganglien, paravertebralem Stamm des sympathischen Nervensystems und verschiedenen Innervierungswegen lokalisiert wurden, was nahe legt, dass das trkB-Genprodukt ein Rezeptor sein kann, der in der Neurogenese und der frühen neuralen Entwicklung beteiligt ist ebenso wie es eine Rolle im adulten Nervensystem spielen kann.
• Die zelluläre Umgebung, in der ein RTK exprimiert wird, kann die biologische Antwort, die bei der Bindung eines Liganden an den Rezeptor gezeigt wird, beeinflussen. Demnach ergibt sich, zum Beispiel, wenn eine Nervenzelle, die einen Trk-Rezeptor exprimiert, einem Neurotrophin, das an den Rezeptor bindet, ausgesetzt wird, neuronales Überleben und Differenzierung. Wird derselbe Rezeptor durch einen Fibroblasten exprimiert, so ergibt ein Aussetzen zum Neurotrophin eine Vermehrung des Fibroblasten (Glass, et al., 1991, Cell 66: 405-413). Es scheint demnach so, dass die extrazelluläre Domäne hinsichtlich der Ligandenspezifität den bestimmenden Faktor darstellt, und ist die Signaltransduktion erst einmal initiiert, wird die zelluläre Umgebung das phänotypische Ergebnis dieser Signaltransduktion bestimmen.
• Eine Anzahl von RTK-Familien wurden basierend auf Sequenzhomologien in ihrer intrazellulären Domäne identifiziert. Die Rezeptor- und Signaltransduktionswege, die durch NGF benutzt wurden, beteiligen das Produkt des trk-Proto-Onkogens (Kaplan et al., 1991, Nature 350: 156-160; Klein et al., 1991, Cell 65: 189-197). Klein et al. (1989, EMBO J. 8: 3701-3709) berichteten von der Isolierung von trkB, welches ein zweites Mitglied der Tyrosin-Proteinkinase-Rezeptorfamilie codiert, von denen herausgefunden wurde, dass sie mit dem menschlichen trk-Protoonkogen stark verwandt sind. TrkB bindet und vermittelt die funktionalen Antworten auf BDNF, NT-4 und, in geringerem Maße, NT-3 (Squinto, et al., 1991, Cell 65: 885-903; IP, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 3060-3064; Klein, et al., 1992, Neuron, 8: 947-956). Auf Ebene der Aminosäuren wurde herausgefunden, dass die Produkte von trk und trkB eine 57%ige Homologie in ihren extrazellulären Regionen teilen, einschließlich 9 der 11 in trk vorliegenden Cysteine. Es wurde herausgefunden, dass diese Homologie in ihren jeweiligen katalytischen Domänen für Tyrosinkinase bis zu 88% ansteigt. Die Trk-Genfamilie wurde nun erweitert und umfasst nun den trkC-Genort, wobei NT-3 als bevorzuter Ligand für trkC identifiziert wurde (Lamballe, et al., 1991, Cell 66: 967- 979; Valenzuela, et al., 1993, Neuron 10: 963-974).
• Die Eph-verwandten transmembranen Tyrosinkinasen umfassen die größte bekannte Familie rezeptoröhnlicher Tyrosinkinasen, wobei viele Mitglieder eine spezifische Expression beim sich entwickelnden und beim adulten Nervensystem zeigen. Zwei neue Mitglieder der Eph-RTK-Familie, genannt Ehk (eph-Homologiekinase) -1 und -2 wurden unter Verwendung einer auf Polymerase-Kettenreaktion basierenden Durchmusterung von Genen, die im Gehirn exprimiert werden, identifiziert (Maisonpierre, et al., 1993, Oncogene 8: 3277-3 88). Es scheint so, als würden diese Gene ausschließlich im Nervensystem exprimiert werden, wobei die Ehk-1-Expression früh in der neuralen Entwicklung beginnt. Kürzlich wurde ein neues Mitglied dieser Gruppe von verwandten Rezeptoren, Ehk-3 cloniert (Valenzuela, et al. im Druck).
• Das elk-Gen codiert eine rezeptorähnliche Protein-Tyrosin-Kinase, die ebenfalls zur eph-Unterfamilie gehört und die fast ausschließlich im Gehirn (und in geringeren Mengen in den Hoden) exprimiert wird (Lewin, et al., 1988, Oncogene 3: 621-678; Lhotak, et al., 1991; Mol. Cell. Biol. 11: 2496-2502. Basierend auf seinem Expressionsprofil wird erwartet, dass der Elk-Rezeptor und sein verwandter Ligand in Zell-Zell-Interaktionen im Nervensystem eine Rolle spielen.
• Anders als die Ehks und die Elk-Rezeptoren scheint der eng verwandte Eck-Rezeptor in einer eher pleiotropen Weise zu funktionieren.; er wurde in neuralen, epithelialen und Skelett-Geweben identifiziert und er scheint bei der Gastrulation, an craniofacialen und Gliedmaßenknospen der Musterbildung im Mausembryo beteiligt zu sein (Ganju, et al., 1994, Oncogene 9: 1613-1624).
• Die Identifikation einer großen Anzahl an Rezeptor-Tyrosin-Kinasen hat die Identifikation ihrer verwandten Liganden bei weitem überstiegen. Bestenfalls liefert die Bestimmung der Gewebe, in welchen solche Rezeptoren exprimiert werden, einen Einblick in die Regulierung des Wachstums, der Vermehrung und der Regeneration von Zellen in Zielgeweben. Da es so scheint, als würden RTKs eine Vielzahl an wichtigen Funktionen während der Entwicklung vermitteln, werden ihre verwandten Liganden zweifellos eine bedeutende Rolle in der Entwicklung spielen.
• Wir fanden eine Reihe verwaister rezeptorähnlicher Tyrosin-Kinasemoleküle, umfassend fünf solcher Moleküle, die zu dem trk-Rezeptor und der Insulin-Rezeptorfamilie homolog sind und weitere vier Moleküle, welche zu CSFIR/PDGFR/kit; beziehungsweise ret; eck-alpha (nun als Ehk-2 bekannt) und eck-beta (Ehk-1) homolog sind, werden beschrieben. Darin werden Verfahren beschrieben, in welchen Zelllinien, die Ehk-1 und Ehk-2 exprimieren, zum Testen verwendet wurden, um ihre verwandten Liganden zu identifizieren. Da es scheint, als würden die ehks in unterschiedlichen neuronalen Populationen exprimiert, umfassend einige der wichtigsten zentralen aufsteigenden cholinergischen Nuclei, wurde erwartet, dass Liganden, die diese Rezeptoren binden, eine Rolle bei der Förderung von Wachstum oder vom Überleben dieser Nervenzellen spielen. Da die Expression von Ehk-1 früh in der Entwicklung beginnt, können seine verwandten Liganden eine Rolle in der Embryogenese spielen.
• Obwohl viele Schemata zur Identifikation von verwandten Liganden der vielen identifizierten verwaisten Rezeptoren angedacht wurden, wurden sehr wenige solche Liganden identifiziert und die Liganden, die bis jetzt identifziert wurden, scheinen keine andere Aktivität zu haben als die Fähigkeit, ihren verwandten Rezeptor zu binden. Die Internationale Veröffentlichung Nummer WO/94111020, veröffentlicht am 26. Mai 1994 beschreibt zum Beispiel Liganden, die an den Eck-Rezeptor binden. Im Besonderen wird der Ligand EBP (ebenfalls bekannt als B61) beschrieben. Obwohl jedoch die Bindung von B61 an den Eck-Rezeptor offenbart wird, wird keine biologische Aktivität beschrieben. Auf ähnliche Weise wurde trotz der Beschreibung in PCT-Veröffentlichung Nummer WO 94/11384 (veröffentlicht am 26. Mai 1994) eines Liganden, der den Elk-Rezeptor bindet, keine biologische Aktivität beobachtet, ungeachtet dessen, ob der Ligand membrangebunden oder in Form eines Fc-Dimers des löslichen Liganden präsentiert wurde. Hinsichtlich des Elk- Rezeptors wurden jedoch chimäre EGFR-Elk-Rezeptoren (bei denen die extrazelluläre Domäne des EGFR mit der cytoplasmatischen Elk-Domäne verbunden ist) verwendet, um die funktionelle Integrität (gemessen durch EGF stimulierte Autophosphorylierung) der enzymatischen Domäne dieses Rezeptors zu zeigen (Lhotak und Pawson, 1993, Mol. Cell. Biol. 13: 7071-7079).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Gemäß der Erfindung können lösliche Formen der hierin beschriebenen Liganden verwendet werden, um bei Ehk-1-, Ehk-2-, Ehk-3-, Eck- und Elk-Rezeptor exprimierenden Zellen biologische Reaktionen zu fördern. Im Besonderen wird hierin ein allgemeines Verfahren beschrieben, das ein "Clustern" von Liganden bei eph-verwandten Rezeptoren hervorruft, welches so funktioniert, dass es ansonsten inaktive lösliche Liganden biologisch aktiv macht, oder welches die biologische Aktivität von Liganden verstärkt, welche ohne ein derartiges Clustern nur geringe Mengen an biologischer Aktivität hätten.
• In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung der biologischen Aktivität der extrazellulären Domäne eines Liganden der eph-Familie bereit, umfassend:
• a) Expression der löslichen Domäne des Liganden mit einem Markierungsepitop;
• b) Exponieren der markierten löslichen Domäne mit Anti-Markierungs-Antikörpern zur Bildung eines Clusters von Liganden der eph-Familie.
• Die Erfindung stellt des Weiteren ein Präparat eines Epitop-markierten löslichen Liganden der eph-Familie, behandelt mit einem Anti-Epitop-Antikörper, welches erhältlich ist nach einem derartigen Verfahren, zur Verfügung.
• In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung der biologischen Aktivität der löslichen Domäne eines Liganden der eph-Familie, ausgewählt aus Efl-1 (B61) und Efl-2 (EHK-IL) zur Verfügung, umfassend:
• a) Expression der löslichen Domäne des Liganden mit einer Fc-Domäne eines IgG; und
• b) Zulassen der Bildung von Fc-Dimeren.
• Die Erfindung stellt des Weiteren einen biologisch aktiven, geclusterten löslichen Liganden der eph-Familie umfassend (lösliches Efl)n zur Verfügung, wobei das lösliche Efl die extrazelluläre Domäne von Efl-1 (B61) oder Efl-2 (EHK-1L) ist und n 2 oder größer ist.
• Noch weiter stellt die Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül, umfassend die DNA-Sequenz von Efl-4 zur Verfügung, wobei die Sequenz der Nucleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe aus:
• (a) der Sequenz der DNA, die die Codierungsregion der Efl-4-DNA-Sequenz umfasst, enthalten in dem Plasmid pJFE14, wie hinterlegt bei der American Type Culture Colection am 21. Oktober 1994 und bezeichnet als 75921;
• (b) DNA-Sequenzen, die unter moderat stringenten Bedingungen mit der DNA aus (a) hybridisieren und ein Efl-4-Protein codieren, welches an den Ehk-1-Rezeptor bindet; und
• (c) DNA-Sequenzen, die als ein Ergebnis des genetischen Codes im Bezug auf die DNA-Sequenzen von (a) oder (b) degeneriert sind und die ein Efl-4-Protein codieren, welches an den Ehk-1-Rezeptor bindet.
• Die Erfindung stellt des Weiteren auch ein isoliertes Polypeptid, das durch eine solche Nucleinsäure und einen Liganden einer biologisch aktiven, geclusterten eph-Familie zur Verfügung, umfassend (lösliches Efl)n, wobei das lösliche Efl die extrazelluläre Domäne eines Polypeptids nach Anspruch 10 ist und n 2 oder größer ist.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
• Fig. 1. Vektor pJFE14.
• Fig. 2. Sequenzvergleich von Liganden für Ehk-1 und Elk-Rezeptoren. Angeordnete Sequenzen von B61 (SEQ ID NR: 1), Ehk-1-Ligand (EHK-1L) (SEQ ID NR: 2) und Elk-Ligand (ELK-L) (SEQ ID NR: 3) werden gezeigt. Reste, die allen drei Sequenzen gemein sind, sind umrandet, und Reste, die mindestens zweien gemein sind, sind in der Consensus-Bahn aufgeführt; die fettgedruckten Punkte zeigen konservierte Cysteine und die Sternchen bezeichnen Reste, die die hauptsächlich konservierten Regionen begrenzen. Kleingedruckte Buchstaben zeigen die angenommenen amirioterminalen Signalsequenzen sowie die transmembrane Domäne von ELK-L und carboxy-terminale hydrophobe GPI- Erkennungsenden von B61 und EHK1-L.
• Fig. 3. Nucleotidsequenz der codierenden Region von EHK-1L (SEQ ID NR: 4).
• Fig. 4. Northern Blot-Analyse der Expression von Efl-1 (B61), Efl-2 (EHK-1L) und Efl-3 (ELK-L) bei Geweben von adulten Ratten (A) und im sich entwickelnden Gehirn (B). Die gesamte RNA (20 Mikrogramm pro Bahn) wurde von den angezeigten Geweben isoliert, auf 1%igen Formaldehyd-Agarose-Gelen fraktioniert und auf Nylon-Membranen überführt. Die Blots wurden auf Sonden, die mit 32P markiert waren, und die von Restriktionsfragmenten, die sich innerhalb der codierenden Regionen jeder cDNA befanden, hybridisiert.
• Fig. 5. Aktivierung von Rezeptoren der Eph-Familie durch membrangebundenen oder geclusterten Liganden, wie durch Elk-Rezeptor-Tyrosin-Phosphorylierung gemessen. Fig. 5A: Stimulierung unter Verwendung von Kontroll-COS-Zellen, die mit Vektor allein (COS-Mock) transfiziert sind oder COS-Zellen, die mit einem Expressionskonstrukt transfiziert sind, das Efl-3 (ELK-L) codiert; Fig. 5B: Stimulierung mit löslichem, myc- markiertem Efl-3 (ELK-L), verwendet als nicht-geclusterter Ligand (zweite und dritte Vertiefung) oder als Ligand, der durch Antikörper geclustert ist (vierte und fünfte Vertiefung). ("+AB" bedeutet lösliche Liganden, geclustert mit Antikörper). Die Kontrolle (0 ng/ml) ist in der ersten Vertiefung gezeigt. Fig. 5C: Stimulierung mit löslichem, myc- markiertem Efl-1 (B61), welches als nicht-geclusterter Ligand (zweite Vertiefung) oder als Ligand, welcher durch Antikörper geclustert ist (dritte Vertiefung), verwendet wird. Die Kontrolle (0 ng/ml) wird in der ersten Vertiefung gezeigt. Die oberen Abbildungen in den Figuren A, B und C zeigen Immunpräzipitate, die mit Antikörpern gegen Phosphotyrosin immun-geblottet wurden. Die unteren Abbildungen in den Figuren A, B und C zeigen Immunpräzipitate, die nachfolgend gestrippt wurden und erneut mit Antikörpern, die die Rezeptoren erkennen, in Reaktion gebracht wurden, um das Gesamt-Rezeptor-Protein sichtbar zu machen.
• Fig. 6. Induktion von Wachstumsreaktionen bei BAF-Zellen, welche durch Eck- Rezeptor-Chimäre vermittelt wurden: A. Stimulationen fanden mit löslichem Efl-2 (EHK-1L), hergestellt in COS-Zellen mit oder ohne nachfolgendes Clustern statt. B. Stimulationen fanden mit löslichem Efl-1 (B61), welches in COS-Zellen mit oder ohne nachfolgendes Clustern hergestellt wurden, statt.
• Fig. 7. Induktion von ELK-Rezeptor-Tyrosin-Phsophorylierung durch einen geclusterten jedoch nicht dimeren Liganden. Bahn A: mock-COS-Überstände ohne antimenschliche Antikörper; Bahn B: anti-menschliche Antikörper; Bahn C: ELK-L-Fc ohne quervernetzende Antikörper; und Bahn D: quervernetzende Antikörper. Löslicher Fc- markierter ELK-Ligand (ELK-L-Fc) wurde als COS-Zellüberstand hergestellt und als nicht geclusterter, dimerer Ligand oder als durch Antikörper geclusterter Ligand verwendet. Die Ligandenkonzentrationen wurden durch Quantifizierung der Menge an Fc-Epitop unter Verwendung eines ELISA-Tests bestimmt. Das Liganden-Clustern wurde durch Zusetzen von Anti-menschlichen Antikörpern und Inkubieren über eine Stunde vor Stimulierung der Zellen durchgeführt. Reporterzellen waren NIL 3T3-Fibroblasten, die mit ELK transfiziert waren. Die Zellen wurden 4-6 Stunden in serumfreiem Medium ausgehungert und dann 40 Minuten mit der folgenden Stimulierung stimuliert: die Zellen wurden mit Antikörpern, die die Rezeptoren erkennen, solubilisiert und immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden mit Antikörpern gegen Phosphotyrosin immungeblottet.
• Fig. 8. Induktion von Wachstumsreaktionen in BAF-Zellen, die durch ECK- Rezeptorchimäre vermitelt werden. Die Stimulierungen wurden mit löslichem dreifachem myc-markiertem EHK1-Liganden (EHKIL-m³) und dreifachem myc-markiertem B61 (B61- m³), welches in COS-Zellen mit oder ohne nachfolgendes Clustern mit anti-myc- und anti- Maus-Antikörper hergestellt wurden, durchgeführt. Da die katalytische Domäne des ECK- Rezeptors die Wachstumsreaktion bei BAF-Zellen nicht vermittelt, wurde stattdessen eine Rezeptor-Chimäre (in der die Ektodomäne des ECK-Rezeptors mit der cytoplasmatischen Domäne des FGF-Rezeptors verbunden wurde) in die BAF-Zellen eingeführt, um die Reporterzellinie darzustellen.
• Fig. 9. Induktion von Wachstumsreaktionen im BAF-Zellen, vermittelt durch ECK- Rezeptor-Chimäre. Die Stimulierungen wurden mit löslichem EHK-1-L-Fc und B61-Fc, das in COS-Zellen mit oder ohne nachfolgendes Clustern mit anti-menschlichen Antikörpern hergestellt wurde, durchgeführt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
• Die Verwendung von Testsystemen unter Verwendung der Ehk-1-, Ehk-2-, Ehk-3-, Eck- und Elk-Rezeptoren führte zu der Entdeckung von zu diesen Rezeptoren verwandten Liganden, wie hierin beschrieben. Solche Liganden sind für die Förderung des Wachstums und des Überlebens von neuronalen, epithelialen oder anderen Rezeptor-tragenden Zellpopulationen in vitro von Nutzen.
• Wie nachfolgend detailliert beschrieben haben die Anmelder durch Expressionsclonierung einen oder mehrere neue Liganden, die die Ehk-1- und Elk-Rezeptoren binden, entdeckt. Zusätzlich haben die Anmelder entdeckt, dass der zuvor identifizierte Ligand B61 (Holzmann et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10: 5830-5838) auch an Ehk-1 bindet und dass sowohl B61 als auch die Ehk-1-Liganden ebenfalls den Ehk-2- und den neu entdeckten Ehk- 3-Rezeptor binden wie auch der Eck-Rezeptor.
• Die hierin beschriebenen Liganden werden Efl's (transmembrane Eph-Liganden der Tyrosin-Kinase-Familie) genannt. Die Aminosäuresequenzen von B61 (Efl-1) und EHK-1L (Efl-2) sowie auch die Sequenz des an Elk bindenden Liganden Efl-3, der in WO 94/11020 (veröffentlicht am 26. Mai 1994) beschrieben wurde, werden in Fig. 2 gezeigt. Ein zusätzlicher Ligand, der an Ehk-1, Ehk-2, und Ehk-3 bindet, sowie der Eck-Rezeptor wurde als Efl-4 identifiziert.
• Plasmid pJFE14, welches den neuen Liganden Efl-4 codiert, wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags am 21. Oktober 1994 als 75921 hinterlegt.
• Wenn hierin verwendet umfassen Efl-1, Efl-2, Efl-3 und Efl-4 funktionell äquivalente Moleküle, in welchen Aminosäurereste innerhalb der Sequenz substituiert werden, was eine stille Veränderung zur Folge hat. Zum Beispiel können ein oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure von ähnlicher Polarität substituiert werden, was als funktionelles Äquivalent wirkt und eine stille Veränderung nach sich zieht. Substitute für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Angehörigen der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Zum Beispiel umfassen die nicht- polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure. Ebenfalls eingegliedert in den Umfang der Erfindung sind Proteine oder Fragmente oder Derivate davon, die dieselbe oder eine ähnliche biologische Aktivität zeigen und Derivate, die während oder nach der Translation z. B. durch Glycosilierung, proteolytische Spaltung, Verbindung mit einem Antikörpermolekül oder einen anderen zellulären Liganden, etc. unterschiedlich modifiziert sind.
• Zellen, welche Efl's expimieren, können dies natürlicherweise tun oder können gentechnisch verändert sein, so dass sie diese Liganden durch Transfektion, Transduktion, Elektroporation, Mikroinjektion, durch ein transgenes Tier etc. von Nucleinsäure, die die hierin beschriebenen Efls in einem geeigneten Expressionsvektor, wie supra beschrieben herstellen. Vektoren, die die cDNA, die Efl-2 (EHK-IL) codiert, enthalten, wurden bei der American Type Collection unter den Bedingungen des Budapester Vertrags am 4. April 1994 als pJFE14, enthaltend Ehk-1L2B4 und Ehk-1L3B1 hinterlegt und wurden mit den ATCC- Benennungen 75728 beziehungsweise 75729 belegt. (Die Liganden, die durch diese Vektoren codiert werden sind identisch). Der pJFE14-Vektor, der die cDNA, die Efl-3 (ELK-L) codiert, enthält, wurde bei der American Type Culture Collection unter den Bedingungen des Budapester Vertrags am 12. April 1994 als pJFE14, enthaltend efl-3' hinterlegt und wurde mit der ATCC-Benennung 75734 belegt. Der pJFEI4-Vektor, der die cDNA, die Efl-4 codiert, enthält, wurde bei der American Type Culture Collection unter den Bedingungen des Budapester Vertrags am 21. Oktober 1994 als pJFE14, enthaltend efl-4 hinterlegt und wurde mit der ATCC-Benennung 75921 belegt.
• Die vorliegende Erfindung umfasst die DNA-Sequenz, die in dem Plasmid ATCC 75921 enthalten ist, sowie DNA- und RNA-Sequenzen, die mit den darin enthaltenen Efl- Sequenzen unter Bedingungen von moderater Stringenz hybridisieren, wie zum Beispiel in Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Ausgabe, Bd: 1, S. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) definiert. Demnach umfassen Nucleinsäuren, die von der Erfindung in Betracht gezogen werden, die Sequenzen, wie in den Hinterlegungen enthalten, Nucleinsäuresequenzen, die mit solchen Sequenzen hybridisieren und die den Ehk- 1-Rezeptor binden, sowie Nucleinsäuresequenzen, die als Folge des genetischen Codes von den vorstehenden Sequenzen degeneriert sind, die jedoch Liganden codieren, die (der) den Ehk-1-Rezeptor binden (bindet).
• Zusätzlich zieht die vorliegende Erfindung die Verwendung der hierin beschriebenen Liganden in löslichen Formen, in verkürzten Formen und markierten Formen in Betracht.
• Jedes Verfahren für die Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor, die der Fachmann kennt, kann verwendet werden, um Expressionsvektoren, die Efl's unter Verwendung geeigneter Transkriptions/Translations-Kontrollsignale und die Protein codierenden Sequenzen codieren, herzustellen. Diese Verfahren können rekombinante DNA und synthetische Verfahren in vitro und Rekombinationen in vivo (genetische Rekombination) umfassen. Die Expression von Nucleinsäuresequenz, die die Efl's oder Peptidfragmente davon codieren, können durch eine zweite Nucleinsäuresequenz reguliert werden, so dass das Protein oder Peptid in einem Wirt, der mit dem rekombinanten DNA- Molekül transformiert ist, exprimiert wird. Die Expression der hierin beschriebenen Efl's kann zum Beispiel durch jedes Promotor/Verstärkerelement, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, kontrolliert werden. Promotoren, die zur Kontrolle der Expression der Liganden verwendet werden können, umfassen die lange terminale Wiederholung, wie in Squinto et al., (1991, Cell 65: 1-20) beschrieben, die frühe SV40-Promotorregion (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), den CMV-Promotor, die M-MuLV 5'-terminale Wiederholung, den Promotor, der in der 3' langen terminalen Wiederholung von Rous-Sarcomavirus (Yamamoto, et al., 1980; Cell 22: 787-797), den Herpes-Thymidin-Kinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 144-1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallthioein-Gens (Brinster et al., 1982, Nature 296; 39-42); prokaryotische Expressionsvektoren wie den β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff, et al.,1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727-3731) oder den tac-Promotor (Deßoer; et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21-25), siehe auch "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74-94; Promotorelemente von Hefe oder anderen Pilzen wie den Gal 4-Promotor, den ADH (Alkohol-Dehydrogenäse)-Promotor, den PGK (Phosphoglyzerin-Kinase)-Promotor, den basischen Phosphatase-Promotor und die folgenden tierischen Transkriptions-Kontrollregionen, die Gewebespezifitätzeigeigen und in transgenen Tieren verwendet wurden: die Genkontrollregion von Elastase I, welche in acinösen Bauchspeicheldrüsenzellen aktiv ist (Swift et al., 1984 Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; Mac Donald, 1987, Hepatology 7: 425- 515); Kontrollregion des Insulingens, welche in Beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122), Kontrollregion des Immunglobulingens, welche in Lymphzellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985 Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987. Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444); die Brusttumor- Viruskontrollregion bei der Maus, die in Hoden, Brust-, Lymph- und Mast-Zellen (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495), die Albumin-Genkontrollregion, die in Leber aktiv ist (Pinkert et al.,1987, Genes and Devel. 1: 268-276), Alpha-Fetoprotein-Genkontrollregion, die in Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-11648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); Alpha 1-Antitrypsin-Genkontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al, 1987, Genes and Devel. 1: 161-171), Beta-Globin-Genkontrollregion, die in Myeloidzellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); Genkontrollregion von basischem Myelinprotein, welches in Oligodendrocytenzellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); Genkontrollregion der leichten Kette 2 von Myosin, die im Skelettmuskel aktiv ist (Shani, 1985, Nature 314: 283-286), und Genkontrollregion des gonadotropen Freisetzungshormons, das im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., Science 234: 1372-1378), sind jedoch nicht darauf beschränkt.
• Demnach können Expressionsvektoren die in einem Bakterien- oder Eukaryonten- Wirt repliziert werden können und die Efl-codierende Nucleinsäure umfassen, wie hierin beschrieben, für die Transfektion des Wirts und dadurch zur direkten Expression solcher Nucleinsäure verwendet werden, um die Efl-Proteine herzustellen, welche dann in biologisch aktiver Form gewonnen werden können. Wie hierin verwendet umfasst eine biologisch aktive Form eine Form, die in der Lage ist an den entsprechenden Rezeptor zu binden, wie Ehk-1 oder Elk und die eine differenzierte Funktion verursacht und/oder den Phänotyp der Zelle, die den Rezeptor exprimiert, beeinflusst. Derartige biologisch aktive Formen würden zum Beispiel die Phosphorylierung der Tyrosin-Kinase-Domäne des Ehk-1 oder Elk-Rezeptors oder die Stimulierung der Synthese von zellulärer DNA induzieren.
• Expressionsvektoren, die die Geninsertionen enthalten, können durch drei allgemeine Ansätze identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Gegenwart oder Abwesenheit von "Markierungs"-Genfunktionen und (c) Expression von inserierten Sequenzen. Im ersten Ansatz kann die Gegenwart eines fremden Gens, welches in einen Expressionsvektor inseriert ist, durch DNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, welche Sequenzen enthalten, die zu einem inserierten efl-Gen homolog sind, nachgewiesen werden. Im zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirt-System basierend auf der Gegenwart oder Abwesenheit bestimmter "Markierungs"-Genfunktionen (z. B. Thymidin-Kinaseaktivität, Resistenz gegen Antibiotika, transformierter Phänotyp, Einschlusskörperbildung bei Baculovirus, etc.), welche durch die Insertion von fremden Genen in den Vektor verursacht werden, identifiziert werden. Zum Beispiel können, wenn das efl-Gen innerhalb der Marker-Gensequenz des Vektors inseriert wird, Rekombinanten, die die Insertion enthalten, durch die Abwesenheit der Genfunktion des Markers identifiziert werden. Im dritten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren durch Testen des fremden Genprodukts, das durch die Rekombinante exprimiert wird, identifiziert werden. Solche Tests können zum Beispiel auf den physikalischen oder funktionalen Eigenschaften des efl- Genprodukts basieren, zum Beispiel durch Binden des Liganden an den Ehk-1- oder Elk- Rezeptor oder eines Abschnitts davon, der zum Beispiel mit einem nachweisbaren Antikörper oder einem Abschnitt davon oder durch Binden an Antikörper, die gegen das Efl-Protein oder einen Abschnitt davon hergestellt wurden, markiert werden kann
• Der Efl-2 (EHK-1L)-Ligand scheint einige Homologie mit dem zuvor identifzierten Liganden B61 (hierin als Efl-1 bezeichnet) zu haben. (Holzmann, et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10: 5830-5838). Wie B61 endet Efl-22 in einer C-terminalen hydrophoben Sequenz, die eine Erkennungssequenz zu codieren scheint, die es erlaubt, durch GPI verbunden zu werden und der deshalb eine intrazelluläre Domäne fehlt. In der Tat scheint eine Vorbehandlung von Efl- 2 exprimierenden Zellen mit Phospholipase C die Bindung des hk-1-Rezeptorkörpers zu reduzieren, was bestätigt, dass diese Proteine durch Pl verbunden sind. Efl-3 wird nicht unter Verwendung von Phospholipase C von der Zelloberfläche gespalten und es scheint ein herkömmliches transmembranes Protein mit einer cytoplasmatischen Domäne zu umfassen.
• Die hierin beschriebenen Liganden können als membrangebundene Formen in tierischen Zellexpressionssystemen hergestelt werden oder in löslicher Form exprimiert werden. Löslichen Formen der Liganden können unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, exprimiert werden. Eine üblicherweise verwendete Strategie beteiligt die Verwendung von Oligonucleotid-Primern, von welchen einer den N-Terminus des Proteins umspannt wobei der andere die Region direkt stromaufwärts zu einem hydrophoben Segment des Proteins umfasst, welche entweder die GPI-Bindungs- Erkennungsdomäne oder eine transmembrane Domäne des Proteins darstellt. Das Oligonucleotid, das die C-terminale Region umspannt, wird so modifiziert, dass sie vor der hydrophoben Domäne ein Stop-Codon enthält. Die beiden Oligonucleotide werden zur Verstärkung einer modifizierten Version des Gens verwendet, das ein Protein codiert, welches sekretiert wird und nicht membrangebunden ist. Alternativ kann in dem Vektor ein geeigneter Restriktionsort verwendet werden, um eine veränderte Sequenz zu inserieren, die die GBI-Bindungs-Erkennungsdomäne oder die transmembrane Domäne entfernt, wodurch ein Vektor entsteht, der in der Lage ist, eine sekretierte Form des Proteins zu exprimieren. Das so hergestellte lösliche Protein würde die Region des Proteins vom N-Terminus zu der Region, die der hydrophoben GPI-Erkennungsdomäne oder der transmembranen Domäne vorangeht, umfassen.
• Die Anmelder haben herausgefunden, dass, obwohl die löslichen Liganden, die gemäß der Erfindung hergestellt wurden, an die Rezeptoren in der eph-Unterfamilie binden, solche löslichen Liganden oft wenig oder keine biologische Aktivität haben. Solche löslichen Liganden werden gemäß der vorliegenden Erfindung durch Liganden-"Clustern" aktiviert. "Clustern" wie hierin verwendet bezieht sich auf jedes Verfahren, welches dem Fachmann bekannt ist, zur Herstellung von Multimeren der löslichen Abschnitte von hierin beschriebenen Liganden.
• In einer Ausführungsform ist ein "geclustertes" efl ein Dimer, der gemäß der vorliegenden Erfindung zum Beispiel unter Verwendung der Fc-Domäne von IgG hergestellt wurde (Aruffo et al., 1991, Cell 67: 35-44), was zur Expression da löslichen Liganden als Disulfld-gebundener Homodimer führt. In einer anderen Ausführungsform werden sekretierte Formen der Liganden mit Epitop-Markierungen an ihren C-Termini konstruiert; anti- Markierungs-Antikörper werden dann verwendet um die Liganden zu aggregieren.
• Zusätzlich zieht die Erfindung andere "gentechnisch hergestellte" Ligandenmoleküle in Betracht, welche als Multimere existieren oder Multimere bilden. Zum Beispiel können Dimere der extrazellulären Domänen unter Verwendung von Leucin-Zippern gentechnisch hergestellt werden. Es wurde gezeigt, dass die Leucin-Zipper-Domänen der menschlichen Transkriptionsfaktoren c-jun und c-fos mit einer Stöchiometrie von 1 : 1 stabile Heterodimere bilden (Busch und Sassone-Corsi; Trends Genetics 6: 36-40 (1990) Gentz et al., Science 243: 1695-1699 (1989)). Obwohl gezeigt wurde, dass sich jun-jun-Homodimere ebenfalls bilden, sind sie etwa 1000-mal weniger stabil als jun-fos-Heterodimere. Fos-fös-Homodimere wurden nicht nachgewiesen. Die Leucin-Zipper-Domäne von entweder c-jun oder c-fos wird durch gentechnische Behandlung von chimären Genen am C-Terminus der löslichen oder extrazellulären Domänen der vorstehend erwähnten Liganden verschmolzen. Die Fusionen können direkt sein oder sie können eine flexible Verbindungsdomage, wie die Hinge-Region von menschlichem IgG oder Polypeptid-Verbindungen, die aus kleinen Aminosäuren wie Glycin, Serin, Threonin oder Alanin in verschiedenen Längen und Kombinationen bestehen, verwenden. Zusätzlich können die chimären Proteine durch His-Eis-His-His-His-His-His (His6) markiert werden, um eine schnelle Reinigung durch Metall-Gelat-Chromatographie zu ermöglichen und/oder durch Epitope, zu denen Antikörper erhältlich sind, um den Nachweis auf Western Blots, Immunpräzipitation oder die Erschöpfung/Blockierung der Aktivität in Biotests zu ermöglichen.
• Alternativ können Multimere durch Gentechnik hergestellt werden und Moleküle exprimieren, die aus dem löslichen oder extrazellulären Abschnitt des Liganden bestehen, der der Fc-Domäne von hlgG folgt, gefolgt von entweder den oben beschriebenen c-jun - oder c- fos-Leucin-Zippern [Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)]. Da diese Leucin- Zipper vor allem Heterodimere bilden, können sie dazu verwende: werden, die Bildung der Heterodimere voranzutreiben, wenn gewünscht. Was die beschriebenen chimären Proteine, die Leucin-Zipper verwenden, betrifft, so können diese ebenfalls mit Metallchelaten oder einem Epitop markiert werden. Diese markierte Domäne kann für die schnelle Reinigung durch Metall-Chelat-Chromatographie und/oder durch Antikörper verwendet werden, um den Nachweis auf Western Blots, Immunpräzipitation, oder die Erschöpfung/Blockierung der Aktivität in Biotests zu ermöglichen.
• In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden multimere lösliche Liganden durch die Expression als chimäre Moleküle unter Verwendung flexibler Verbindungsschleifen hergestellt. Ein DNA-Konstrukt, welches das chimäre Protein codiert, wird so angelegt, dass es zwei oder mehrere lösliche oder extrazelluläre Domänen, die durch eine flexible Schleife in ein Tandem ("Kopf an Kopf") miteinander verbunden werden, exprimiert. Diese Schleife kann gänzlich artifiziell (z. B. Polypeptid-Wiederholungen, welche in einem bestimmten Intervall von Serin oder Threonin im erbrochen werden) oder "geliehen" von natürlich vorkommenden Proteinen (z. B. der Hinge -Region von hlG) sein. Es können Moleküle hergestellt werden, in welchen die Länge und Zusammensetzung der Schleife variiert ist, um die Selektion von Molekülen mit er wünschten Eigenschaften zu gewährleisten. Obwohl sie nicht durch Theorie gebunden sein möchten, glauben die Anmelder, dass die Membran-Gebundenheit der Liganden das Liganden-Clustern erleichtert, was wiederum die Rezeptor-Multimerisierung und -Aktivierung fördert. Dementsprechend wird die biologische Aktivität des löslichen Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung durch Nachahmung des membrangebundenen Liganden-Clusterns in Lösung erreicht. Somit umfasst ein biologisch aktiver, geclusterter, löslicher Ligand der eph-Familie (lösliches Efl)n, worin das lösliche efl die extrazelluläre Domäne eines Liganden ist, der einen Rezeptor der eph-Familie bindet und n zwei oder größer ist. Wie hierin beschrieben sind Efl-1, Efl-2 und Efl-3 alle gemäß dem Verfahren der Erfindung biologisch aktiv gemacht.
• In jedem Fall wird der Fachmann erkennen, dass der Erfolg das Clusterns eine Analyse der biologischen Aktivität unter Verwendung von Biotests, wie den hierin beschriebenen erfordert. Zum Beispiel gibt es, wie in Fig. 5 gezeigt, trotz der Tatsache, dass die Rezeptorphosphorylierung deutlich durch die Stimulierung von Rezeptor exprimierenden Reporter-Zellen mit COS-Zellen, welche Membranformen der Liga den B61, Efl-2 und Efl-3 (Fig. 5A, Bahnen 1 und 2) über-exprimieren, induziert wird, bei der Verwendung von löslichen Formen dieser Liganden keine erkennbare Phosphorylierung (Fig. 5B, Bahnen 2 und 3, und Fig. 5C, Bahn 2). Werden jedoch sekretierte Formen der Liganden mit myc markiert und werden Antikörper verwendet, um die Liganden zu clustern, so induzieren die zuvor inaktiven löslichen Liganden stark eine Rezeptor-Tyrosin-Phosphorylierung in Reporter- Zellen, welche Elk- und Ehk-1-Rezeptoren exprimieren (Fig. 5B, Bahnen 4 und 5, Fig. 5C, Bahn 3) sowie eine Vermehrung in Reporter-Zellen, welche eine Eck-Rezeptor-Chimäre exprimieren (Fig. 6A).
• Obwohl in einigen Beispielen die Dimerisierung der Liganden ausreicht, um biologische Aktivität zu induzieren, zeigen die in Fig. 7 aufgeführten Daten, wie die hierin beschriebenen Verfahren in bestimmten Fällen verwendet werden, um die Hinlänglichkeit eines bestimmten Cluster-Verfahrens zu bestimmen: Wie in Fig. 7 mit dem Elk-Liganden gezeigt scheint die Dimerisierung des löslichen Liganden unter Verwendung von Fc nicht auszureichen, um eine biologische Antwort zu erzielen (Fig. 7, Bahn C). Dennoch ergab ein weiteres Clustern des Liganden gemäß der Erfindung unter Verwendung von anti-Fc- Antikörpern eine deutliche Zunahme der biologischen Aktivität (Bahn D).
• Im Fall des Liganden B61 scheint mit dem löslichen Liganden ohne Clustern ein geringer Wert an biologischer Aktivität erzielt zu werden; eine solche niedrige biologische Aktivität kann durch "Eigen-Clustern" auf geringem Niveau verursacht werden. Dennoch zeigten die Anmelder, dass sogar im Fall von efl's wie B61, die einige biologische Aktivität haben, die Aktivität durch Clustern gemäß der vorliegenden Erfindung verstärkt werden kann.
• Zellen der vorliegenden Erfindung können übergangsweise oder vorzugsweise konstitutiv und permanent die Efl's in natürlicher Form oder in löslicher Form als markierte Efl's oder geclusterte Efl's wie hierin beschrieben exprimieren.
• Die rekombinanten Faktoren können durch jedes Verfahren, das die nachfolgende Bildung eines stabilen, biologisch aktiven Proteins gewährleisten, gereinigt werden. Als Beispiel und nicht als Beschränkung können die Faktoren von Zellen entweder als lösliche Proteine oder als Einschlusskörper gewonnen werden, von welchen sie quantitativ durch 8M Guanidiri-Hydrochlorid und Dialyse extrahiert werden können. Um die Faktoren weiter zu reinigen können herkömmliche Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Umkehrphasenchromatographie oder Gelfiltration verwendet werden.
• Der mögliche therapeutische Nutzen von verwandten Ligunden von Ehk-1 wurde kürzlich vorgeschlagen. Im adulten Gehirn zeigten zelluläre Lokalisationen von ehk-1 an, dass das Gen vor allem in Neuronen exprimiert wird und ihre höchste Expressionsmenge in unterscheidbaren neuronalen Populationen erreichen, die einige der wichtigsten zentralen aufsteigenden cholinergischen Nuclei (interpedunkulare Region, Riechwulst und seitliche Mandeln) und monoaminergische Nuclei (Locus coeruleus, Dorsal aht und Substantia nigra) umfassen. Ehk-1-Sonden heben stark den piriformen Cortex in der ventrolateralen Region des Vorderhirns, das horizontale Glied des diagonalen Bands, das rostrale Septum und Neuronen, welche mit dem Indusium griseum und der Tenia tecta in Verbindung stehen im Hippocampus, in pyramidalen Neuronen in CA3 und CA2 und etwas schwächer in CA1 im oberen Colliculus und im retrosplenialen Cortex und in Neuronen des Locus coeruleus.
• Im Gehirn adulter Ratten kann beobachtet werden, dass Ehk-1 neuronenreiche Anhäufungen, welche mit den interpedunkularen Nuclei und der Substantia nigra, den basolateralen und lateralen Mandeln und der Dorsalnaht in Verbindung stehen stark hervorhebt. Ehk-1-Sonden konnten mit der granulären Schicht des Cerebellums, mit Purkinje- Zellen im Cerebellum und mitralen Zellen im Riechkolben hybridisieren.
• Bei E13-Embryos kommen ehk-1-Transkripte bemerkenswert häufiger im Kopf als im Körper vor. Vom ersten Tag nach dei Geburt an (P1)erreichen die Bande ihren höchsten Wert im Gehirn und gehen im adulten Gehirn leicht zurück Ehk-1-Bande gehen in zerebellaren Proben während des Übergangs von P1 zu Adulten zurück, was nahe legt, dass die Hauptexpressionsstellen im adulten Gesamtgehirn or allem außerhalb des Cerebellums liegen.
• Längeres Aussetzen zeigt, dass die neuralspezifischen Banden ebenfalls in RNAs von Primärkulturen von Astrocyten des Hipocampus nachweisbar sind. Dies ist unerwartet, da RNA-Hybridisierungsstudien in situ anzeigen, dass das ehk-Gen vor allem in Neuronen, nicht in Glia exprimiert wird. Untersuchungen in verschiedenen etablierten Zelllinien zeigt an, dass ehk-1 vor allem in Zellen neuronalen Ursprungs einschließlich verschiedener neuroepitheliomaler und neuroblastomaler Linien exprimiert wird.
• Der Elk-Rezeptor wird ebenfalls primär im Gehirn exprimiert. Entsprechend wird angenommen, dass der hierin beschriebene Elk-bindende Ligand die Induktion einer differentiellen Funktion unterstützen wird und/oder den Phänotyp wie das Wachstum und/oder das Überleben von Nervenzellen bei der Expression dieses Rezeptors beeinflussen wird.
• Northern-Blot-Analyse (Fig. 4) zeigte eingeschränkte und reziproke Expressionsmuster für Efl-2 (EHK-1L) und Efl-1 (B61) im Gegensatz zur breiten Verteilung von Efl-3 (ELK-L). Wie Elk-1 wird Efl-2 fast ausschließlich im Zentralnervensystem exprimiert mit der bemerkenswerten Ausnahme von hoher Expression in der Haut, wo eine Ehk-1-Expression fast nicht nachweisbar ist. Im Gegensatz dazu wird Efl-1 (B61) primär in nicht-neuronalen Geweben exprimiert (Fig. 4A; längeres Aussetzen zeigt geringe Mengen an B61 in den meisten Nervenstrukturen). Anders als der Elk-Rezeptor der nur im Gehirn und in den Hoden exprimiert wird, wird Efl-1 (ELK-L) sowohl in neutronalen als auch nicht- neuronalen Geweben in großem Maße exprimiert. Im Gehirn ist sowohl die Expression von Efl-1 als auch Efl-3, jedoch nicht von Efl-2 früh in der Entwicklung deutlich höher und geht dann zurück (Fig. 4B). Was Efl-1 und Efl-3 betrifft, so werden die Liganden für andere für das Nervensystem spezifische Rezeptor-Tyrosinkinasen (wie die 1 Neurotrophin-Liganden für die Trk-Rezeptoren) ebenfalls in nicht-neuronalen Geweben exprimiert (Maisonpierre et al. 1990, Science 247: 1446-1451; Maisonpierre et al. 1990, Neuron 5: 501-509), offensichtlich weil sie als Ziel-abgeleitete Faktoren für axonale Prozesse, die diese Gewebe innervieren, dienen (Thoenen, H. 1991; Trends Neurosci. 14: 165-170). Die nicht-neuronale Expression von Efl-1 und Efl-3 erhöht die Möglichkeit, dass sie als Liganden für Mitglieder der Eph- Rezeptorfamilie dienen, wie Eck, welche durch nicht-Nervenzellen exprimiert werden.
• Die hierin beschriebenen Efl's, Peptidfragmente davon oder Derivate, einschließlich geclusterte Liganden können in einem geeigneten pharmakologischen Träger formuliert werden, um Arzneimittel bereitzustellen. Die Efl-Proteine, Peptidfragmente oder Derivate können systemisch oder lokal Verabreicht werden. Jede geeignete Art der Verabreichung, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf intravenöse, intrathecale, intraarterielle, intranasale, orale, subcutane, intraperitoneale Verabreichung oder lokale Injektion oder chirurgisches Implantat Langzeitwirkende Formulierungen werden ebenfalls bereitgestellt.
BEISPIEL 1: EXPRESSIONSCLONIERUNG VON EHK-1-BINDENDEN LIGANDEN
• COS-7-Zellen wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle Medium (DMEM), welches 10% fötales Rinderserum (FBS), jeweils 1% Penicillin und Streptomycin (P/S) und 2 mM Glutamin in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; enthielt, gezüchtet. Die menschliche Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y (erhalten von June Biedler, Sloan-Kettering) wurde in Eagle minimalem Essentialmedium (EMEM) mit 10% FBS, (P/S) und 2 mM Glutamin gezüchtet.
• Menschliche Efl-cDNA-Clone voller Länge wurden durch Absuchexi einer SHSYSYcDNA-Genbank in dem pJFE14-Vektor, der in COS-Zellen exprimiert wird, erhalten. Menschliche Efl-4-cDNA-Clone voller Länge wurden durch Absuchen einer cDNA-Genbank einer menschlichen 143B-Osteosarcom Zelllinie in dem pJFE14-Vektor, der in COS-Zellen exprimiert wird, erhalten. Der pJFE14-Vektor ist, wie in Fig. 1 gezeigt, eine modifizierte Version des Vektors pSRα (Takebe, et al. 1988, Mol. Cell. Biol. 8: 466-472). Die Genbank wurde unter Verwendung der zwei BSTX1-Restriktionsorte im pJFE14-Vektor hergestellt.
• COS-7-Zellen wurden vorübergehend entweder mit der pJFE14-Vektor-Genbank oder einem Kontrollvektor durch das DEAE-Dextran-Transfektionsprotokoll transfiziert. Kurz, COS-M5-Zellen wurden in einer Dichte von 1,0 · 10&sup6; Zellen pro 100 mm Platte 24 Stunden vor der Transfektion ausgestrichen. Für die Transfektion wurden die Zellen in serumfreiem DMEM, welches 400 ug/ml DEAE-Dextran, 1 pM Chloroquin und 2 mM Glutamin und 1 ug der geeigneten DNA enthielt, 3-4 Stunden bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; gezüchtet. Das Transfektionsmedium wurde belüftet und durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 10% DM50 2-3 Min lang ersetzt. Nach diesem DMSO-"Schock" wurden die COS-7-Zellen mit 10% FBS, jeweils 1% Penicillin und Streptomycin und 2 mM Glutamin für 48 Stunden in DMEM platziert.
• Das Absuchen wurde unter Verwendung eines Ehk-1-Rezeptorkörpers, der aus der extrazellulären Domäne von Ehk-1 bestand, welche mit der konstanten Region von IgG1 verbunden war, durch direkte Lokalisierung einer Oberflächenfärbung durchgeführt. Dieser Rezeptorkörper wurde wie folgt hergestellt: Der Fc-Abschnitt von menschlichem IgG1, der an der Hinge-Region beginnt und bis zu dem Carboxylende des Moleküls reicht, wurde unter Verwendung von PCR mit Oligonucleotiden, die der veröffentlichten Sequenz von menschlichem IgG1 entsprechen, von plazentaler cDNA cloniert. Geeignete Restriktionsorte wurden ebenfalls in die Oligonucleotide eingeschlossen, um eine Clonierung des PCR- Fragments in einen Expressionsvektor zu gewährleisten. Expressionsvektoren, die Rezeptoren von voller Länge enthalten, wurden entweder durch den Abbau durch Restriktionsenzyme oder durch PCR-Strategien modifiziert, um die transmembranen und intrazellulären Domänen durch Restriktionsorte zu ersetzen, die eine Clonierung des menschlichen IgG1-Fragments in diese Orte gewährleisten; dies wurde auf eine Weise durchgeführt, dass ein Fusionsprotein mit der Ektodomäne des Rezeptors als Aminoende und dem Fc-Abschnitt von menschlichem IgG1 als Carboxylende erzeugt wurde. Ein Alternativverfahren zur Herstellung von Rezeptorkörpern wird in Goodwin, et al. 1993, Cell 73: 447-456 beschrieben. Kurz, eine Platte von 100 mm mit COS-Zellen wurde mit 1 ug SHSY5Y-Genbank-Plasmid-DNA transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen dadurch sondiert, dass sie 30 Min mit Ehk-1IgG (in Form von COS-Zellüberständen) inkubiert wurden. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen, mit Methanol fixiert und dann zusätzliche 30 Min mit PBS/10% Rinder-Kälberserum/anti-menschlichem IgG-basischem Phsophatase-Konjugat inkubiert. Nach drei Waschungen mit PBS wurden die Zellen 30-60 Min in alk-phos-Substrat inkubiert. Die Platte wurde dann mikroskopisch auf die Gegenwart von oberflächengefärbten Zellen hin geprüft. Für jede gefärbte Zelle wurde mit einer Plastikpipettenspitze ein kleiner, sie umgebender Bereich von der Platte gekratzt und Plasmid-DNA wurde dann gewonnen und verwendet, um Bakterienzellen zu elektroporieren. Plasmid-DNA, die von Kulturen hergestellt wurde, welche aus diesen Elektroporationen abgeleitet wurden, wurde verwendet, um COS-Zellen für eine zweite Anreicherungsrunde zu transifzieren. Die zweite Runde wurde mit Standard-Panning-Techniken durchgeführt. Nach der zweiten Anreicherungsrunde wurden einzelne Bakterienkolonien herausgenommen und Plasmid-DNA, die aus diesen Kolonien hergestellt wurde, wurde auf ihre Fähigkeit, Ehk-1-Färbung in COS-Zellen, welche mit ihnen transfiziert wurden, zu induzieren, getestet.
• Drei Clone aus der SY5Y-Familie wurden identifziert, die eine Bindung an den Ehk-1- Rezeptorkörper zeigten. Der erste wurde als B61 identifziert. Der zweite und dritte Clon, welche identisch sind, und hierin efl-2 genannt werden, scheinen sich von B61 zu unterscheiden, jedoch verwandt zu sein, wie unter Verwendung von teilweiser Nucleotidsequenzierung bestimmt wurde, welche nahe legt, dass diese Familienmitglieder von B61 sein könnten. Alle drei Liganden scheinen membrangebunden zu sein. Des weiteren ist Efl-2 wie B61 GPI-gebunden.
• Die Genbank, die von der menschlichen Osteosarcom-Zelllinie abgeleitet ist ergab einen Clon, der Efl-4 codiert. Dieser Ligand bindet die Ehk-1, Ehk-2 und Ehk-3 und Eck- Rezeptoren, jedoch nicht den Elk-Rezeptor.
BEISPIEL 2; CLONIERUNG VON NEUEN EFL'S
• Homologieregionen zwischen B61 und Efl-2 können verwendet werden, um zusätzliche Efl's, wie in der Patentanmeldung der Vereinigten Staaten Reihe Nr. 08/144.992 beschrieben, zu identifizieren. Fig. 2 zeigt zum Beispiel zwei solche Sequenzhomologieregionen, die jeweils die Aminosäuresequenzen mit den Einzelbuchstaben V(F/Y)WNSSN (SEQ ID NR: 5) und NDY(VJL)DI(J/Y)CPHY (SEQ ID NR: 6) tragen, wobei die Buchstaben in Klammern Reste anzeigen, die sich in menschlichem und Ratten-B61 im Vergleich zu dem abgeleiteten Efl-2-Protein unterscheiden. Degenerierte Oligodesoxynucleotide, die diesen beibehaltenen Proteinregionen entsprechen, können dann konstruiert werden und verwendet werden, um PCR-Reaktionen unter Verwendung von cDNAs, die aus verschiedenen Geweben, einschließlich embryonischem und adultem Gehirn, hergestellt werden, auszulösen. Entstehende verstärkte DNA-Fragmente können dann durch Insertion in die Plasmide cloniert werden, DNA-Sequenzierung unterzogen werden und diese Sequenzen können dann mit jenen der bekannten Efl's verglichen werden.
BEISPIEL 3: EXPRESSIONSCLONIERUNG VON ELK-BINDENDEN LIGANDEN
• COS-7-Zellen wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle Medium (DMEM), welches 10% fötales Rinderserum (FBS), jeweils 1% Penicillin und Streptomycin (P/S) und 2 mM Glutamin in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; enthielt, gezüchtet. Die menschliche Neuroepitheliomlinie CP-100 (erhalten von) wurde in Eagle minimalem Essentialmedium (EMEM) mit 10% FBS, (P/S) und 2 mM Glutamin gezüchtet.
• Menschliche Efl-cDNA-Clone voller Länge wurden durch Absuchen einer CP 100- cDNA-Genbank in dem pJFE14-Vektor, der in COS-Zellen exprimiert wird, erhalten. Dieser Vektor ist, wie in Fig. 1 gezeigt, eine modifizierte Version des Vektors pSRa (Takebe, et al. 1988, Mol. Cell. Biol. 8: 466472). Die Genbank wurde unter Verwendung der zwei BSTX1- Restriktionsorte im pJFE14-Vektor hergestellt.
• COS-7-Zellen wurden vorübergehend entweder mit der pJFE14-Vektor-Genbank oder einem Kontrollvektor durch das DEAE-Dextran-Transfektionsprotokoll transfiziert. Kurz, COS-M5-Zellen wurden in einer Dichte von 1,0 · 10&sup6; Zellen pro 100 mm Platte 24 Stunden vor der Transfektion ausgestrichen. Für die Transfektion wurden die Zellen in serumfreiem DMEM, welches 400 ug/ml DEAE-Dextran, 1 uM Chloroquin und 2 mM Glutamin und 1 ug der geeigneten DNA enthielt, 3-4 Stunden bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; gezüchtet. Das Transfektionsmedium wurde belüftet und durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 10% DMSO 2-3 Min lang ersetzt. Nach diesem DMSO-"Schock" wurden die COS-7-Zellen mit 10% FBS, jeweils 1% Penicillin und Streptomycin und 2 mM Glutamin für 48 Stunden in DMEM platziert.
• Das Absuchen wurde unter Verwendung eines Elk-Rezeptorkörpers, der aus der exftazellulären Domäne von Elk bestand, welche mit der konstanten Region von IgG1 verbunden war, durch direkte Lokalisierung einer Oberflächenfärbung durchgeführt. Dieser Rezeptorkörper wurde wie folgt hergestellt: Der Fc-Abschnitt von menschlichem IgG1, der an der Hinge-Region beginnt und bis zu dem Carboxylende des Moleküls reicht, wurde von plazentaler cDNA unter Verwendung von PCR mit Oligonucleotiden, die der veröffentlichten Sequenz von menschlichem IgG1 entsprechen, cloniert. Geeignete Restriktionsorte wurden ebenfalls in die Oligonucleotide eingeschlossen, um eine Clonierung des PCR-Fragments in einen Expressionsvektor zu gewährleisten. Expressionsvektoren, die Rezeptoren von voller Länge enthielten, wurden entweder durch den Abbau durch Restriktionsenzyme oder durch PCR-Strategien modifiziert, um die transmembranen und intrazellulären Domänen durch Restriktionsorte zu ersetzen, die eine Clonierung des menschlichen IgG1-Fragments in dies Orte gewährleisten; dies wurde auf eine Weise durchgeführt, dass ein Fusionsprotein mit der Ektodomäne des Rezeptors als Aminoende und der Fc-Abschnitt von menschlichem IgG1 als Carboxylende erzeugt wurde. Ein Alternativverfahren zur Herstellung von Rezeptorkörpern wird in Goodwin, et al. 1993, Cell 73: 447456 beschrieben.
• Kurz, eine Platte von 100 mm mit COS-Zellen wurde mit 1 pg CHP100-Genbank- Plasmid-DNA transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen dadurch sondiert, dass sie 30 Min mit Elk-IgG (in Form von COS-Zellüberständen) inkubiert wurden. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen, mit Methanol fixiert und dann zusätzliche 30 Min mit PBS/10% Rinder-Kälberserum/anti-menschlichem IgG-basischem Phsophatase-Konjugat inkubiert. Nach drei Waschungen mit PBS wurden die Zellen 30-60 Min in alk-phos-Substrat inkubiert. Die Platte wurde dann mikroskopisch auf die Gegenwart von oberflächengefärbten Zellen hin geprüft. Für jede gefärbte Zelle wurde mit einer Plastikpipettenspitze ein kleiner, sie umgebender Bereich von der Platte gekratzt und Plasmid-DNA wurde dann gewonnen und verwendet, um Bakterienzellen zu elektroporieren. Plasmid-DNA, die von Kulturen hergestellt wurde, welche aus diesen Elektroporationen abgeleitet wurden, wurde verwendet, um COS-Zellen für eine zweite Anreicherungsrunde zu transfizieren. Die zweite Runde wurde mit Standard-Panning-Techniken durchgeführt. Nach der zweiten Anreicherungsrunde wurden einzelne Bakterienkolonien herausgenommen und Plasmid-DNA, die aus diesen Kolonien hergestellt wurde, wurde auf ihre Fähigkeit, Elk- Färbung in COS-Zellen, welche mit ihnen transfiziert wurden, zu induzieren, getestet.
• Ein Clon, von dem eine Bindung an den Elk-Rezeptorkörper identifiziert wurde, wurde beim ATCC am 12. April 1994 hinterlegt und als 75734 bezeichnet.
BEISPIEL 4: AKTIVIERUNG VON LÖSLICHEN EFL'S
• Tests von membrangebundenen Efl's wurden entweder durch Züchten von COS- Zellen, die mit Vektor allein (COS-Mock) oder von COS-Zellen, die mit Efl-3- Expressionsvektor transfiziert wurden; durchgeführt, wobei die Zellen von den Platten mit PBS und 1 mM EDTA gelöst, dann pelletiert und in PBS resuspendiert wurden. Die Zellen wurden oben auf Reporter-Zelllinien aufgelagert.
• Lösliches Efl-3 (Elk-1) und Efl-1 (B61), jedes unter Verwendung des myc-Epitops an ihren C-Enden markiert [Stahl, et al. Science 263, 92-95 (1994)] wurden als COS- Zellüberstände hergestellt und als ungeclusterte Liganden oder als durch Antikörper geclusterte Liganden verwendet. Die Ligandenkonzentrationen wurden durch Quantifizieren der Menge an myc-Epitop auf Slot-Blots erhoben; das Liganden-Clustern wurde durch Zusetzen von monoclonalen anti-myc-Antikörpern und polyclonalen anti-Maus-Antikörpern vervollständigt und bei 37ºC eine Stunde inkubiert, bevor die Zellen stimuliert wurden. Reporter-Zelllinien waren 3T3-Fibroblasten, die mit Elk transfiziert waren (Fig. 5A und 5B) oder C2C12-Zellen, die mit Ehk-1 transfiziert waren (Fig. 5C). Reporterzellen wurden auf 10 cm-Platten 4-6 Stunden in serumfreiem Medium ausgehungert und dann 15 Minuten wie oben angemerkt stimuliert, dann solubilisert und mit Antikörpern, die die Rezeptoren erkennen, immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden mit Antikörpern gegen Phosphotyrosin immun-geblottet (Fig. 5, obere Abbildungen) und danach gestrippt und erneut mit Antikörpern belegt, die die Rezeptoren erkennen, um das gesamte Rezeptorprotein sichtbar zu machen (Fig. 5, untere Abbildungen).
• Um die Induktion der Wachstumsreaktionen in BAF. Zellen zu messen, welche durch Rezeptor-Chimären vermittelt wurden, wurden Stimulierungen mit löslichem EHK1L (Efl-2) und B61 (Efl-1), welche in COS-Zellen mit oder ohne nachfolgendes Clustern hergestellt wurden, durchgeführt. Nach zwei Tagen Stimulierung wurde die Anzahl an lebensfähigen Zellen durch Zusetzen der vitalen Färbung MTT (3-{4,5-Dimethylthiazol-yl}-2,5- diphenyltetrazoliumbromid) über 4 Stunden festgestellt, gefolgt von Solubilisierung und Bestimmung der optischen Dichte (O. D.) wie zuvor beschrieben [Ip et al., 1993, Neuron 10: 137-149) (Fig. 8). Die in Fig. 9 beschriebenen Daten resultieren aus MTT-Tests, die wie vorstehend mit löslichem Ehk-1L-Fc und B61-Fc, hergestellt in COS-Zellen mit und ohne nachfolgendes Clustern mit anti-Fc-Antikörpern, durchgeführt wurde. Da die katalytische Domäne des Eck-Rezeptors Wachstumsreaktionen in BAF-Zellen nicht vermittelt, wurde stattdessen eine Rezeptorchimäre (in der die Ektodomäne des Eck-Rezeptors mit der cytoplasmatischen Domäne des FGF-Rezeptors fusioniert wurde) in BAF-Zellen eingeführt, um eine Reporter-Zelllinie herzustellen.
• Wie in Fig. 5B, Bahnen 2 und 3 und in Fig. 5C, Bahn 2 gezeigt, wurde keine Liganden induzierte Rezeptoraktivierung, wie durch die Rezeptorphosphorylierung beurteilt, bei der Verwendung von löslichen Formen von Elk-1 (Efl-3) oder B61 (Efl-1) beobachtet. Eine Rezeptorphosphorylierung wurde jedoch deutlich durch die Stimulierung von Rezeptor exprimierenden Reporter-Zellen mit COS-Zellen, die membrangebundene Formen dieser Liganden über-exprimieren, induziert (z. B. Fig. 5A, Bahnen 1 und 2). Um diese Diskrepanz zu erklären, vermuteten wir, dass Membranbindung das Liganden-Clustern erleichtert, welches wiederum die Rezeptormultimerisation und -Aktivierung fördert. Um ein Liganden-Clustern in Lösung nachzuahmen, wurden sekretierte Ligandenformen mit Epitopmarkierungen an ihren C-Termini konstruiert; Antikörper gegen die Markierungen wurden dann verwendet um die Liganden zu aggregieren. Diese Art des Clusterns ermöglichte es zuvor inaktiven löslichen Liganden, die Rezeptortyrosin-Phosphorylierung in Reporter-Zellen, die Elk- und Ehk-1-Rezeptoren exprimieren (Fig. 5B, Bahnen 1-5 und Fig. 5C, Bahnen 1-3) in hohem Maß zu induzieren. Auf ähnliche Weise reicht die Dimerisierung des Liganden, wie gezeigt in Fig. 7 mit Hinblick auf Efl-3 (ELK-L), nicht aus, um biologische Aktivität zu induzieren, wohingegen Multimere eine signifikante Aktivität zeigten. Diese Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit, wie hierin beschrieben, die Effizienz eines bestimmten Mechanismus des Clusterns insofern festzustellen, als jeder einzelne Ligand betroffen ist.
• Eine solche Effizienz des Clusterns kann durch Messen der Phosphorylierung des Rezeptors bestimmt werden. Alternativ kann die Vermehrung in Reporterzellen verwendet werden, die einen geeigneten Rezeptor oder eine geeignete Rezeptorchimäre exprimieren, wie die Eck-Rezeptorchimäre, die in Experimenten verwendet wurde, deren Ergebnisse in Fig. 6 gezeigt sind.
• Dosis-Reaktions-Studien zeigten, dass Clustern eine mindestens 100-mal größere Potenz und gesättigte Reaktionen mit geringen Ligandenkonzentrationen (im Vergleich zu jenen, welche mit Liganden gesehen wurden) im Vergleich zu anderen Rezeptorfamilien so wohl im Phosphorylierungstest (getestet für den Elk-Liganden, Daten nicht gezeigt) als auch im Vermehrungstest (getestet für Efl-1 und B61, Fig. 6) ergab [Ip, et al. Neuron 10: 137- 149 (1993)]. Die geringe Wirkung von nicht-geclustertem B61 (Fig. 6B) erinnert an die kürzliche Entdeckung, dass hohe Konzentrationen an löslichem B61 die Eck-Tyrosin- Phsophorylierung induzieren könnte [Bartley, et al. Nature 368: 558-560 (1994)]; in der letzteren Studie wurde die Sättigung nicht einmal bei 1-2 mg/ml B61-Konzentrationen erreicht. Diese Wirkungen könnten einer schwachen Fähigkeit des löslichen Liganden selbst zugeschrieben werden zu dimerisieren oder zu aggregieren, entweder spontan oder, als Ergebnis einer Reinigung. Es wird angenommen, dass lösliche Liganden ihre Rezeptoren auf Grund ihrer Bivalenz oder Multivalenz aktivieren [Schlessinger, J. & Ullrich, A. Neuron 9: 383-391 (1992)]; einige Liganden sind Monomere, die zwei unterschiedliche Rezeptorbindungsstellen enthalten, wohingegen andere als kovalent oder nicht-kovalent miteinander verbundene Dimere Bivalenz erreichen. Unsere Ergebnisse definieren eine neue Klasse von Liganden, die als lösliche Liganden uneffektiv erscheinen, möglicherweise, weil sie monovalent sind, obwohl sie in Lösung durch Clustern künstlich aktiviert werden können. Diese Liganden scheinen für die Aggregation und die Aktivierung ihrer Rezeptoren von ihrer Membranbindung abzuhängen. Durch die Begrenzung der Diffusion in zwei Richtungen könnte eine Membranbindung die Wahrscheinlichkeit von Ligand-Ligand-Kollisionen leicht erhöhen und dadurch die Ligandendimerisierung oder ein extensiveres Liganden-Clustern zwischen Liganden, die in Lösung nur schwach interagieren, fördern. Alternativ können spezifische Mechanismen zur Bildung von Ligandencluster auf der Zelloberfläche existieren. Zusätzlich würde erwartet, dass Liganden-Rezeptor-Paare in den Kontaktregionen zwischen Zellen, die Liganden tragen und Zellen, die Rezeptoren tragen, erwartet.
• Jedes oder alle dieser lateralen Aggregations-Wirkungen könnten zur Rezeptor- Multimerisation und Aktivierung beitragen. Die Beobachtung, dass der EPH-verbundene, neuronal-exprimierte NUK-Rezeptor sich vorübergehend in Regionen mit Zell-Zell-Kontakt konzentriert [Henkemeyer, et al. Oncogene 9: 1001-1014 (1994)] bestätigt die Möglichkeit, dass Interaktionen zwischen einem Liganden, der an eine Membran gebunden ist und einem Rezeptor, der an eine andere Membran gebunden ist, die laterale Aggregation fördern könnte.
HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
• Die folgenden Mikroorganismen wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag hinterlegt.
ZUGANGSNUMMER
• pJFE14 enthaltend efl-2 75728
• pJFE14 enthaltend efl-3 75734
• pJFE 14 enthaltend efl-4 75921
• Die vorliegende Erfindung ist auf die hierin beschriebenen Ausführungsformen nicht beschränkt.

Claims (11)

1. Verfahren zur Verstärkung der biologischen Aktivität der extrazellulären Domäne eines Liganden der eph-Familie umfassend:

(a) Expression der löslichen Domäne des Liganden mit einem Markierungsepitop;

(b) Exponieren der markierten löslichen Domäne mit Anti-Markierungs- Antikörpern zur Bildung eines Clusters von Liganden der eph-Familie.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierung sich am C-Terminus des Liganden befindet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Markierungsepitop c-myc oder die Fc-Domäne eines Immunglobulins ist.

4. Verfahren zur Verstärkung der biologischen Aktivität einer löslichen Domäne eines Liganden der eph-Familie, ausgewählt aus Efl-1 (B61) und Efl-2 (EHK- 1L), umfassend:

(a) Expression der löslichen Domäne des Liganden mit einer Fc-Domäne eines IgG; und

(b) Zulassen der Bildung von Fc-Dimeren.

5. Präparat eines Epitop-markierten, löslichen Liganden der eph-Familie, behandelt mit einem Anti-Epitop-Antikörper, welches erhältlich ist nach dem Verfahren der Ansprüche 1, 2 oder 3.

6. Präparat nach Anspruch 5, wobei sich das Markierungsepitop am C- Terminus des Liganden befindet.

7. Präparat nach Anspruch 6, wobei das Epitop myc oder die Fc-Domäne eines Immunglobulins ist.

8. Biologisch aktiver, geclusterter, löslicher Ligand der eph-Familie, umfassend (lösliches Efl)n, wobei das lösliche Efl die extrazelluläre Domäne von Efl-1 (B61) oder Efl-2 (EHK-1L) ist und n 2 oder größer ist.

9. Isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül, umfassend die DNA- Sequenz von Efl-4, wobei die Sequenz der Nucleinsäure ausgewählt ist aus:

(a) der Sequenz der DNA, die die Codierungsregion der Efl-4-DNA- Sequenz umfasst, enthalten in dem Plasmid pJFE1 4, wie hinterlegt bei der American Type Culture Collection am 21. Oktober 1994 und bezeichnet als 75921;

(b) DNA-Sequenzen, die unter moderat stringenten Bedingungen mit der DNA aus (a) hybridisieren und ein Efl-4-Protein codieren, welches an den Ehk-1-Rezeptor bindet; und

(c) DNA-Sequenzen, die als ein Ergebnis des genetischen Codes im Bezug auf die DNA-Sequenzen von (a) oder (b) degeneriert sind und die ein Efl-4-Protein codieren, welches an den Ehk-1-Rezeptor bindet.

10. Isoliertes Polypeptid, codiert durch die Nucleinsäure nach Anspruch 9.

11. Biologisch aktiver, geclusterter, löslicher Ligand der eph-Familie, umfassend (lösliches Efl)n, wobei das lösliche Efl die extrazelluläre Domäne eines Polypeptids nach Anspruch 10 ist und n 2 oder größer ist.